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6.1.1 : L'utilisation de mutants pour étudier l'opéron lac - Biologie

6.1.1 : L'utilisation de mutants pour étudier l'opéron lac - Biologie



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Objectifs d'apprentissage

  • Décrire comment les diploïdes partiels peuvent être utilisés pour examiner les relations génétiques dans les organismes haploïdes.
  • Prédire si lac les gènes d'opéron seront exprimés lorsque des mutations données sont présentes.

Des mutants uniques du lac opéron

Les lac l'opéron et ses régulateurs ont d'abord été caractérisés en étudiant des mutants de E. coli qui présentaient diverses anomalies dans le métabolisme du lactose. Certains mutants ont exprimé la lac gènes d'opéron de manière constitutive, ce qui signifie que l'opéron a été exprimé, que le lactose soit ou non présent dans le milieu. De tels mutants sont appelés constitutif mutants.

Les lieu de l'opérateur (lacO) - Un exemple est Oc, dans laquelle une mutation dans une séquence opérateur et réduit ou exclut le répresseur (le lacI produit du gène) de reconnaître et de se lier à la séquence opérateur. Ainsi, dans Oc mutants, lacZ, de dentelle, et la CA sont exprimés que du lactose soit présent ou non.

Les lacI lieu – Un type d'allèle mutant de lacI (appelé je-) empêche soit la production d'un polypeptide répresseur, soit produit un polypeptide qui ne peut pas se lier à la séquence opérateur. C'est aussi un exprimant constitutif de la lac opéron car l'absence de liaison au répresseur permet la transcription.

Un autre type de mutant de lacI appelé jes empêche le polypeptide répresseur de se lier au lactose, et ainsi se liera à l'opérateur et sera non inductible.. Ce mutant réprime constitutivement le lac opéron que du lactose soit présent ou non. Les lac l'opéron n'est pas exprimé et ce mutant est appelé un super-répresseur.

Deux lac opérons dans une seule cellule crée des diploïdes partiels dans E. coli

On peut en apprendre davantage sur la réglementation de la lac opéron lorsque deux copies différentes sont présentes dans une cellule. Ceci peut être accompli en utilisant le Facteur F pour porter une copie, tandis que l'autre est sur le génomique E. coli chromosome. Il en résulte un diploïde partiel dans E. coli.

Le facteur F est un ADN extra-chromosomique qui peut être soit un plasmide libre, soit intégré dans le chromosome bactérien hôte. Cette commutation est accomplie par des éléments IS où un croisement inégal peut recombiner le facteur F et les séquences d'ADN adjacentes (gènes) dans et hors du chromosome hôte. Les chercheurs ont utilisé cet outil génétique pour créer des diploïdes partiels (mérozygotes) qui leur permettent de tester la régulation avec différentes combinaisons de différentes mutations dans une cellule. Par exemple, la copie du facteur F peut avoir un jeS mutation tandis que la copie génomique pourrait avoir une OC mutation. Comment cette cellule réagirait-elle à la présence/absence de lactose (ou glucose) ? Ce diploïde partiel peut être utilisé pour déterminer que jeS est dominant pour je+, qui à son tour domine je-. Il peut également être utilisé pour montrer le OC la mutation n'agit que sur cis- tandis que le lacI la mutation peut agir dans trans- .

Exemple (PageIndex{1})

Considérez la question posée ci-dessus : Une cellule avec une copie du lac l'opéron d'un facteur F a le jeS mutation, alors que la copie génomique a une OC mutation. Comment cette cellule réagirait-elle à la présence/absence de lactose (ou glucose) ?

Solution

Les jeS La mutation code pour une forme de la protéine qui ne peut pas se lier à l'allolactose et continue donc à reconnaître l'opérateur, même en présence de lactose. Cependant, la copie génomique de l'opérateur OC est muté en une séquence qui n'est plus reconnue par le lac répresseur. Pour cette raison, le lacZYA gènes dans la génomique lac l'opéron sera continuellement exprimé dans cette cellule, car lacI le répresseur ne pourra pas lier cette séquence.


Lac Opéron

En plus de l'opérateur principal, LacO, montré dans Figure 1 , deux séquences ‘pseudo-opérateurs’ sont présentes dans le lac séquence d'opéron et contribuent à la répression. Les séquences d'ADN des pseudo-opérateurs sont très similaires, mais pas identiques, à LacO et sont liées par LacI plus faiblement. La présence de deux sites de liaison à l'ADN dans le tétramère de la protéine LacI suggère un mécanisme par lequel les pseudo-opérateurs pourraient améliorer la répression - un tétramère LacI pourrait lier deux opérateurs distincts et générer une structure d'ADN en boucle. Des preuves expérimentales du bouclage de l'ADN ont été obtenues auprès de divers laboratoires. Des preuves récentes indiquent que l'angle entre les deux dimères doit s'ouvrir pour que la formation de la boucle se produise, comme illustré dans Figure 4 . Ces structures en boucle sont très stabilisées, ce qui explique le refoulement important de lacZYA expression observée dans les cellules bactériennes. En effet, un ADN contenant de multiples séquences d'opérateurs et avec la densité de surenroulement caractéristique de E. coli présente une demi-vie pour le complexe qui dépasse 2 jours. Cependant, même ces complexes en boucle répondent rapidement (en moins de 30 s) à la présence de sucres inducteurs, permettant une adaptation rapide à une source externe de lactose qui peut être transitoire.

Figure 4 . Structure d'ADN en boucle. La ligne courbe bleu sarcelle représente le lac ADN de l'opéron (avec ombrage pour indiquer la proximité de l'observateur), qui contient trois sites possibles de liaison à LacI (dont deux, O1 et ô2, sont montrés liés à LacI). La séquence pseudo-opérateur O2 est situé dans le lacZ gène, et la séquence opérateur primaire O1 chevauche la séquence promotrice de la lacZYA gènes métaboliques ( Figure 1 ). Tetrameric LacI est montré au bas de la figure comme interagissant simultanément avec O1 et ô2. Cette structure boucle l'ADN et génère un complexe à très haute stabilité. Notez que les dimères au sein d'un tétramère LacI se séparent et adoptent un angle plus grand entre eux lors de la boucle entre O1 et ô2 qu'en l'absence de bouclage (c'est-à-dire la structure montrée dans Figure 3(a) ). Le besoin de flexibilité entre les dimères pour que le bouclage se produise est soutenu par des preuves expérimentales.


12.1 Le lac opéron

Les lac L'opéron (opéron lactose) est un opéron nécessaire au transport et au métabolisme du lactose dans Escherichia coli et de nombreuses autres bactéries entériques.

Un opéron est une unité fonctionnelle d'ADN contenant un groupe de gènes sous le contrôle d'un seul promoteur. Les gènes sont transcrits ensemble dans un brin d'ARNm et soit traduits ensemble dans le cytoplasme, soit subissent un épissage pour créer des ARNm monocistroniques qui sont traduits séparément, c'est-à-dire plusieurs brins d'ARNm qui codent chacun pour un seul produit génique. Il en résulte que les gènes contenus dans l'opéron sont exprimés ensemble ou pas du tout. Plusieurs gènes doivent être co-transcrits pour définir un opéron.

Bien que le glucose soit la source de carbone préférée pour la plupart des bactéries, le lac L'opéron permet la digestion efficace du lactose lorsque le glucose n'est pas disponible grâce à l'activité de la bêta-galactosidase. La régulation génique du lac L'opéron a été le premier mécanisme de régulation génétique à être clairement compris, il est donc devenu un exemple de premier plan de la régulation des gènes procaryotes. Il est discuté ici en détail pour cette raison. Ce système de métabolisme du lactose a été utilisé par François Jacob et Jacques Monod pour déterminer comment une cellule biologique sait quelle enzyme synthétiser. Leur travail sur le lac opéron leur a valu le prix Nobel de physiologie en 1965.

Les opérons bactériens sont des transcrits polycistroniques capables de produire plusieurs protéines à partir d'un transcrit d'ARNm. Dans ce cas, lorsque le lactose est requis comme source de sucre pour la bactérie, les trois gènes de la lac l'opéron peut être exprimé et leurs protéines suivantes traduites : lacZ, lacY et lacA. Le produit du gène de lacZ est la -galactosidase qui clive le lactose, un disaccharide, en glucose et galactose. lacY code pour la bêta-galactoside perméase, une protéine membranaire qui s'incruste dans la membrane cytoplasmique pour permettre le transport cellulaire du lactose dans la cellule. Enfin, lacA code pour la Galactoside acétyltransférase.

