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Dans quelle mesure la microscopie à contraste de phase et à fond noir est-elle utilisée en recherche biologique ?

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Dans quelle mesure la microscopie à contraste de phase et à fond noir est-elle utilisée dans la recherche biologique aujourd'hui ? Il semble que celles-ci aient été inventées il y a longtemps, alors je pense que ce serait une bonne idée d'apprendre ces techniques. (Je commencerai un programme de premier cycle en biologie au printemps prochain… mais je m'intéresse toujours à combien les chercheurs utilisent ces technologies : si peu, je devrais mieux utiliser mon temps)


J'utilise très souvent le contraste de phase, car il ne s'agit que de changer un groupe de lentilles d'un fond clair. Au lieu de passer des heures avec la coloration ou, pire, l'immunocoloration, j'obtiens une vue d'ensemble (diamètre cellulaire) en quelques secondes. Je peux même retourner dans les mêmes cellules le lendemain. Le passage au champ noir consiste également à tourner un cadran ou à appuyer sur un interrupteur.

Si vous utilisez déjà un fond clair, il n'y a pas grand-chose à apprendre à leur sujet en termes de physique réellement utile ou de préparation d'échantillons. Les choses que vous pourriez apprendre - disons que les couleurs sont altérées en fond noir - seront rarement nécessaires dans la pratique. Ces méthodes sont le genre de choses que vous n'avez pas vraiment besoin de connaître en profondeur, à moins que vos expériences ne les nécessitent. Même alors, la pratique et l'huile de coude seraient plus utiles que l'optique avancée. N'oubliez pas que dans la plupart des cas, l'hypothèse scientifique est plus importante que les outils que vous pouvez utiliser pour la résoudre.


Si vous envisagez de faire n'importe quel type de travail en biologie cellulaire (et si vous vous lancez dans la biologie, il est presque certain que vous le ferez à un moment donné), apprendre à utiliser un microscope est un must. Vous utiliserez fréquemment un oscilloscope lors de la culture de cellules pour analyser leur morphologie, les compter, rechercher des signes de contamination, visualiser la différenciation, etc. Les microscopes sont également utilisés lors de la réalisation de protocoles de coloration d'immunofluorescence et d'immunohistochimie.

Ainsi, même si les instruments et certaines techniques existent depuis un certain temps, ils sont toujours très pertinents aujourd'hui.


38 - UTILISATION DE LA MICROSCOPIE À CONTRASTE DE PHASE

La microscopie à contraste de phase est un outil très utile et puissant pour examiner la morphologie des phagocytes mononucléés. En microscopie optique, les deux changements importants qui se produisent dans la lumière traversant un échantillon sont des changements d'amplitude ou de phase. Pour l'éclairage conventionnel en champ clair, la microscopie avec des échantillons colorés contraste à l'intérieur d'un objet est provoquée principalement par des différences d'absorption de la lumière. L'éclairage pour la microscopie de phase nécessite une source lumineuse qui est une ligne relativement étroite dans le plan focal arrière du condenseur du sous-étage. Avec le condenseur et l'objectif correctement focalisés, les ondes lumineuses qui proviennent d'un point de la source annulaire formeront un faisceau parallèle de rayons lors du passage à travers le plan de champ. En microscopie à contraste de phase, le changement de phase de la lumière directe par rapport à la lumière diffractée qui émerge de l'échantillon rend l'objet visible. Les changements d'indice de réfraction ou de longueur de trajet lumineux se produisent principalement sur les bords d'un échantillon, faisant ainsi du phénomène de phase un effet de bord.


Dans quelle mesure la microscopie à contraste de phase et à fond noir est-elle utilisée en recherche biologique ? - La biologie

Charlotte K. Omoto*
*Département de Génétique et Biologie Cellulaire

Joan Folwell#
#Département de zoologie

Université d'État de Washington
Boîte postale 644234
Pullman, WA 99164-4234
Voix : (509) 335-5591
Télécopieur : (509) 335-1907

INTRODUCTION

La microscopie optique est un outil d'investigation important pour la biologie qui est utilisé régulièrement dans les lycées et les collèges. La structure de nombreux spécimens biologiques présente un faible contraste qui ne peut être révélé par les microscopes composés à fond clair qui sont fournis dans de nombreuses salles de classe. Les microscopes qui améliorent le contraste de ces spécimens grâce à des optiques spéciales sont d'un coût prohibitif pour la plupart des budgets d'enseignement. Cet article décrit une modification simple et peu coûteuse qui transforme un microscope à fond clair en un microscope à fond noir permettant d'examiner des échantillons à faible contraste. Cet article explique la théorie de base de la microscopie à fond noir. Des photographies comparant l'application en fond clair et en fond noir sont présentées. Cette technique permet une utilisation étendue du microscope à fond clair à tous les niveaux d'enseignement avec très peu de manipulations ou de dépenses.

Théorie de la microscopie à fond noir

Les microscopes sont utilisés pour agrandir des objets. Grâce au grossissement, une image apparaît plus grande que l'objet d'origine. Le grossissement d'un objet peut être calculé grossièrement en multipliant le grossissement de la lentille de l'objectif par le grossissement de la lentille oculaire. Les objets sont agrandis pour pouvoir voir les petits détails. Il n'y a pas de limite au grossissement qui peut être obtenu, cependant, il y a un grossissement au-delà duquel les détails ne deviennent pas plus clairs. Le résultat est appelé grossissement vide lorsque les objets sont agrandis mais que leurs détails ne deviennent pas plus clairs. Par conséquent, non seulement le grossissement mais la résolution sont importants pour la qualité des informations dans une image.

Le pouvoir de résolution du microscope est défini comme la capacité de distinguer deux points l'un de l'autre. La résolution d'un microscope dépend d'un certain nombre de facteurs dans sa construction. Il existe également une limite théorique inhérente à la résolution imposée par la longueur d'onde de la lumière visible (400-600 nm). La limite théorique de résolution (la plus petite distance pouvant être vue entre deux points) est calculée comme suit :

où l représente la longueur d'onde de la lumière utilisée et N.A. est l'ouverture numérique. Les microscopes destinés aux étudiants ont généralement une résolution bien inférieure à la limite théorique en raison de lentilles et de systèmes d'éclairage de qualité inférieure.

La microscopie à fond clair standard repose sur la lumière provenant de la source de la lampe qui est collectée par le condenseur de la sous-étage et façonnée en un cône dont le sommet est focalisé dans le plan de l'échantillon. Les spécimens sont vus en raison de leur capacité à modifier la vitesse et la trajectoire de la lumière qui les traverse. Cette capacité dépend de l'indice de réfraction et de l'opacité de l'échantillon. Pour voir un spécimen dans un microscope à fond clair, les rayons lumineux qui le traversent doivent être suffisamment modifiés pour pouvoir interférer les uns avec les autres ce qui produit un contraste (différences d'intensité lumineuse) et, ainsi, construire une image. Si l'échantillon a un indice de réfraction trop similaire au milieu environnant entre la platine du microscope et l'objectif, il ne sera pas vu. Pour bien visualiser les matériaux biologiques, les matériaux doivent avoir ce contraste inhérent causé par les indices de réfraction appropriés ou être colorés artificiellement. Ces limitations obligent les instructeurs à trouver des matériaux naturellement à contraste élevé ou à améliorer le contraste en les colorant, ce qui nécessite souvent de les tuer. La visualisation adéquate de matériaux vivants transparents ou d'échantillons minces non colorés n'est pas possible avec un microscope à fond clair.

La microscopie à fond noir repose sur un système d'éclairage différent. Plutôt que d'éclairer l'échantillon avec un cône de lumière rempli, le condenseur est conçu pour former un cône de lumière creux. La lumière au sommet du cône est focalisée sur le plan de l'échantillon lorsque cette lumière dépasse le plan de l'échantillon, elle se propage à nouveau dans un cône creux. La lentille de l'objectif se trouve dans le creux sombre de ce cône bien que la lumière se déplace autour et au-delà de la lentille de l'objectif, aucun rayon n'y pénètre (Fig. 1). Le champ entier apparaît sombre lorsqu'il n'y a pas d'échantillon sur la platine du microscope, d'où le nom de microscopie à fond noir. Lorsqu'un échantillon est sur scène, la lumière au sommet du cône le frappe. L'image est faite uniquement par les rayons diffusés par l'échantillon et capturés dans l'objectif (notez les rayons diffusés par l'échantillon sur la figure 1). L'image apparaît claire sur l'arrière-plan sombre. Cette situation peut être comparée à l'apparence pailletée de particules de poussière dans une pièce sombre éclairée par de puissants rayons de lumière entrant par une fenêtre latérale. Les particules de poussière sont très petites, mais sont facilement visibles lorsqu'elles diffusent les rayons lumineux. C'est le principe de fonctionnement de la microscopie à fond noir et explique comment l'image d'un matériau à faible contraste est créée : un objet sera vu sur un fond sombre s'il diffuse la lumière qui est capturée avec le dispositif approprié tel qu'un objectif.

Les microscopes à fond noir de la plus haute qualité sont équipés de condenseurs spécialisés et coûteux construits uniquement pour l'application sur fond noir. Cet effet de fond noir peut être obtenu dans un microscope à fond clair, cependant, par l'ajout d'un simple "stop". L'arrêt est un morceau de matériau opaque placé sous le condenseur de la sous-platine, il bloque le centre du faisceau de lumière provenant de la base du microscope et forme le cône de lumière creux nécessaire à l'éclairage en fond noir.

Procédures

    Carl Zeiss États-Unis
    Division de microscopie
    1-800-233-2343
    (demandez le nom et le numéro du représentant local)

Si un arrêt de fond noir fabriqué n'est pas disponible pour vos microscopes, il existe des alternatives. S'il y a un porte-filtre sous le condenseur, une butée de fond noir d'une autre société peut s'adapter ou être adaptée. Une pièce de monnaie ou un cercle d'un autre matériau opaque peut être monté au centre d'un disque transparent, par exemple en verre, et inséré. Un arrêt peut également être façonné en poinçonnant un cercle de papier de construction noir, le cercle est attaché au fond du condenseur avec du ruban adhésif double. Cette alternative peut être un peu délicate car le matériau doit être placé au centre du condenseur et le condenseur doit être nettoyé lorsque le ruban est retiré. Techniquement, pour bloquer correctement le faisceau, le diamètre de la butée doit varier de 8 mm à 20 mm selon le grossissement et l'ouverture numérique de l'objectif.

La microscopie sur fond noir réduit la quantité de lumière entrant dans le système de lentilles d'un microscope de deux manières. Premièrement, la butée bloque le centre du faisceau de lumière qui remplirait autrement la lentille de l'objectif. Deuxièmement, seule la lumière qui est diffusée par l'échantillon et pénètre dans l'objectif est vue. Par conséquent, le meilleur résultat de visualisation nécessite d'augmenter l'intensité lumineuse autant que possible : en réglant le réglage de l'intensité lumineuse au maximum, en ouvrant le diaphragme de champ, en ouvrant l'ouverture du condenseur et en supprimant toute couleur ou autres filtres. Les lames de microscope correctes doivent également être utilisées, elles doivent avoir une épaisseur de 1 mm.

L'éclairage doit être aligné et ajusté pour obtenir la meilleure image. Avant de modifier le fond noir, alignez le faisceau lumineux au centre du champ de vision selon les instructions du fabricant. Pour faciliter la mise au point du condenseur de la sous-platine et de la lentille d'objectif, utilisez une lame remplie d'échantillons qui sont faciles à trouver des instructions pour faire suivre une lame de cellules de joue. Mettre au point la lame échantillon à faible grossissement (10X) en mode fond clair. Insérez l'arrêt de fond noir sans changer la mise au point. Assurez-vous que la quantité maximale de lumière est disponible. Montez le condenseur à sa position la plus élevée avec le bouton de mise au point du condenseur. Regardez l'échantillon et abaissez lentement le condenseur jusqu'à ce que l'échantillon soit visible sur un fond sombre et avec le contraste le plus net. Enfin, réglez la vue de l'image avec le bouton de mise au point fine.

Limitation de la microscopie à fond noir

L'avantage de la microscopie à fond noir devient aussi son inconvénient : non seulement l'échantillon, mais la poussière et d'autres particules diffusent la lumière et sont facilement observables. Par exemple, non seulement les cellules de la joue mais les bactéries dans la salive sont évidentes sur la figure 2D. Plus de soin dans la préparation des échantillons doit être exercé dans l'application de fond noir. Les lames de verre doivent être soigneusement nettoyées de la poussière et de la saleté étrangères. Il peut être nécessaire de filtrer les milieux d'échantillonnage (agar, eau, solution saline) pour exclure les contaminants déroutants. Les échantillons de matériaux doivent être étalés en couche mince. Trop de matériau sur la lame crée de nombreuses couches et bords qui se chevauchent, ce qui rend difficile l'interprétation des structures.

