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15.2 : Analyse du contrôle métabolique - Biologie

15.2 : Analyse du contrôle métabolique - Biologie


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Introduction à l'analyse du contrôle métabolique

La cinétique enzymatique peut sembler difficile étant donné les dérivations mathématiques compliquées, le nombre d'espèces chimiques impliquées (une enzyme et tous ses substrats et produits), le nombre d'étapes du mécanisme et le grand nombre de constantes de vitesse, de cinétique et de dissociation. Un exemple d'une telle réaction « compliquée » exploré précédemment est présenté ci-dessous :


Mais les enzymes simples agissent rarement de manière isolée. Ce sont des composants de voies complexes qui comportent une multitude d'étapes, dont beaucoup sont régulées. Pour bien comprendre une réaction, il est important d'étudier les concentrations de toutes les espèces dans l'ensemble de la voie en fonction du temps. Imaginez dériver les équations et déterminer toutes les concentrations et constantes pertinentes d'une voie telle que la glycolyse !


Pour étudier la cinétique enzymatique en laboratoire, vous devez passer beaucoup de temps à développer des tests pour mesurer comment la concentration des espèces change en fonction du temps pour pouvoir mesurer les vitesses initiales d'une réaction catalysée par une enzyme. Cependant, dans les réseaux de réactions métaboliques connectées, la concentration de certaines espèces dans le système peut ne pas changer. Comment cela peut-il arriver ? Deux exemples simples pourraient aider à expliquer comment.


Exemple 1 : Il n'y a aucune entrée ou sortie d'une réaction donnée. Cela se produirait dans un système fermé pour une réaction réversible à l'équilibre.

Pour une réaction réversible du réactif R allant au produit P avec des constantes de vitesse directe et inverse du premier ordre, l'équation suivante peut être écrite à l'équilibre :

A l'équilibre, R et P ne changent pas.

Exemple 2 : Considérez la réaction comme faisant partie d'une voie de réactions (comme un système ouvert). Imaginez maintenant une entrée non nulle pour former le réactif R et une sortie non nulle qui consomme le produit P. Si les taux d'entrée et de sortie sont les mêmes, les concentrations de R et P ne changeront pas avec le temps. C'est-à-dire que la vitesse de formation d'un réactif R pour une réaction donnée est égale à la vitesse à laquelle le produit P de la réaction donnée est utilisé. Cela conduirait à un état stationnaire mais pas à une concentration d'équilibre de l'espèce.

Comprendre une enzyme pure in vitro et in vivo nécessite des approches différentes. Les biochimistes aiment isoler et purifier jusqu'à homogénéité une enzyme présente dans certains tissus et étudier son mécanisme d'action. En effectuant des mesures thermodynamiques pour mesurer les constantes d'équilibre (Kéq) ou des constantes de dissociation (K), d'où ΔG0 peut être calculée, une concentration en protéine est généralement maintenue constante lorsque la concentration en ligand de liaison varie (variable indépendante). Un signal variable dépendante (souvent spectroscopique) est mesuré. Les mesures sont effectuées lorsque l'équilibre est atteint.

Pour les mesures cinétiques enzymatiques in vitro, la concentration enzymatique est généralement maintenue constante tandis que le substrat et les modificateurs sont modifiés (variables indépendantes) pour déterminer comment la vitesse (variable dépendante) change. La vitesse est déterminée par la concentration du substrat. Lorsque l'inhibition est étudiée, le substrat est varié tandis que l'inhibiteur est maintenu constant à plusieurs concentrations fixes différentes.

In vivo, la concentration en substrat et même la concentration en enzyme sont déterminées par la vitesse. Comparez à nouveau cela à la cinétique in vitro lorsque les concentrations déterminent la vitesse
Pour les ensembles de réactions dans les voies, il est préférable d'utiliser le terme flux, J. En régime permanent, les flux d'entrée et de sortie pour une réaction donnée sont identiques. Le flux J est utilisé pour décrire le taux du système tandis que le taux ou la vitesse v utilisé pour décrire le taux d'une enzyme individuelle dans un système.


Les programmes informatiques peuvent trouver des concentrations d'états stables en trouvant les racines des équations différentielles ordinaires (ODE) lorsqu'elles sont réglées sur zéro (vF = vr). Pour modéliser un processus à de très faibles concentrations, les programmes peuvent également utiliser des simulations probabilistes ou stochastiques pour modéliser les distributions de probabilité pour les espèces et leur évolution dans le temps pour un nombre fini de particules. Dans de telles simulations, les concentrations (mM) sont placées avec le nombre de particules. Les EDO ne fonctionnent pas bien pour décrire ces conditions car les changements de concentrations ne sont pas continus.