Il serait inutile de produire des enzymes en l'absence de lactose ou si une source d'énergie préférable telle que le glucose était disponible. Les lac L'opéron utilise un mécanisme de contrôle en deux parties pour s'assurer que la cellule dépense de l'énergie pour produire les enzymes codées par le lac opéron uniquement lorsque cela est nécessaire. En l'absence de lactose, le lac répresseur, lacI, arrête la production des enzymes codées par le lac opéron. Les lac répresseur est toujours exprimé à moins qu'un co-inducteur ne s'y lie. En d'autres termes, il n'est transcrit qu'en présence de petite molécule co-inducteur. En présence de glucose, la protéine activatrice de catabolite (CAP), nécessaire à la production des enzymes, reste inactive et EIIAGlc arrête la perméase de lactose pour empêcher le transport du lactose dans la cellule. Ce double mécanisme de contrôle provoque l'utilisation séquentielle du glucose et du lactose dans deux phases de croissance distinctes, appelées diauxie.

Des abréviations à trois lettres sont utilisées pour décrire les phénotypes des bactéries, notamment E. coli.

  • Lac (la possibilité d'utiliser du lactose),
  • His (la capacité à synthétiser l'acide aminé histidine)
  • Mot (motilité de nage)
  • SmR (résistance à l'antibiotique streptomycine)

Dans le cas de Lac, les cellules de type sauvage sont Lac+ et sont capables d'utiliser le lactose comme source de carbone et d'énergie, tandis que les dérivés mutants Lac- ne peuvent pas utiliser le lactose. Les trois mêmes lettres sont généralement utilisées (minuscules, en italique) pour étiqueter les gènes impliqués dans un phénotype particulier, où chaque gène différent est en outre distingué par une lettre supplémentaire. Les lac les gènes codant pour les enzymes sont lacZ, lacY et lacA. Le quatrième lac le gène est lacI, codant pour le répresseur lactose—« I » signifie inductibilité.

On peut faire la distinction entre les gènes de structure codant pour des enzymes et les gènes régulateurs codant pour des protéines qui affectent l'expression des gènes. L'usage courant étend la nomenclature phénotypique pour l'appliquer aux protéines : ainsi, LacZ est le produit protéique du gène lacZ, la -galactosidase. Diverses séquences courtes qui ne sont pas des gènes affectent également l'expression des gènes, y compris le lac promoteur, lac p, et le lac opérateur, lac o. Bien qu'il ne s'agisse pas d'un usage strictement standard, les mutations affectant lac o sont appelés lac oc, pour des raisons historiques.

Les lac L'opéron se compose de 3 gènes de structure et d'un promoteur, d'un terminateur, d'un régulateur et d'un opérateur. Les trois gènes de structure sont : lacZ, lacY et lacA.

  • lacZ code pour la β-galactosidase (LacZ), une enzyme intracellulaire qui clive le lactose disaccharidique en glucose et galactose.
  • lacY code pour la bêta-galactoside perméase (LacY), un symporteur transmembranaire qui pompe les β-galactosides, dont le lactose, dans la cellule en utilisant un gradient de protons dans la même direction. La perméase augmente la perméabilité de la cellule aux -galactosides.
  • lacA code pour la β-galactoside transacétylase (LacA), une enzyme qui transfère un groupe acétyle de l'acétyl-CoA aux β-galactosides.

Seuls lacZ et lacY semblent nécessaires au catabolisme du lactose.

Contrôle spécifique de la lac dépend de la disponibilité du substrat lactose pour la bactérie. Les protéines ne sont pas produites par la bactérie lorsque le lactose n'est pas disponible comme source de carbone. Les lac les gènes sont organisés en un opéron, c'est-à-dire qu'ils sont orientés dans la même direction immédiatement adjacente sur le chromosome et sont co-transcrits en une seule molécule d'ARNm polycistronique. La transcription de tous les gènes commence par la liaison de l'enzyme ARN polymérase (RNAP), une protéine de liaison à l'ADN, qui se lie à un site de liaison à l'ADN spécifique, le promoteur, immédiatement en amont des gènes. La liaison de l'ARN polymérase au promoteur est facilitée par la protéine activatrice de catabolite liée à l'AMPc (CAP, également connue sous le nom de protéine réceptrice de l'AMPc). Cependant, le gène lacI (gène régulateur de lac opéron) produit une protéine qui empêche RNAP de se lier au promoteur de l'opéron. Cette protéine ne peut être éliminée que lorsque l'allolactose s'y lie et l'inactive. La protéine formée par le gène lacI est connue sous le nom de lac répresseur. Le type de réglementation que le lac L'opéron subit est appelé inductible négative, ce qui signifie que le gène est désactivé par le facteur régulateur (répresseur lac) à moins qu'une molécule (lactose) ne soit ajoutée. En raison de la présence du lac répresseur, les ingénieurs génétiques qui remplacent le gène lacZ par un autre gène devront cultiver les bactéries expérimentales sur de la gélose contenant du lactose. S'ils ne le font pas, le gène qu'ils essaient d'exprimer ne sera pas exprimé car la protéine répresseur empêche toujours RNAP de se lier au promoteur et de transcrire le gène. Une fois le répresseur retiré, RNAP procède ensuite à la transcription des trois gènes (lacZYA) en ARNm. Chacun des trois gènes sur le brin d'ARNm a sa propre séquence Shine-Dalgarno, de sorte que les gènes sont traduits indépendamment. La séquence d'ADN du E. coli lac l'opéron, l'ARNm lacZYA et les gènes lacI sont disponibles auprès de GenBank (voir).

Le premier mécanisme de contrôle est la réponse régulatrice au lactose, qui utilise une protéine régulatrice intracellulaire appelée répresseur lactose pour empêcher la production de -galactosidase en l'absence de lactose. Le gène lacI codant pour le répresseur se trouve à proximité du lac opéron et est toujours exprimé (constitutif). Si le lactose est absent du milieu de croissance, le répresseur se lie très étroitement à une courte séquence d'ADN juste en aval du promoteur près du début de lacZ appelé le lac opérateur. La liaison du répresseur à l'opérateur interfère avec la liaison de l'ARNP au promoteur et, par conséquent, l'ARNm codant pour LacZ et LacY n'est produit qu'à de très faibles niveaux. Cependant, lorsque les cellules sont cultivées en présence de lactose, un métabolite du lactose appelé allolactose, fabriqué à partir de lactose par le produit du gène lacZ, se lie au répresseur, provoquant un décalage allostérique. Ainsi altéré, le répresseur est incapable de se lier à l'opérateur, permettant à RNAP de transcrire le lac gènes et conduisant ainsi à des niveaux plus élevés des protéines codées.

Le deuxième mécanisme de contrôle est une réponse au glucose, qui utilise l'homodimère de la protéine activatrice de catabolite (CAP) pour augmenter considérablement la production de -galactosidase en l'absence de glucose. L'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) est une molécule signal dont la prévalence est inversement proportionnelle à celle du glucose. Il se lie au CAP, qui à son tour permet au CAP de se lier au site de liaison du CAP (une séquence d'ADN de 16 pb en amont du promoteur sur la gauche dans le schéma ci-dessous, environ 60 pb en amont du site de démarrage de la transcription), ce qui aide l'ARNP en se liant à l'ADN. En l'absence de glucose, la concentration d'AMPc est élevée et la liaison de CAP-AMPc à l'ADN augmente significativement la production de -galactosidase, permettant à la cellule d'hydrolyser le lactose et de libérer du galactose et du glucose.

Plus récemment, il a été démontré que l'exclusion de l'inducteur bloque l'expression de la lac opéron en présence de glucose. Le glucose est transporté dans la cellule par le système phosphotransférase dépendant de la PEP. Le groupe phosphate du phosphoénolpyruvate est transféré via une cascade de phosphorylation constituée des protéines générales PTS (système phosphotransférase) HPr et EIA et des protéines PTS spécifiques du glucose EIIAGlc et EIIBGlc, le domaine cytoplasmique du transporteur de glucose EII. Le transport du glucose s'accompagne de sa phosphorylation par EIIBGlc, drainant le groupement phosphate des autres protéines PTS, dont EIIAGlc. La forme non phosphorylée de EIIAGlc se lie à la lac perméase et l'empêche d'apporter du lactose dans la cellule. Par conséquent, si à la fois du glucose et du lactose sont présents, le transport du glucose bloque le transport de l'inducteur de la lac opéron.

Les lac Le répresseur est une protéine en quatre parties, un tétramère, avec des sous-unités identiques (Figure 12.2). Chaque sous-unité contient un motif hélice-tour-hélice (HTH) capable de se lier à l'ADN. Le site opérateur où le répresseur se lie est une séquence d'ADN avec une symétrie de répétition inversée. Les deux demi-sites d'ADN de l'opérateur se lient ensemble à deux des sous-unités du répresseur. Bien que les deux autres sous-unités du répresseur ne fassent rien dans ce modèle, cette propriété n'a pas été comprise pendant de nombreuses années.

