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Régénération appropriée des colonnes StrepTrap HP pour FPLC

Régénération appropriée des colonnes StrepTrap HP pour FPLC



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Ma question concerne la purification des protéines à l'aide d'un KTA FPLC. Nous avons utilisé des colonnes StrepTrap HP (volume de colonne (CV) de 1 ml) de GE Healthcare Life Sciences pour purifier une protéine à marquage streptococcique. Dans la première approche, cela a plutôt bien fonctionné. Nous avons souhaité réutiliser les colonnes après les avoir régénérées selon le protocole officiel. Les étapes incluses ont toutes été réalisées à un débit de 1 ml/min et avec des solutions filtrées :

  1. 3 CV d'eau distillée
  2. 3 CV 0,5 M NaOH
  3. 3 CV d'eau distillée
  4. 5 CV 20 % EtOH
  5. Stockage des colonnes dans EtOH 20 % à 4°C.
  6. Equilibration des colonnes avec Binding Buffer juste avant la prochaine utilisation.

En adhérant au protocole nous avons rencontré quelques problèmes avec la purification suivante (c'était la même protéine, mais un nouvel échantillon d'extrait cellulaire). La purification fonctionnait moins efficacement et la quantité de protéine purifiée était très faible.

Nous avons essayé un protocole légèrement différent pour la régénération, également à un débit de 1 ml/min et des solutions filtrées.

  1. 5 CV d'eau distillée
  2. 5 CV 20 % EtOH
  3. 3 CV 6 M chlorhydrate de guanidine (sol.)
  4. 5 CV 0,5 M NaOH
  5. 3 CV d'eau distillée
  6. 5 CV 20 % EtOH
  7. Stockage dans 20 % EtOH à 4°C
  8. Équilibrage avec le tampon de liaison avant la prochaine utilisation.

Nous avons choisi le chlorhydrate de guanidine pour dénaturer toutes les protéines restantes de la résine de la colonne et favoriser ainsi la régénération. Mais aussi avec ce protocole nous avons rencontré les mêmes problèmes (faible efficacité de purification).

Je serais très intéressé si l'un d'entre vous a rencontré les mêmes problèmes et a peut-être une solution/un meilleur protocole pour cette étape de régénération.

Merci d'avance pour vos suggestions ! :)


Protocole de détermination de structure pour les oligomères de domaine transmembranaire

Les ancres transmembranaires (TM) des protéines de surface cellulaire ont été l'un des « points aveugles » de la biologie structurelle car elles sont généralement très hydrophobes, parfois dynamiques, et donc des cibles difficiles pour la caractérisation structurelle. Une pléthore d'exemples montre que ces ancres membranaires ne sont pas simplement des ancres mais peuvent se multimériser spécifiquement pour activer les récepteurs de signalisation à la surface cellulaire ou pour stabiliser les protéines d'enveloppe dans les virus. Grâce à une série d'études sur les domaines TM (TMD) des récepteurs immunitaires et des protéines membranaires virales, nous avons établi un protocole robuste pour déterminer les structures de résolution atomique des oligomères TM par RMN dans des bicelles qui imitent étroitement une bicouche lipidique. Notre protocole surmonte les obstacles généralement rencontrés par les techniques de biologie structurelle telles que la cristallographie aux rayons X et la microscopie cryoélectronique (cryo-EM) lors de l'étude de petits TMD. Ici, nous fournissons les détails du protocole, couvrant cinq aspects techniques majeurs: (i) une méthode générale de production de fragments de protéines TM ou membranaires proximaux (MP) marqués isotopiquement qui implique l'expression de la protéine (qui est fusionnée à TrpLE) dans corps d'inclusion et libération de la protéine cible par clivage au bromure de cyanogène (CNBr) (ii) détermination de l'état oligomérique des TMD dans les bicelles (iii) détection des contacts intermoléculaires à l'aide d'expériences d'effet nucléaire Overhauser (NOE) (iv) détermination de la structure et (v) titrage par sonde paramagnétique (PPT) pour caractériser la partition membranaire des oligomères TM. Ce protocole est largement applicable pour combler les lacunes structurelles de nombreuses protéines membranaires de type I/II. Les procédures peuvent prendre de 3 à 6 mois, selon la complexité et la stabilité de l'échantillon de protéine.


Fond

Les protéines R-Spondin (roof plate-specific Spondin) constituent une famille de protéines sécrétées, connues pour leur rôle important dans la prolifération, la différenciation et la mort cellulaire, en induisant la voie Wnt [1, 2]. Les RSPO sont exprimées dans plusieurs tissus embryonnaires et chez l'adulte, des niveaux d'expression adéquats étant essentiels pour le développement de l'organisme et le maintien de l'homéostasie [3, 4]. Plusieurs études ont démontré l'importance des RSPO dans la régulation de plusieurs processus spécifiques aux tissus, tels que la formation osseuse, le développement du tissu musculaire squelettique, la prolifération des cellules β pancréatiques et des cellules souches intestinales et même le cancer, comme examiné par Yoon et Lee [5]. Cependant, un fonctionnement inapproprié de ces protéines peut conduire à diverses pathologies [revues par [5, 6], telles que : inversion du phénotype sexuel, hyperkératose et prédisposition au carcinome épidermoïde de la peau [7, 8], anomalies et problèmes craniofaciaux dans la formation des membres, des poumons et des follicules pileux [9,10,11,12], dans la formation du placenta [13, 14] et dans le développement des ongles (Anonychia) [15,16,17,18]. Par conséquent, il devient évident que les RSPO présentent un grand potentiel thérapeutique pour le traitement d'un certain nombre de maladies.

Quatre protéines RSPO (RSPO1 à 4) ont été décrites, qui présentent toutes des domaines caractéristiques qui sont conservés chez les vertébrés, tels que : (1) un domaine de répétition de la thrombospondine 1 (TSR), (2) un domaine de type furine riche en cystéine ( CR-FU), (3) un domaine basique riche en acides aminés (BR) de longueur variable (région carboxy-terminale), et (4) une séquence de peptide signal hydrophile (SP) [5]. Le peptide signal présent au niveau de la région amino-terminale de la protéine assure son entrée dans la voie sécrétoire canonique, s'adressant au réticulum endoplasmique, transitant par le complexe de l'appareil de Golgi et sa sécrétion vers l'espace extracellulaire [4, 19]. Le domaine RSPO CR-FU, à son tour, est identifié comme étant responsable de la médiation de l'activation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine [4, 19, 20, 21], bien que d'autres études suggèrent également que ce domaine pourrait être impliqué dans la régulation de la sécrétion de ces protéines [21]. D'autre part, les domaines BR et TSR ont été proposés comme étant responsables de la régulation de l'intensité de l'action des RSPO dans l'induction canonique de la voie Wnt [20]. De plus, les domaines TSR et BR semblent toujours être responsables de l'association des RSPO à la matrice extracellulaire (ECM), en se liant aux glycosaminoglycanes (GAG) et aux protéoglycanes [4, 19, 22, 23, 24] [revu par [ 6]].