Pour créer l'image, cette technique repose sur la lumière diffusée par des spécimens. La couleur manque ou est minime, cela peut être décevant pour le spectateur. La taille réelle des spécimens est également impactée, la largeur des objets devient exagérée.

Exemples d'images en fond noir.

La figure 2 compare les images de Chlamydomonas vivantes, une algue biflagellée en mode fond clair et en mode fond noir. Bien que les cellules soient vues avec un fond clair, les flagelles ne sont pas discernables (Fig. 2B). Un certain contraste peut être obtenu en fermant le diaphragme d'ouverture du condenseur qui permet alors de voir les flagelles (Fig. 2A). Cependant, la fermeture de l'ouverture du condenseur diminue l'ouverture numérique de l'objectif, réduisant ainsi la résolution. Le fond noir permet de voir distinctement les flagelles et les détails à l'intérieur (Fig. 2C). L'utilisation de la microscopie à fond noir permet ainsi d'obtenir à la fois un contraste élevé et une haute résolution.

Les cellules de la joue font une étude rapide. Les cellules buccales sont obtenues en grattant doucement l'intérieur de la bouche avec un cure-dent et en étalant finement les cellules sur une lame, une lamelle est placée sur la préparation qui ne sèche pas. Ces cellules n'ont pas de contraste inhérent et sont difficiles à voir avec un fond clair. Un contraste spectaculaire est obtenu dans un microscope à fond noir, le noyau et d'autres inclusions intracellulaires ainsi que les bactéries dans le milieu environnant peuvent être facilement localisés et identifiés (Fig. 2D).


Principe de fonctionnement de la microscopie à contraste de phase

La microscopie à contraste de phase est basée sur le principe que de petits changements de phase dans les rayons lumineux, induits par des différences d'épaisseur et d'indice de réfraction des différentes parties d'un objet, peuvent se transformer en différences de luminosité ou d'intensité lumineuse.

En termes simples, la microscopie à contraste de phase est la traduction de déphasages invisibles dans différences visibles d'intensités. Les changements de phase ne sont pas détectables à l'œil humain alors que la luminosité ou l'intensité lumineuse peuvent être facilement détectées par l'œil humain.

Composants optiques du microscope à contraste de phase

Le microscope à contraste de phase est similaire à un microscope composé ordinaire dans sa composition optique. Semblable à un microscope normal, il possède une source lumineuse, un système de condenseur, un système de lentilles d'objectif et un système de lentilles oculaires.

Un microscope à contraste de phase diffère du microscope normal en ce qu'il a DEUX composants supplémentaires :

(1). Diaphragme annulaire de sous-étage

(2). Plaque de phase

(1). Diaphragme annulaire de sous-étage

Il est situé sous le condenseur de sous-étage du microscope. Le diaphragme annulaire du sous-étage aide à créer un cône ou anneau de lumière étroit et creux pour éclairer l'objet.

(2). Plaque de phase

La plaque de phase est également appelée plaque de diffraction ou plaque de retard de phase. Il est situé dans le plan focal arrière de l'objectif. Les composants retardateurs de phase sont revêtus sur cette plaque. La plaque de phase est un disque de verre transparent avec un ou plusieurs canaux. Le canal est recouvert d'un matériau qui peut absorber la lumière mais ne peut pas la retarder. L'autre partie (autre que le canal) de la plaque de phase est revêtue de matériaux retardateurs de lumière tels que le fluorure de magnésium. La plaque de phase aide à réduire la phase de la lumière incidente.

Comment le contraste est-il créé en microscopie à contraste de phase ?

Les cellules non colorées ne peuvent pas créer de contraste sous le microscope normal. Cependant, lorsque les lumières traversent une cellule non colorée, elles rencontrent des régions dans les cellules avec des indices de réfraction et une épaisseur différents. Lorsque les rayons lumineux traversent une zone d'indice de réfraction élevé, il dévie de son trajet normal et un tel rayon lumineux subit un changement de phase ou un retard de phase. Les rayons lumineux traversant la zone de moindre indice de réfraction restent inchangés (pas de changement de phase).

La différence de phases entre les rayons lumineux retardés et non retardés est d'environ ¼ de la longueur d'onde d'origine (c'est-à-dire /4). Les yeux humains sont NE PAS capable de détecter ces changements infimes dans la phase de la lumière et ainsi, ces petits changements de phase ne créent aucun contraste dans l'image. Le microscope à contraste de phase dispose de dispositifs spéciaux (diaphragme annulaire et plaque de phase) qui convertissent ces changements de phase infimes en changements d'amplitude ou de luminosité afin qu'une différence de contraste puisse être créée dans l'image finale. Cette différence de contraste peut être facilement détectée par nos yeux.

Voyons comment le microscope à contraste de phase obtient un contraste dans l'image sans tacher l'objet. En microscope à contraste de phase, afin d'obtenir un contraste, les ondes diffractées doivent être séparées des ondes directes. Cette séparation est réalisée par le diaphragme annulaire du sous-étage.

Le diaphragme annulaire illumine l'échantillon avec un cône de lumière creux. Certains rayons (rayons directs) traversent la région la plus mince de l'échantillon et ne subissent aucun retard et pénètrent directement dans la lentille de l'objectif. Les rayons lumineux traversant la région la plus dense de l'échantillon sont considérés et ils fonctionnent avec une phase retardée que les rayons non déviés. Le retard de la phase de la lumière est d'environ ¼ du ?? de la lumière incidente. La lumière retardée et non retardée doit traverser la plaque de phase maintenue sur le plan focal arrière de l'objectif pour former l'image finale.

La plaque de phase est conçue et positionnée de manière à ce que les rayons lumineux retardés traversent la zone de la plaque de phase où les matériaux retardateurs de lumière sont enduits. Quand le ¼ (ou λ/4) la lumière retardée traverse cette région de la plaque de phase, elle est en outre retardée de ¼ (ou λ/4). Avec cela, le changement ou le retard final sera- + ¼λ = ½λ (ou λ/4 + λ/4 = λ/2). Les rayons non retardés traverseront les canaux de la lame de phase et leur phase n'est pas modifiée par la lame de phase.

Quand l'imprudent et ½λ (ou λ/2) la lumière retardée sont recombinées (au point focal), un interférence négative ou destructrice est créé parce que le crête et creux des rayons lumineux non retardés et retardés s'annuleront l'un l'autre. Avec l'interférence destructive, l'image de l'échantillon apparaît plus sombre sur un fond clair. D'autre part, si les rayons lumineux non déviés traversent la phase concernant le matériau, les deux rayons seront dans la même phase et le résultat sera un interférence positive ou constructive. En cas d'interférence constructive, l'image de l'échantillon devient plus lumineuse sur un fond sombre. Ainsi, en microscopie à contraste de phase, la combinaison d'interférences destructives et constructives crée un contraste élevé dans l'image finale.

Applications de la microscopie à contraste de phase

Le microscope à contraste de phase de grossissement et de résolution est similaire à celui d'un microscope ordinaire. Pourtant, la PCM a de nombreuses applications en sciences biologiques. Les applications de la microscopie à contraste de phase peuvent être résumées comme suit :

Ø PCM permet la visualisation de cellules vivantes.

Ø Il permet la visualisation des cellules non colorées.

Ø PCM peut être utilisé pour visualiser divers organites cellulaires (mitochondries, noyau et vacuoles).

Ø Aide à étudier les événements cellulaires tels que la division cellulaire, la phagocytose, la cyclose, etc.

Ø Utilisé pour visualiser tous les types de mouvements cellulaires tels que les mouvements chromosomiques et flagellaires.

Ø Permettre l'étude de la dynamique du cytosquelette lors de la division cellulaire, de la phagocytose etc.

Ø Permettre l'étude de la perméabilité membranaire des cellules et des différents organites.

Ø La microscopie à contraste de phase est largement utilisée pour observer les cellules vivantes en culture tissulaire afin de surveiller leur croissance

Avantages du microscope à contraste de phase

Ø Fournir l'image claire des cellules non colorées.

Ø Éviter les dommages des cellules dus à la préparation chimique et à la coloration.

Ø Fournir des images à contraste élevé mettant en évidence les détails fins des cellules.

Ø La construction optique est relativement simple.

Ø Un microscope composé peut être élevé au microscope à contraste de phase avec des ajouts mineurs.

Ø Permettre une observation prolongée des cellules vivantes sans perdre la viabilité des cellules.

Ø L'imagerie des cellules vivantes et la surveillance des processus en direct sont possibles.

Inconvénients / Limitations du microscope à contraste de phase

Ø Le microscope à contraste de phase produit un halo lumineux autour des images. La formation du halo est due à la séparation partielle ou incomplète des rayons directs et déviés.

Ø PCM n'est utile que pour visualiser des cellules individuelles ou une couche mince de cellules.

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Principe de fonctionnement du microscope composé

Les microscopes composés fonctionnent sur le principe que lorsqu'un petit échantillon à agrandir est placé juste au-delà du foyer de son objectif, une image virtuelle, inversée et fortement agrandie de l'objet est formée à la moindre distance de vision distincte de l'œil. tenu près de l'oculaire.

Classification du microscope composé

Le microscope composé est classé en deux catégories

1. Microscope optique

Le microscope optique est en outre classé en quatre catégories telles que

  1. Microscope à fond clair
  2. Microscope à fond noir.
  3. Microscope à contraste de phase.
  4. Microscope à fluorescence.

2. Microscope électronique

Le microscope électronique est en outre classé en trois catégories telles que

1. Microscope optique

Les microscopes optiques utilisent la lumière visible et des lentilles grossissantes pour examiner de petits objets non visibles à l'œil nu, ou avec des détails plus fins que l'œil nu ne le permet. Cependant, le grossissement n'est pas le problème le plus important en microscopie.

Ils sont classés dans les groupes suivants

une. Microscope à fond clair

Dans un microscope à fond clair, le spécimen apparaît comme sombre sur le fond clair.

Applications:

Ils sont utilisés en laboratoire pour étudier la structure externe des micro-organismes.

b. Microscope à fond noir :

Au microscope à fond noir, l'échantillon apparaît comme brillant sur un fond sombre.

Applications:

Ce microscope est utilisé pour distinguer les cellules vivantes minces non colorées qui ne sont pas visibles sous un simple microscope.

c. Microscope à contraste de phase :

Certaines cellules vivantes non pigmentées ne sont pas visibles au microscope optique car elles ne peuvent pas créer de différences de contraste entre les cellules et l'eau. Seul le microscope à contraste de phase peut créer une différence de contraste entre la cellule et l'eau, c'est pourquoi ces cellules ne sont visibles que dans le microscope à contraste de phase

Application:

Utilisation pour l'étude de la forme et de la motilité des micro-organismes.

ré .Microscope à fluorescence :

Dans ce type, l'échantillon est coloré avec des colorants fluorescents puis exposé aux rayons ultraviolets (UV). Les colorants fluorescents absorberont la lumière de faible longueur d'onde et deviendront excités en conséquence, ils libéreront une lumière de longueur d'onde élevée. En utilisant ce mécanisme, les microscopes fluorescents fonctionnent.

Application:

Utilisation dans les laboratoires médicaux pour l'identification d'agents pathogènes. Également utilisé pour la localisation de protéines spécifiques.

2. Microscope électronique

Les microscopes électroniques utilisent des électrons comme source d'éclairage. Il a un pouvoir de résolution plus élevé que les microscopes optiques.

Il existe différents types de microscopes électroniques tels que

une. Microscope électronique à balayage (MEB)

Ce type de microscope électronique produit une image d'un échantillon en balayant la surface avec un faisceau focalisé d'électrons. Les électrons interagissent avec les atomes de l'échantillon, produisant divers signaux contenant des informations sur la topographie de surface et la composition de l'échantillon.

Application:

Utilisé pour étudier en détail la surface des micro-organismes.

b. Microscope électronique à transmission (MET)

Dans ce microscope, le faisceau d'électrons traverse un échantillon pour former une image. L'échantillon utilisé pour la MET doit avoir une épaisseur de 20 à 100 nm.

Application:

Il servait à étudier la structure interne d'un spécimen.

c. Microscopie confocale

Microscope confocal également connu sous le nom de microscopie confocale à balayage laser (CLSM) ou microscopie confocale à balayage laser (LCSM).

Il s'agit d'une technique d'imagerie optique permettant d'augmenter la résolution optique et le contraste d'une micrographie en utilisant un trou d'épingle spatial pour bloquer la lumière floue lors de la formation de l'image.

Ce microscope La capture de plusieurs images bidimensionnelles à différentes profondeurs dans un échantillon permet la reconstruction de structures tridimensionnelles (un processus connu sous le nom de sectionnement optique) au sein d'un objet.