Finalement, il a été découvert que deux opérateurs supplémentaires sont impliqués dans lac régulation. L'un (O3) se situe à environ -90 pb en amont de O1 à la fin du gène lacI, et l'autre (O2)) est à environ +410 pb en aval de O1 dans la partie précoce de lacZ. Ces deux sites n'ont pas été trouvés dans les premiers travaux car ils ont des fonctions redondantes et les mutations individuelles n'affectent pas beaucoup la répression. Les mutations uniques en O2) ou en O3 n'ont que 2 à 3 fois les effets. Cependant, leur importance est démontrée par le fait qu'un double mutant défectueux à la fois en O2) et en O3 est considérablement dé-réprimé (d'environ 70 fois).

Dans le modèle actuel, lac répresseur est lié simultanément à la fois à l'opérateur principal O1 et à O2) ou O3. L'ADN intermédiaire sort du complexe. La nature redondante des deux opérateurs mineurs suggère que ce n'est pas un complexe bouclé spécifique qui est important. Une idée est que le système fonctionne par attache si le répresseur lié se libère momentanément de O1, la liaison à un opérateur mineur le maintient à proximité, de sorte qu'il puisse se reconnecter rapidement. Cela augmenterait l'affinité du répresseur pour O1.

Figure 12.2 : Un modèle structurel simulé d'un complexe entre le lac protéine répresseur (LacI) et un segment d'ADN de 107 pb de long. Deux sous-unités fonctionnelles LacI dimères (vert + bleu et jaune + orange) se lient chacune à une séquence d'opérateur d'ADN (en haut). La mobilité des groupes de tête de liaison à l'ADN couplés au corps stable du corps de LacI fournit la force pour le bouclage de l'ADN (Ville et al.).

Le répresseur est une protéine allostérique, c'est-à-dire qu'il peut prendre l'une ou l'autre de deux formes légèrement différentes, qui sont en équilibre l'une avec l'autre. Dans une forme, le répresseur se lie à l'ADN de l'opérateur avec une spécificité élevée, et dans l'autre forme, il a perdu sa spécificité. Selon le modèle classique d'induction, la liaison de l'inducteur, soit l'allolactose soit l'IPTG, au répresseur affecte la répartition du répresseur entre les deux formes. Ainsi, le répresseur lié à l'inducteur est stabilisé dans la conformation ne se liant pas à l'ADN. Cependant, ce modèle simple ne peut pas être toute l'histoire, car le répresseur est lié de manière assez stable à l'ADN, mais il est libéré rapidement par l'ajout d'un inducteur. Par conséquent, il semble clair qu'un inducteur peut également se lier au répresseur lorsque le répresseur est déjà lié à l'ADN. On ne sait pas encore tout à fait quel est le mécanisme exact de la liaison.

La liaison non spécifique du répresseur à l'ADN joue un rôle crucial dans la répression et l'induction de l'opéron Lac. Le site de liaison spécifique de la protéine Lac-répresseur est l'opérateur. L'interaction non spécifique est médiée principalement par des interactions charge-charge tandis que la liaison à l'opérateur est renforcée par des interactions hydrophobes. De plus, il existe une abondance de séquences d'ADN non spécifiques auxquelles le répresseur peut se lier. Essentiellement, toute séquence qui n'est pas l'opérateur est considérée comme non spécifique. Des études ont montré que sans la présence d'une liaison non spécifique, l'induction (ou la non-répression) de l'opéron Lac ne pourrait pas se produire même avec des niveaux saturés d'inducteur. Il a été démontré que, sans liaison non spécifique, le niveau basal d'induction est dix mille fois inférieur à celui observé normalement. En effet, l'ADN non spécifique agit comme une sorte de "puits" pour les protéines répresseurs, les distrayant de l'opérateur. Les séquences non spécifiques diminuent la quantité de répresseur disponible dans la cellule. Cela réduit à son tour la quantité d'inducteur nécessaire pour dé-réprimer le système.

Un certain nombre de dérivés ou d'analogues du lactose ont été décrits qui sont utiles pour le travail avec le lac opéron. Ces composés sont principalement des galactosides substitués, où la fraction glucose du lactose est remplacée par un autre groupe chimique. L'isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) est fréquemment utilisé comme inducteur de la lac opéron pour le travail physiologique. L'IPTG se lie au répresseur et l'inactive, mais n'est pas un substrat pour la -galactosidase. L'un des avantages de l'IPTG pour les études in vivo est que, puisqu'il ne peut pas être métabolisé par E. coli sa concentration reste constante et le taux d'expression de lac gènes contrôlés p/o, n'est pas une variable dans l'expérience. L'apport en IPTG dépend de l'action de la lactose perméase chez P. fluorescens, mais pas chez E. coli.

Le micro-organisme expérimental utilisé par François Jacob et Jacques Monod était la bactérie commune de laboratoire, E. coli, mais bon nombre des concepts de régulation de base découverts par Jacob et Monod sont fondamentaux pour la régulation cellulaire dans tous les organismes. L'idée clé est que les protéines ne sont pas synthétisées lorsqu'elles ne sont pas nécessaires - E. coli préserve les ressources cellulaires et l'énergie en ne fabriquant pas les trois protéines Lac lorsqu'il n'est pas nécessaire de métaboliser le lactose, comme lorsque d'autres sucres comme le glucose sont disponibles. La section suivante explique comment E. coli contrôle certains gènes en réponse à des besoins métaboliques.

Pendant la Seconde Guerre mondiale, Monod testait les effets de combinaisons de sucres comme sources de nutriments pour E. coli et B. subtilis. Monod suivait des études similaires menées par d'autres scientifiques avec des bactéries et des levures. Il a découvert que les bactéries cultivées avec deux sucres différents présentaient souvent deux phases de croissance. Par exemple, si du glucose et du lactose étaient tous deux fournis, le glucose était d'abord métabolisé (phase de croissance I, voir figure 2), puis le lactose (phase de croissance II). Le lactose n'a pas été métabolisé pendant la première partie de la courbe de croissance diauxique parce que la β-galactosidase n'a pas été produite lorsque le glucose et le lactose étaient présents dans le milieu. Monod a nommé ce phénomène diauxie.

Monod a ensuite concentré son attention sur l'induction de la formation de -galactosidase qui se produisait lorsque le lactose était le seul sucre dans le milieu de culture.

Une percée conceptuelle de Jacob et Monod a été de reconnaître la distinction entre les substances régulatrices et les sites où elles agissent pour modifier l'expression des gènes. Ancien soldat, Jacob a utilisé l'analogie d'un bombardier qui libérerait sa cargaison mortelle à la réception d'une transmission ou d'un signal radio spécial. Un système fonctionnel nécessite à la fois un émetteur au sol et un récepteur dans l'avion. Maintenant, supposons que l'émetteur habituel est cassé. Ce système peut fonctionner en introduisant un deuxième émetteur fonctionnel. En revanche, a-t-il dit, considérons un bombardier avec un récepteur défectueux. Le comportement de ce bombardier ne peut pas être modifié par l'introduction d'un deuxième avion fonctionnel.

Pour analyser les mutants régulateurs du lac opéron, Jacob a développé un système par lequel une deuxième copie du lac des gènes (lacI avec son promoteur, et lacZYA avec promoteur et opérateur) pourraient être introduits dans une seule cellule. Une culture de telles bactéries, qui sont diploïdes pour le lac gènes mais par ailleurs normaux, est ensuite testé pour le phénotype régulateur. En particulier, il est déterminé si LacZ et LacY sont fabriqués même en l'absence d'IPTG (en raison du fait que le répresseur lactose produit par le gène mutant n'est pas fonctionnel). Cette expérience, dans laquelle des gènes ou des groupes de gènes sont testés par paires, est appelée test de complémentation.

Ce test est illustré à la figure 12.4 (lacA est omis par souci de simplicité). Tout d'abord, certains états haploïdes sont indiqués (c'est-à-dire que la cellule ne porte qu'une seule copie du lac gènes). Le panneau (a) montre la répression, (b) montre l'induction par IPTG, et (c) et (d) montrent l'effet d'une mutation sur le gène lacI ou sur l'opérateur, respectivement. Dans le panneau (e), le test de complémentation pour le répresseur est montré. Si une copie du lac gènes portent une mutation dans lacI, mais la deuxième copie est de type sauvage pour lacI, le phénotype résultant est normal, mais lacZ est exprimé lorsqu'il est exposé à l'inducteur IPTG. Les mutations affectant le répresseur seraient récessives au type sauvage (et ce type sauvage est dominant), et cela s'explique par le fait que le répresseur est une petite protéine qui peut diffuser dans la cellule. La copie du lac l'opéron adjacent au gène lacI défectueux est efficacement bloqué par la protéine produite à partir de la deuxième copie de lacI.