Revenons maintenant à notre question rhétorique précédente consistant à dériver les équations et à déterminer toutes les concentrations et constantes pertinentes d'une voie telle que la glycolyse ! Cela a en fait été fait par Teusink et al pour la glycolyse dans la levure. En fait, de nombreuses voies métaboliques et de transduction du signal complexes ont été modélisées mathématiquement dans l'espoir de mieux comprendre les réponses cellulaires et organiques. La modélisation quantitative et la prédiction des intrants, des extrants et des concentrations de toutes les espèces dans des voies complexes constituent la base de la biologie des systèmes.

Principes de base de l'analyse du contrôle métabolique

Une variété d'entrées est requise pour de telles analyses informatiques :

une. Chemins définis. Ceux-ci sont disponibles dans de nombreuses bases de données. Un exemple de voies KEGG pour la glycolyse de levure est présenté ci-dessous

b. Un programme de modélisation informatique pour saisir tous les paramètres, équations, modèles et calculer les concentrations pour toutes les espèces en fonction du temps. Les programmes gratuits et téléchargeables qui le font incluent COPASI, Virtual Cell et Cell Designer. Un exemple de modèle cartographié de Cell Designer pour la glycolyse de levure avec plusieurs réactions supplémentaires dérivées de la voie glycolytique classique est présenté ci-dessous.

Les résultats des calculs des analyses de la glycolyse de la levure n'ont pu s'adapter aux données expérimentales que s'ils étaient corrigés par l'ajout de plusieurs réactions de branchement (illustrées dans les figures ci-dessus et ci-dessous) :

c. Une liste de toutes les espèces impliquées dans la voie (représentée dans la figure ci-dessous pour les réactions de glycolyse et de ramification).

ré. Une liste de toutes les réactions (ci-dessous pour les réactions de glycolyse et de ramification, tirée de COPASI)


e. Paramètres de toutes les espèces. Un exemple est présenté ci-dessous pour l'hexokinase (tiré de COPASI).

F. Équations qui peuvent être utilisées pour calculer l'évolution des concentrations de toutes les espèces avec le temps. Ce sont généralement des équations différentielles ordinaires (EDO) comme décrit dans le chapitre 6B - Cinétique des réactions simples et catalysées par des enzymes, sections B1 : Réactions à une seule étape.) Les EDO sont faciles à écrire mais nécessitent un ordinateur pour les résoudre à mesure que le nombre d'espèces en interaction augmente. .


Un exemple de réaction chimique et un ensemble d'EDO pour chaque espèce sont présentés ci-dessous.

Si une réaction supprime l'espèce X, le côté droit de l'ODE pour la disparition de cette espèce a un signe - pour ce terme. De même, si une réaction augmente l'espèce X, le membre de droite a un signe +. Les exemples ci-dessus montrent des réactions unimoléculaires (C à D, C à A + B) et bimoléculaires (A+B à C).


Un exemple d'ODE tiré de COPASI est montré ci-dessous pour le changement de concentration de glucose-6-phosphate.

Des bases de données contenant des modèles organisés avec toutes les informations ci-dessus ont été développées pour de nombreuses voies. Le modèle de glycolyse de levure décrit ci-dessus se trouve dans la base de données Biomodels. Le modèle, BIOMD0000000064, peut être téléchargé en tant que fichier de langage de balisage de biologie des systèmes (SBML) et importé dans l'un des programmes décrits ci-dessus.
Les graphiques ci-dessous montrent les concentrations pour certaines espèces et toutes les espèces en fonction du temps pour la glycolyse de levure en utilisant COPASI.

Analyse du contrôle métabolique et inhibition enzymatique simple

Les biochimistes modélisent des réactions complexes catalysées par des enzymes en présence et en l'absence de modificateurs (activateurs ou inhibiteurs) pour développer des mécanismes pour les réactions. Les paramètres cinétiques suivants sont déterminés expérimentalement en ajustant la vitesse initiale (vo) en fonction de la concentration du substrat ([S]) grâce à des algorithmes d'ajustement non linéaires.

  • Km – la constante de Michaelis, la concentration de substrat à vitesse semi-maximale ;
  • Vm – la vitesse à la concentration du substrat saturant ;
  • kchat - le chiffre d'affaires pour la conversion du réactif lié en produit ;
  • Kix – constantes de dissociation d'inhibition.


Un exemple d'inhibition compétitive illustre un type courant d'analyse pour de telles réactions.

Une représentation picturale moderne d'une simple réaction irréversible, catalysée par une enzyme du substrat S allant au produit P avec inhibition par le produit et par un inhibiteur ajouté est montrée ci-dessous :

Considérons la simple réaction catalysée par une enzyme pour une conversion réversible du substrat S en produit P qui comporte 3 étapes réversibles.