Application

La microscopie confocale est largement utilisée dans les communautés scientifiques et industrielles et les applications typiques sont les sciences de la vie, l'inspection des semi-conducteurs et la science des matériaux.


Microscopie – Table des matières

Définition de la microscopie

Il est dérivé de deux mots grecs, à savoir mikros signifiant petit et skopeo signifiant voir ou regarder. La branche de la science qui traite de l'utilisation de microscopes pour visualiser diverses cellules et tissus invisibles à l'œil nu s'appelle la microscopie.

Histoire de la microscopie

Terminologies associées à la microscopie

1. Grossissement: C'est la mesure de l'agrandissement qu'un objet semble être lorsqu'on le regarde au microscope.
2. Résolution: Elle peut être définie comme la distance la plus courte entre deux points pouvant être distingués comme des entités distinctes. Plus la valeur est petite, plus la résolution d'un microscope est élevée et les détails des images peuvent être observés avec une meilleure clarté.
3. Micrographie : Le domaine de la prise de vue au microscope est appelé micrographie.

Formule pour calculer la puissance de résolution du microscope

Le pouvoir de résolution d'une lentille peut être calculé à l'aide de la formule suivante :

(varepsilon = 0.61 imes frac<<< m>< m<.A>>< m<.>>>>) (formule de Reyleigh)
(lambda :)Longueur d'onde
(< m>< m<.55mu m>>) est utilisé pour la lumière visible
N.A. : Lentille d'objectif N.A.

Microscopie optique ou optique

Lorsque la source lumineuse utilisée pour éclairer le champ dans un microscope est lumière blanche (lumière visible), on l'appelle microscopie optique. La lumière blanche est transmise ou réfléchie à travers l'échantillon biologique, puis la lumière entrante passe à travers une seule ou une série de lentilles pour atteindre l'observateur. La microscopie optique utilise principalement deux types de microscopes, à savoir le microscope simple et le microscope composé.

Microscope simple

Définition: Les microscopes simples sont des microscopes à lentille unique, parfois aussi appelés microscopes à dissection.

  1. Objectif utilisé : Il est doté d'une loupe à double lentille convexe à courte focale.
  2. Principe: Un microscope simple fonctionne sur le principe que lorsqu'un objet minuscule est placé dans la distance focale d'une lentille convexe, il donne une image virtuelle, dressée et agrandie.
  3. Grossissement: Le grossissement d'un objectif dépend de sa distance focale et il est généralement plus petit que le microscope composé.

Schéma du microscope simple ou à dissection

Microscope composé

Définition: Les microscopes composés sont des microscopes à double lentille. Les deux lentilles sont appelées lentille d'objectif et oculaire. Il est communément appelé microscope étudiant.

  1. Objectif utilisé : Un microscope composé utilise deux lentilles convexes, une dans l'oculaire et une autre dans l'objectif. Les lentilles oculaires varient en fonction de leurs distances focales et, par conséquent, les grossissements diffèrent également. Un microscope étudiant est livré avec trois lentilles d'objectif avec un grossissement de (< m<10 x, 40 x>>) et (< m<100x>>) tandis que le grossissement de l'oculaire peut être (< m<5x, 10x, 15x, 20x>>) et (< m<30x>>)
  2. Principe: L'objectif reçoit la lumière diffusée par l'échantillon, tandis que l'oculaire est utilisé pour l'observation finale de l'image. il donne une image virtuelle, dressée et agrandie.
  3. Grossissement: Le grossissement d'une lentille dépend de sa distance focale et il est généralement plus élevé que le simple microscope.

Schéma du microscope composé ou étudiant

Parties du microscope composé

Un microscope composé typique comprend les éléments suivants :

  • 1. Tête/Corps : C'est la partie supérieure du microscope. Le corps du microscope contient les pièces suivantes :
    • (a) Oculaire : On l'appelle aussi lentille oculaire. C'est la lentille présente à l'extrémité supérieure du tube métallique. Les modèles monoculaires ont un seul tube tandis que les modèles binoculaires ont deux tubes, chacun avec un oculaire. La distance entre deux tubes peut être ajustée selon la distance
    • (b) Tube oculaire : Il s'agit d'un tube métallique, (160,< m>) ((6,3) pouces) de long. Cette longueur est basée sur la résolution des yeux humains et conçue pour minimiser les aberrations.
    • (c) Lentille d'objectif : Ce sont les lentilles principales du microscope.
    • (d) Nez : tient les lentilles de l'objectif, a un mouvement de rotation de sorte qu'un objectif particulier puisse être sélectionné pour faire face à l'échantillon.
    • (d) Boutons de mise au point grossière et fine : Ils sont utilisés pour déplacer le tube du corps afin de focaliser l'image. Les boutons grossiers sont utilisés pour effectuer une mise au point approximative de l'image, tandis que les boutons de mise au point fine sont utilisés pour supprimer toute mise au point floue et sont entièrement basés sur la puissance de résolution de l'œil.
    • (e) Étape : Il s'agit d'une plate-forme plate où un spécimen est monté. Il s'agit d'une étape mécanique et de légers mouvements sont possibles pour un meilleur éclairage.
    • (f) Extraits de scène : Tenez fermement la lame en position et des mouvements des doigts sont effectués pour visualiser différentes zones de l'échantillon.
    • (g) Ouverture : C'est le trou par lequel la lumière transmise atteint la platine et à son tour l'échantillon.
    • (h) Diaphragme à iris : Contrôlez la quantité de lumière atteignant l'échantillon. Ceci est nécessaire car différents spécimens nécessitent une quantité de lumière différente pour obtenir des contrastes nets et une meilleure résolution. Ainsi, le diaphragme à iris permet d'obtenir un meilleur contraste en contrôlant la quantité de lumière.
    • (i) Condenseur : Il est situé sous le diaphragme et peut être déplacé de haut en bas pour focaliser la lumière sur l'échantillon.
    • (a) Illuminateur : Le cas échéant, il s'agit généralement d'une lampe halogène basse tension. Mais de nombreux modèles utilisent également la lumière naturelle et sont dirigés vers l'ouverture à l'aide d'un miroir.

    Procédure de travail du microscope composé

    La procédure pour monter un échantillon et l'observer avec un microscope composé se déroule comme suit :
    1. Un échantillon biologique est monté sur une lame de verre transparente immergée dans de la glycérine ou de l'eau et recouverte d'une lamelle.
    2. Une telle glissière prête est ensuite montée sur la scène entre le condenseur et l'objectif.
    3. Un faisceau de lumière visible est focalisé sur l'échantillon à l'aide d'un miroir réflecteur et d'un condenseur.
    4. L'ouverture du diaphragme peut également être ajustée pour contrôler la quantité de lumière.
    5. Une lentille d'objectif (fixée sur la tourelle porte-objectifs) est choisie en fonction du grossissement souhaité. Un objectif (< m<100x>>) nécessite une immersion d'huile sur l'échantillon.
    6. L'objectif capte ensuite la lumière à travers l'échantillon et un observateur peut voir l'image à travers l'oculaire
    7. En fonction du grossissement et de la résolution de l'image, un bouton de réglage grossier et fin peut être utilisé pour obtenir une image claire.
    8. Si une immersion dans l'huile est utilisée, la lentille de l'objectif, l'échantillon et la platine doivent être nettoyés avec un chiffon en coton.

    Différence entre le microscope simple et le microscope composé

    Microscope simpleMicroscope composé
    (1)Utilise une seule lentilleUtilise un système à deux lentilles
    (2)Une seule lentille est présenteDes objectifs (3) à (5) sont présents et un ou deux oculaires sont présents
    (3)Le grossissement est limité à la seule lentille utiliséeLe grossissement est la multiplication du grossissement de l'oculaire et de l'objectif
    (4)La lentille du condenseur est absenteLa lentille du condenseur est utilisée pour contrôler l'intensité de la lumière entrant dans l'échantillon
    (5)Les réglages grossiers sont très limités alors qu'un réglage fin n'est pas possibleLes réglages grossiers et fins pour une image claire sont bons et effectués avec un bouton coaxial
    (6)La source lumineuse est naturelleLa source lumineuse peut être naturelle ou artificielle (ampoules halogènes)
    (7)Le miroir est de type concave et réfléchissantLe miroir est plan d'un côté et concave de l'autre

    Techniques de microscopie optique

    La microscopie optique ou microscopie optique a de nombreuses techniques développées en fonction du contraste recherché ou de la partie de l'échantillon à mettre en évidence. Toutes ces variantes sont conçues à des fins spécifiques. Quelques-uns d'entre eux sont :

    Microscopie à fond clair : Le microscope d'étudiant commun ou microscope optique est appelé microscope à fond clair parce que l'image est produite contre un champ très éclairé.

    • 1. Le spécimen est plus dense et quelque peu opaque que l'environnement.
    • 2. La lumière traversant un tel échantillon est absorbée.
    • 3. La microscopie à fond clair est utilisée pour observer des spécimens biologiques conservés, colorés ou même vivants.
    • 4. Les avantages de ce type simple de microscopie sont la facilité de manipulation et la préparation minimale des échantillons.
    • 5. L'inconvénient est que la résolution reste faible.

    Microscopie à fond noir : En microscopie optique, la technique du champ sombre est utilisée pour améliorer le contraste dans un échantillon non coloré.

    • 1. La lumière directement transmise est minimisée et à la place, la lumière diffusée par l'échantillon est utilisée pour former l'image.
    • 2. Cela produit les arrière-plans classiques sombres, presque noirs avec des objets lumineux dessus et d'où le nom microscopie à fond noir.
    • 3. Il peut être utilisé pour observer des spécimens vivants.

    Microscopie à contraste de phase : Dans les échantillons biologiques, il existe une légère différence entre l'indice de réfraction (R.I) de la cellule ou de parties de la cellule et le milieu environnant, ce qui limite sa focalisation et sa résolution. Cette différence est utilisée dans les microscopes à contraste de phase.

    • 1. Les différences de phase entre la lumière diffractée par l'échantillon et la lumière non diffractée de l'environnement sont utilisées pour créer des variations de luminosité.
    • 2. Ceci est particulièrement utilisé pour visualiser les structures cellulaires, comme un noyau, qui sont autrement invisibles en microscopie à fond clair.
    • 3. Le microscope à contraste de phase a permis aux biologistes d'étudier les cellules vivantes, comme les cellules lors de la division cellulaire.

    Microscopie interférentielle : La microscopie par interférence utilise un prisme pour diviser la lumière en deux faisceaux légèrement divergents qui traversent ensuite l'échantillon.

    • 1. Il est donc basé sur la mesure des différences d'indice de réfraction lors de la recombinaison des deux faisceaux.
    • 2. Une interférence se produit lorsqu'un faisceau lumineux est retardé ou avancé par rapport à l'autre.
    • 3. La microscopie d'interférence est supérieure à la microscopie à contraste de phase.

    Microscopie à fluorescence : Ce type de microscopie utilise l'échantillon/les échantillons qui sont fluorescents.

    • 1. La lumière d'une longueur d'onde est utilisée pour éclairer l'échantillon et la lumière émise par l'échantillon est utilisée pour créer une image.
    • 2. Les cellules ou parties de cellules sont marquées avec des colorants fluorescents.
    • 3. Cette méthode est utilisée dans les études modernes des sciences de la vie car elle est très sensible et permet la détection même de molécules uniques.

    Microscopie polarisante : Ce sont des microscopes conventionnels mais ont une fonction supplémentaire pour utiliser la lumière polarisante.

    • 1. Un filtre polarisant est présent qui permet de polariser la lumière puis d'éclairer l'objet.
    • 2. Si l'objet est biréfringent, il divise la lumière en deux faisceaux de polarisations différentes.
    • 3. Le filtre installé sous l'oculaire bloque toute la lumière polarisée sauf une.
    • 4. L'analyseur peut être tourné pour obtenir un contraste maximum pour une meilleure image.
    • 5. Ce type de microscopie est utilisé pour déterminer l'orientation des structures moléculaires natives dans les cellules et pour analyser les premiers stades de développement des organismes

    Autres types de microscopes

    1. Microscope électronique : La différence fondamentale entre un microscope optique et un microscope électronique est qu'un microscope électronique utilise un faisceau d'électrons plutôt que de la lumière visible. Les électrons ont des longueurs d'onde beaucoup plus courtes que la lumière visible, ce qui permet aux microscopes électroniques de produire des images à plus haute résolution que les microscopes optiques standard.

    2. Les structures subcellulaires et leurs détails peuvent être clairement observés.

    3. Le principal inconvénient des microscopes électroniques est que les cellules vivantes ne peuvent pas être observées car les échantillons doivent être préparés par un processus de fixation étendu.