Actuellement, il est connu que les protéines RSPO sont capables d'induire les voies Wnt canoniques (bêta-caténine-dépendantes) et non canoniques (bêta-caténine-indépendantes) [revue par [5, 6]]. Cependant, bien que plusieurs études sur les mécanismes d'action des RSPO soient disponibles, de nombreuses questions demeurent sur leurs récepteurs et les mécanismes impliqués dans la transduction du signal par ces protéines. Des études ont révélé que les RSPO se lient aux répétitions riches en leucine contenant les récepteurs couplés aux protéines G 4–6 (Lgr4–6) [25,26,27] pour induire la voie de signalisation canonique Wnt/bêta-caténine, mais d'autres études indiquent également que ces protéines sont capables de se lier aux protéines liées aux récepteurs des lipoprotéines de basse densité 5-6 (Lrp5-6) [4, 19, 21, 28] et Kremen1 (KRM1) [29]. Il est également connu que les RSPO agissent en inhibant la protéine Zinc and Ring Finger 3 (ZNRF3) [30] et en se liant à Frizzled 8 (Fzd8) pour induire la voie Wnt [19], bien que, apparemment, les RSPO ne se lient que faiblement au FZD. récepteurs [21, 28]. Cependant, une partie de cette controverse concernant les récepteurs RSPO peut s'expliquer par des études suggérant une action synergique de ces protéines avec les ligands Wnt [4, 31]. De plus, dans un travail récent, la non-équivalence des protéines WNT et des RSPO vis-à-vis de l'induction de l'auto-renouvellement dans les cellules souches intestinales LGR5+ a été observée, mais une coopération entre ces protéines a été mise en évidence [32]. Contrairement à la voie canonique Wnt, la voie β-caténine indépendante semble avoir un statut moins contradictoire dans la littérature, bien qu'elle soit moins explorée et présente encore plusieurs lacunes. Récemment, les syndécans se sont avérés être de nouveaux récepteurs RSPO dans la voie Wnt [24], mais des études ont montré que seules les protéines RSPO2 et RSPO3 se lient aux syndécans.

RSPO1 se distingue des molécules RSPO par son potentiel d'utilisation thérapeutique, notamment dans le domaine de la médecine régénérative, en raison de son activité mitogène dans les cellules souches. Ce potentiel a été confirmé par plusieurs études qui ont montré l'utilisation de RSPO1 dans plusieurs modèles animaux pour le traitement de : la mucite intestinale induite par chimiothérapie [33] ou radiothérapie [34], les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) telles que la rectocolite hémorragique (CU) et la maladie de Crohn (MC), dans laquelle la réponse inflammatoire conduit à la mort continue des cellules épithéliales intestinales [31, 35] et le diabète sucré (DM), en tant qu'agent cytoprotecteur et prolifératif des cellules β, en régulant la voie canonique Wnt [36 , 37]. De plus, d'autres études suggèrent son utilisation dans les maladies articulaires telles que l'arthrite [38] et dans le cancer, agissant peut-être comme un gène suppresseur de tumeur dans la leucémie lymphoïde [38, 39].

La protéine RSPO1, produite et étudiée ici, est composée de 263 résidus d'acides aminés disposés en une seule chaîne polypeptidique de 28 959 Da. Selon la base de données Universal Protein Resource (UniProt), RSPO1 est codé à partir du RSPO1 gène, situé sur le chromosome 1, position 38 076 951 à 38 100 595, présentant quatre isoformes, qui résultent de l'épissage alternatif des exons. L'analyse in silico de la protéine RSPO1 a démontré une structure tridimensionnelle riche en structures secondaires de feuille β, dépourvue d'hélice alpha. Des études récentes ont démontré la présence d'une N-glycosylation au niveau de l'asparagine Asn137 de la chaîne polypeptidique, qui est liée à la sécrétion, l'activité et la stabilité de RSPO1 [40, 41], bien que les deux articles mentionnés ci-dessus présentent des résultats contradictoires sur l'effet de la N-glycosylation. sur l'activité biologique de la protéine RSPO1.

Ici, la RSPO1 humaine recombinante a été générée en utilisant une lignée cellulaire humaine, à savoir : des cellules HEK293 (Human Embryonic Kidney). Les cellules de mammifères ont été utilisées pour la production de plusieurs protéines recombinantes, notamment en raison de leur capacité à effectuer des modifications post-traductionnelles, essentielles au maintien de la structure et de la fonction des protéines. Parmi les modifications post-traductionnelles, la glycosylation mérite une attention particulière dans la production de protéines recombinantes dans des systèmes hétérologues, car ces modifications peuvent interférer avec le repliement, l'activité, la stabilité et la maturation des protéines, selon le système d'expression utilisé [42]. Dans ce contexte, en raison de sa capacité à générer des schémas de glycosylation complexes, notamment avec l'ajout d'acides sialiques, la lignée cellulaire HEK293 a été largement utilisée pour la production de protéines recombinantes, étant la lignée cellulaire humaine la plus souvent utilisée dans la production de produits biopharmaceutiques. approuvé par les organismes de réglementation, tels que la FDA (Food and Drug Administration) [43, 44].

L'objectif de cette étude était de générer une plateforme d'expression stable pour la production de rhRSPO1 dans des cellules humaines afin d'obtenir un produit protéique purifié, caractérisé et biologiquement actif. À l'avenir, cette plate-forme pourrait être optimisée pour la production de rhRSPO1 de manière efficace et reproductible pour être utilisée en thérapie cellulaire. En plus de la génération de clones cellulaires surproducteurs de rhRSPO1, un nouveau protocole de purification de rhRSPO1 a été établi, produisant un produit protéique de haute pureté.


Résultats et discussion

Il y a deux aspects distincts de la procédure présentée ici. Tout d'abord, plusieurs composants du mélange d'expression ont été individuellement criblés pour une formation optimisée de liaisons disulfure natives. Deuxièmement, il est montré que ces conditions de solution optimisées peuvent être combinées avec GB1 (le domaine B1 de la protéine G de Streptocoque sp.) fusion pour une expression améliorée [ [21] ]. Le succès de cette combinaison est lié à des détails subtils dans la préparation du mélange réactionnel.

Activité de synthèse de protéines acellulaires dans des conditions oxydantes

La machinerie de traduction dans le système d'expression de départ pour ce projet [ [21] ] a été dérivée de l'environnement réducteur du E. coli cytoplasme. Nous avons donc d'abord déterminé les rendements de synthèse protéique dans ce système dans des conditions de plus en plus oxydantes. L'expression à petite échelle de la protéine membranaire OmpX, qui est exclusivement produite dans la fraction insoluble, a été réalisée dans des mélanges réactionnels supplémentés avec des ratios variables de glutathion réduit (GSH) et de GSSG (Fig. 1). L'analyse SDS/PAGE du produit d'expression insoluble a indiqué que la synthèse protéique intrinsèque n'est pas inhibée par l'ajout de jusqu'à 10 mm de GSSG, même en l'absence de GSH (Fig. 1). À un niveau de 20 m m de GSSG, la production d'OmpX a diminué de manière significative, et à 30 m m de GSSG, le système acellulaire n'a plus produit de synthèse mesurable d'OmpX. Ces résultats peuvent être justifiés par l'observation que les composants protéiques du système acellulaire ont précipité à des concentrations de GSSG supérieures à 10 m m , et ainsi ils ont pu être détectés dans la fraction protéique insoluble. L'ajout de jusqu'à 20 m m de GSH en l'absence de GSSG n'a pas affecté de manière mesurable l'efficacité de la traduction.

Impact des conditions redox sur l'activité traductionnelle du E. coli basé sur un système d'expression sans cellule [ [21] ] qui a été utilisé comme point de départ pour la présente étude. L'expression acellulaire de la protéine de test OmpX dans pIVEX2.4 a été réalisée pendant 2 h à 30 °C en présence des rapports indiqués de GSH et GSSG. Après la réaction, la fraction protéique insoluble contenant OmpX a été collectée et analysée par SDS/PAGE. Chaque piste correspond à 3,5 L de mélange réactionnel. N indique la réaction de contrôle négatif sans ADN matrice.

Ajustement précis des conditions redox pour la formation de liaisons disulfure dans le système acellulaire

Pour déterminer les conditions d'oxydoréduction appropriées qui favorisent la formation de liaisons disulfure et le repliement natif sans sacrifier l'efficacité de la traduction, nous avons étudié la production soluble de hDpl(24-152)-pIVEX2.4 dans des milieux réactionnels acellulaires complétés par divers rapports de GSH et de GSSG. L'analyse par transfert Western du surnageant de la réaction a révélé que l'expression soluble la plus élevée de hDpl(24-152) a été obtenue en présence de 2 m m de GSH et de 5 à 10 m m de GSSG (Fig. 2A). Étant donné que le mélange réactionnel contient également 2,1 mm de dithiothréitol (DTT), 2,1 mm de β-mercaptoéthanol (2-ME) et 1,5 mm de cystéine (tableau 1), une expression soluble élevée a ainsi été obtenue en présence d'environ 10 mm de groupes sulfhydryle libres et de 5 –10 mm GSSG.