Si les étapes de réaction chimique directe (f) et inverse (r) (réactions 2 et -2) étaient irréversibles et écrites séparément, des équations simples de Michaelis-Menten pourraient être écrites pour chaque

Pour les réactions réversibles réelles de l'étape 2, le taux à terme net ne peut pas être trouvé par simple soustraction des deux équations ci-dessus, car les équations différentielles décrivant les taux à terme simples et inverses ne tiennent pas compte des étapes inverses.

Une dérivation simple (en supposant un équilibre rapide pour les étapes avant et arrière) peut être faite pour la réaction directe nette. Considérons à nouveau la réaction catalysée par une enzyme suivante :

Vous vous souvenez peut-être que pour les réactions isolées E + S <----> ES et pour E + P <----> EP, les constantes de dissociation simples, KS et KP sont donnés par

L'hypothèse d'équilibre rapide stipule que la vitesse de dissociation de l'ES et de l'EP, qui sont toutes deux des étapes physiques, est beaucoup plus rapide que la vitesse des étapes de conversion chimique pour chaque complexe. D'où k-1 >> k2 et k3 >> k-2, de sorte que les quantités relatives de ES et EP peuvent être déterminées à partir des constantes de dissociation comme indiqué ci-dessus.

La conservation de la masse de l'enzyme donne

À partir de là, nous pouvons obtenir le montant fractionnaire de l'ES et de l'EP


Nous pouvons maintenant dériver l'équation de vitesse pour la réaction directe nette pour le cas d'équilibre rapide :

Sachant que k2E0 et k-2E0 représentent les vitesses maximales, VF et Vr, respectivement, l'équation devient :

Une équation de forme similaire peut être dérivée de l'hypothèse d'état stationnaire. Cette équation est clairement différente de l'équation précédente (4) dérivée en supposant intuitivement une simple soustraction des taux directs et inverses irréversibles dont nous avons maintenant montré qu'ils sont invalides par comparaison.

Des programmes comme COPASI ont de nombreuses équations intégrées pour les vitesses de nombreuses réactions catalysées par des enzymes qui ont des formes similaires. Deux sont illustrés ci-dessous :

Michaelis-Menten réversible :

Inhibition compétitive réversible :


Analyse du contrôle métabolique - Exemple d'essai

Analyse du contrôle métabolique Le but de l'analyse du contrôle métabolique et son lien avec la cinétique enzymatique L'analyse du contrôle métabolique est un modèle utilisé pour examiner la distribution des flux et d'autres concentrations métaboliques dans les voies métaboliques parmi les différentes enzymes trouvées dans la voie (Heinstra & Geer, 1991). Ce modèle suppose qu'il existe une mesure particulière de contrôle de flux distribuée au sein des enzymes. Il est utile car il explique comment la quantité de flux et de concentrations intermédiaires dépend de certaines considérations de réseau particulières.

Le modèle aide à comprendre le contrôle que chaque enzyme exerce sur les flux et les concentrations (Acerenza & Kacser, 1997). L'analyse du contrôle métabolique est une façon d'étudier le comportement cinétique des systèmes enzymatiques. La cinétique enzymatique est l'étude de la façon dont les enzymes catalysent les réactions chimiques. La réalisation d'une analyse du contrôle métabolique aide à comprendre les effets des propriétés que possèdent des enzymes particulières et comment elles affectent les flux et les concentrations métaboliques. En utilisant ce modèle, il est possible de dire comment les changements de concentration enzymatique affectent la sensibilité des variables métaboliques telles que les flux et les concentrations métaboliques.

Par conséquent, l'analyse du contrôle métabolique aide au calcul de ces sensibilités, autrement appelées coefficients de contrôle de flux des enzymes à partir de leurs élasticités ou propriétés cinétiques. Les procédures utilisées dans les calculs sont modifiées pour s'adapter aux conceptions de voies les plus complexes. Par conséquent, des procédures mathématiques ont été dérivées pour permettre le calcul des effets des coefficients de contrôle de flux en fonction de leur intensité. Toutes ces informations sont nécessaires à la compréhension du fonctionnement des réseaux enzymatiques.

Il devient donc possible de prédire leur réaction à toute perturbation hors norme, telle que les perturbations environnementales (Heinstra & Geer, 1991). Différentes manières d'estimer les coefficients de contrôle de flux Les coefficients de contrôle déterminent l'évolution relative des flux et des concentrations , qui se produit en réponse à des changements environnementaux et génétiques sur les enzymes. Ces coefficients sont estimés de différentes manières. Une façon est la modulation unique, qui est une méthode simple, utilisée dans les cas où une seule enzyme est perturbée.

Une autre méthode est la double modulation. Dans cette méthode, deux étapes sont employées dans l'étude d'une voie et sans connaître les propriétés cinétiques à l'avance, puis les propriétés cinétiques sont connues après la réalisation de l'analyse. Cette méthode est avantageuse car les valeurs des changements n'ont pas besoin d'être connues à l'avance. Selon l'analyse d'Acerenza et Cornish-Bowden (1990), cette caractéristique rend la méthode flexible afin qu'elle puisse être utilisée sur différentes structures de différentes tailles.