    4. Les microscopes électroniques sont de deux types principaux : le microscope électronique à balayage (MEB) et le microscope électronique à transmission

    (a) Microscope électronique à balayage (MEB) : un faisceau d'électrons se déplace d'avant en arrière sur la surface d'une cellule ou d'un tissu et donne une très belle vue (< m<3D>>). La meilleure résolution de SEM en (2011) était (0.4,< m>)

    (b) Microscope électronique à transmission (MET) : l'échantillon est découpé en tranches très fines et le faisceau d'électrons traverse l'échantillon. La MET est utilisée pour connaître les structures des organites cellulaires.

    5. Les microscopes électroniques sont plus lourds, plus volumineux et très chers que les microscopes optiques. De plus, la préparation des échantillons est un processus long et fastidieux.

    Microscopes ultraviolets (UV) : Il utilise la lumière ultraviolette pour l'éclairage des spécimens. Les rayonnements ultraviolets ont des longueurs d'onde beaucoup plus courtes que la lumière visible et des images à très haute résolution peuvent être obtenues. Ce type de microscopie est utile notamment pour connaître la croissance des cristaux de protéines.

    Microscopes infrarouges : La microscopie réalisée à l'aide de longueurs d'onde infrarouges est appelée microscopie infrarouge. Il est largement utilisé dans la recherche, l'industrie et l'une des applications est la criminalistique des affaires civiles et pénales. Il est utilisé pour détecter si deux échantillons sont identiques ou non.

    Microscopes laser confocaux : Les sources d'éclairage laser sont utilisées dans divers types de microscopes. Il s'agit d'un domaine émergent. La microscopie confocale est utilisée lorsque les structures (< m<3D>>) sont importantes.

    Importance de la microscopie

    L'importance de la microscopie est la suivante :


    1. La microscopie a de vastes applications en biologie et en médecine.
    2. Il est principalement utilisé pour connaître les structures aux niveaux tissulaire et cellulaire.
    3. Les structures subcellulaires sont également explorées à l'aide de divers types de microscopes.
    4. Les microscopes infrarouges sont utilisés pour détecter si deux échantillons sont identiques ou non.
    5. La microscopie UV est particulièrement utile pour connaître la croissance des cristaux de protéines.
    6. La microscopie à fond noir est utile pour observer des spécimens vivants.
    7. La microscopie confocale est utilisée lorsque les structures (< m<3D>>) sont importantes.
    8. La microscopie à fluorescence est utilisée pour détecter des signaux au niveau d'une seule molécule.

    Résumé sur la microscopie

    Dans le monde scientifique d'aujourd'hui, un microscope est un instrument couramment utilisé dans le domaine des sciences biologiques et de la médecine. Il est utilisé depuis l'observation d'organismes unicellulaires simples, de divers tissus biologiques jusqu'à des structures subcellulaires à très haute résolution. Les applications de la microscopie en sciences biologiques et en médecine sont énormes et le domaine lui-même est engageant et fascinant.

    Les progrès récents de la microscopie à fluorescence pour le contraste et la sensibilité sont tels que les scientifiques sont capables de détecter des signaux au niveau d'une seule molécule. Les microscopes électroniques, bien que plus lourds et coûteux, sont nécessaires dans les études à haut débit où des grossissements extrêmes sont requis. L'imagerie moléculaire et l'imagerie cellulaire sont devenues les nouveaux mots à la mode. Les nouvelles avancées dans les techniques histologiques, les colorants et les colorants couramment utilisés et le développement de divers fluorochromes permettent aux scientifiques d'explorer le monde vivant qui nous entoure avec de nouveaux grossissements.

    Foire aux questions (FAQ) sur Microscopie

    Q.1. Qu'est-ce que la microscopie ?
    Réponse :La microscopie est la branche de la science qui utilise divers types de microscopes pour voir des objets qui seraient autrement invisibles à l'œil nu.

    Q.2. WQuels sont les types de microscopes ?
    Réponse : Divers types de microscopes sont utilisés dans les sciences. Un microscope optique composé est le plus courant. Microscopes optiques, microscopes électroniques, microscopes laser confocaux sont quelques autres exemples.

    Q.3. A quoi sert la microscopie ?
    Réponse :La microscopie a de vastes applications en biologie et en médecine. Il est principalement utilisé pour connaître les structures aux niveaux tissulaire et cellulaire. Les structures subcellulaires sont également explorées à l'aide de divers types de microscopes.

    Q.4. Quel est le principe d'un microscope simple ?
    Réponse :Un microscope simple utilise le principe selon lequel lorsqu'un objet est placé dans sa distance focale, une image virtuelle, droite et agrandie de l'objet est formée.

    Q.5. Quels sont les deux principaux types de microscopes ?
    Réponse : Le microscope simple à lentille unique et les microscopes à lentilles composées ou doubles sont les deux principaux types de microscopes optiques.

    Q.6. Quelles sont les (14) parties d'un microscope ?
    Réponse : L'image suivante montre toutes les parties d'un microscope composé.

    Q.7. Quel est le microscope le plus couramment utilisé dans les laboratoires ?
    Réponse :Le microscope composé également appelé microscope étudiant est le microscope le plus couramment utilisé dans les laboratoires.

    Maintenant que vous disposez de toutes les informations nécessaires sur la microscopie et nous espérons que cet article détaillé vous sera utile. Si vous avez des questions sur la microscopie, envoyez-nous un ping via la zone de commentaire ci-dessous et nous vous répondrons dans les plus brefs délais.


    MICROSCOPIE | Microscopie à contraste de phase

    Contraste de phase Zernike

    La méthode de contraste de phase de Zernike est similaire au champ noir, sauf que la lumière directe (non diffractée) a sa phase relative modifiée de 90°, au lieu d'être éliminée. En pratique , ceci est réalisé en utilisant une ouverture annulaire de condenseur et un objectif avec un anneau de phase ( figure 2 ) . Le changement de phase peut être de ±90°, donnant un contraste de phase positif ou négatif. L'anneau de phase ne transmet généralement que partiellement, ce qui a pour effet d'améliorer la sensibilité. D'après les équations [8] ou [11] , l'imagerie d'un objet faible est linéaire en phase. L'artefact de halo est présent, comme en microscopie à fond noir. Les informations de faible amplitude sont imagées comme en microscopie à fond noir.

    Figure 2 . Schéma de principe de la microscopie à contraste de phase de Zernike.

    Pour l'objet de phase faible eqn [12] , on a alors

    pour un contraste de phase positif ou négatif, respectivement, où g est la transmittance d'amplitude de l'anneau de phase. La réponse de la fonction de transfert d'objet faible est améliorée grâce à l'ouverture annulaire du condenseur.


    Dans quelle mesure la microscopie à contraste de phase et à fond noir est-elle utilisée en recherche biologique ? - La biologie

    La microscopie à contraste de phase et à contraste d'interférence différentiel ( DIC ) sont des techniques complémentaires capables de produire des images à contraste élevé de phases biologiques transparentes qui n'affectent généralement pas l'amplitude des ondes lumineuses visibles traversant l'échantillon. Étant donné que les différences de phase sont indétectables à l'œil humain et ne sont pas facilement observées dans un microscope sous un éclairage en fond clair, le trajet de la lumière à travers le microscope doit être modifié de manière appropriée afin de produire des images satisfaisantes des échantillons de phase. De nombreuses techniques populaires d'amélioration du contraste reposent sur la capacité des échantillons de phase à modifier la différence de chemin optique entre les ondes traversant le matériau biologique et celles traversant le milieu environnant.

    La distinction la plus fondamentale peut-être entre le contraste interférentiel différentiel et la microscopie à contraste de phase est la base optique sur laquelle les images sont formées par les techniques complémentaires. Le contraste de phase donne des valeurs d'intensité d'image en fonction de l'amplitude de la longueur du trajet optique de l'échantillon, avec des régions très denses (celles ayant de grandes longueurs de trajet) apparaissant plus sombres que l'arrière-plan. Alternativement, les caractéristiques de l'échantillon qui ont une épaisseur relativement faible, ou un indice de réfraction inférieur à celui du milieu environnant, sont rendues beaucoup plus claires lorsqu'elles sont superposées sur le fond gris moyen.

    La situation est tout à fait distincte pour le contraste d'interférence différentiel, où les gradients de longueur de chemin optique (en fait, le taux de changement dans la direction du cisaillement du front d'onde) sont principalement responsables de l'introduction du contraste dans les images des spécimens. Les gradients abrupts de la longueur du trajet génèrent un excellent contraste et les images affichent un pseudo-ombrage en relief tridimensionnel caractéristique de la technique DIC. Les régions ayant des pentes de chemin optique très faibles, telles que celles observées dans des spécimens étendus et plats, produisent un contraste insignifiant et apparaissent souvent dans l'image au même niveau d'intensité que l'arrière-plan.

    Outre les différences dans les mécanismes de formation de contraste, les images DIC et de contraste de phase diffèrent par un certain nombre d'autres caractéristiques. La figure 1 illustre plusieurs images numériques comparant des spécimens capturés en DIC et en contraste de phase. Une cellule épithéliale de la muqueuse buccale humaine (joue), révélant le noyau, les inclusions cytoplasmiques et de nombreuses bactéries sur la surface supérieure, est présentée sur la figure 1 (a), imagée avec un contraste d'interférence différentiel. Le même champ de vision avec éclairage à contraste de phase est illustré sur la figure 1(b). L'image de contraste de phase présente des halos prononcés autour de la périphérie cellulaire et du noyau, qui sont absents dans l'image de contraste d'interférence différentielle. Les examens de microscopie DIC à sectionnement optique (non illustrés) révèlent que les bactéries sont présentes (presque exclusivement) sur la surface de la membrane qui baigne dans le milieu environnant plutôt que sur la face inférieure de la cellule. Ce fait ne peut pas être déterminé sans ambiguïté avec le contraste de phase.

    Dans la figure 1 (c), une section épaisse de tissu rénal murin imagé avec un contraste d'interférence différentiel révèle un faisceau de cellules enfermées dans un tubule. Une image en contraste de phase (figure 1(d)) de la même zone est confuse et perturbée par la présence de halos de phase en dehors du plan de mise au point. Cependant, plusieurs noyaux cellulaires apparaissent visibles sur l'image en contraste de phase, qui ne sont pas distinguables dans la CIVD. Des vues à grossissement relativement élevé d'un périsarc à tige annulaire polypoïde Obelia en CIVD et contraste de phase sont illustrées sur les figures 1(e) et 1(f), respectivement. Dans DIC, (Figure 1(e)) la structure annulaire apparaît hémisphérique avec des rayons internes qui émanent radialement de la tige. De plus, des particules granulaires sont visibles dans la structure de la tige, mais les détails anatomiques sont largement indéfinis. L'image en contraste de phase (figure 1(f)) est confondue par des halos autour des anneaux annulaires et à l'intérieur de la tige.

    L'un des principaux avantages du contraste interférentiel différentiel par rapport au contraste de phase est la possibilité d'utiliser l'instrument à pleine ouverture numérique sans les effets de masquage des plaques de phase ou des anneaux du condenseur, qui restreignent considérablement la taille des ouvertures du condenseur et de l'objectif. Le principal avantage est une résolution axiale améliorée, en particulier en ce qui concerne la capacité du microscope DIC à produire d'excellentes images haute résolution à de grandes ouvertures. La figure 2 est illustrée par des images numériques acquises avec une lentille de Bertrand de l'ouverture arrière de l'objectif dans des microscopes à contraste d'interférence différentiel (figure 2 (a)) et à contraste de phase (figure 2 (b)). Dans les deux cas, l'objectif est une fluorite 40x ayant une ouverture numérique de 0,75, et le diaphragme d'ouverture du condenseur est ouvert au plus grand diamètre. Même avec le polariseur en place et un prisme de Nomarski installé dans le condenseur, l'ouverture DIC est beaucoup plus grande que l'ouverture de contraste de phase, principalement parce que l'anneau du condenseur de phase restreint une partie importante de l'éclairage qui traverserait normalement le train optique du microscope.

    Le contraste de phase n'a pas l'effet azimutal prononcé inhérent au contraste d'interférence différentiel, qui se manifeste par l'orientation asymétrique des prismes de séparation de faisceau de Nomarski (ou de Wollaston modifié) par rapport à l'axe optique du microscope et aux polariseurs. L'absence d'effet d'orientation se produit parce que la plaque de phase annulaire dans un condenseur de microscope à contraste de phase (figure 2 (b)) est symétrique en rotation sur 360 degrés et illumine l'échantillon uniformément sous tous les angles. En conséquence, l'image de contraste de phase est indépendante de l'orientation et n'est pas soumise à des effets de contraste dépendant de la rotation. Pour de nombreux spécimens imagés en contraste d'interférence différentiel, une orientation préalable afin d'obtenir un contraste maximal (parallèle ou perpendiculaire à l'axe de cisaillement) restreint la liberté de rotation de l'échantillon, en particulier pour les structures périodiques linéaires ou rapprochées.