Influence des potentiels d'oxydoréduction variables et des concentrations d'isomérase des liaisons disulfure sur l'expression acellulaire de trois protéines cibles contenant des liaisons disulfure. Sont présentées des analyses par western blot (A, B, C) et SDS/PAGE (D) des protéines solubles obtenues après expression acellulaire pendant 2,5 h à 30 °C en utilisant soit le pIVEX2.4 (A, B, D) ou le vecteur pCFX1 (C). Pour chaque piste en (A), (C) et (D), le volume d'échantillon appliqué correspond à 2,5 L de mélange réactionnel, et en (B) à 1,5 L. (A) Niveaux d'expression soluble de hDpl(24-152) à divers potentiels redox obtenus en mélangeant différents rapports de GSH et de GSSG. (B) Des mélanges réactionnels pour l'expression de hDpl(24-152) qui contenaient 2 m m de GSH et 5 m m de GSSG ont été complétés par des concentrations croissantes des isomérases de liaison disulfure DsbC ou PDI. (C) Expression sans cellule soluble de GB1-mDpl(24-155) à des niveaux variables du potentiel redox et de la concentration en DsbC. (D) Effets des potentiels d'oxydoréduction variables et des concentrations de DsbC sur la production soluble de mIL22 (34-179). Les flèches indiquent les bandes correspondant à la protéine cible, et N identifie la voie de la réaction de contrôle négatif sans plasmide matrice.

Composant Concentration
KOAc 217 m m
Phosphate de créatine 80 m m
HEPES-KOH 58 m m
Mg(OAc)2 11 m m
NaN3 3,8 m m
PEG-8000 3,25 % (p/v)
2-moi 2,1 m m
TNT 2,1 m m
ATP 1,2 m m
GTP 0,86 m m
CTP 0,86 m m
UTP 0,86 m m
AMPc·Na + 0,64 m m
Acide folinique·Ca 2+ 68 m
E. coli ARNt 175 μg·mL -1
Créatine kinase 5,8 m
Plasmide cible 10 g·mL -1
ARN polymérase T7 65 nm
Acides aminés (chacun) 1,5 m m
Extrait cellulaire S30 30% (v/v)

Compléter le système d'expression acellulaire avec des catalyseurs de liaison disulfure

La comparaison SDS/PAGE des rendements solubles et insolubles de hDpl(24–152) a révélé que seulement 5 % environ (8 g·mL −1 ) de la hDpl totale produite (160 g·mL −1 ) étaient obtenus sous forme soluble à les conditions d'oxydoréduction optimales susmentionnées. Dans une tentative d'augmenter la production soluble de hDpl(24-152), le mélange réactionnel avec des conditions redox fixées à 2 mm GSH et 5 mm GSSG a été complété par diverses concentrations de thiol : disulfure interchange protein DsbC (DsbC) et protéine disulfure isomérase ( PDI). L'analyse Western blot a montré qu'un supplément de 10 m de DsbC ou de PDI augmentait significativement la production soluble de hDpl(24-152) (Fig. 2B). Ainsi, plus de 50 % (80 g.mL -1 ) du hDpl(24-152) synthétisé a été obtenu sous forme soluble. Les conditions ainsi établies pour une expression optimale de hDpl(24-152) pourraient être reportées sur GB1-mDpl(24-155) (Fig. 2C).

Pour mIL22(34-179), l'analyse SDS/PAGE a indiqué qu'en l'absence de catalyseurs de liaison disulfure enzymatique, la production maximale de protéine soluble a été atteinte après l'ajout de 2 m m GSH et 5-10 m m GSSG. L'ajout de 5 μ m de DsbC a encore augmenté la production de la protéine soluble ∼ 2,5 fois (Fig. 2D), et plus de 80 % (0,2 mg·mL −1 ) du total synthétisé mIL22(34-179) (0,25 mg· mL -1 ) a été obtenu sous forme soluble. Étant donné que les rendements solubles maximaux ont été obtenus avec 5 μ m de DsbC, il y a une indication que l'arrangement natif des liaisons disulfure est plus facilement obtenu pour mIL22(34-179) que pour hDpl(24-152) ou pour mDpl(24-155) .

Il a déjà été démontré que la liaison disulfure oxydase thiol : protéine d'échange disulfure DsbA (DsbA) améliore le repliement natif des protéines in vitro en améliorant la formation de liaisons disulfure pendant le processus de pliage [ [25] ]. Nous avons donc également étudié les effets de l'ajout jusqu'à 25 m de DsbA, préparé comme décrit dans le Doc. S3, en un mélange réactionnel qui contenait également 2 m m de GSH, 5 m m de GSSG et 10 m de DsbC. Dans ces conditions, l'ajout de DsbA n'a pas augmenté le rendement soluble de hDpl(24-152). De même, l'ajout de DsbA en l'absence de DsbC n'a pas amélioré l'expression soluble, et nous n'avons pas poursuivi l'expérimentation avec DsbA. Dans l'ensemble, à la fois la DsbC procaryote et la PDI eucaryote ont favorisé l'expression de la protéine cible soluble, indiquant qu'elles peuvent être utilisées de manière interchangeable dans le présent système d'expression.

Expression sans cellules avec l'extrait cellulaire S30 de E. coli Cellules origami (DE3)

E. coli souches contenant des mutations dans les gènes codant pour la thiorédoxine réductase (trxB) et la glutathion réductase (gor) ont montré qu'ils produisaient une formation accrue de liaisons disulfure dans le cytoplasme bactérien [ [26] ]. Pour étudier le potentiel d'extraits de ces souches pour la production acellulaire de protéines contenant des liaisons disulfure avec le protocole optimisé pour BL21 (DE3) RIPL-Star, nous avons préparé l'extrait S30 du E. coli Souche Origami (DE3) (Novagen, Darmstadt, Allemagne). Nous avons ensuite comparé la production acellulaire de mIL22(34-179) à l'aide d'extraits S30 préparés à partir de E. coli Origami (DE3) ou E. coli Cellules BL21 (DE3) RIPL-Star, qui ont été complétées avec divers ratios de GSH et GSSG. L'analyse par SDS/PAGE a indiqué des niveaux d'expression très faibles de mIL22 (34-179) dans les réactions avec l'extrait S30 de cellules Origami, et nous n'avons pas étudié plus avant cet extrait.

Fusion GB1 N-terminale pour des rendements d'expression accrus

Nous avons récemment montré que les constructions de fusion N-terminales avec le domaine GB1 ont augmenté les rendements d'expression acellulaire des protéines humaines [ [21] ]. Ici, nous explorons l'utilisation de la fusion GB1 avec les systèmes acellulaires susmentionnés qui ont été optimisés pour les protéines contenant des disulfures. Dans l'ensemble, la fusion GB1 des protéines cibles s'est donc avérée n'affecter ni le rapport GSH/GSSG optimal ni la concentration optimale d'isomérase de liaison disulfure requise pour le repliement natif. Ainsi, 10 mL de réactions acellulaires de hDpl(24-152) avec (pCFX1) ou sans (pIVEX2.4) fusion avec le domaine de solubilité GB1 ont été réalisées dans des conditions optimales pour la formation de ponts disulfures, c'est-à-dire avec 2 mm de GSH, 5 mm GSSG et 10 m DsbC. Après purification, l'absorption UV à 280 nm a indiqué des rendements de 4,2 mg de hDpl soluble (24-152) de pCFX1 et de 0,8 mg de pIVEX2.4. L'augmentation de 5 fois pour la construction de fusion avec le domaine GB1 est probablement due à la fois à une production totale accrue de la protéine par une efficacité de traduction améliorée [ [21] ] et une solubilité accrue [ [27] ]. SDS/PAGE a montré que le rendement de 4,2 mg correspond à 75 % de l'expression totale de hDpl(24-152) (5,6 mg), contre ∼ 2 % de la protéine synthétisée totale en l'absence d'additifs formant disulfure.