Références Acerenza, L. & Cornish-Bowden, A. (1997). Généralisation de la méthode de double modulation pour la détermination in situ des élasticités. Biochem, Journal, 327, 217-223. Acerenza, L. & Kacser, H. (1990). Cinétique enzymatique et contrôle métabolique. Une méthode pour tester et quantifier l'effet des propriétés enzymatiques sur les variables métaboliques. Biochemical Journal, 269 (3), 697-707. Heinstra, P.H. & Geer, B.W. (1991). Analyse du contrôle métabolique et variation enzymatique : Manipulation nutritionnelle du flux de l'éthanol aux lipides chez la drosophile. Mol. Biol. Evol., 8(5), 703-708.


Contenu

Un coefficient de contrôle [7] [8] [9] mesure le changement relatif en régime permanent d'une variable système, par ex. flux de voie (J) ou concentration de métabolite (S), en réponse à un changement relatif d'un paramètre, par ex. l'activité enzymatique ou le taux à l'état d'équilibre ( v i > ) de l'étape i. Les deux principaux coefficients de contrôle sont les coefficients de contrôle de flux et de concentration. Les coefficients de contrôle de flux sont définis par

et les coefficients de contrôle de la concentration par

Théorèmes de sommation Modifier

Le théorème de sommation du contrôle de flux a été découvert indépendamment par le groupe Kacser/Burns et le groupe Heinrich/Rapoport au début des années 1970 et à la fin des années 1960. Le théorème de sommation du contrôle des flux implique que les flux métaboliques sont des propriétés systémiques et que leur contrôle est partagé par toutes les réactions du système. Lorsqu'une seule réaction modifie son contrôle du flux, cela est compensé par des changements dans le contrôle du même flux par toutes les autres réactions.

Le coefficient d'élasticité mesure la réponse locale d'une enzyme ou d'une autre réaction chimique aux changements de son environnement. De tels changements incluent des facteurs tels que des substrats, des produits ou des concentrations d'effecteurs. Pour plus d'informations, veuillez vous référer à la page dédiée aux coefficients d'élasticité.

Théorèmes de connectivité Modifier

Les théorèmes de connectivité sont des relations spécifiques entre les élasticités et les coefficients de contrôle. Ils sont utiles car ils mettent en évidence la relation étroite entre les propriétés cinétiques des réactions individuelles et les propriétés du système d'une voie. Il existe deux ensembles de théorèmes de base, un pour le flux et un autre pour les concentrations. Les théorèmes de connectivité de concentration sont à nouveau divisés selon que l'espèce du système S n > est différent de l'espèce locale S m > .

Il est possible de combiner la sommation avec les théorèmes de connectivité pour obtenir des expressions fermées qui relient les coefficients de contrôle aux coefficients d'élasticité. Par exemple, considérons la voie non triviale la plus simple :

En utilisant ces deux équations, nous pouvons résoudre les coefficients de contrôle de flux pour donner

En utilisant ces équations, nous pouvons examiner quelques comportements extrêmes simples. Par exemple, supposons que la première étape soit totalement insensible à son produit (c'est-à-dire ne réagissant pas avec lui), S, alors ε S v 1 = 0 ^>=0> . Dans ce cas, les coefficients de contrôle se réduisent à

C'est tout le contrôle (ou la sensibilité) est sur la première étape. Cette situation représente l'étape classique de limitation du débit qui est fréquemment mentionnée dans les manuels. Le flux à travers la voie dépend entièrement de la première étape. Dans ces conditions, aucune autre étape de la voie ne peut affecter le flux. L'effet est cependant dépendant de l'insensibilité totale de la première étape à son produit. Une telle situation risque d'être rare dans les parcours réels. En fait, l'étape de limitation de vitesse classique n'a presque jamais été observée expérimentalement. Au lieu de cela, une gamme de limites est observée, certaines étapes ayant plus de limites (contrôle) que d'autres.

Nous pouvons également dériver les coefficients de contrôle de la concentration pour la voie simple en deux étapes :

Considérez le cheminement simple en trois étapes :

où D le dénominateur est donné par

Notez que chaque terme du numérateur apparaît dans le dénominateur, cela garantit que le théorème de sommation du coefficient de contrôle de flux est satisfait.

De même, les coefficients de contrôle de concentration peuvent également être dérivés, pour S 1 >

Notez que les dénominateurs restent les mêmes qu'avant et se comportent comme un facteur de normalisation.