    Les effets de contraste d'azimut dans le contraste d'interférence différentiel peuvent être utilisés avantageusement en équipant le microscope d'une platine d'échantillon circulaire rotative à 360 degrés. Conçues à l'origine pour les observations en microscopie à lumière polarisée, les platines circulaires permettent à l'opérateur de faire pivoter l'échantillon par rapport à l'axe de cisaillement du prisme afin de maximiser ou de minimiser les effets de contraste pour les caractéristiques sélectionnées de l'échantillon. Le contraste en microscopie DIC atteint un niveau minimum pour les échantillons de phase linéaire qui s'étendent le long de la direction du cisaillement, mais peut varier considérablement en faisant pivoter la platine de quelques degrés. Les spécimens non linéaires, tels que les cellules, les coupes de tissus, les particules et les polymères amorphes, ne présentent pas d'effet d'azimut significatif dans la DIC et peuvent généralement être imagés de manière satisfaisante dans diverses orientations.

    La figure 3 présente deux spécimens linéaires ayant une quantité significative de périodicité et d'asymétrie imagées à la fois en contraste de phase et en DIC. Dans les deux cas, le contraste dans les images obtenues à partir de la DIC dépend largement de l'orientation de l'échantillon par rapport à l'axe de cisaillement du microscope, tandis que les caractéristiques de l'image en contraste de phase sont indépendantes de la rotation de l'échantillon autour de l'axe optique du microscope. Les images des figures 3 (a) et 3 (b) ont été obtenues en DIC à partir d'un spécimen monté d'un frustule de diatomée pennée allongé à symétrie bilatérale. Lorsque le grand axe de la diatomée est aligné parallèlement à l'axe de cisaillement du prisme de Nomarski (figure 3 (a)), les crêtes et les pores du frustule sont facilement observés. La flèche blanche dans le coin supérieur droit de la figure 3 (a) indique l'axe de cisaillement du prisme de Nomarski pour les images DIC illustrées à la figure 3. La rotation de la diatomée de 90 degrés (perpendiculairement à l'axe de cisaillement) réduit le contraste dans l'image frustule et masque des détails importants présents dans la microstructure. Par exemple, les arêtes longitudinales facilement observées sur les bords et le centre du frustule sur la figure 3(a) sont absentes sur la figure 3(b). Les effets d'azimut sont absents dans le même échantillon lorsqu'il est imagé à l'aide d'un système optique à contraste de phase (figure 3 (c)), qui affiche un contraste similaire quelle que soit l'orientation de l'échantillon. Notez que le contraste de l'image sur la figure 3(c) ressemble plus fortement à celui affiché par l'image DIC sur la figure 3(b) plutôt qu'à l'image à contraste élevé présentée sur la figure 3(a). Dans ce cas, les avantages des effets azimutaux résultant de l'orientation de l'échantillon dans le contraste d'interférence différentiel sont clairement évidents.

    Un deuxième exemple d'effets d'azimut qui sont présents dans le DIC, mais sans contraste de phase, est illustré sur les figures 3(d) à 3(f). Le spécimen est une écaille de poisson cténoïde semi-transparente contenant des inclusions en forme de losange qui manquent cruellement de contraste et sont difficiles à distinguer lorsqu'elles sont superposées sur les épines striées du corps de l'écaille. Lorsque l'échelle cténoïde est orientée avec les épines du corps parallèles à l'axe de cisaillement dans un microscope DIC (figure 3 (d)), les inclusions rectangulaires transparentes deviennent visibles et masquent les épines du corps. La rotation de la platine du microscope de 90 degrés réduit le niveau de contraste des inclusions, et les épines striées deviennent clairement visibles (figure 3 (e)). En contraste de phase (figure 3 (f)), les inclusions sont présentes avec des halos d'accompagnement, ainsi que les épines striées, quelle que soit l'orientation de l'échantillon.

    La corrélation entre le contraste de l'image et l'orientation de l'échantillon dans le contraste d'interférence différentiel peut souvent être utilisée avec avantage dans l'étude d'échantillons linéaires étendus. Par exemple, les structures hautement ordonnées dans les frustules de diatomées et les spécimens similaires peuvent se chevaucher, ce qui entraîne des images confuses lorsqu'elles sont observées en contraste de phase et des techniques similaires d'amélioration du contraste. En capturant des images à plusieurs orientations, la microscopie DIC est souvent en mesure de présenter une compréhension plus claire de la morphologie complexe présente dans de nombreux spécimens linéaires étendus. De plus, lorsque la méthodologie de sectionnement optique est couplée à une imagerie spécifique à l'azimut, la microscopie à contraste d'interférence différentielle peut souvent révéler des caractéristiques difficiles, voire impossibles, à distinguer à l'aide de techniques alternatives.

    Artefacts Halo et Shade-Off

    Les artefacts de halo et d'ombrage qui affligent le système optique à contraste de phase sont largement absents dans les images de contraste d'interférence différentielle. En contraste de phase positif, les caractéristiques de l'échantillon avec un indice de réfraction plus élevé que le milieu environnant sont entourées d'une frange brillante (halo) qui obscurcit souvent les détails des bords. Bien que les halos puissent être supprimés à un degré limité par des modifications de configuration de la conception de la plaque de phase objective, ils ne peuvent pas être entièrement éliminés. Dans certains cas, les images de contraste d'interférence différentielle souffrent d'une luminosité excessive le long des bords ayant des gradients optiques très raides, mais cet effet se produit généralement lorsque les valeurs de retard de polarisation sont trop faibles, et peut être contourné par un réglage approprié du prisme de Nomarski (ou de S narmont polariseur compensateur).

    La présence et la gravité des halos en contraste de phase dépendent, en partie, de la différence d'indice de réfraction entre l'échantillon et le milieu environnant. Souvent, les spécimens à contraste de phase contiennent une grande variété de structures qui affichent des indices de réfraction extrêmement fluctuants, qui produisent ensemble des images complexes. Les zones ayant un indice de réfraction inférieur à celui du milieu environnant présentent des halos sombres par opposition aux halos brillants qui peuvent être observés autour des caractéristiques d'indice de réfraction plus élevé. Les halos apparaissent en raison des paramètres de configuration du système optique du microscope à contraste de phase. Une petite partie de la lumière incidente déviée par l'échantillon traverse la plaque de phase objective en raison de la nature sphérique des fronts d'onde diffractés. Des caractéristiques d'échantillon plus petites donnent lieu à des angles de diffraction plus grands, mais de grandes structures étendues peuvent produire des fronts d'onde diffractés ayant des angles moins profonds qui tombent souvent dans la zone d'ouverture de l'objectif occupée par les plaques de phase.

    Une comparaison entre le contraste de phase et les images DIC en ce qui concerne les artefacts de halo est présentée à la figure 4 pour trois spécimens transparents couramment imagés. Les érythrocytes humains (globules rouges) présentent un halo distinctif entourant les cellules en forme de disque lorsqu'ils sont imagés en contraste de phase positif à des grossissements moyens et élevés (Figure 4 (a)). Notez que la partie centrale des disques d'érythrocytes est plus claire que la périphérie en raison d'une longueur de chemin optique réduite dans cette région. Lorsque le même champ de vision est examiné en contraste d'interférence différentiel (Figure 4 (b)), les artefacts de halo entourant les cellules sont absents, mais les images acquièrent une apparence d'ombre portée orientée le long de l'axe de cisaillement du prisme de Nomarski (du nord-ouest au sud-est), qui est manifesté par la partie supérieure gauche des crêtes externes étant d'apparence beaucoup plus claire que les crêtes correspondantes du côté opposé (en bas à droite) des cellules.

    Les cellules vivantes cultivées en culture monocouche sont fréquemment observées et imagées en utilisant à la fois la microscopie à contraste de phase et à contraste d'interférence différentielle. Plusieurs cellules HeLa adhérentes en culture sur des lamelles de verre sont illustrées sur la figure 4 (c) avec une optique à contraste de phase. Des artefacts de halo entourent la périphérie des membranes cellulaires et sont également évidents sur certains des plus grands organites dans les cellules. Bien que de nombreux détails cellulaires internes soient présents à haute résolution dans cette image, les informations sur les contrats intracellulaires sont supprimées par les régions brillantes (halo) apparaissant entre les membranes cellulaires adjacentes. L'absence d'artefacts de halo est évidente dans le même champ de vision (figure 4 (d)) lorsqu'il est imagé avec un contraste d'interférence différentiel. Les détails internes des cellules sont moins évidents dans la CIVD, mais la périphérie des membranes cellulaires est imagée plus clairement qu'avec le contraste de phase. En fait, la proximité étroite des cellules voisines est très évidente dans l'image DIC, ce qui rend la technique plus précise pour étudier les événements intercellulaires, tels que l'inhibition de contact.

    Les membres du genre d'algues vertes filamenteuses, Zygnema, présentent une structure linéaire allongée composée d'unités cellulaires individuelles répétitives. En contraste de phase (Figure 4 (e)), les spécimens filamenteux de Zygnema affichent un halo prononcé entourant l'extérieur des filaments d'algues en forme de bâtonnets, mais contiennent également des détails internes substantiels qui sont obscurcis par l'artefact du halo. Les structures cellulaires internes répétitives en forme de U bisymétrique (Figure 4 (e)) donnent lieu à de grands halos qui réduisent considérablement le contraste et masquent les plus petites caractéristiques. Le contraste d'interférence différentiel élimine les artefacts de halo présents dans les images à contraste de phase de Zygnema (Figure 4 (f)), et révèle sensiblement plus de détails internes présents au centre du filament. Cependant, afin d'obtenir les conclusions les plus définitives concernant la structure du filament de Zygnema, les deux techniques d'imagerie doivent être appliquées conjointement (comme c'est le cas pour de nombreux spécimens décrits ci-dessus).

    Comme discuté ci-dessus, les caractéristiques des spécimens ayant un indice de réfraction plus élevé que le milieu environnant affichent des halos brillants autour de la périphérie et présentent des parties centrales plus sombres lorsqu'elles sont imagées avec des systèmes optiques à contraste de phase positif. L'effet inverse se produit lorsque des caractéristiques ayant un indice de réfraction inférieur à celui du milieu sont observées (halos sombres et régions internes claires). Les effets de halo varient avec la taille de la caractéristique de l'échantillon et dépendent fortement du différentiel d'indice de réfraction entre l'échantillon et le milieu environnant. Des différences plus importantes d'indice de réfraction ont tendance à générer des effets de halo plus prononcés, qui dépendent également de paramètres instrumentaux, tels que les dimensions de la plaque de phase et la densité neutre, et le facteur de grossissement objectif. De plus, la taille des caractéristiques de l'échantillon joue un rôle primordial dans la détermination de la gravité des artefacts de halo en microscopie à contraste de phase.

    La situation est assez différente en microscopie DIC, où les grands différentiels d'indice de réfraction et la taille des caractéristiques de l'échantillon n'altèrent pas la qualité de l'image.En fait, des différences prononcées d'indice de réfraction entre l'échantillon et son milieu environnant sont souvent hautement souhaitables et conduisent généralement à d'excellentes images en contraste d'interférence différentiel. La taille des caractéristiques ne présente généralement pas de problème en microscopie DIC. Les échantillons ayant de grandes fluctuations de taille et d'indice de réfraction peuvent fréquemment être imagés simultanément (côte à côte) avec des systèmes optiques à contraste d'interférence différentiel pour produire des structures ayant un excellent contraste, ce qui permet d'observer et de reconnaître des détails même infimes.

    Les artefacts de halo et le contraste de l'image sont également affectés par l'épaisseur optique de l'échantillon à un degré beaucoup plus important en contraste de phase qu'en microscopie DIC. À de grandes différences de chemin optique (jusqu'à une demi-longueur d'onde), des images de contraste de phase ambiguës peuvent être produites car les caractéristiques les plus épaisses d'un échantillon affichent souvent des niveaux de contraste très proches, ou identiques, à ceux des caractéristiques les plus minces. Cela résulte des relations complexes entre la longueur du chemin optique (épaisseur de l'échantillon et indice de réfraction), le contraste et les angles de phase. En général, les spécimens à contraste de phase idéaux ne devraient pas avoir des caractéristiques dépassant environ un dixième de longueur d'onde dans la différence de chemin optique. Des spécimens minces sont également souhaitables pour la microscopie DIC, mais la technique est capable de produire des images appropriées avec des spécimens qui ont des valeurs d'épaisseur (et des longueurs de chemin optique) beaucoup plus grandes que celles recommandées pour le contraste de phase. Cependant, des échantillons très épais peuvent influencer négativement le chevauchement des plans d'interférence entre les prismes de l'objectif et du condenseur, réduisant la qualité et le contraste des images DIC.