Si la même expérience est réalisée en utilisant une mutation d'opérateur, un résultat différent est obtenu (panneau (f)). Le phénotype d'une cellule portant un site opérateur mutant et un site opérateur sauvage est que LacZ et LacY sont produits même en l'absence de l'inducteur IPTG car le site opérateur endommagé, ne permet pas la liaison du répresseur pour inhiber la transcription des gènes de structure. La mutation de l'opérateur est dominante. Lorsque le site opérateur où le répresseur doit se lier est endommagé par mutation, la présence d'un second site fonctionnel dans la même cellule ne fait aucune différence pour l'expression des gènes contrôlés par le site mutant.

Une version plus sophistiquée de cette expérience utilise des opérons marqués pour distinguer les deux copies du lac gènes et montrer que le(s) gène(s) de structure non régulé(s) est(sont) celui(s) à côté de l'opérateur mutant (panneau (g). Par exemple, supposons qu'une copie soit marquée par une mutation inactivant lacZ de sorte qu'elle ne puisse produire la protéine LacY, tandis que la seconde copie porte une mutation affectant lacY et ne peut produire que LacZ.Dans cette version, seule la copie de la lac l'opéron adjacent à l'opérateur mutant est exprimé sans IPTG. On dit que la mutation de l'opérateur est cis-dominante, elle est dominante au type sauvage mais n'affecte que la copie de l'opéron qui lui est immédiatement adjacente.

Cette explication est trompeuse dans un sens important, car elle procède d'une description de l'expérience et explique ensuite les résultats en termes de modèle. Mais en fait, il est souvent vrai que le modèle vient en premier, et une expérience est conçue spécifiquement pour tester le modèle. Jacob et Monod ont d'abord imaginé qu'il devait y avoir un site dans l'ADN avec les propriétés de l'opérateur, puis ont conçu leurs tests de complémentation pour le montrer.

La dominance des mutants opérateurs suggère également une procédure pour les sélectionner spécifiquement. Si les mutants régulateurs sont sélectionnés à partir d'une culture de type sauvage utilisant du phényl-Gal, comme décrit ci-dessus, les mutations de l'opérateur sont rares par rapport aux mutants répresseurs car la taille de la cible est si petite. Mais si au lieu de cela nous commençons avec une souche qui porte deux copies de l'ensemble lac région (qui est diploïde pour lac), les mutations du répresseur (qui se produisent toujours) ne sont pas récupérées car la complémentation par le deuxième gène lacI de type sauvage confère un phénotype de type sauvage. En revanche, la mutation d'une copie de l'opérateur confère un phénotype mutant car il est dominant par rapport à la seconde copie de type sauvage.

L'explication de la diauxie dépendait de la caractérisation de mutations supplémentaires affectant le lac gènes autres que ceux expliqués par le modèle classique. Deux autres gènes, cya et crp, ont été identifiés par la suite qui cartographiés loin de lac, et qui, lorsqu'ils sont mutés, entraînent une diminution du niveau d'expression en présence d'IPTG et même dans des souches de la bactérie dépourvues du répresseur ou de l'opérateur. La découverte de l'AMPc dans E. coli a conduit à la démonstration que des mutants défectueux pour le gène cya mais pas pour le gène crp pouvaient être restaurés à leur pleine activité par l'ajout d'AMPc au milieu.

Le gène cya code pour l'adénylate cyclase, qui produit l'AMPc. Chez un mutant cya, l'absence d'AMPc rend l'expression des gènes lacZYA plus de dix fois inférieure à la normale. L'ajout d'AMPc corrige la faible expression Lac caractéristique des mutants cya. Le deuxième gène, crp, code pour une protéine appelée protéine activatrice de catabolite (CAP) ou protéine réceptrice de l'AMPc (CRP).

Cependant, les enzymes du métabolisme du lactose sont fabriquées en petites quantités en présence à la fois de glucose et de lactose (parfois appelée expression de fuite) en raison du fait que le répresseur LacI s'associe/se dissocie rapidement de l'ADN plutôt que de s'y lier étroitement, ce qui peut laisser du temps pour que RNAP se lie et transcrive les ARNm de lacZYA. Une expression qui fuit est nécessaire pour permettre le métabolisme d'une partie du lactose après que la source de glucose est dépensée, mais avant lac l'expression est pleinement activée.

  • Lorsque le lactose est absent, il y a très peu de production d'enzyme Lac (l'opérateur a un répresseur Lac lié à celui-ci).
  • Lorsque le lactose est présent mais qu'une source de carbone préférée (comme le glucose) est également présente, une petite quantité d'enzyme est produite (le répresseur Lac n'est pas lié à l'opérateur).
  • Lorsque le glucose est absent, CAP-cAMP se lie à un site d'ADN spécifique en amont du promoteur et effectue une interaction protéine-protéine directe avec RNAP qui facilite la liaison de RNAP au promoteur.

Le délai entre les phases de croissance reflète le temps nécessaire pour produire des quantités suffisantes d'enzymes métabolisant le lactose. Premièrement, la protéine régulatrice CAP doit s'assembler sur le lac promoteur, entraînant une augmentation de la production de lac ARNm. Plus d'exemplaires disponibles du lac L'ARNm entraîne la production (voir traduction) de beaucoup plus de copies de LacZ (β-galactosidase, pour le métabolisme du lactose) et LacY (lactose perméase pour transporter le lactose dans la cellule). Après un délai nécessaire pour augmenter le niveau des enzymes métabolisant le lactose, les bactéries entrent dans une nouvelle phase rapide de croissance cellulaire.

Deux énigmes de la répression des catabolites concernent la façon dont les niveaux d'AMPc sont couplés à la présence de glucose, et deuxièmement, pourquoi les cellules devraient même s'en préoccuper. Une fois le lactose clivé, il forme en fait du glucose et du galactose (facilement converti en glucose). En termes métaboliques, le lactose est une aussi bonne source de carbone et d'énergie que le glucose. Le taux d'AMPc n'est pas lié à la concentration de glucose intracellulaire mais à la vitesse de transport du glucose, qui influence l'activité de l'adénylate cyclase. (En outre, le transport du glucose conduit également à une inhibition directe de la lactose perméase.) Pourquoi E. coli fonctionne de cette façon, on ne peut que spéculer. Toutes les bactéries entériques fermentent le glucose, ce qui suggère qu'elles le rencontrent fréquemment. Il est possible qu'une petite différence d'efficacité de transport ou de métabolisme du glucose par rapport au lactose rende avantageux pour les cellules de réguler la lac opéron de cette manière.

Les lac gène et ses dérivés peuvent être utilisés comme gène rapporteur dans un certain nombre de techniques de sélection à base bactérienne telles que deux analyses hybrides, dans lesquelles la liaison réussie d'un activateur transcriptionnel à une séquence de promoteur spécifique doit être déterminée. Dans les plaques LB contenant du X-gal, le changement de couleur des colonies blanches à une nuance de bleu correspond à environ 20 à 100 unités de β-galactosidase, tandis que les milieux lactose tétrazolium et lactose MacConkey ont une plage de 100 à 1 000 unités, étant les plus sensibles dans respectivement les parties haute et basse de cette plage. Étant donné que les milieux lactose MacConkey et lactose tétrazolium reposent tous deux sur les produits de dégradation du lactose, ils nécessitent la présence à la fois des gènes lacZ et lacY. Le nombre lac les techniques de fusion qui incluent uniquement le gène lacZ sont donc adaptées aux plaques X-gal ou aux bouillons liquides ONPG. L'ONPG (ortho-Nitrophényl-β-galactoside) est un substrat colorimétrique et spectrophotométrique pour la détection de l'activité β-galactosidase. Ce composé est normalement incolore. Cependant, si la β-galactosidase est présente, elle hydrolyse la molécule ONPG en galactose et ortho-nitrophénol. Ce dernier composé a une couleur jaune qui peut être utilisée pour vérifier l'activité enzymatique au moyen d'un dosage colorimétrique (à la longueur d'onde de 420 nm). La β-galactosidase est requise pour l'utilisation du lactose, de sorte que l'intensité de la couleur produite peut être utilisée comme mesure du taux enzymatique. Bien que l'ONPG imite le lactose et soit hydrolysé par la β-galactosidase, il est incapable d'agir comme inducteur de la lac opéron. Sans un autre analogue du lactose pouvant jouer le rôle d'inducteur, tel que l'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), la β-galactosidase ne sera pas transcrite et l'ONPG ne sera pas hydrolysée.


La nature des mutations constitutives de l'opérateur lactose ☆,☆☆

Analyse d'un grand nombre de O des mutants c de l'opéron lac a fourni des preuves indiquant que : (a) la prépondérance de O les mutations c sont du type à substitution de base et toutes ne confèrent qu'une constitutivité partielle pour la synthèse de l'enzyme Lac (b) pratiquement toutes en une seule étape O c les mutations tombent dans l'une ou l'autre d'un petit nombre de classes par rapport aux niveaux constitutifs (c) de nombreuses O les mutations c ont également des effets promoteurs concomitants, à savoir affecter le niveau maximum de la synthèse de l'enzyme Lac.