Dans d'autres essais, des réactions de 10 ml de mIL22(34-179) dans pIVEX2.4 ou pCFX3 ont été effectuées en utilisant des [u-15 N]-acides aminés dans des conditions optimales pour mIL22(34-179), c'est-à-dire avec l'ajout de 2 mm GSH, 10 mm GSSG et 5 μ m DsbC. Nous avons obtenu 2,0 mg de mIL22 (34-179) à partir de l'expression dans pIVEX2.4 et 6,6 mg à partir de l'expression dans pCFX3, où SDS/PAGE a indiqué que plus de 90 % (6,6 mg) du total produit la construction de fusion N-terminale avec le Le domaine GB1 (7,3 mg) était soluble. En l'absence d'additifs favorisant le disulfure, seulement ∼ 5 % de la protéine de fusion GB1-mIL22 exprimée était soluble. Enfin, une réaction sans cellules de 10 ml utilisant des acides aminés marqués [u-15 N] dans pCFX1 avec addition de 2 m m de GSH, 5 mm de GSSG et 10 m de DsbC a donné 3,0 mg de mDpl purifié (24-155), correspondant à ∼ 50 % de la protéine totale exprimée (6 mg). Le rendement inférieur en protéine soluble, par rapport à hDpl(24-152), semble refléter une difficulté accrue à produire la protéine de souris, comme cela a été observé précédemment avec l'expression dans E. coli cultures cellulaires [ [23, 24] ]. Le rendement en protéine de fusion GB1-mDpl soluble sans additifs favorisant le disulfure était ∼ 2 % de la protéine synthétisée totale.

Validation structurelle des protéines contenant des disulfures à partir de la production acellulaire et conclusions

La teneur en sulfhydryle libre des trois protéines étudiées ici a été déterminée avec le test d'Ellman dans des conditions dénaturantes, comme décrit dans la section Matériels et méthodes. Il n'y avait aucune preuve d'une teneur en sulfhydryle libre mesurable, ce qui implique que les liaisons disulfure s'étaient formées avec succès.

Pour obtenir la preuve que les protéines produites par l'expression acellulaire étaient repliées de manière native, nous avons enregistré des spectres RMN de cohérence quantique unique (HSQC) hétéronucléaire 2D [15 N, 1 H]. Pour les hDpl(24-152) et mDpl(25-155) produits sans cellules, la comparaison avec les attributions de résonance amide du squelette disponibles [ [23, 24] ] a indiqué que le pli natif était obtenu (Fig. 3). Cela inclut que hDpl(24-152) exprimé soit libre soit sous forme de construction de fusion avec le domaine GB1 a adopté le pli natif (Fig. 3A,B). Les spectres contiennent également des signaux RMN provenant des étiquettes de purification et de solubilité N-terminales.

Spectres 2D [ 15 N, 1 H]-HSQC de hDpl(24–152) et mDpl(24–155) préparés par expression acellulaire avec 15 acides aminés marqués N dans des mélanges réactionnels contenant 2 mm de GSH, 7,5 mm de GSSG et 10 µm DsbC. (A) 200 μ m [u-15 N]-hDpl(24-152) produit à partir de deux réactions de 10 ml utilisant le vecteur pIVEX2.4. (B) 275 m [u-15 N]-GB1-hDpl(24-152) préparé à partir d'une réaction sans cellules de 10 ml en utilisant le vecteur pCFX1. Les signaux supplémentaires provenant du domaine GB1 [ [27] ] peuvent être facilement reconnus. (C) 140 m [u-15 N]-mDpl(24-155) après clivage de la thrombine pour éliminer le domaine de solubilité GB1 N-terminal. La protéine a été synthétisée dans une réaction sans cellule en mode batch de 10 ml en utilisant le vecteur pCFX1. Tous les échantillons contenaient 20 m m d'acétate de sodium à pH 5,2, 100 m d'EDTA, 10 m d'azoture de sodium et 5 % de D2O. Les spectres ont été enregistrés à une fréquence de résonance 1 H de 750 MHz avec T = 20 °C. Les croix rouges en (A) et (B) montrent les positions de pic publiées pour hDpl(24-152) (BMRB 5145), et celles en (C) les positions de pic pour mDpl(26-157) (BMRB 4938).

Il a été démontré que l'interleukine-22 humaine forme des dimères en solution même à des concentrations micromolaires [ [28] ]. Il semble que mIL22 (34-179) soit également dimère en solution, car le spectre 2D [ 15 N, 1 H]-HSQC contient un nombre de signaux inférieur à celui attendu du nombre de groupes amide dans la protéine, la plupart des résidus étant représentés par des pics faibles (Fig. 4A). On peut néanmoins reconnaître que le spectre RMN correspond à une protéine globulaire repliée. Pour la protéine dénaturée dans l'urée, le spectre 2D [ 15 N, 1 H]-HSQC contenait un certain nombre de résonances amides qui, dans la précision du nombre de pics, correspondaient étroitement au nombre attendu de la structure primaire (Fig. 4B) . Le mIL22 (34-179) produit sans cellules a montré un spectre CD dans les UV lointains typique d'une protéine avec une teneur élevée en structure secondaire hélicoïdale (Fig. 5), et l'activité biologique de la protéine produite a été vérifiée à l'aide d'IL-22- souris déficientes dans le laboratoire de B. Becher [ [29] ].

Spectres 2D [ 15 N, 1 H]-HSQC pour (A) natif et (B) déplié à l'urée [u-15 N]-mIL22(34-179) exprimé avec le vecteur pIVEX2.4 dans un tube de 10 mL sans cellule mélange réactionnel additionné de 2 mm de GSH, 10 mm de GSSG et 5 µm de DsbC. En (B), la protéine a été dénaturée dans 8 m d'urée et 10 m m de DTT. Les spectres ont été enregistrés à une fréquence de résonance 1H de 750 MHz et à T = 37°C.

Spectre CD UV lointain à 20 °C de mIL22(34-179) produit par synthèse acellulaire. L'échantillon contenait 15 μ m de mIL22 (34–179), 3 m m de phosphate de sodium à pH 7,0, 34 m m de chlorure de sodium et 1,1 m m de chlorure de potassium.

Dans l'ensemble, la documentation actuelle du repliement natif des protéines eucaryotes contenant des disulfures produites en milligrammes dans un système acellulaire valide le protocole d'expression acellulaire utilisé, qui comprenait l'ajustement d'un potentiel redox approprié en ajoutant de petites concentrations de GSH et de GSSG à Extrait cellulaire S30 de la E. coli BL21 (DE3) RIPL-Star et en complétant ce mélange avec une isomérase de liaison disulfure pour faciliter l'arrangement correct des liaisons disulfure. Il convient de noter que les meilleurs résultats ont été obtenus en présence de groupes sulfhydryle de 10 mm et de GSSG de 5 à 10 mm, ce qui correspond étroitement aux conditions redox dans le réticulum endoplasmique [ [30] ], où des liaisons disulfure sont généralement formées [ [ 2] ]. L'observation renouvelée de l'expression soluble significativement augmentée des constructions de fusion N-terminales de la protéine cible avec le domaine GB1 [ [21] ] indique que cette approche pourrait être assez largement applicable pour obtenir des rendements accrus dans l'expression acellulaire. Concernant l'utilisation de ce système d'expression en biologie structurale, il est intéressant que la régénération énergétique soit basée sur la créatine phosphate, qui n'active pas les voies métaboliques dans l'extrait cellulaire et permet donc la production de protéines marquées par des isotopes stables. Il évite en outre la réduction de GSSG pendant la réaction acellulaire et élimine ainsi la nécessité d'un prétraitement chimique de l'extrait S30. Ces résultats distinguent notre système d'expression des systèmes acellulaires décrits précédemment. Ceux-ci ont soit fourni des rendements de < 50 μg de protéine native par millilitre de mélange réactionnel [ [9-11, 14] ] ou étaient basés sur une régénération d'énergie avec du phosphoénolpyruvate [ [14, 16, 17] ], ce qui est incompatible avec le marquage des isotopes stables. et nécessite un prétraitement chimique de l'extrait cellulaire pour stabiliser le potentiel redox [ [14-16] ].