Nous pouvons aller plus loin et mettre à l'échelle les dérivés pour éliminer les unités. En multipliant les deux côtés par e 1 > et en divisant les deux côtés par x on obtient les dérivées mises à l'échelle :


Résultats

L'influence du stress LK sur la croissance des plantes d'orge sauvage tibétaine et d'orge cultivée

Trois génotypes d'orge utilisés dans cette expérience ont montré une différence nette de tolérance à la LK en termes de biomasse après une exposition au stress LK pendant 16 jours (Fig. 1a et b). La réduction du poids frais des racines (RFW) et du poids frais des pousses (SFW) causée par LK par rapport au témoin était d'environ 8 % et 25 %, respectivement, en moyenne sur trois génotypes (Fig. 1a et b). L'étendue réduite différait entre trois génotypes, avec XZ141 montrant une réduction significative de RFW et la réduction de deux autres génotypes n'était pas significative (Fig. 1a). Bien que SFW ait été significativement réduit pour les trois génotypes dans les plantes traitées par LK, XZ153 a montré évidemment moins de réduction que les deux autres génotypes (Fig. 1b). De même, les valeurs SPAD (teneur en chlorophylle) des trois génotypes ont été significativement réduites sous stress LK, XZ153 étant le moins (environ 22%) et le XZ141 étant le plus (environ 33%) réduit, respectivement (Fig. 1c).De plus, des symptômes évidents de carence en K ont pu être observés dans les vieilles feuilles de XZ141, tandis que LuDaoMai et XZ153 présentaient respectivement des symptômes modérés et légers (Fig. 1d). En bref, les résultats actuels ont confirmé les conclusions précédentes selon lesquelles le XZ153 était plus tolérant au LK que le XZ141 et LuDaoMai.

Performances de croissance des trois génotypes d'orge dans des conditions contrôlées (C) et pauvres en potassium (LK). une Poids frais de racine (m = 4) (b) Tirez du poids frais (m = 4) (c) Valeur SPAD (teneur en chlorophylle) (m = 6) () Symptômes de LK des vieilles feuilles. * et ** indiquent significatif (p < 0,05) et hautement significatif (p < 0,01) différences entre les traitements témoins, respectivement

Les changements dans les profils des métabolites de trois génotypes en réponse au stress LK

Au total, 57 types de métabolites ont été détectés, qui ont changé de manière significative sous le stress LK par rapport au témoin (C) dans les racines et les feuilles de trois génotypes (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S1). Afin d'identifier les différents métabolites entre l'orge tibétaine sauvage et cultivée en réponse à la nutrition K, tous les profils de métabolites, constitués de 72 échantillons d'orge (c'est-à-dire constitués de deux tissus, trois génotypes, deux niveaux de K et six répétitions), ont été réalisés par Heatmap et l'analyse de cluster hiérarchique. Selon l'analyse Heatmap (Fig. 2), une séparation évidente a pu être observée entre deux tissus végétaux dans le contrôle ou le traitement LK, avec 72 échantillons clairement regroupés en deux classes, tous les 36 échantillons pour la racine et la feuille, respectivement. De plus, deux sous-classes, constituées respectivement des échantillons du contrôle et du traitement LK, ont pu être divisées au sein des échantillons de feuilles et de racines (Fig. 2).

Carte thermique et analyse hiérarchique des clusters pour les 57 métabolites détectés dans les trois génotypes d'orge. C : témoin LK : faible en potassium R : racine L : feuille. Les noms des métabolites indiqués dans les numéros correspondants de 1 à 57 ont été répertoriés dans le fichier supplémentaire 1 tableau S1

Profils des métabolites et voie dans les racines d'orge répondant au stress LK

Au total, 55 métabolites dans les racines ont été modifiés de manière significative dans leurs concentrations sous stress LK par rapport au témoin, dont 18 acides aminés, 14 sucres et polyols, 16 acides organiques et 7 autres composés (tableau 1). Afin de révéler l'effet du stress LK sur l'alternance des métabolites, une analyse PCA a été menée sur ces 55 métabolites (Fig. 3 et Fichier additionnel 2 : Tableau S2). De toute évidence, les échantillons du contrôle et du traitement LK pourraient être clairement séparés par PC1, représentant environ 55,9% de la variation totale (Fig. 3a). Les principaux métabolites contribuant au PC1 comprenaient l'inositol, la putrescine, l'acide maléique, la L-glutamine, le glucose et 10 autres métabolites (Fig. 3a). Le PC2 pouvait clairement séparer les échantillons traités par LK au sein de trois génotypes mais n'a pas séparé les échantillons de contrôle (Fig. 3a). Ainsi, une analyse discriminante par les moindres carrés partiels (PLS-DA) a été en outre menée pour déterminer la différence (Fig. 3b et Fichier supplémentaire 3 : Tableau S3). Dans les conditions de contrôle, les métabolites dans les racines contribuant au composant 1 (représentant environ 41,4 %) étaient la L-glutamine, la L-lysine, l'acide succinique, le saccharose, l'acide fumarique et 10 autres métabolites (Fig. 3b et fichier supplémentaire 3 : Tableau S3).