Ce travail a été soutenu par les numéros de subvention des National Institutes of Health GM13383 et GM16308 tandis que l'un d'entre nous (JRS) a reçu un prix de développement de carrière, GM-28123, et l'autre (TS) un récipiendaire d'une bourse postdoctorale nationale en santé HD 42801 .

Il s'agit de la contribution no. 415 de l'Institut Eleanor Roosevelt pour la recherche sur le cancer et du Département de biophysique, Centre médical de l'Université du Colorado, Denver, Colorado.


Questions de pensée critique

Toutes les cellules d'un organisme partagent le génome. Cependant, au cours du développement, certaines cellules se développent en cellules cutanées tandis que d'autres se développent en cellules musculaires. Comment les mêmes instructions génétiques peuvent-elles aboutir à deux types cellulaires différents dans le même organisme ? Expliquez bien votre réponse.

Différents programmes génétiques sont activés ou désactivés lorsque les cellules se différencient en différents types de cellules (par exemple, cellules de la peau, cellules musculaires, etc.). En conséquence, les cellules expriment les gènes nécessaires au tissu dans lequel elles se trouvent.

  1. Lorsque du lactose et du glucose sont présents dans le milieu, la transcription de l'opéron lac est induite.
  2. Lorsque le lactose est présent mais que le glucose est absent, l'opéron lac est réprimé.
  3. Lactose acts as an inducer of the lac operon when glucose is absent.
  4. Lactose acts as an inducer of the lac operon when glucose is present.
  1. Mutation in structural genes will stop transcription.
  2. Mutated lacY will prevent CAP from binding.
  3. Mutated lacA will metabolize lactose or maltodextrin.
  4. Transcription will continue but lactose will not be metabolized properly.

In some diseases, alteration to epigenetic modifications turns off genes that are normally expressed. En théorie, comment pourriez-vous inverser ce processus pour réactiver ces gènes ?

  1. In new seedlings, histone acetylations are present upon cold exposure, methylation occurs.
  2. In new seedlings, histone deacetylations are present upon cold exposure, methylation occurs.
  3. In new seedlings, histone methylations are present upon cold exposure, acetylation occurs.
  4. In new seedlings, histone methylations are present upon cold exposure, deacetylation occurs.
  1. Mutated promoters decrease the rate of transcription by altering the binding site for the transcription factor.
  2. Mutated promoters increase the rate of transcription by altering the binding site for the transcription factor.
  3. Mutated promoters alter the binding site for transcription factors to increase or decrease the rate of transcription.
  4. Mutated promoters alter the binding site for transcription factors and thereby cease transcription of the adjacent gene.
  1. The transcription rate would increase, altering cell function.
  2. The transcription rate would decrease, inhibiting cell functions.
  3. The transcription rate decreases due to clogging of the transcription factors.
  4. The transcription rate increases due to clogging of the transcription factors.

Les wnt transcription pathway is responsible for key changes during animal development. Based on the transcription pathway shown below. In this diagram, arrows indicate the transformation of one substance into another. Square lines, or the lines with no arrowheads, indicate inhibition of the product below the line. Based on this, how would increased wnt gene expression affect the expression of Bar-1?

  1. RBPs can bind first to the RNA, thus preventing the binding of miRNA, which degrades RNA.
  2. RBPs bind the miRNA, thereby protecting the mRNA from degradation.
  3. RBPs methylate miRNA to inhibit its function and thus stop mRNA degradation.
  4. RBPs direct miRNA degradation with the help of a DICER protein complex.
  1. UV rays can alter methylation and acetylation of proteins.
  2. RNA binding proteins are modified through phosphorylation.
  3. External stimuli can cause deacetylation and demethylation of the transcript.
  4. UV rays can cause dimerization of the RNA binding proteins.
  1. Phosphorylation of proteins can alter translation, RNA shuttling, RNA stability or post transcriptional modification.
  2. Phosphorylation of proteins can alter DNA replication, cell division, pathogen recognition and RNA stability.
  3. Phosphorylated proteins affect only translation and can cause cancer by altering the p53 function.
  4. Phosphorylated proteins affect only RNA shuttling, RNA stability, and post-translational modifications.
  1. UV rays could cause methylation and deacetylation of the genes that could alter the accessibility and transcription of DNA.
  2. The UV rays could cause phosphorylation and acetylation of the DNA and histones which could alter the transcriptional capabilities of the DNA.
  3. UV rays could cause methylation and phosphorylation of the DNA bases which could become dimerized rendering no accessibility of DNA.
  4. The UV rays can cause methylation and acetylation of histones making the DNA more tightly packed and leading to inaccessibility.
  1. These drugs maintain the demethylated and the acetylated forms of the DNA to keep transcription of necessary genes “on”.
  2. The demethylated and the acetylated forms of the DNA are reversed when the silenced gene is expressed.
  3. The drug methylates and acetylates the silenced genes to turn them back “on”.
  4. Drugs maintain DNA methylation and acetylation to silence unimportant genes in cancer cells.
  1. Understanding gene expression patterns in cancer cells will identify the faulty genes, which is helpful in providing the relevant drug treatment.
  2. Understanding gene expression will help differentiate cancerous cells from malignant cells.
  3. Gene profiling would identify the target genes of the cancer-causing bacteria.
  4. Breast cancer patients who do not express EGFR can respond to anti-EGFR therapy.
  1. Personalized medicines would vary based on the type of mutations and the gene’s expression pattern.
  2. The medicines are given based on the type of tumor found in the body of an individual.
  3. The personalized medicines are provided based only on the symptoms of the patient.
  4. The medicines tend to vary depending on the severity and the stage of the cancer.

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    • Auteurs : Julianne Zedalis, John Eggebrecht
    • Éditeur/site Web : OpenStax
    • Titre du livre : Biologie pour les cours AP®
    • Date de parution : 8 mars 2018
    • Lieu : Houston, Texas
    • URL du livre : https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/1-introduction
    • Section URL: https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/16-critical-thinking-questions