Discussion

L'étude systématique de la fonction à travers les familles d'enzymes n'a été tentée que récemment et n'a pas été appliquée auparavant à un échantillon représentatif d'une superfamille entière à cette échelle. Une petite famille d'enzymes non caractérisée, DUF849, a été étudiée par Bastard et al. (3) en utilisant une stratégie intégrée d'évaluation de la diversité fonctionnelle. Sur la base du criblage d'un ensemble d'enzymes représentatives (124 sur 900) contre 17 substrats putatifs, cette étude a révélé que la famille catalyse généralement la condensation d'un acide -céto avec de l'acétyl-CoA produisant de l'acétoacétate et de l'ester de CoA. Une promiscuité catalytique généralisée a été décrite dans la superfamille des métallo-β-lactamases à travers les analyses de 24 enzymes contre 10 réactions hydrolytiques catalytiquement distinctes où les enzymes ont catalysé en moyenne 1,5 réactions en plus de leur activité native (38). Dans une étude orthogonale, le criblage des 23 membres solubles de l'HADSF au sein d'une même espèce (E. coli) a été réalisée avec un ensemble de 80 substrats phosphorylés disponibles dans le commerce (4). Les résultats ont annoté le E. coli enzymes et a démontré que les membres de l'HADSF possèdent la capacité d'hydrolyser une large gamme de composés phosphorylés, 19 des 29 enzymes testées présentant une large gamme de substrats.

Nos résultats démontrent, à travers un échantillonnage représentatif d'organismes procaryotes dans le HADSF, que le degré d'ambiguïté du substrat est grand et omniprésent. Cela conduit à la question suivante : comment la présence d'enzymes avec une large gamme de substrats peut-elle contribuer à l'aptitude d'organismes individuels et à des communautés microbiennes complexes ? L'accumulation de métabolites peut perturber le flux métabolique ou les métabolites eux-mêmes peuvent s'avérer toxiques pour les organismes (39). Un large chevauchement de substrats entre les membres de l'HADSF peut fournir une protection contre de tels effets métaboliques délétères. Le chevauchement des fonctions peut servir à fournir un renouvellement suffisant (sans optimiser l'efficacité d'une enzyme en particulier) pour métaboliser de grands pools de substrats similaires. Le chevauchement des substrats peut également aider à l'évolution d'une nouvelle fonction métabolique en réponse aux défis environnementaux. La promiscuité augmente la flexibilité au cours de l'évolution en réponse aux changements dans le pool de substrats. Au cours de l'évolution, s'il y a une variation dans le pool de substrats, il est plus facile pour les mutations de modifier le spectre de spécificité de substrat des enzymes larges et chevauchantes, c'est-à-dire la divergence avant la duplication des gènes (40, 41).

La découverte que les membres HADSF avec une insertion de coiffe minimale ou nulle (type C0) sont plus spécifiques que ceux avec des insertions de domaine (types C1, C2A ou C2B, Fig. 4 B et C) est surprenant car le domaine cap fournit les déterminants de spécificité dans le HADSF (10). On pourrait s'attendre à ce que dans les membres CO, il y ait peu de résidus enzymatiques qui interagissent avec le groupe partant du substrat et donc le groupe partant pourrait varier en taille, en forme et en surface électrostatique, produisant une enzyme avec une large spécificité. Cependant, un modèle alternatif explique l'observation faite ici. La structure du groupe laissant le substrat peut être limitée par la nécessité d'agir comme une barrière entre le solvant en vrac et le cofacteur Mg 2+ du site actif, l'Asp nucléophile et l'acide/base général Asp, remplaçant le domaine cap dans ce rôle. En effet, les structures des membres C0 HADSF Scp-1 (35) et GmhB (42) montrent que l'ajustement entre l'enzyme et le substrat ne permet pas à une sonde de la taille de l'eau d'entrer dans le site actif (voir Annexe SI, fig. S22). Inversement, dans les enzymes avec des domaines cap, il y a un site actif fermé et un certain nombre de résidus enzymatiques de la ou des boucles de spécificité cap sont disponibles pour effectuer des interactions avec différents substrats, permettant l'évolution de l'activité contre plusieurs substrats. De plus, la mobilité du domaine cap par rapport au domaine coeur peut permettre l'accès à différents substrats de taille variable.

The concept that domain insertions provide the raw material for the evolution of specificity determinants (including the residues that allow substrate ambiguity) is supported by recent findings. The directed evolution and bioinformatics analysis of a lactamase supports the model that enzymes are more capable of catalyzing multiple reactions when the active site is composed of loops juxtaposed to, but separate from, the core scaffold (43). Domain insertion can be considered an extreme example of this observation. The facilitation of substrate ambiguity via domain insertion can be a widespread phenomenon in protein evolution, because it has been estimated that ∼10% of insertion events are domain insertions (44). Overall, our findings are consistent with the concept that domain insertions act to drive the evolution of new functions. The widespread substrate ambiguity in the C1- and C2-type HADSF members observed herein may be a vestige of the evolutionary process. Previous work has shown that in the process of in vitro evolution selection pressure toward increasing one activity results in “generalists” that show multiple activities that were not selected for (45).


Matériaux et méthodes

Plants, growth conditions and sampling

The work was carried out using Arabidopsis thaliana L. (Heynh) (ecotypes Leuh, Col-O and Ws-2), the NASC <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"N92274","term_id":"1264583","term_text":"N92274">> N92274 (pgi1𠄳), les pgi1𠄲 mutant [28], the aps1::T-DNA mutant (SALK_040155) [31], the pgm::T-DNA mutant (GABI_094D07), the gpt2::T-DNA mutant (GABI_454H06), pgi1𠄳 plants expressing either PGI1 ou PGI1*, les pgi1𠄳/gpt2 et pgi1𠄲/gpt2 double mutants and the pgi1𠄲/sex1 et pgi1𠄳/sex1 doubles mutants. Les pgi1𠄲/sex1 et pgi1𠄲/gpt2 double mutants were confirmed by PCR using the oligonucleotide primers listed in S1 Table. Les 35S-PGI1 et 35S-PGI1* plasmid constructs utilized to produce PGI1 ou PGI1* exprimer pgi1𠄳 plants were produced as illustrated in S7 Fig. pgi1𠄳 plants expressing GBSS-GFP were produced using the 35S-GBSS-GFP plasmid construct [105] whereas pgi1𠄲 plants expressing GBSS-GFP were produced using the 35S-GBSS-GFP* plasmid construct produced as illustrated in S8 Fig. The plasmid constructs were transferred to Agrobacterium tumefaciens EHA105 cells by electroporation and utilized to transform Arabidopsis plants according to [106]. Transgenic plants were selected on the appropriate antibiotic-containing selection medium.

Unless otherwise indicated plants were cultured in soil in growth chambers under the indicated photoperiodic conditions (light intensity of 90 μmol photons sec -1 m -2 ) and at a constant temperature of 22ଌ. Harvested source leaves were immediately freeze-clamped and ground to a fine powder in liquid nitrogen with a pestle and mortar.

To analyze the effects of exogenously applied CKs on starch content plants were grown in vitro on MS agar plates at a constant temperature of 22ଌ under LD conditions. Three-weeks old plants were then transferred to MS agar plates containing the indicated concentrations of tZ. After two additional days leaves were harvested, and starch content was measured as described below.