Analyse de la variation du métabolome racinaire et des 15 principaux métabolites pour le PC1 et le Comp 1. une Analyse en composantes principales (ACP) de la variation du métabolome des racines parmi les échantillons et les 15 principaux métabolites contribuant au PC1 (b) Analyse discriminante des moindres carrés partiels (PLS-DA) de la variation du métabolome des racines parmi les échantillons. PC1 : le premier composant principal PC2 : le deuxième composant principal Comp1 : composant 1 C : témoin LK : faible en potassium R : racine (m = 6)

Sous stress LK, 38 et 11 métabolites dans les racines de XZ153, 30 et 16 métabolites dans les racines de XZ141, et 40 et 10 métabolites dans les racines de LuDaoMai ont montré respectivement une accumulation ascendante et descendante significative (tableau 1). Dans l'ensemble, le stress LK a provoqué une augmentation spectaculaire de plusieurs acides aminés basiques ou neutres (Fig. 4 et Tableau 1). XZ153 a accumulé des teneurs plus élevées en L-phénylalanine (environ 1,5 fois), ornithine (environ 2,9 fois), L-lysine (environ 5,3 fois), L-asparagine (environ 1,8 fois) et L-glutamine acides (environ 11,7 -fold) que XZ141 et LuDaoMai (tableau 1). Alors que les acides aminés acides, tels que l'acide aspartique et le glutamate, ont diminué dans les trois génotypes sous stress LK, XZ141 présentant la réduction la plus importante (tableau 1). L'inhibition de la synthèse de l'acide aspartique conduit à une réduction de la β-alanine en aval (Fig. 4). De plus, la L-alanine et la tyrosine étaient évidemment réduites dans XZ141, mais pas dans les deux autres génotypes (tableau 1).

Voies métaboliques dans les racines des trois génotypes d'orge en réponse à un stress à faible teneur en K. Les six colonnes de gauche à droite sur l'axe X représentent respectivement LuDaoMai (contrôle et traitement), XZ141 (contrôle et traitement) et XZ153 (contrôle et traitement). La concentration de chaque métabolite sur l'axe Y est présentée après normalisation sur le logiciel Metaboanalyst (http://www.metaboanalyst.ca/)

L'accumulation de la plupart des sucres et de leurs métabolites associés a été augmentée sous le stress LK (Fig. 4 et Tableau 1). Les teneurs en métabolites en aval, tels que le fructose, le glucose, le mannitol et le tréhalose, ont également augmenté, s'accompagnant d'une augmentation de la teneur en saccharose. De plus, les niveaux relatifs de glucides, tels que le xylose, l'arabinose, le glucose, le saccharose, le galactose et les polyols étaient plus élevés dans XZ153 que dans XZ141 (Fig. 4 et Tableau 1). XZ153 avait les teneurs en ribose et en tréhalose les plus élevées parmi trois génotypes sous stress LK, augmentant d'environ 3,2 et 2,9 fois respectivement par rapport au témoin (tableau 1).

En revanche, le stress LK a provoqué une réduction significative des métabolites impliqués dans le cycle du TCA, comme le montrent les teneurs réduites en acide succinique, citrate, acide malique et acide cétoglutarique (Fig. 4 et Tableau 1), indiquant que la production d'énergie par le cycle du TCA s'est détériorée sous stress LK. Il est intéressant de noter qu'il y avait une différence génotypique significative dans la teneur relative en citrate, en acide cétoglutarique et en acide malique sous stress LK, XZ141 montrant plus de réduction que les deux autres génotypes (Fig. 4 et Tableau 1). De plus, les teneurs en certains acides organiques, tels que l'acide benzoïque, l'acide maléique et l'acide ascorbique ont augmenté sous stress LK, tandis que l'acide quinique a diminué dans XZ141 (Fig. 4 et Tableau 1). De plus, la différence génotypique a également été détectée dans d'autres métabolites, notamment l'urée, l'uracile et les acides pipéridine (tableau 1).

Profils et cheminement des métabolites dans les feuilles d'orge répondant au stress LK

Les métabolomes foliaires de trois génotypes ont également été considérablement modifiés sous stress LK par rapport au témoin (tableau 2). Au total, 52 métabolites ont été modifiés de manière significative dans leurs concentrations sous stress LK par rapport au témoin (tableau 2). Les résultats de l'ACP ont montré que PC1 pouvait séparer les échantillons de contrôle et de traitement LK, représentant environ 56,2 % de la variation (Fig. 5 et Fichier supplémentaire 4 : Tableau S4). Contrairement aux racines, PC2 pourrait clairement séparer les échantillons de feuilles au sein des génotypes, expliquant environ 17,5% de la variation (Fig. 5). Les 15 principaux métabolites contribuant au PC1 dans les feuilles étaient 5 sucres (glucose, fructose, arabinose, sorbose et galactose) et 3 acides aminés (valine, tyrosine et leucine), et 7 autres métabolites, tandis que le PC2 était dominé par l'acide fumarique, β-alanine, maltose, L-alanine et L-proline (Fig. 5 et Fichier additionnel 4 : Tableau S4).