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    BIOL 3301 EXAM 3 Section 07869 GENETICS Wednesday April 2 2003 1 00 2 30 pm NOTE MAKE SURE YOU READ THE QUESTIONS CAREFULLY Name SSN True false statements write True or False in front of the statement 2 points each 1 The experiments by Griffith on Streptococcus pneumoniae were the first demonstration of bacterial transformation T 2 DNA polymerase III is the main activity during DNA replication T 3 Helicase is required for synthesis of the RNA primer during DNA replication F 4 Topoisomerase is a reverse transcriptase that maintains chromosome ends F 5 DNA ligase catalyzes the formation of hydrogen bonds F 6 The RNA polymerase core enzyme is sufficient for correct initiation of transcription F 7 Protein synthesis is terminated by a rho dependent mechanism F 8 IF2 stimulates binding of the 30S ribosome subunit to mRNA F 9 A homeodomain is a cis regulatory sequence F 10 Enhancers can only operate upstream of promoters they are enhancing F Multiple choice circle the correct answer 2 points each 1 A sample of normal double stranded DNA was found to have a thymine content of 27 What is the expected proportion of guanine a 9 b 23 c 32 d 36 e 73 2 The figure shown below depicts the structure of a dATP b dCTP c ddATP d UTP e ddTTP 3 Hershey and Chase proved that DNA is the transforming principle They observed that the isotope accumulated in the bacteria was a 31P b 35S c 32P d 15N e none of the above 4 In a DNA double helix nucleotides on complementary strands are held together by a covalent bonds b salt bridges c hydrogen bonds d phosphodiester bonds e none of the above 5 Meselsohn and Stahl demonstrated that DNA replication is a conservative b dispersive c funky d semi conservative e none of the above 6 rII mutants are grown on the restrictive host E coli K plate 1 and on the permissive host E coli B plate 2 The plaques appear as follows a Plate 1 no plaques Plate 2 large plaques b Plate 1 large plaques Plate 2 large plaques c Plate 1 small plaques Plate 2 small plaques d Plate 1 no plaques Plate 2 small plaques e Plate 1 no plaques Plate 2 no plaques 7 Mutations that do not complement are a allelic b non allelic c intergenic d null mutants e missense mutations 8 A tRNA with the anticodon 3 UGG 5 would carry a phenylalanine b tyrosine c tryptophane d serine e threonine 9 The E coli RNA polymerase holoenzyme consists of the following subunits a 2 1 1 1 b 2 2 1 c 2 1 1 d 1 2 1 1 e 2 2 1 10 The following diagram shows a fragment of transcribed DNA and the upper strand is the template strand 5 ATTGCC 3 3 TAACGG 5 The transcribed RNA can be represented by a 5 AUUGCC 3 b 5 TAACGG 3 c 5 AUUGCC 3 d 5 UAACGG 3 e 5 GGCAAU 3 11 EF Tu is required for a loading aminoacyl tRNA into the A site of the ribosome b regenerating EF Ts c translocation of the peptidylchain d translocation of the ribosome e releasing empty tRNAs from the ribosome 12 Stop codons are not recognized by tRNAs but by a ribosomes b the Shine Dalgarno sequence c release factors d EF Tu e IF3 13 A partial diploid of genotype I P O Z Y I P O Z Y will show a inducible production of beta galactosidase b inducible production of beta galactosidase and permease c constitutive production of beta galactosidase and permease d inducible production of permease e no beta galactosidase or acetylase production at all 14 Which of the following statements is true for eukaryotic RNA polymerases a RNA polymerase I synthesizes mRNA b RNA polymerase II synthesizes snRNA and rRNA c RNA polymerase I synthesizes rRNA d RNA polymerase III synthesizes mRNA e none of the above 15 Transcription termination in eukaryotes depends on a a hairpin structure b Rho termination factor c recognition of a AAUAAA sequence and endonuclease cleavage d polyadenylation e guanyltransferase Fill in 2 points each 1 Two of the bases Adenine and Guanine are similar in structure and are called purines The other two bases Thymine and Cytosine are called pyrimidines 2 B DNA is the most common form of DNA The spacing between basepairs is 3 4 A 3 Yanofsky studied the trp synthetase gene and demonstrated the colinearity of gene and protein 4 E coli DNA replication begins from a fixed origin but then proceeds bidirectionally ending at a site called the terminus 5 Translation initiation depends on recognition of the Shine Dalgarno sequence by the 3 end of 16S rRNA Homework 1 A We are studying some of the Neurospora mutants described by Beadle and Tatum These mutants numbered 1 to 7 are all involved in the same biosynthetic pathway The compounds generated in the different biosynthetic steps are A B C D F G H I Reconstruct the biosynthetic pathway starting on the left with the compound that comes first in the biosynthetic pathway 7 points Compound tested growth no growth A B C D F G H I 1 2 3 4 5 6 7 H G I A D F B C 4 7 3 2 5 6 1 B What are auxotrophic mutants 3 points Mutants that require addition of a supplement to grow on minimal medium 2 You are studying a gene in E coli that specifies a protein A part of its sequence is Phe Tyr Ser Trp Glu Ala Met ThrYou recover a series of mutants for this gene that show no enzymatic activity By isolating the mutant enzyme products you find the following sequences Mutant 1 Phe Asn Ser Trp Glu Ala Met Thr Mutant 2 Phe Tyr Ser Trp Mutant 3 Phe His Cys Leu Pro Ala Val Thr Mutant 4 Phe Tyr Met Leu Gly Ala Met Thr What is the DNA sequence that specifies this part of the protein What is the molecular nature for each mutation 10 points Wildtype TTC TAT TCN TGG GAA GCN ATG ACN C C AGT G C Mutant 1 TTC AAT TCN TGG GAA GCN ATG ACN C C AGT G C Point mutation leads to amino acid substitution Mutant 2 TTC AAT TCN TGG TAA C C AGT C Point mutation leads to stop codon Mutant 3 TTC CAT TGT CTN CCN GCN GTN ACN C C C TTA G Inversion Mutant 4 TTC TAT ATG CTN GGN GCN ATG ACN C C TTA G Insertion single underlined and deletion double underlined Open questions 20 points NOTE If you would run out of space you can also use the back of this page to continue your answer Describe and explain the lac operon and its regulation including catabolite repression LAC OPERON STRUCTURE The lac operon consists of POZYA P O are cis regulatory sequences P promoter O operator ZYA are structural genes lacZ encodes beta galactosidase lacY encodes permease lacA encodes transacetylase Beta galactosidase converts lactose into glucose and …


    Important topics of solutions for NCERT class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance:

    6.1.1 Structure of Polynucleotide Chain

    6.1.2 Packaging of DNA Helix

    6.2 The Search for Genetic Material

    6.2.1 The Genetic Material is DNA

    6.2.2 Properties of Genetic Material (DNA versus RNA)

    6.4.1 The Experimental Proof

    6.4.2 The Machinery and the Enzymes

    6.5.2 Transcription Unit and the Gene

    6.5.3 Types of RNA and the process of Transcription

    6.6.1 Mutations and Genetic Code

    6.6.2 tRNA– the Adapter Molecule

    6.8 Regulation of Gene Expression

    6.9.1 Salient Features of Human Genome

    6.9.2 Applications and Future Challenges

    In CBSE NCERT solutions for class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance, you will also get solutions to the questions based on the human genome project as it was a megaproject that aimed to sequence every base in the human genome. This project has yielded much new information among us. Many new areas and avenues have opened up as a consequence of the project. In NCERT solutions for class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance, you will get an explanation of DNA Fingerprinting. It is a technique to find out variations in individuals of a population at the DNA level. It works on the principle of polymorphism in DNA sequences.

    In solutions for NCERT class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance, you will get solutions to the questions based on two important nucleic acid which is also called as genetic materials for living organisms and these are:

    DNA and RNA are the two types of nucleic acids found in living systems whereas DNA is double-stranded and RNA is single-stranded, DNA acts as the genetic material in most of the organisms and RNA acts as genetic material in some viruses, mostly functions as a messenger. In NCERT solutions for class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance, you will get solutions to the questions on Central dogma which consists of three important things that are:

    After going through solutions for NCERT class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance you will be able to answer all the questions which are given at the end of this chapter.


    MATÉRIAUX ET MÉTHODES

    Preparation of proteins and DNA

    Lac repressor (both wild-type and mutants) was overexpressed in BLIM cells (22) and purified according to Chen and Matthews (23). The DNA construct used in TPM experiments was synthesized by PCR similarly to the method described by Finzi and Gelles (20). Briefly, the pRW490 plasmid (19), containing two primary operators (with sequence 5′-TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAAT-TTCACACAGG-3′) spaced 305 bp apart, was used as template in a PCR (201223, Qiagen, Germany) employing the following primers (MWG-Biotech AG, Germany): 5′-Biotin-AGATCCAGTTCGATGT-3′ 5′-Digoxigenin-ATAGTGGCTCCAAGTAGC-3′.

    The PCR product (purified using 28104, Qiagen, Germany) is a 1302 bp molecule labeled with biotin at one end and with digoxigenin at the other end (see Figure 1 ).

    A flow chamber (with a volume of � μl) was constructed between a microscope slide and a coverslip kept at a distance of � μm by double-sided tape. Strips of silicon grease were deposited on the inner side of the tape to provide lateral sealing and avoid contact of the solution with the tape itself. The microscope slides were previously cleaned in an ultrasonic bath in ethanol for 5 min. The coverslips were cleaned further by a 10 min treatment with reactive ion plasma in a radio-frequency plasma cleaner (PDC-002, Harrick Inc., NY).

    Buffers and sample preparation for TPM

    Unless otherwise specified, all chemicals and reagents were purchased from Sigma𠄺ldrich. The sample was prepared as follows. All steps were performed at room temperature long incubations were conducted in a water-saturated container to avoid evaporation of the sample. A solution containing 20 μg/ml anti-digoxigenin (1333089, Roche, IN) in phosphate-buffered saline (PBS) buffer [2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, 5.4 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2Bon de commande4 (pH 7.4)] was introduced into the flow chamber and incubated for 20 min to insure optimal surface coating. The excess antibody was then removed by washing the chamber 5𠄷 times with 80 μl of LBB buffer [10 mM Tris–HCl (pH 7.4), 200 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 5% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO), 0.2 mM DTT, 0.1 mg/ml α-casein]. The DNA sample (80 μl at a concentration of � ng/ml in LBB buffer: this DNA concentration was chosen to maximize single DNA tethers as described below) was then introduced in the chamber and incubated for 1 h. Unbound DNA was removed by washing with 7 × 50 μl LBB − buffer (LBB lacking DTT and DMSO). Streptavidin-coated polystyrene microspheres (diameter 440 nm, Indicia Biotechnology, France) in LBB − buffer were then introduced in the flow chamber and incubated for 30 min. Unbound microspheres were finally removed with 5 × 50 μl washes of LBB buffer supplemented with Lac repressor at a tetramer concentration of 4, 20 or 100 pM, depending on the experiment. The flow chamber was then sealed with silicon grease to allow prolonged observation at the microscope (each slide could be observed for several hours without detectable loss in activity of LacI).

    Data collection and analysis

    The slide was mounted on an inverted microscope (Eclipse TE300, Nikon, Japan), images of a region of interest containing the microsphere chosen were acquired at a frequency of 25 Hz with a video camera (C3077-71, Hamamatsu, Japan) and digitized with an A/D converter (IMAQ PCI-1408, National Instruments, TX). The software for instrumentation control, data acquisition and data processing was written in Labview (v. 6.0, National Instruments, TX). Microspheres were chosen for recording based on the range of mobility exhibited each microsphere was normally monitored for 𢏁 h.