    Dans les spécimens plats et étendus de longueur de chemin optique uniforme, un artefact connu sous le nom d'ombrage est couramment observé en microscopie à contraste de phase. L'ombrage se manifeste par la partie centrale de l'échantillon affichant une diminution progressive du contraste jusqu'à ce que l'intensité se rapproche de celle du milieu environnant. Dans les cas extrêmes, les spécimens étendus ne seront visibles qu'en contraste de phase en raison de la présence de leurs halos. En DIC, une variation de l'intensité de l'image ne se produit que s'il y a un changement marqué dans la différence de chemin optique, et les limites des spécimens étendus sont souvent la seule caractéristique qui peut être reconnue avec cette technique.

    Profondeur de champ et sectionnement optique

    Étant donné que les images à contraste de phase peuvent devenir ambiguës (ou même subir une inversion de contraste) lorsque la longueur du trajet optique de l'échantillon fluctue sur une large plage, la technique doit être limitée aux échantillons ayant une différence de trajet d'un dixième de longueur d'onde ou moins, comme indiqué précédemment. . En d'autres termes, les échantillons épais, ou ceux ayant des structures en forme de coin, ne sont généralement pas adaptés aux investigations quantitatives avec la microscopie à contraste de phase. Les spécimens minces ont également tendance à produire des images supérieures en contraste d'interférence différentiel, mais des spécimens plus épais (ayant une différence de chemin optique entre un dixième et une longueur d'onde complète) peuvent également être imagés à de grandes ouvertures en utilisant des techniques de sectionnement optique.

    L'ouverture d'éclairage en contraste de phase est fixée par la taille de l'anneau du condenseur et ne peut pas être modifiée pour obtenir une profondeur de champ accrue ou réduite. Cette restriction entrave les observations de spécimens contenant d'importants artefacts de halo, qui peuvent parfois masquer les caractéristiques des spécimens focalisés en raison de la superposition de détails provenant d'une lumière excessive provenant de l'extérieur du plan focal objectif. De tels problèmes surviennent souvent lorsqu'on essaie d'imager des spécimens trop épais pour le contraste de phase. Cependant, comme discuté précédemment, la capacité de sectionnement optique de la microscopie à contraste d'interférence différentielle (à des tailles d'ouverture de condenseur larges) permet d'obtenir d'excellentes images avec des spécimens relativement épais.

    Les avantages des sections optiques à grande ouverture d'échantillons épais en contraste d'interférence différentiel sont illustrés sur la figure 5 et comparés aux mêmes champs de vision imagés avec contraste de phase. La figure 5 (b) illustre un bourgeon de méduse d'un polype reproducteur de l'hydrozoaire Obelia imagé à un grossissement élevé en DIC avec l'ouverture du diaphragme iris du condenseur réglée à environ 95 pour cent de la taille de l'ouverture de l'objectif. La section optique mince qui en résulte révèle des détails d'image très nets des caractéristiques de la méduse, qui ne sont que très peu obscurcis par la lumière provenant du plan focal. Lorsque le même champ de vision est examiné en contraste de phase (figure 5 (a)), l'image de la méduse est floue par des halos et présente une résolution réduite en raison de l'ouverture restreinte du système optique.

    Des situations similaires sont présentées dans les figures 5(c) à 5(f). La figure 5(c) montre des écailles d'ailes qui se chevauchent du monarque ( Danaus plexippus ), l'un des papillons les plus communs en Amérique du Nord. Les échelles individuelles ne sont pas distinguables sur la figure 5(c) en raison des artefacts de halo et des caractéristiques indistinctes qui ne sont pas dans le plan de mise au point. En général, l'image est confuse par de nombreux artefacts, ce qui rend les caractéristiques des spécimens difficiles à déchiffrer. L'imagerie du même spécimen en contraste d'interférence différentiel (Figure 5 (d)) élimine de nombreux artefacts gênants éloignés du plan focal et délimite clairement les caractéristiques de la surface sur une seule échelle d'aile. De même, un paquet d'œufs dans l'abdomen d'un ténia du concombre canin (Dipylidium caninum) révèle des bords tranchants entourant les œufs individuels lorsqu'ils sont imagés dans DIC (Figure 5 (f)). Cependant, les œufs focalisés sont dépourvus de structure distinctive en contraste de phase (Figure 5 (e)), principalement en raison de halos provenant d'autres œufs situés loin du plan focal.

    La capacité de sectionnement optique du contraste interférentiel différentiel à de grandes tailles d'ouverture de condenseur et à une ouverture numérique élevée est essentielle pour l'imagerie de plans focaux uniques dans des échantillons de phase épaisse. Les détails et la lumière parasite des caractéristiques situées en dehors du plan focal immédiat ne compromettent pas les images DIC de la même manière que les images à contraste de phase, qui sont souvent compliquées par des artefacts de halo. En conséquence, le contraste interférentiel différentiel peut être utilisé pour obtenir d'excellentes images dans des conditions quelque peu défavorables (échantillons très épais), même lorsqu'une grande profondeur de champ rend l'identification des structures de phase impossible en microscopie à contraste de phase en raison des détails qui se chevauchent.

    Un avantage du contraste de phase par rapport à la DIC est la capacité d'imager avec succès des échantillons dichroïques et biréfringents. Étant donné que les systèmes optiques à contraste d'interférence différentielle reposent sur la lumière polarisée pour établir l'orientation des champs de front d'onde, l'absorption différentielle des ondes ordinaires et extraordinaires par un échantillon biréfringent ou dichroïque conduit à des images confuses. Le contraste de phase ne nécessite pas l'utilisation de lumière polarisée et est exempt de perturbations optiques générées par les échantillons biréfringents.

    L'une des principales préoccupations concernant les artefacts de biréfringence en microscopie à contraste d'interférence différentielle découle de l'utilisation généralisée de récipients de culture tissulaire en plastique. Le stress inhérent à la structure du vaisseau polymère moulé produit une biréfringence excessive qui dépolarise la lumière et perturbe l'interprétation des images DIC. Ainsi, les cellules vivantes cultivées dans ces conteneurs ne peuvent pas être imagées de manière satisfaisante avec un contraste d'interférence différentiel et, à la place, sont généralement observées et photographiées avec des systèmes optiques à contraste de phase ou à contraste de modulation Hoffman.

    Les artefacts typiques résultant de l'imagerie d'échantillons biréfringents en CIVD sont présentés à la figure 6, ainsi que des images de champs de vision identiques en contraste de phase. Des granules de stockage d'amidon (se présentant sous forme de globules) provenant d'une section mince quadruple colorée de tissu de pomme de terre (Solanum tuberosum), illustrant également une partie du tubercule mature avec périderme, cortex et tissus vasculaires réduits, sont présentés dans les figures 6(a) et 6(b). Étant donné que les glucides contenus dans les grains de fécule de pomme de terre présentent une structure moléculaire lamellaire ordonnée, des portions des grains (et dans certains cas, le grain entier lui-même) sont biréfringentes et absorbent les fronts d'onde polarisés qui quittent le prisme de Nomarski du condenseur et traversent l'échantillon. En conséquence, les grains de fécule de pomme de terre observés en microscopie DIC présentent des couleurs d'interférence et les motifs en croix de Malte caractéristiques (provenant des polariseurs croisés), qui sont typiques des spécimens anisotropes biréfringents ayant une symétrie sphérique (Figure 6 (b)). L'artefact de biréfringence dans DIC masque une grande partie de la structure interne des grains d'amidon, qui révèlent beaucoup plus de détails lorsqu'ils sont imagés en contraste de phase (figure 6 (a)), même si l'échantillon a été coloré.

    La figure 6(c) est illustrée par une image en contraste de phase d'une seule fibre de rayonne montrant la morphologie piquée qui est présente à la fois sur la surface et à l'intérieur du polymère. La rayonne est fabriquée à partir de cellulose, de linters de coton ou de copeaux de bois en traitant les matériaux en vrac avec de l'hydroxyde de sodium et du disulfure de carbone, puis en faisant passer la solution visqueuse résultante dans des filières. Les fibres produites dans ce procédé ont un ordre à longue distance et sont généralement très biréfringentes. L'examen DIC (figure 6(d)) de la fibre de rayonne confirme le caractère biréfringent, qui se manifeste dans les couleurs d'interférence newtoniennes présentes dans l'image. Les couleurs, bien que belles, obscurcissent les détails de l'échantillon et diminuent l'utilité du DIC pour l'imagerie des matériaux de ce type. Les images biréfringentes illustrées sur les figures 6(b) et 6(d) ont été enregistrées à l'aide d'échantillons relativement minces (5-20 micromètres) à faible grossissement (20x) qui restent nets dans tout le champ de vision. Lorsque des échantillons biréfringents plus épais sont imagés avec DIC, les couleurs d'interférence provenant de plans éloignés du point de focalisation ont tendance à obscurcir les détails de l'échantillon à un degré beaucoup plus important. Par conséquent, à mesure que l'épaisseur de l'échantillon augmente (pour les échantillons biréfringents), les images résultantes produites en DIC ont tendance à perdre du contraste et la qualité se détériore rapidement.

    Les problèmes associés à l'observation de cellules vivantes cultivées dans des récipients de culture tissulaire en plastique en utilisant la microscopie à contraste d'interférence différentielle sont clairement évidents en comparant les figures 6(e) et 6(f). Plusieurs cellules de fibroblastes de peau de cerf Muntjac indien ( Muntiacus muntjak ) en culture monocouche sont illustrées à la figure 6 (e), imagées à l'aide d'un objectif à longue distance de travail et d'une combinaison de condenseur en contraste de phase sur un microscope de culture tissulaire inversé. Les cellules ont été cultivées dans des récipients en polystyrène moulé ayant une épaisseur de paroi supérieure et inférieure d'environ 1,2 mm chacune (l'épaisseur combinée du polystyrène est de 2,4 mm). Même avec des objectifs à contraste de phase dotés de colliers de correction conçus pour l'observation à travers du verre ou du plastique épais, la qualité de l'image souffre par rapport aux cellules imagées sur des plaques de verre de couverture minces (170 micromètres) (comparez la figure 6(e) à la figure 4(c) ). Cependant, une grande partie des détails cellulaires internes est encore visible, y compris les noyaux, le nucléole, les vacuoles et de nombreuses particules plus petites.

    En contraste d'interférence différentiel, les cellules de fibroblastes de Muntjac indien cultivées illustrées sur la figure 6 (e) perdent une quantité significative de contraste (figure 6 (f)) en raison des effets d'absorption et d'interférence du conteneur en polystyrène biréfringent. Parce que les parois du conteneur sont relativement épaisses, la biréfringence de contrainte dépolarise les fronts d'onde ordinaires et extraordinaires dans la paroi supérieure du récipient de culture tissulaire avant qu'ils ne traversent les cellules, et à nouveau après avoir quitté les cellules et traversé la paroi inférieure. Le résultat est une baisse de contraste si importante que les cellules ne peuvent être imagées que lorsque le diaphragme du condenseur est presque complètement fermé (similaire aux techniques de fond clair avec des spécimens transparents). Dans ces conditions, les images présentent de nombreux artefacts de diffraction en plus du faible contraste, et rendent la DIC pratiquement inutile pour ce type d'observation.

    La principale source d'erreurs dans l'examen d'échantillons biréfringents avec une microscopie à contraste d'interférence différentielle provient de la nécessité d'utiliser une lumière polarisée, comme discuté ci-dessus. Dans les échantillons biréfringents, les fronts d'onde orthogonaux polarisés (ordinaires et extraordinaires) sont absorbés à différents degrés, en fonction de leur orientation par rapport aux molécules anisotropes dans l'échantillon. En conséquence, lorsque les fronts d'onde orthogonaux sont recombinés dans le prisme de Nomarski objectif et passent à travers l'analyseur, ils interfèrent avec une intensité différente. L'image finale n'est donc pas seulement fonction de la différence de chemin optique subie par les deux fronts d'onde (normalement un facteur critique en DIC), mais aussi des amplitudes différentielles des deux faisceaux induits par l'échantillon. L'effet sur les images est similaire à une configuration de microscope dans laquelle les axes de transmission du polariseur et de l'analyseur ne sont pas parfaitement perpendiculaires (en effet, légèrement décroisés). Parce que le contraste de phase ne repose pas sur la lumière polarisée, la technique est en grande partie exempte d'artefacts induits par les spécimens biréfringents.