Analyse de la variation du métabolome des feuilles et des 15 principaux métabolites contribuant aux PC1 et PC2. PC1 : le premier composant principal PC2 : le deuxième composant principal C : témoin LK : faible en potassium L : feuille (m = 6)

Comme les changements de métabolites racinaires, les niveaux de plus des deux tiers d'acides aminés ont également été augmentés dans les feuilles des plantes soumises à un stress LK (tableau 2). Parmi eux, la L-sérine (environ 2,0 fois), la L-phénylalanine (3,7 fois), la L-lysine (5,3 fois), la tyrosine (4,9 fois), la L-asparagine (43,1 fois) et l'acide glutamique ( 13,8 fois) avait plus d'augmentation dans XZ153 que dans XZ141 et LuDaoMai (tableau 2). Cependant, l'acide aspartique et l'acide glutamique ont été réduits dans les trois génotypes, XZ141 étant le plus touché (Fig. 6 et Tableau 2).

Voies métaboliques dans les feuilles des trois génotypes d'orge en réponse à un stress à faible teneur en K. Les six colonnes de gauche à droite sur l'axe X représentent respectivement LuDaoMai (contrôle et traitement), XZ141 (contrôle et traitement) et XZ153 (contrôle et traitement). La concentration de chaque métabolite sur l'axe Y est présentée après normalisation sur le logiciel Metaboanalyst (http://www.metaboanalyst.ca/)

Le stress LK a augmenté les teneurs en certains sucres solubles (tels que le glucose, le fructose et le saccharose) par rapport au témoin (Fig. 6 et Tableau 2). Par conséquent, XZ153 a montré une augmentation spectaculaire des teneurs en glucose (environ 24,8 fois), en galactose (13,5 fois) et en arabinose (3,6 fois) sous stress LK, soit une augmentation beaucoup plus importante que les deux autres génotypes. Il est intéressant de noter que l'effet du stress LK sur la teneur en saccharose différait grandement entre les tissus végétaux et entre les génotypes. XZ153 et LuDaoMai ont eu peu de changement dans les feuilles sous stress LK, alors qu'ils ont montré une augmentation significative des racines (Fig. 6 et Tableau 2). En revanche, XZ141 a montré une augmentation significative des feuilles sous stress LK, tandis que peu de changements dans les racines (tableau 2).

De plus, le cycle du TCA était fortement inhibé sous stress LK, comme le montrent les teneurs plus faibles en acide citrique, acide cétoglutarique et succinique ainsi que d'autres intermédiaires du TCA par rapport au témoin (Fig. 6 et Tableau 2). Par exemple, les teneurs en acide cétoglutarique et en acide malique ont été significativement diminuées dans XZ141, étant beaucoup plus faibles que les deux autres génotypes. De plus, une accumulation réduite d'acide ascorbique et d'acide pyroglutamique a été enregistrée sous stress LK dans XZ141, mais pas dans les deux autres génotypes (tableau 2).


Résultats

Courbes d'étalonnage du lactate

L'une des caractéristiques les plus pertinentes de l'approche MCA est la possibilité de décrire la réponse du système et la distribution du contrôle le long de la voie métabolique de manière quantitative. Dans le cas à l'étude, la quantification précise du lactate du produit final est une question importante pour la détermination correcte du flux glycolytique (Fig. 2A).

Pour quantifier le lactate, il est primordial de calibrer le dosage en prenant en compte une courbe de référence avec des masses de lactate connues. La figure 2B montre un schéma des réactions couplées qui permettent facilement à l'étudiant d'effectuer des mesures de lactate. D'autre part, la figure 2D montre un instantané d'une plaque à 96 puits représentative des résultats typiquement obtenus lorsque la réaction colorimétrique est terminée. La courbe d'étalonnage (exécutée en double) est obtenue indépendamment par différents groupes d'étudiants : les valeurs d'absorbance sont tracées en fonction de la masse de lactate (Fig. 3A et Tableau 1). Il est à noter que la linéarité est observée jusqu'à 40 nmoles de lactate, limite supérieure utile pour les mesures qui s'ensuivent.