Enzyme assays

One g of the frozen powder (see above) was resuspended at 4ଌ in 3 ml of 100 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM EDTA and 2 mM dithiothreitol, 1 mM PMSF and 10 ml/L protease inhibitor cocktail (Sigma P9599), and centrifuged at 14,000 x g for 20 min. The supernatant was desalted by ultrafiltration on Vivaspin 500 centrifugal concentrator (Sartorius) and the protein extract thus obtained was assayed for enzymatic activities. AGP and UGP activities were measured following the two-step assay method described in [48]. PGI and SuSy were measured as described in [24] and [107], respectively. Adenylate kinase was assayed in the two directions of the reaction as described in [108] using an HPLC system (Waters corporation) fitted with a Partisil 10-SAX column. PGM and acid invertase were assayed as described in [29] and [109], respectively. Rubisco activity was measured according to [110]. Amylolytic activities were assayed as described in [111]. PPase and SPS were measured as described in [74]. SS activity was measured in two steps: (1) SS reaction and (2) measurement of ADP produced during the reaction. The SS assay mixture contained 50 mM HEPES (pH 7.5), 6 mM MgCl2, 3 mM dithiothreitol, 1 mM ADPG and 3% glycogen. After 5 min at 37ଌ reactions were stopped by boiling the assay mixture for 2 min. ADP was measured by HPLC on a Waters Associate’s system fitted with a Partisil-10-SAX column. One unit (U) is defined as the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 μmol of product per min.

Non-reducing western blot analyses of AGP

For non-reducing western blots of AGP, 50 mg of the homogenized frozen material (see above) was extracted in cold 16% (w/v) TCA in diethyl ether, mixed, and stored at -20ଌ for at least 2 h as described in [48]. The pellet was collected by centrifugation at 10,000 x g for 5 min at 4ଌ, washed 3 times with ice-cold acetone, dried briefly under vacuum, and resuspended in 1x Laemmli sample buffer containing no reductant. Protein samples were separated on 10% SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose filters, and immunodecorated by using antisera raised against maize AGP as primary antibody [48], and a goat anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate (Sigma) as secondary antibody.

Chromatographic separation of cytPGI and pPGI

Chromatographic separation of the two PGI isoforms was conducted using an AKTA FPLC from Amersham Pharmacia Biotech. Protein extracts of WT and pgi1𠄳 leaves (see above) were loaded onto a HiLoad 16/10 Q-sepharose HP anion exchange column (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with 50 mM HEPES (pH 7.5). After washing the column, the adsorbed proteins were eluted with a linear 0𠄰.8 M NaCl gradient in 50 mM HEPES (pH 7.5). The flow rate was 5 ml/min and 2.5 ml fractions were collected. Fractions were analyzed for PGI activity as described above.

Native gel assay for PGI activity

PGI zymograms were performed as described in [29]. Protein extracts (see above) of both WT and pgi1 leaves were loaded onto a 7.5% (w/v) polyacrylamide gel. After electroforesis gels were stained by incubating in darkness at room temperature with 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM F6P, 1 mM NAD + , 4 mM MgCl2, 0.2 mM methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (Sigma M5655) and 0.25 mM phenazine methosulfate (Sigma P9625) and 1 U/mL of G6P dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides (Sigma G8404).

Procédures analytiques

For determination of metabolites content, fully expanded source leaves of 30 days after germination (DAG) plants were harvested at the indicated illumination period, freeze-clamped and ground to a fine powder in liquid nitrogen with a pestle and mortar. ADPG content was measured by HPLC-MS/MS as described in [55]. For measurement of sucrose, glucose and fructose, a 0.1 g aliquot of the frozen powder was resuspended in 1 mL of 90% ethanol, left at 70ଌ for 90 min and centrifuged at 13,000 x g for 10 min. For measurement of G6P, F6P and G1P 0.5 g aliquot of the frozen powdered tissue was resuspended in 0.4 ml of 1 M HClO4, left at 4ଌ for 2 h and centrifuged at 10,000 x g for 5 min. The supernatant was neutralized with K2CO3 and centrifuged at 10,000 x g. Sucrose, glucose, fructose, F6P, G6P and G1P from supernatants were determined by HPLC with pulsed amperometric detection on a DX-500 Dionex system. NADP(H) and NAD(H) were measured as described in [112]. Starch was measured by using an amyloglucosydase�sed test kit (Boehringer Mannheim, Germany). For measurement of adenine nucleotides a 0.5 g aliquot of the frozen powder was resuspended in 0.4 ml HClO4, left at 4ଌ for 2 h and centrifuged at 10,000 x g for 5 min. The supernatant was neutralized with K2CO3 and centrifuged at 10,000 x g. Nucleotides content in the supernatant was measured by HPLC (Waters corporation) fitted with a Partisil 10-SAX column as described in [113]. Recovery experiments were carried out by the addition of known amounts of metabolites standards to the frozen tissue slurry immediately after addition of extraction solutions.

For determination of CKs levels, aliquots of the frozen leaves (see above) were lyophilized and CKs were quantified according to the method described in [114].

Iodine staining

Leaves harvested at the end of the light period were fixed by immersion into 3.7% formaldehyde in phosphate buffer. Leaf pigments were then removed in 96% ethanol. Re-hydrated samples were stained in iodine solution (KI 2% (w/v) I2 1% (w/v)) for 30 min, rinsed briefly in deionized water and photographed.

Gas exchange determinations

Fully expanded apical leaves were enclosed in a LI-COR 6400 gas exchange portable photosynthesis system (LI-COR, Lincoln, Nebraska, USA). The gas exchange determinations were conducted at 25ଌ with a photosynthetic photon flux density of 350 μmol m -2 s -1 . UNEm was calculated using equations developed by [115]. g s values were determined as described in [116]. From the A/Ci curves, Vcmax, TPU and Jmax were calculated according to [117]. To avoid miscalculation of Am and Ci due to leakage into the gasket of the gas analyzer, we performed CO2 response curves using an empty chamber. The values obtained for Am and Ci in the empty chamber were compared with those of the chamber filled with a leaf and substracted from the values obtained with the empty chamber. ETR values were calculated according to [118] as ΦPSII x PPFD x 0.84 x 0.5, where PPDF is the photosynthetic photon flux density incident on the leaf, 0.5 was used as the fraction of excitation energy distributed to PSII [119] and 0.84 as the fractional light absorbance [120]. The rate of mitochondrial respiration in the dark was determined by measuring the rate of CO2 evolution in the dark.

PCR quantitative en temps réel

Total RNA was extracted from leaves using the trizol method according to the manufacturer’s procedure (Invitrogen). RNA was treated with RNAase free DNAase (Takara). 1.5 μg RNA was reverse transcribed using polyT primers and the Expand Reverse Transcriptase kit (Roche) according to the manufacturer’s instructions. Real time quantitative PCR reaction was performed using a 7900HT sequence detector system (Applied Biosystems) with the SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) according to the manufacturer’s protocol. Each reaction was performed in triplicate with 0.4 μL of the first strand cDNA in a total volume of 20 μL. The specificity of the PCR amplification was checked with a heat dissociation curve (from 60ଌ to 95ଌ). Comparative threshold values were normalized to 18S RNA internal control. The specificity of the obtained RT-PCR products was controlled on 1.8% agarose gels. Primers used for RT-PCRs of PGI1, BAM1, BAM2, BAM3 et BAM5 are listed in S2 Table.

Microscopie confocale

Subcellular localization of GFP-tagged GBSS was performed using D-Eclipse C1 confocal microscope (NIKON, Japan) equipped with standard Ar 488 laser excitation, BA515/30 filter for green emission and BA650LP filter for red emission.

Light and electron microscopy

Light microscopy and TEM analyses were carried out essentially as described in [105]. Briefly, small pieces (2 mm 2 ) of leaves were immediately fixed by submersion in a solution of 3% glutaraldehyde (v/v) in 0.05 M sodium cacodylate buffer, pH 7.4 (3 h at 4ଌ, under vacuum). After fixing, the specimens were washed in a cacodylate buffer (0.05 M sodium cacodylate, 1% sucrose), three times for 30 min each at 4ଌ, and post-fixed with a solution of 1% osmium tetroxide in the above cacodylate buffer (overnight, 4ଌ). After two washes, 30 min each, at 4ଌ with the same cacodylate buffer, the samples were dehydrated in an ethanol series and progressively embedded in LR White resin (London Resin Co., Reading, UK). Semithin (1 μm) sections were stained with 1% (w/v) toluidine blue in aqueous 1% sodium borate for direct observation with a Zeiss Axiophot photomicroscope (Zeiss, Oberkochen, Germany). Ultrathin (70� nm) sections for TEM were constructed with 2% aqueous uranyl acetate and lead citrate. Observations were performed with a STEM LEO 910 electron microscope (Oberkochen, Germany) at 80 kV, equipped with a Gatan Bioscan 792 camera (Gatan, Pleasanton, CA, USA).