    Les échantillons d'amplitude légèrement colorés, qui ne sont pas nécessairement biréfringents mais peuvent conserver une quantité importante de caractère de gradient de phase, subissent une intensité réduite en raison de l'absorption des longueurs d'onde visibles par la plaque de phase objective en microscopie à contraste de phase. Cependant, ces spécimens peuvent souvent produire des résultats satisfaisants en contraste d'interférence différentiel lorsque des gradients de chemin optique substantiels sont présents et que les deux fronts d'onde polarisés sont absorbés de manière égale. En fait, la coloration sélective des organites intracellulaires (par exemple, les noyaux intacts et les chromosomes en métaphase) peut être couplée à l'imagerie par microscopie DIC afin d'améliorer les détails de l'échantillon et de séparer les événements se produisant au moment où les cellules ont été fixées.

    La figure 7 illustre plusieurs exemples d'échantillons colorés avec des chromophores biologiques courants (absorbant la lumière visible) et imagés à la fois par contraste de phase et microscopie DIC. Une section mince de tissu adipeux humain teinté de graisse observée en contraste d'interférence différentiel est présentée sur la figure 7 (a), et le même champ de vision avec contraste de phase sur la figure 7 (b). L'image en contraste de phase est confuse et manque de résolution des détails fins, principalement à cause des artefacts de halo qui masquent les avantages de la coloration biologique. Le contraste de phase n'est clairement pas approprié pour extraire des informations significatives de cet échantillon. À la différence, une image DIC correspondante du même spécimen (figure 7 (a)) rend les globules gras dans un pseudo-relief tridimensionnel à ombre portée, ce qui les distingue assez bien des autres caractéristiques de l'image.

    Le même effet est observé avec la microscopie DIC sur la figure 7 (c), où des noyaux méiotiques et des chromosomes colorés de manière différentielle dans une section mince de testicules de grenouille peuvent être observés avec un contraste élevé. Cette image bénéficie de l'application intelligente de plusieurs colorants qui aident à séparer chromatiquement le matériel génétique des autres composants intracellulaires. En fait, l'échantillon donne plus d'informations importantes lorsqu'il est imagé en DIC que dans le mode d'observation de la cible d'éclairage en fond clair. Le même champ de vision en contraste de phase (figure 7 (d)) est confondu par des halos entourant les composants intracellulaires densément colorés, qui sont beaucoup plus difficiles à distinguer dans ce mode d'imagerie. Une situation similaire existe pour une section mince colorée de dent de mammifère présentée sur les figures 7(e) et 7(f). Dans la CIVD, les lamelles striées dans l'émail sont faciles à observer en raison de leur relief (Figure 7 (e)), tandis que des différences de chemin optique moins qu'optimales couplées à une surcoloration masquent ces structures en contraste de phase (Figure 7 (f)). Les exemples de la figure 7 fournissent des preuves solides que le contraste interférentiel différentiel est une technique appropriée pour observer des spécimens légèrement colorés, même si les mêmes spécimens sont difficiles à imager en contraste de phase.

    La différence la plus évidente entre la DIC et la microscopie à contraste de phase est la pseudo-images tridimensionnelles à projection d'ombre formées par des systèmes optiques à contraste d'interférence différentielle. Les images d'échantillons sont rendues d'une manière qui rappelle les techniques d'ombrage utilisées pendant de nombreuses années en microscopie électronique, qui fournissent des informations sur les propriétés topographiques de l'échantillon. Cependant, en DIC, les collines et vallées apparentes sur les images ne doivent pas être confondues avec une indication du profil topographique réel de l'échantillon, et doivent toujours être interprétées avec prudence. Le contraste de phase ne produit pas d'images ayant un caractère tridimensionnel significatif.

    De nombreuses similitudes et différences entre la microscopie à contraste de phase et à contraste interférentiel différentiel sont résumées dans le tableau 1 pour un certain nombre de variables, notamment la luminosité de l'image, la résolution, les limitations de décalage de phase, les artefacts, les caractéristiques de l'échantillon et le coût. En résumé, la luminosité de l'image à la fois en contraste de phase et en DIC est bien inférieure (seulement quelques pour cent) à l'observation ordinaire en fond clair, mais ces techniques d'amélioration du contraste sont capables de fournir des images bien plus définies. L'éclairage est plus critique pour la microscopie DIC que le contraste de phase, en particulier lors de l'utilisation de polariseurs à faible transmission à des grossissements élevés. Souvent, une lampe à décharge au tungstène-halogène ou au mercure de 100 watts est nécessaire pour une imagerie satisfaisante, alors que les microscopes à contraste de phase fonctionnent correctement avec des lampes à incandescence de 50 watts. La résolution latérale (x-y) et axiale (z) en microscopie à contraste interférentiel différentiel dépasse considérablement celle du contraste de phase, qui présente une résolution modeste ou médiocre dans les deux dimensions même si la limite de détection de déphasage est similaire dans les deux cas.

    Caractéristiques de la microscopie à contraste de phase et DIC
    Caractéristique Contraste de phase CID
    Luminosité de l'image
    (Champ clair = 100 %)
    1,3 % 0,36 - 2,3 pour cent
    Perte de lumière par épi-fluorescence
    (Champ clair = 0 %)
    28 pour cent 73 %
    Résolution latérale Condenseur
    anneau
    Limité
    Supérieur
    Résolution axiale
    (Discrimination en profondeur)
    Pauvres Supérieur
    Ouverture éclairante 10 pour cent de
    Objectif NA
    Variable
    Déphasage
    Limite de détection
    < l /100 < l /100
    Utilité à des déphasages élevés Pas utile Utile
    Effets azimutaux Non Oui
    Halos et Shade-Off Oui Non
    Spécimens colorés Pas utile Utile
    Spécimens biréfringents Utile Pas utile
    Spécimen biréfringent
    Conteneurs
    Oui Non
    Image en fond clair
    Détérioration
    Léger Rien
    Coût Modérer Haute
    Tableau 1

    Les échantillons de phase épaisse ayant de grandes différences de chemin optique peuvent être facilement imagés en contraste d'interférence différentiel en utilisant des techniques de sectionnement optique, mais sont souvent difficiles à imager avec un contraste de phase en raison des artefacts de halo. D'autres facteurs, tels que les effets azimutaux et la possibilité d'imager des échantillons colorés en DIC, aident à compenser les deux techniques. Le contraste de phase est bien plus utile pour les observations de routine dans les laboratoires de culture tissulaire, où l'imagerie de cellules vivantes dans des récipients de culture en plastique est une activité quotidienne. Alternativement, les informations haute résolution sont mieux récupérées en utilisant des méthodes de contraste d'interférence différentielle (souvent couplées à une vidéo en accéléré) pour l'imagerie de cellules vivantes.En général, la DIC nécessite plus de compétences techniques pour configurer et utiliser, y compris le processus d'alignement complexe, la manipulation continue de la mise au point de l'échantillon, le réglage du diaphragme à iris, l'orientation de l'échantillon et le déplacement latéral du prisme de Nomarski objectif pour obtenir un contraste optimal. Les microscopes à contraste de phase sont beaucoup plus faciles à aligner et à utiliser, et peuvent être utilisés assez efficacement par des microscopistes relativement inexpérimentés.

    L'utilité du contraste de phase est généralement limitée à l'imagerie d'échantillons de phase transparents ayant un faible contraste. Inversement, la microscopie DIC peut être utilisée à la fois pour les échantillons colorés et non colorés, mais souffre d'artefacts lorsque des caractéristiques biréfringentes sont rencontrées. Un meilleur contrôle du contraste de l'échantillon est obtenu en traduisant le prisme objectif (ou le compensateur de S narmont) en DIC, qui peut être ajusté sur une large gamme de positions pour obtenir différents niveaux de couleurs d'interférence en niveaux de gris, ou des effets de coloration optique multicolores à grandes différences de chemin. De plus, le diaphragme d'ouverture du condenseur peut également être ajusté dans le DIC pour modifier le contraste et la résolution de l'échantillon. Le contraste de phase est limité au contraste offert par le diaphragme annulaire du condenseur et la plaque de phase de l'objectif logée dans l'objectif. Pratiquement aucun réglage de contraste (autre que l'échange de plaques de phase) n'est possible avec la microscopie à contraste de phase.

    Parmi les considérations les plus importantes dans de nombreux laboratoires, lors de la comparaison de la CIVD et du contraste de phase, se trouve le coût des composants accessoires. Étant donné que la DIC nécessite plusieurs prismes de Nomarski biréfringents coûteux et des éléments optiques sans contrainte (objectifs et condenseur), l'instrumentation est nettement plus chère que les composants à contraste de phase. Dans de nombreux cas, en particulier lorsque la photomicrographie et/ou l'imagerie numérique n'est pas une considération primordiale, le contraste de phase servira souvent les objectifs d'un laboratoire. Cependant, lorsque des images haute résolution doivent être obtenues à partir de cellules et de tissus vivants, ou d'échantillons de phase transparente fragiles similaires, le contraste d'interférence différentiel est la technique de choix.

    En général, la microscopie à contraste de phase et à contraste interférentiel différentiel doit être considérée comme des techniques complémentaires (plutôt que concurrentes) et utilisées ensemble pour étudier pleinement les propriétés optiques, la dynamique et la morphologie des échantillons. L'introduction d'objectifs à contraste de phase modernes ayant des plaques de phase de densité neutre inférieure permet au microscopiste, dans de nombreux cas, d'utiliser un seul ensemble d'objectifs pour l'imagerie en fond clair, en fluorescence, en contraste de phase et en DIC.

    Douglas B. Murphy - Département de biologie cellulaire et d'anatomie et installation de microscope, École de médecine de l'Université Johns Hopkins, 725 N. Wolfe Street, 107 WBSB, Baltimore, Maryland 21205.

    Jan Hinsch - Leica Microsystems, Inc., 90 Boroline Road, Allendale, New Jersey, 07401.

    Kenneth R. Spring - Consultant scientifique, Lusby, Maryland, 20657.

    Michael W. Davidson - Laboratoire national de champ magnétique élevé, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Floride, 32310.


    Microscopie électronique

    UNE microscope électronique à transmission (Fig. 6-1 D) peut résoudre des points inférieurs à 0,3 nm, mais la résolution pratique est généralement limitée par les dommages causés aux échantillons par le faisceau d'électrons et les méthodes utilisées pour préparer les échantillons. Historiquement, la méthode la plus couramment utilisée pour préparer les cellules pour la microscopie électronique consistait à fixer l'échantillon avec des produits chimiques, à l'enrober dans du plastique, à couper l'échantillon en lames minces, et colorer les coupes avec des métaux lourds (Fig. 6-4 F). Avec cette technique, la résolution est limitée à environ 3 nm, mais cela est suffisant pour combler le fossé entre la microscopie optique et les structures moléculaires. À l'apogée de la microscopie électronique en biologie cellulaire, entre 1950 et 1970, des coupes minces ont révélé l'essentiel de ce que l'on sait de l'organisation des organites dans les cellules.

    (A, avec l'aimable autorisation de JL Bowman, University of California, Davis. C, avec l'aimable autorisation de J. Sinard, Yale University, New Haven, Connecticut. E, avec l'aimable autorisation de John Heuser, Washington University, St. Louis, Missouri. D–F, Avec l'aimable autorisation de Don W. Fawcett, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts.)

    La résolution la plus élevée est atteinte avec des spécimens réguliers, tels que des cristaux de protéines bidimensionnels rapidement congelés et visualisés alors qu'ils sont incrustés dans un film mince de glace vitreuse (c'est-à-dire amorphe, non cristalline) (voir Fig. 5-11A). C'est appelé cryomicroscopie électronique car la platine contenant l'échantillon congelé est refroidie à la température de l'azote liquide. Les micrographies électroniques et la diffraction électronique de cristaux congelés ont produit des structures de bactériorhodopsine (voir Fig. 7-8), de canaux d'eau d'aquaporine (voir Fig. 10-15) et de tubuline (voir Fig. 34-4) à des résolutions de 3 à 4 nm. Des méthodes de traitement d'images informatiques sont utilisées pour calculer la structure tridimensionnelle des protéines dans ces spécimens réguliers. Ces méthodes sont similaires à celles utilisées pour calculer les cartes de densité électronique à partir des diagrammes de diffraction des rayons X (voir Fig. 3-10). Bien que la résolution soit limitée et la collecte des données fastidieuse en cristallographie électronique, les images au microscope électronique ont l'avantage de contenir l'information de phase qui est souvent difficile à déterminer avec la diffraction des rayons X.

    La microscopie électronique est utile pour étudier les polymères protéiques et d'autres grands échantillons macromoléculaires à une résolution inférieure à l'atome. Diverses méthodes sont utilisées pour préparer les échantillons et conférer un contraste. Une façon consiste à congeler des filaments ou des assemblages macromoléculaires dans de la glace vitreuse, comme décrit précédemment (voir les figures 34-7 et 36-4A). Une seconde est la coloration négative, par laquelle les échantillons sont séchés à partir de solutions aqueuses de sels de métaux lourds (Fig. 6-4 B). Une enveloppe de colorant dense enveloppe les particules à la surface d'un mince film de carbone et peut préserver les détails structurels à une résolution d'environ 1 nm. Alternativement, les macromolécules séchées sur une surface lisse peuvent être ombragées avec une fine couche de métal évaporé d'une électrode (Fig. 6-4 C). Une variante de cette approche qui améliore la conservation consiste à congeler les spécimens rapidement, à évaporer la glace entourant les molécules, puis à appliquer une couche de platine (voir les figures 30-4 et 34-11).