    The position of the microsphere in the sample plane (x-y plane) was monitored in real-time during the experiment using a centroid algorithm (24,25): each video frame was deinterlaced and calculation of the centroid was performed separately, after background subtraction, on the even and odd lines of the image, to obtain measurements of the bead's position with a frequency of 50 Hz. The average radius of mobility of the microsphere was calculated in real-time and charted, during the experiment, at the desired frequency. Les X et oui coordinates of the microsphere, determined at a frequency of 50 Hz, were also stored for subsequent analysis as described below. Symmetry of the distribution of centroid positions in the x-y plane was used as diagnostic to insure that the microsphere would not be tethered by multiple DNA molecules or be perturbed in its diffusive motion by surface irregularities (25,26). Additionally, the DNA dilution adopted for all experiments had been previously optimized for a relatively high yield of tethered microspheres (density of about 1 tethered microsphere in each microscope field of 34 × 26 μm 2 ) with a negligible probability of multiple DNA molecules bound to the same microsphere.

    At the end of the experiment, data were analyzed as follows. Slow apparatus fluctuations and drift in stage position were removed from the X(t) et oui(t) recordings by filtering the data with a Butterworth high-pass filter (cutoff frequency of 0.1 Hz). From the filtered data, R(t) was then calculated as [ x ( t ) ] 2 + [ y ( t ) ] 2 and a running average 〈R(t)〉 was calculated by filtering the R(t) trace with a Gaussian filter (27). For each microsphere a set of four 〈R(t)〉 traces was calculated using Gaussian filters with cutoff frequencies of 0.133, 0.066, 0.044 and 0.033 Hz, corresponding to standard deviations of the filter's impulse response of 1, 2, 3 and 4 s, respectively. The left panels of Figures 2 and ​ and3 3 show examples of 〈R(t)〉 traces obtained with a filter cutoff frequency of 0.066 Hz.

    Examples of TPM experimental recordings obtained with wild-type LacI. The left panels show time courses of the average radius of microsphere mobility, 〈R(t)〉 (calculated as described in the Materials and Methods section, choosing a Gaussian filter with cutoff frequency of 0.066 Hz) obtained with LacI at a concentration of 100 pM (une), 20 pM (c), and 4 pM (e). The right panels show the distributions of 〈R(t)〉 corresponding to each of the recordings shown on the left. The lines represent the best fit of the sum of two Gaussians (see Materials and Methods) to the histogram. The fitted parameters are shown in the insets.

    Examples of TPM experimental recordings obtained with LacI mutants Q60G and Q60 + 1. The left panels show time courses of the average radius of mobility, 〈R(t)〉 (calculated as in Figure 2 ), obtained with Q60G (une) and Q60 + 1 (c) at a concentration of 100 pM. Histograms (shown on the right) are fitted with two Gaussians as described in Figure 2 .

    Dwell-times were extracted from each 〈R(t)〉 recording using a half-amplitude threshold method (27): the 〈R(t)〉 distribution (the right panels of Figures 2 and ​ and3 3 show some examples) was fitted with a double Gaussian: A 1 exp [ − ( x − x c 1 ) 2 / 2 σ 1 2 ] + A 2 exp [ − ( x − x c 2 ) 2 / 2 σ 2 2 ] . For each recording, the threshold was set half way between the peaks of the two fitted Gaussian curves.

    A first semi-quantitative analysis of dwell-times was elaborated following a method analogous to that described by Finzi and Gelles (20), which is based on the choice of a single filter: the R(t) data were filtered with cutoff frequency of 0.033 Hz, corresponding to a filter dead time (T) of 5.4 s. The transitions giving raise to events shorter than T were ignored (20,28) and the resulting dwell-time distributions were analyzed to produce the durations histograms, reporting only the events with durations longer than 2T (20,27).

    Then, a full characterization of the analysis method was conducted using filters with different cutoff frequencies (0.133, 0.066, 0.044 and 0.033 Hz) as mentioned above. From the measured distributions of dwell-times, the average lifetime of the looped (τLm) and the unlooped (τEuh) states were calculated for each experimental condition studied. In the results section we will show that these measured parameters strongly depend on the choice of filter operated. Thus, we developed a set of mathematical corrections aimed at obtaining, from the TPM measurements, a reliable estimate of the average duration of the looped and unlooped state in the DNA molecule, regardless of the choice of filter and the effects of residual noise in the measurements (see Supplementary Data). For this analysis, dwell-times were measured without imposing any cutoff in duration, since filter's limited time resolution (27) and false events due to noise are taken into account in our analysis method.

    The full description of the derivation of our novel method will be published elsewhere here we provide the mathematical expressions applied to the experimental results presented in this paper for wt-LacI at different concentrations and the Q60G and Q60 + 1 mutants. A description of the corrections used in this work and a demonstration of the validity of this method, based on numerical simulations, is reported in the Supplementary Data.


    Use of Escherichia coli operon-fusion strains for the study of glycerol 3-phosphate transport activity.

    Strains of Escherichia coli K-12 deleted in the native lac operon and bearing both a wild-type glpT operon encoding for sn-glycerol 3-phosphate (G3P) transport and a hybrid operon in which glpT operator and promoter regions are fused to the lacZ gene were constructed. In strains with such a hybrid operon, beta-galactosidase and beta-galactoside permease become inducible by G3P. In these mutants the function and maturation of the glpT-coded proteins should be distinguishable from the level of gene expression, since the beta-galactosidase activity can serve as an index of the latter. With the aid of such mutants, it was shown that: (i) the expressions of the two neighboring operons, glpT and glpA (encoding anaerobic G3P dehydrogenase), are not coordinate (ii) upon induction, the appearance of the cytoplasmic beta-galactosidase activity preceded that of methyl-beta-D-thiogalactoside transport activity (requiring only a cytoplasmic membrane protein) by about 4 min and that of G3P transport activity (requiring both a cytoplasmic membrane protein and a periplasmic protein) by about 9 min and (iii) when cells grown at several temperatures from 24 to 42 degrees C were measured for G3P transport activity at 30 degrees C, the activity increased with the growth temperature, indicating that, within the range studied, the rate of transport increases with the fluidity of membrane phospholipids.


    DISCUSSION

    Due to its versatility and simplicity, the TPM method has been used for the study of a variety of biochemical systems at the single molecule level ( 20 , 24 , 25 , 33 – 36 ). With regard to dynamic measurements, the main limitation of this experimental approach is represented by the low signal-to-noise ratios that can be accomplished. This limitation is mostly determined by the size of the microspheres used, which defines the time necessary for the diffusive motion to explore the volume available for a certain tether length (see Figure 1 ) variations in the length of the tether can be detected on timescales longer than this characteristic diffusion time. This limitation may be overcome and much higher signal-to-noise ratios (or, equivalently, higher temporal resolution in the measurements) may be accomplished substituting much faster diffusing objects (such as quantum dots) for the microspheres thus far used. When implemented using microspheres, however, TPM requires care in the quantitative interpretation of the measured lifetimes. Figure 7 , in fact, demonstrates how filtering of the experimental recordings (needed to obtain a good discrimination between the loop and unloop states) strongly influences the values of the measured lifetimes. We have elaborated a method of analysis of TPM data to overcome these problems and reliably measure the kinetic parameters of Lac repressor-induced loop formation and disruption.

    The formation of the 305 bp long loop in our DNA construct by simultaneous binding of the Lac repressor tetramer to the two operators is associated with a bending energy in the DNA molecule corresponding to about 9.5 kBT ( 37 , 38 ), calculated simplifying the loop geometry to a circle, and with a DNA persistence length of 50 nm ( 39 , 40 ). The spacing between operators in the Lac operon is 92 and 401 bp ( 4 , 5 ), thus the bending energies involved in the formation of these loops can be significant and may play an important role in the kinetics of transcription regulation. The effects of DNA tension and torsion on the kinetics of DNA-binding proteins have recently been explored in a variety of theoretical studies ( 13 – 15 ) and in experimental measurements on Gal repressor ( 41 ).

    Single molecule approaches are providing fundamental information on the mechanical properties of a growing number of enzymatic systems in vitro ( 42 ). The measurement of forces in the pN range has indicated nucleic acid processing enzymes (such as RNA polymerase, DNA polymerase, topoisomerases) as molecular motors ( 43 – 45 ) capable of producing forces even larger than those of ‘classic’ motors, such as myosin ( 46 ) or kinesin ( 47 , 48 ). These forces may be crucial for these enzymes to overcome obstacles, unwind double-stranded structures and move along the DNA template under the conditions of compaction, tension and torsion to which it is subject in vivo . Transcription regulation systems, including the Lac operon, are sensitive to these forces to the extent by which binding and dissociation of the regulatory proteins are influenced by the bending and twisting energetics of the DNA. Measurements based on the use of magnetic tweezers have clearly demonstrated the sensitivity of the GalR system to supercoiling in the DNA target molecule ( 41 ). The persistence length of DNA in vivo is much lower than that measured in vitro ( 6 ), due to the action of accessory proteins. It is presumable that this physical property of DNA can be modulated to some extent by the quantity and quality of accessory proteins expressed in the cell. Thus, a new concept is recently emerging in gene regulation: the physical properties of DNA may play an important role in shaping the dynamics of gene regulation ( 38 , 49 ).