The Bottom Line: Increased Research Productivity

When asked what having the NGC system in his lab will enable his group to do in the future, Fraser summarizes it thus: “Throughput and reliability are extremely important in a lab with many researchers using the same instrument. The NGC system will boost our capacity to purify multiple proteins more quickly. We used to do four runs a day, now we can do five — perhaps a 25% increase in throughput — because it is much quicker to switch between users.” This enhanced capacity promises to relieve a major bottleneck to research productivity in many labs, a sentiment echoed by senior proteomics researchers, who have often cited chronic problems with chromatography systems as a major source of downtime.

Although research at a basic level such as that conducted in the Fraser lab is typically far removed from technological applications, when asked to speculate on the scope of possible uses for the knowledge obtained in their work, Fraser replies that the study of translation mechanisms could have numerous therapeutic uses. For example, “Understanding how viruses hijack ribosomes to translate their mRNA may lead to the development of drugs that can specifically inhibit viral translation (Fraser and Doudna, 2007). Our studies could also help elucidate the role of translational regulation in cancer.” In a world living with an HIV epidemic with no cure in sight and facing increasing cancer mortality, such technologies could be of great benefit to people all across the globe.


Exemple 3

Objective: Identification of the HMGB1 family in the skin extract and examination of bone marrow mesenchymal stem cell-inducing activity

Method: Whether or not the neonatal mouse skin extract contained the HMGB protein family was confirmed using the Western blot method. Ten μl of the skin extract obtained in [Example 2] was used as a sample and subjected to SDS-PAGE electrophoresis. The proteins separated within the gel were transferred onto a PVDF membrane using a blotting device (ATTO). The membrane was incubated with PBS containing 3% skim milk and 0.1% Tween 20 (S-T-PBS) at room temperature for 1 hour, and then was allowed to react with each of rabbit anti-mouse HMGB1 antibody, rabbit anti-mouse HMGB2 antibody, or rabbit anti-mouse HMGB3 antibody which were diluted 1000-fold with S-T-PBS, at 4° C. for 16 hours. After the reaction, the PVDF membrane was washed with S-T-PBS five times for 5 minutes. Then, the PVDF membrane was incubated with 2000-fold diluted (diluted with S-T-PBS) peroxidase labeled goat anti-rabbit IgG antibody (GE Healthcare) at 25° C. for 1 hour. Further, after washing with S-T-PBS five times for 5 minute, the PVDF membrane was allowed to react with ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare). The ECL film was exposed and developed to detect the presence of HMGB1, HMGB2, and HMGB3 proteins.

RNA was extracted from the skin of neonatal mouse using Trizol (invitrogen), and further cDNA was synthesized using SuperScript III cDNA synthesis kit (Invitrogen). Using this cDNA as a template, cDNAs of HMGB1, HMGB2, and HMGB3 were amplified using the PCR (polymerase chain reaction) method. The cDNAs were inserted into the plasmid vector pCAGGS for expressing proteins in mammalian cells, such that proteins with an additional Flag tag sequence (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys SEQ ID: 18) at the N terminus of the amino acid sequence could be expressed. These plasmid vectors were introduced into HEK293 (Human embryonic kidney derived culture cell line) and cultured for 48 hours to express the proteins. Cells expressing each of the HMGB1, HMGB2, and HMGB3 proteins and the culture supernatant were incubated at 4° C. for 16 hours, which was then centrifuged at 4400 g for 5 minutes to collect the supernatant. 100 μL of the anti-Flag antibody gel (Sigma) was mixed into 50 mL of this supernatant, and was then incubated at 4° C. for 16 hours. Centrifugation was then performed to collect the gel, and washed with PBS five times. Further, the protein was eluted using 3× Flag peptide (final 100 μg/ml). Expressions of recombinant proteins were observed by the Western blot method using 1000-fold diluted (diluted with S-T-PBS) mouse anti-Flag antibody and 2000-fold diluted (diluted with S-T-PBS) peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody (GE Healthcare). The mouse bone marrow mesenchymal stem cell migration activity in these purified recombinant proteins was assessed in the same manner as in [Example 2] using a Boyden chamber. Moreover, in order to observe the in vivo drug efficacy of the HMGB family, the dorsal skin of 8-week-old C57BL/6 mice was cut out in a circle having a diameter of 8 μm to prepare cutaneous ulcer models. Purified HMGB1, HMGB2, and HMGB3 (100 ng) were each mixed with the same amount of hyaluronic acid solution having a concentration of 1 g/100 mL of PBS, and 100 μL of it was administered to the ulcer surface. The ulcer surface was covered with a transparent adhesive wound dressing/protective material Tegaderm (3M Healthcare) to avoid drying, and the wound area was measured over time to determine the therapeutic effect.

Further, to examine whether or not the human skin extract and the purified human HMGB1 has an activity to allow migration of human bone marrow mesenchymal stem cells, a Boyden chamber was used in the same manner as in [Example 2] for assessment. A human skin having an area of 1 cm 2 was immersed in 1 ml PBS, and then was incubated at 4° C. for 16 hours and subsequently centrifuged at 440 at 4° C. for 10 minutes. The supernatant alone was collected to be used as a human skin extract. Moreover, human bone marrow mesenchymal stem cells (Cambrex) were used as the cells to be placed in the upper chamber of the Boyden chamber (as a result of surface antigen analysis by flow cytometry, these cells have been confirmed to be CD105-positive, CD166-positive, CD29-positive, CD44-positive, CD34-negative, and CD45-negative. They have also been found to differentiate into adipocytes, chondrocytes, and bone cells by differentiation induction tests). Moreover, 100 ng/well of human HMGB1 (R&D) and human skin extract diluted 10-fold with PBS and were placed in the lower chamber. PBS was used as a control.

Result: As a result of Western blotting, bands of HMGB2 and HMGB3 were detected as well as the HMGB1 band. Therefore, the neonatal mouse skin extract was confirmed to contain the family proteins, HMGB2 and HMGB3, besides HMGB1 (FIG. 15). Expression vectors of HMGB1/HMGB2/HMGB3 having a Flag tag added at the N-terminus of each protein, were prepared (FIG. 16). These expression vectors were introduced into HEK293 cells, and the expressed proteins were purified using the Flag tag, and Western blotting was carried out to observe these proteins (FIG. 17). The mouse bone marrow mesenchymal stem cell migration activity was measured using these purified proteins, and the activity was confirmed in all of the proteins (FIG. 18). The ulcer area produced in the back of the mouse was measured every 7 days, and a significant effect on reducing ulcer area was confirmed in the HMGB1, 2, and 3 treatment group, as compared to the non-treatment group (FIG. 19). Similar to the mouse case, human HMGB1 and the human skin extract were revealed to have human bone marrow mesenchymal stem cell migration activity (FIG. 20).

Discussion: HMGB2 and HMGB3 are known as proteins having high homologies to HMGB1. These proteins are also expected to have properties similar to HMGB1. It was confirmed that HMGB2 and HMGB3 of the HMGB1 family are also produced from the extract of the free skin section. Further, HMGB1/HMGB2/HMGB3 recombinant proteins were produced, and their in vitro bone marrow mesenchymal stem cell migration activity and the in vivo therapeutic effect on a cutaneous ulcer were also confirmed. It was revealed that the HMGB family (HMGB1/HMGB2/HMGB3) and the recombinant HMGB family in the neonatal mouse free skin section have a bone marrow mesenchymal stem cell-inducing activity and an activity of locally inducing bone marrow-derived stem cells which are differentiatable into epithelium, and that the thus induced bone marrow-derived cell group differentiates into various cells such as epidermal keratinocytes, hair follicles, and fibroblasts in the damaged tissue to promote the recovery of the damaged tissue. Moreover, since bone marrow mesenchymal stem cells are multipotent stem cells, the present inventors believe that therapeutic effects can also be expected in the same manner by systematic administration or local administration of the HMGB family to treat damaged states in other tissues, for example, tissue damages such as brain injury, myocardial infarction, and bone fracture.