    Le traitement d'images par ordinateur de micrographies de certains types de structures peut produire une reconstruction tridimensionnelle moyenne d'une structure moléculaire. Les particules à symétrie hélicoïdale, telles que les filaments d'actine (voir Fig. 33-7) et les microtubules (voir Fig. 34-5), sont analysées par une méthode de traitement d'image appelée déconvolution pour reconstruire la structure tridimensionnelle. Des particules uniques peuvent également être reconstruites en classant d'abord des images de milliers de particules orientées de manière aléatoire en catégories correspondant à différentes vues. Ensuite, une structure tridimensionnelle moyenne est calculée informatiquement à partir de cet ensemble. Un exemple est le translocon Sec61p associé à un ribosome (voir Fig. 20-6). Plus récemment, les progrès informatiques ont conduit au développement de la tomographie au microscope électronique, dans laquelle de nombreuses images sont prises d'un échantillon relativement épais sous différents angles (en inclinant l'échantillon à l'intérieur du microscope). La superposition brouille chaque image, mais lorsqu'elles sont fusionnées en une carte tridimensionnelle, des structures aussi complexes que des cellules entières peuvent être visualisées à une résolution de quelques nanomètres.

    UNE Microscope électronique à balayage (SEM) peut être utilisé sur des échantillons plus épais, tels que des cellules entières ou des tissus qui ont été fixés, séchés et recouverts d'un mince film métallique. Ici, un faisceau d'électrons balaye un motif matriciel sur la surface des spécimens, et les électrons secondaires émis par la surface à chaque point sont collectés et utilisés pour reconstruire une image (Fig. 6-4 A). La résolution du SEM conventionnel est limitée, mais néanmoins précieuse, pour étudier les caractéristiques de surface des cellules et leurs relations tridimensionnelles dans les tissus. Les SEM qui utilisent des canons spéciaux à haute énergie (émission de champ) pour produire le faisceau d'électrons ont une résolution considérablement améliorée, et ceux-ci ont été très utiles pour étudier les sous-structures cellulaires, telles que les pores nucléaires (voir Fig. 14-6B).


    Dans quelle mesure la microscopie à contraste de phase et à fond noir est-elle utilisée en recherche biologique ? - La biologie

    Résumé de l'article:

    Préparation des échantillons pour la microscopie

    Les microscopes sont les instruments qui nous permettent d'observer des objets microscopiques tels que des micro-organismes, des bactéries, des virus, des champignons et des protozoaires. Ils sont utilisés pour étudier l'organisation cellulaire des tissus végétaux et animaux, la division cellulaire ou les processus de mitose-méiotique. Les microscopes sont utilisés pour la détection de paramètres pathologiques tels que la présence de parasites dans le sang, les caractéristiques morphologiques des globules blancs et rouges. L'importance des analyses microscopiques en médecine légale et en diagnostic est bien connue. En plus de ces applications biologiques, les microscopes ont une utilité potentielle dans des sciences telles que la nanotechnologie, la physique, la chimie, l'environnement et la métallurgie. Le grossissement du microscope est dérivé de la lumière ou des électrons. Selon la source de grossissement, 2 types de microscopes : à lumière (optique) et à électrons, sont utilisés par les microbiologistes. Les cellules mortes et vivantes peuvent être observées mais doivent être préparées par des techniques microscopiques spécifiques pour une observation au microscope. Voyons différents types et modifications des techniques de préparation des échantillons pour la microscopie.

    1. Préparation en microscopie optique
    :
    Divers types de microscopes optiques comme le champ clair, le champ sombre, le contraste de phase et la fluorescence sont utilisés à des fins différentes. Selon le type de microscope et d'application, l'échantillon ou l'objet est préparé pour l'observation.

    Microscope à fond clair- Dans ce type, le champ microscopique apparaît brillant contre un échantillon sombre. L'échantillon absorbe la lumière et apparaît sombre. Ceci est essentiel pour l'observation des cellules microbiennes, en particulier des bactéries, car elles n'absorbent pas beaucoup de lumière. L'augmentation de la capacité d'absorption de la lumière des microbes est rendue possible en les colorant avec des colorants appropriés. Trois types de colorants, acides (éosine, fuchsine acide), basiques (cristal violet, bleu de méthylène) et neutres (colorants acides et basiques combinés) sont utilisés dans la coloration. L'application du colorant est suivie d'un traitement avec une solution de mordant (iode, acide tannique) qui forme un complexe insoluble avec le colorant et le dépose dans la membrane cellulaire ou la paroi cellulaire. Les frottis d'échantillons sont fixés par la chaleur ou une solution de formol pour éviter le lessivage par le colorant ou l'eau. Les frottis colorés peuvent également être conservés de façon permanente en les traitant avec une solution de baume du Canada. Les huiles d'immersion sont également utilisées pour augmenter le pouvoir de résolution et réduire la distance de travail de l'objectif. Des préparations colorées sont nécessaires car les bactéries vivantes ne révèlent pas beaucoup de détails structurels. Le seul inconvénient de la coloration est que les échantillons ne peuvent pas être observés à l'état vivant. La coloration des cellules fournit également un plus grand contraste et une différenciation des couleurs nécessaires à l'observation. Différents types de colorations et procédures de coloration sont disponibles pour les micro-organismes. Des techniques de coloration spéciales sont utilisées pour démontrer les caractéristiques morphologiques externes telles que la forme, l'arrangement cellulaire, la paroi cellulaire, les flagelles, les pili, la capsule et les structures internes telles que les endospores, les granules cytoplasmiques et le noyau de la cellule microbienne. La coloration ou la coloration implique des étapes telles que le séchage et la fixation du frottis suivi d'un traitement séquentiel avec un colorant ou un mélange de colorants, un mordant, un décolorant et la contre-coloration. Les taches simples telles que le bleu de méthylène confèrent leur couleur directement à la cellule. Les bactéries sont généralement colorées avec des colorants basiques car elles ont un cytoplasme acide. Certaines caractéristiques bactériennes telles que les capsules n'absorbent pas le colorant, elles sont donc colorées négativement. Pour cela, la suspension bactérienne est mélangée avec du colorant nigrosine ou de l'encre de Chine, enduite et séchée. Au microscope, les cellules apparaissent comme des corps brillants non colorés sur un fond de couleur sombre. Certaines bactéries (spirochètes) ne sont pas colorées par de simples colorations, peuvent être observées par coloration négative. Les structures très fragiles comme les flagelles sont colorées par imprégnation de colorant. Puisqu'ils sont très minces, ils sont traités avec une solution de colorant de manière à permettre le dépôt de colorant sur la structure. Cela rend la coloration ainsi que l'augmentation de l'épaisseur de cette structure. Les procédures de coloration différentielle telles que la réaction de Gram et la coloration acido-résistante confèrent une coloration différente à différentes bactéries ou à leurs composants structurels. La coloration de Gram différencie les bactéries en 2 grands groupes : Gram positif et Gram négatif en fonction de leur différence dans la composition de la paroi cellulaire. La coloration de Gram est une technique très essentielle dans l'identification et la classification des bactéries. C'est également un exemple idéal de méthode de coloration des bactéries et il est donc indispensable de le décrire dans cet article. Il a été inventé par le scientifique Christian Gram en 1884. Il comporte 4 étapes : La première étape est la coloration primaire du frottis avec une solution de cristal violet. Dans la deuxième étape, une solution d'iode est appliquée comme mordant pour fixer le colorant primaire dans la paroi cellulaire. La tache primaire est décolorée avec de l'alcool ou de l'acétone. La quatrième étape est la contre coloration au rouge neutre ou à la safranine. Chaque étape est réalisée avec un temps défini suivi d'étapes de lavage intermittentes à l'eau distillée. Les bactéries à Gram négatif prennent la couleur de la contre-coloration tandis que les bactéries à Gram positif conservent la couleur violette du cristal violet. De même, comme les bactéries, les levures, les champignons, les actinomycètes, les algues, les protozoaires et un groupe spécial de bactéries telles que les rickettsies sont colorés pour des études microscopiques.

    Microscope à fond noir- Dans cette microscopie, l'échantillon apparaît brillant sur un fond sombre et ceci est réalisé par le condenseur du microscope. La microscopie à fond noir est utilisée pour l'observation d'échantillons non colorés. Des spécimens à l'état vivant peuvent être observés. Pour cela, des préparations de montage humide et de chute suspendue sont effectuées. La suspension de cellules microbiennes est placée (sous forme de goutte et non de frottis) sur une lame à cavité sans graisse. La lamelle est placée et scellée avec de la cire pour éviter l'évaporation de la goutte de suspension. Bien que les caractères morphologiques ne soient pas révélés, le mouvement des cellules individuelles comme la motilité peut être observé.

    Microscope à contraste de phase- Il est utilisé pour observer les cellules non colorées et leurs différences cytologiques. Son fonctionnement est basé sur le principe que les relations de phase modifiées par l'illumination sont induites par des éléments autrement invisibles dans le cytoplasme. Le microscope est fourni avec un objectif à contraste de phase et un condenseur spécial. Cela permet de distinguer les structures non colorées au sein de la cellule qui ne diffèrent que légèrement par leurs indices de réfraction. Étant donné qu'aucune coloration n'est requise, les changements chimiques et morphologiques ne se produisent pas. Des cellules microbiennes vivantes ou statiques peuvent être observées.

    Microscopie à fluorescence- Le fonctionnement du microscope à fluorescence est basé sur le phénomène de fluorescence. Lorsqu'un colorant absorbe la lumière d'une certaine longueur d'onde, il émet également une lumière de moins d'énergie et de longueur d'onde plus longue. En pratique, les microbes sont colorés avec des colorants fluorescents tels que la fluorescéine ou la rhodamine. La coloration couramment utilisée est la technique des anticorps fluorescents (FAT), également connue sous le nom de méthode d'immunofluorescence directe. Dans ce cas, le colorant fluorescent est combiné avec des anticorps cellulaires microbiens, de tels anticorps marqués sont mélangés avec une suspension microbienne et observés au microscope à fluorescence. Le FAT a été très utile en pathologie diagnostique pour l'identification d'agents pathogènes tels que Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholera, Neisseria meningitidis, Candida albicans, les coliformes fécaux et les streptocoques, les pseudomonades, les virus de la polio et de la rage.

    2. Préparation de la microscopie électronique: Les techniques de microscopie électronique sont considérablement différentes de la microscopie optique. Ils donnent une résolution et un grossissement plus élevés en utilisant un faisceau d'électrons de longueur d'onde extrêmement étroite en présence d'un champ magnétique. Les microscopes électroniques à transmission et à balayage ont des applications et des techniques de préparation d'échantillons variables. Certains d'entre eux sont décrits ici.

    Microscope électronique à balayage- L'échantillon est soumis à un balayage de surface par faisceau d'électrons. Selon la forme et la composition chimique, l'échantillon irradié émet des électrons secondaires. Il révèle la topographie de surface et la structure 3-D de l'échantillon.

    Microscope électronique à transmission (MET) - Les échantillons doivent être ultrafins pour être observés par MET. Même les cellules bactériennes sont très épaisses pour observer les détails intracellulaires. La coupe ultrafine est réalisée par une technique spéciale. Les cellules bactériennes sont intégrées dans un bloc de plastique et coupées en tranches ultrafines (60 nm). Les coupes sont ensuite colorées par des sels d'uranium ou de lanthane. Étant donné que les cellules sont découpées sous différents angles, chaque détail sur l'organisation structurelle est obtenu. Des coupes ultrafines non colorées peuvent être observées par fracturation par congélation. Ici, le spécimen n'est pas coloré mais des répliques en carbone sont préparées pour révéler des détails extracellulaires. Dans une autre technique, l'échantillon est séché sur une grille de cuivre spéciale et placé sous vide. Des atomes de platine métal lourd sont projetés et déposés à partir d'un filament incliné fortement chauffé sur l'échantillon. C'est ce qu'on appelle la projection d'ombre. L'observation MET de l'image ombrée révèle des détails sur la forme de l'échantillon. Coloration négative similaire à la microscopie optique, mais l'acide phosphotungstique dense aux électrons est utilisé comme colorant. Il est utilisé pour observer les détails fins des virus, des flagelles et des pili.


    Voir la vidéo: Biologie Cellulaire - 01- Généralités et Techniques détudes (Décembre 2022).