    We have applied the TPM technique, in combination with a new method for data analysis, to the investigation of the effects of flexibility (both in DNA and in the hinge region of the protein) on the kinetics of loop formation and disruption.

    The analysis of the kinetics of loop disruption is simplified by the fact that there is a 1:1 correspondence between the TPM state of lower microsphere mobility and the biochemical ORO state (see Figure 6 ). This correspondence is confirmed by the lack of dependence of τ Lm on LacI concentration ( Figure 4 , left panels Figure 7a , filled symbols). In fact, as an alternative interpretation, one could imagine a fast equilibrium between O-OR and ORO, characterized by rates much faster then the diffusion rate of the microsphere and shifted toward ORO, so to give raise to an apparent TPM loop state concealing fast biochemical reactions. However, if this were the case, one would expect the durations of the observed TPM loop state to depend on the concentration of LacI. In fact, the exit from the fast equilibrium would be determined by a reaction leading the system into a third, long lived, state. The most relevant long lived state in this regard depends on the concentration of LacI, and thus the entire behavior of the system is dependent on this parameter. More precisely, the ratio between the rates from O-OR toward RO-OR and O-O is given by [LacI]/ K , which has a value of about 10, 2 and 0.4 for [LacI] of 100, 20 and 4 pM, respectively. At the two higher concentrations, RO-OR is, thus, prevalent: under these conditions, the rate of transition between O-OR and the other main unloop state scales linearly with [LacI]. Thus, the probability of exiting the above mentioned hypothetical equilibrium would also scale linearly with [LacI]. Since the measured duration of the TPM loop state does not depend on the concentration of LacI over a broad range of concentrations [4, 20 and 100 pM tested in this work, and 100 pM and 1 nM tested by Finzi and Gelles ( 20 )] the hypothesis of the TPM loop state underlying a fast biochemical equilibrium is not likely rather, the exit from this TPM state monitors directly the disruption of the loop in the DNA molecule. Thus, the TPM measurement provides a means for directly monitoring the effect of the loop strain on the kinetics of dissociation, as described in the results by the parameter α. Our findings indicate a weak dependence of the rate of loop disruption on the DNA bending and twisting energy, as demonstrated by the value of α between 1 and 2.

    With regard to the kinetics of loop formation, on the other hand, our measurements indicate that formation of a loop in the DNA molecule by binding of Lac repressor simultaneously to two operators is highly sensitive to the DNA bending energy. Qualitatively, this result is well-expected based both on theoretical considerations and previous ligase-catalyzed circularization experiments however, our results on LacI are somewhat surprising quantitatively. In fact, the values we have obtained for Jm (of the order of 10 −10 M) are significantly lower than those measured by ligase-catalyzed cyclization experiments [>10 −8 M for DNA segments of 300 bp ( 8 )] and calculated from physical models of the DNA molecule ( 11 ). It is fundamental to evaluate the effects of the microsphere on the values measured for Jm by TPM technique. It is expected, in fact, that the presence of the microsphere may slow down the kinetics of loop formation, due to an effective swelling force exerted entropically by the microsphere on the polymer. Below we will discuss results indicating that, in a system like the one we setup for the measurements on LacI, the effect of the microsphere on the measured kinetics of loop formation (and, therefore, on the measured Jm ) should not exceed, at most, a factor of 10.

    In their theoretical work, extensively modeling the physical properties of the TPM system, Segall et al . provide an analytical expression [Equation 12 in Ref. ( 50 )] for the swelling force as a function of DNA contour length, persistence length and microsphere radius. In our experimental system, the swelling force estimated according to this expression is about 30 fN. Segall et al . ( 50 ) conclude that a force of this magnitude due to the presence of the microsphere would decrease the rate of looping by about a factor of 2.

    Further, the TPM recordings of the position distributions of the microsphere in the absence of Lac repressor exhibit interesting non-Gaussian features ( 25 ) which may be exploited to estimate the magnitude of the swelling force. Using numerical simulations of the TPM system [similar to those described by Segall et al . ( 50 )] to fit our data, we have estimated in our system an effective swelling force of 127 ± 14 fN (best estimate ± range for 95.4% confidence see Supplementary Data). Recent theoretical works ( 14 , 51 ) have described the effects of force on Jm : a force in the range between 30 and 140 fN due to the presence of the microsphere would not be expected to decrease Jm by more than a factor of 10.

    Finally, Hsieh et al . ( 19 ) reported an estimate of the equilibrium constant K * for the intramolecular looping reaction: for the pRW490 construct containing the two primary operators at a distance of 305 bp from each other, they reported a value of 16 for K * . In our measurements, the equilibrium constant for the intramolecular looping reaction is given by K ′ = Jmkune / (2 k α). Using the values of Jm and α reported in Table 1 we obtain K ′ between 2.5 and 7. The difference between K * et K ′ is to be attributed to the microsphere, according to the following relationship: − RT ln( K ′) = Δ gtpm = gDNA/LacI + gperle , où gDNA/LacI = − RT ln( K* ) is the free energy of looping in the absence of microsphere and Δ gperle is the positive free energy contribution due to the microsphere opposing an entropic force to the formation of the loop. From these relations, based on the measurement of K ′ reported above, we estimate Δ gperle between 0.8 and 1.8 kBT . If we assume that this energetic barrier affects mostly the rate of formation of the loop, this would lead to a reduction of the looping rate by at most 55–83%, in agreement with what calculated by Segall et al . ( 50 ). Thus, we conclude that, even accounting for an underestimation of Jm by about an order of magnitude in TPM due to the microsphere, Lac repressor looping is characterized by a Jm much (at least 10 times) lower than the ligase-catalyzed circularization of a DNA segment of the same length.

    The shape of a DNA loop can vary over a wide range of geometries determining large variations in the loop energetics and in the resulting Jm values ( 15 , 49 ), with significant deviations from those measured in cyclization experiments. Also, the effect of the protein bridging between the two extremities of the loop significantly influences the calculated values of Jm ( 52 , 53 ).

    The structure of the DNA–LacI complex in the looped configuration has not yet been determined. In addition to the original V-shaped model, proposed by Lewis et al . ( 54 ), an extended conformation of the Lac repressor has been proposed ( 55 ). The rigidity of these conformations and the possibility for the protein to switch between these multiple structural states are fundamental in determining Jm for loop formation. Also, distance and phasing between the operators is a fundamental factor in determining the value of Jm , as already demonstrated for ligase-catalyzed circularization. The TPM method holds promise to allow a systematic characterization of the dependence of LacI regulation of the Lac operon on each of these components, providing in the near future, a complete picture of the orientation effects and of the protein and DNA mechanics involved in the process.

    Our measurements on the mutants of the hinge region Q60G and Q60 + 1 indicate that alterations in the flexibility and geometry of the hinge lead to significant changes in the kinetics measurable with TPM. The association and dissociation rate constants for these mutants have not been measured in standard biochemical assays however, the data shown in Figure 7b clearly demonstrate the large effects of these mutations on the looped lifetimes, with much smaller effects on the unlooped lifetimes. These results lead to the conclusion that the mutations studied cause changes predominantly in the value of the dissociation rate constant. As expected, the mutant characterized by the lower equilibrium dissociation constant (Q60G) displays a longer looped average lifetime, whereas the mutant with the higher K (Q60 + 1) displays a shorter looped average lifetime. However, the sensitivity of the protein to DNA strain is not significantly affected by these mutations. It is likely that a role of this kind may be more appropriate for the tetramerization domain, and for the regions of interaction between monomers in the tetramer, which affect the propensity of the protein to take a V-shape, an open shape or other possible conformations responsible for a different sensitivity to strain in the DNA target.

    In conclusion, with regard to DNA bending, our work indicates that the rate of loop formation by Lac repressor depends more strongly than previously expected on the energetics of bending and twisting of DNA. Therefore, the mechanical and biochemical factors that in vivo modulate these energetics can play a crucial role in the modulation of gene expression regulation at least in the paradigmatic example of the Lac operon. With regard to the protein flexibility, on the other hand, our results show that the hinge flexibility and geometry have a determinant effect especially on the lifetime of the looped state, demonstrating the interplay of the mechanical properties of partners in this classic example of protein–DNA interacting system.

    Future steps aimed at a further characterization of the TPM system will investigate the effect of microspheres of different sizes on TPM measurements. Also, the measurement of looping and unlooping kinetics of different constructs in which the distances and phasing between operators is varied will provide important additional information.


    Voir la vidéo: Les Opérons: La régulation de lexpression chez les procaryotes Biologie Moléculaire (Août 2022).