Moreover, it is known that, between human and mouse, amino acid sequence homology for HMGB1 is 98% (213/215), 96% (202/210) for HMGB2, and 97% (195/200) for HMGB3. Therefore, human HMGB and mouse HMGB are considered to have similar activities, and the results of the present Examples revealed that human skin extract and human HMGB1 have bone marrow mesenchymal stem cell-inducing activities in a manner same as those of mouse skin extract and mouse HMGB1.


FUNDING

A.V., S.M., T.M., L.V., C.L. were supported by CNRS (Mission pour l’interdisciplinarité, Agromics 2014–2016) this work was submitted to fulfill the requirements for a doctorate of biology at ED341-E2M2 from Université de Lyon, granted from the French Ministère de l’Education Nationale, de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche (to T.M.) this work has benefited from the I2BC crystallization and protein–protein interactions platforms supported by FRISBI [ANR-10-INSB-05-01] Cell and Tissue Imaging (PICT IBiSA), Institut Curie, member of the French National Research Infrastructure France-BioImaging [ANR10-INBS-04]. Funding for open access charge: CNRS.

Déclaration de conflit d'intérêts. None declared.


An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

A multi-column plate adapter allows chromatography columns to be interfaced with multi-well collection plates for parallel affinity or ion exchange purification providing an economical high throughput protein purification method. It can be used under gravity or vacuum yielding milligram quantities of protein via affordable instrumentation.

An economical and versatile high throughput protein purification system using a multi column plate adapter. Hi, protein purification is imperative to the study of protein structure and function. And it's usually used in combination with biophysical techniques.

This is especially important in the era of functional proteomics that require a high-throughput protein production. We hypothesized that a multi-column plate adapter, the MCPA, can interface multiple chromatography columns of different resins with multi-well plates for parallel purification. With this adapter, we have developed an economical and versatile method of protein purification that can be used under gravity or vacuum rival in the speed of an automated system.

Here we show this method for nickel affinity chromatography and ion exchange chromatography. Assemble the MCPA by placing a punctured sealing mat onto a long drip plate, then insert the desired number of columns into the holes of the sealing mat. Place an open collection plates in the base of the manifold and close with the top of the manifold.

Attach tubing and place the assembled MCPA with columns on the top. Pipet 1.2 mil of the nickel-NTA solution into the columns. Whilst pipetting, ensure that the beads remain fully mixed.

Switch on the pump and run the 20%ethanol through the columns and into the collection plate below. Turn off the pump once the liquid is run through. Dispose of the contents of the collection plate into a waste box.

Add three resin volumes of EDTA buffer to all the columns. Turn on the pump and run the liquid through. Now wash the columns with three resin volumes of 0.5 molar sodium hydroxide buffer.

Wash the columns with four resin volumes of 100 millimolar nickel sulfate, then 10 resin volumes of Mili-Q water. If a column is running slower, push the liquid through with the syringe plunger. Pour out the contents of the collection plates into a waste box.

Then wash the columns twice with four resin volumes of 10 millimolar imidazole wash buffer and empty the collection plates. If multiple samples are being purified, replace the open collection plates with a 48-well plates. With the vacuum off, load the lysates into the columns.

Use a thin plastic stirrer to gently mix the beads and the lysates in the column to maximize binding. Turn on the pump and run the liquid through. If a column becomes blocked, transfer the lysate resin mixture to a column with a fresh filter.

Freeze the collection plates to contain your flow-through. Replaced with an open collection plate and then wash the columns with nine resin volumes of 10 millimolar imidazole wash buffer. Repeat this step four or five times.

To avoid overflow, periodically empty the waste plates. Replace the open collection plates with a 96-well plate, ensuring A1 is in the top left corner. Pipet one resin volume of denaturing elution buffer into the columns.

Run the liquid through and check the collection plate to ensure that there is no contamination between the wells. For the next dilution, repeat the previous steps and collect in a fresh collection plate. Take a 50 microliter aliquot of each elution for the purity and concentration analysis.

Next, wash the columns with two milliliters of 20%ethanol. Add another two mil of 20%ethanol to the columns and use the fresh thin plastic stirrer to mix up the beads in the ethanol before transferring to a 50 mil tube for storage at four degrees Celsius. Assemble the MCPA in vacuum manifold with an open collection plate and syringe plungers in all of the columns.

Remove all of the syringe plungers from the front row. Remove the rubber gasket from a five mil syringe plunger and then pierce a hole in the center. Then push the bottom of an open column through the punctured rubber gasket.

Repeat these steps and insert into the front row of columns. Ensure that the Q sepharose beads are fully mixed. And with the blue pipette tip that is cut two centimeters from the bottom, pipet 800 microliters of the Q sepharose beads into the open columns.

Once the beads have settled to the bottom of the columns, switch on the vacuum pump enough to run the 20%ethanol through. Wash the columns twice with two mil of 10 millimolar Tris. Turn off the pump just before the Tris buffer has run through to prevent the resin drying out.

Runoff can be discarded and replace with a 48-well collection plates. Transfer all samples to be purified to the Q Sepharose columns in the first row and use a thin plastic stirrer to mix the samples and the beads for around two minutes before turning on the vacuum pump. Store or freeze your flow-through for later analysis.

With an open collection plate, wash the columns twice with two mil of 10 millimolar Tris. Replace the open collection plates with the 96-well plate. The first elution fraction can be collected in the first row or in the second row.

To elute in the second row, remove the syringe plungers from these positions. Move the Q Sepharose columns into these positions and then place syringe plungers into the open columns in the first row. Pipet one milliliter of the first salt concentrations into the Q Sepharose columns.

Turn on the pump and collect the elution. To collect the next elution, remove the syringe plungers from the next positions, move the Q Sepharose columns into these positions and then replace the plungers in the previous positions. Repeat these steps for each successive salt concentration used to elute.

Ensure that a new collection plate is used for every four elutions and that every plate is labeled and stored. With an open collection plates, wash the columns with two mil of four molar sodium chloride, 10 millimolar Tris. Pipet two mil of 20%ethanol and run this through until it is just above the beads and then seal the columns for storage.

As an example, the MCPA has successfully purified 14 AbpSH3 mutants in denaturing conditions by a nickel-NTA. A small contaminant can be seen at 25 kilodaltons, though the protein is still largely pure. The small contaminants seen in denaturing conditions is removed in native conditions.

This was shown when 11 different SH3 domains were purified. This shows that the MCPA can be used for comparison of purification conditions. AbpSH3 can be separated from the majority of contaminants via ion exchange purification from lysates.

Good yields of considerably pure AbpSH3 protein were recovered with various higher molecular weights contaminants. Purification of samples post-nickel-NTA using ion exchange with the MCPA has successfully removed these high-weight contaminants. Though there is still a slight contamination, the fractions are still largely pure and have yielded good biophysical data using NMR and thermal chemical denaturation assays.

In conclusion, our results show that our hypothesis is correct and that the MCPA can successfully purify milligram quantities of proteins using different chromatography techniques. The MCPA system can be configured in multiple ways within the same runs to optimize purification conditions. The setup is simple, cheap, and easy to train inexperienced users, especially in labs that do not routinely purify proteins.


Introduction

Figure 1. Polymer p(SS-co-PEGMA) stabilizes FGF2 as a conjugate and pVS facilitates FGF2-receptor binding when added as an excipient. When combined into a block copolymer, p(SS-co-PEGMA)-b-VS, the new conjugate both stabilizes FGF2 and increases protein activity. Protein structure modified from PDB 1CVS using PyMOL software.


Voir la vidéo: Color based functionality check - Strep-Tactin and Strep-TactinXT columns compared (Août 2022).