Pente (Abs × nmol −1 )
Un groupe d'étudiants (2017) 0.0217 ±0.0009 0.0216 ±0.0009
cohorte 2016 0.0178 ± 0.0001
cohorte 2017 0.0208 ± 0.0003
  • Des solutions de différentes concentrations de lactate ont été utilisées pour construire une courbe d'étalonnage en utilisant les réactifs du kit Roche Diagnostics (Indianapolis, Indiana) et des photographies de plaques 96 puits (Supporting Information Fig. S3). A titre d'exemple, ce tableau montre les pentes des courbes d'étalonnage obtenues par un groupe de 20 étudiants (2017) pour une plaque mesurée en double. De même, les moyennes des pentes mesurées par tous les groupes d'étudiants ayant terminé le cours en 2016 (cohorte 2016) ou en 2017 sont présentées. Les écarts types de chaque résultat sont également indiqués.

Nous avons également testé les performances de détection du lactate après dilution des réactifs jusqu'à 10 fois, en notant que le test reste fonctionnel, mais que la plage linéaire devient plus courte à des dilutions plus élevées. Par conséquent, pour réduire les coûts sans compromettre les performances, nous avons décidé de ne diluer les réactifs qu'à moitié. Cette dilution représente un bon choix, car elle garantit une réponse uniformément linéaire dans le canal vert. La figure 3B et le tableau 1 montrent les résultats obtenus par groupes d'élèves au cours de deux périodes de cours consécutives (2016 et 2017). Une grande reproductibilité est observée par comparaison des résultats de ces deux cohortes.

Mesures du flux glycolytique et son inhibition par l'IAA

Comme indiqué ci-dessus, nous mesurons le flux glycolytique en présence de différentes concentrations d'IAA en quantifiant la quantité de lactate extracellulaire sécrétée par les globules rouges en fonction du temps d'incubation (Fig. 4 ). Le stockage des globules rouges dans des conditions de banque de sang produit des altérations biochimiques significatives 15 , en particulier après les 2 premières semaines de stockage 32 . Des différences quantitatives dans le flux glycolytique et les caractéristiques de régulation de cette voie métabolique peuvent être observées, en fonction du vieillissement. in vitro des cellules, devenant ainsi de la plus haute importance pour travailler avec des globules rouges fraîchement prélevés.

Les résultats d'une expérience typique réalisée en double par un groupe d'étudiants sont présentés dans les panneaux A et B de la figure 4. Pour estimer les valeurs du flux, les étudiants traitent les données par régression linéaire sur chaque série temporelle correspondant à une concentration d'inhibiteur donnée dosée. . Les résultats sont présentés sous forme de graphique combiné comprenant toutes les données disponibles. Comme prévu, en l'absence d'IAA, la quantité de lactate dans le surnageant montre l'augmentation la plus importante avec le temps, démontrant ainsi que les globules rouges restent métaboliquement actifs dans ces conditions expérimentales : incubation de 90 min à 37 ° C dans un tampon de RBC, 20 mM de glucose. Surtout, aucune hémolyse significative n'est observée au cours de cette période d'incubation, les valeurs de concentration de lactate au début de l'expérience sont très similaires pour toutes les conditions essayées, et la réaction colorimétrique pour le dosage du lactate ne subit pas d'interférence par l'inhibiteur jusqu'à la concentration la plus élevée dosée. . Plus important encore, la production linéaire de lactate observée en fonction du temps est cohérente avec la principale condition nécessaire pour appliquer ce type d'analyse, à savoir que le système respecte l'état stationnaire.

D'autre part, la présence de l'inhibiteur d'IAA diminue la production de lactate, en particulier lorsque les cellules sont exposées à une concentration d'IAA supérieure à 1 mM. En effet, l'exposition à 5 mM d'IAA entraîne une abrogation complète de la production de lactate. À ce stade de l'activité, les étudiants se rendent compte que l'IAA provoque une perturbation majeure de la voie métabolique impliquée dans la production de lactate : la glycolyse couplée à la fermentation du lactate.

Remarquablement, chaque concentration d'inhibiteur détermine un état stationnaire différent, caractérisé par un flux de lactate particulier. Grâce à une simple inspection, les étudiants peuvent facilement comparer les flux mesurés. De plus, le calcul de l'erreur standard associée à l'ajustement de la régression linéaire permet d'évaluer la précision des mesures de flux de lactate. L'expérience que nous avons recueillie montre la robustesse globale de l'ensemble de données résultant.

Résultats de flux (JIAA) les données en fonction de la concentration d'IAA obtenues par deux groupes indépendants d'étudiants de la cohorte 2017 sont représentées sur la figure 5A et le tableau 2. Le profil de variation du flux avec la concentration incrémentale d'IAA est très reproductible. Les données accumulées obtenues par tous les groupes d'étudiants en 2016 et 2017 sont représentées graphiquement ensemble (Fig. 5B et Tableau 2). Quelques points intéressants pour la discussion découlent de l'observation de la forme du graphique. Premièrement, différentes régions peuvent être clairement définies dans le JIAA par rapport aux courbes [IAA]. En fait, un léger incrément de flux (plus évident dans l'ensemble de données de 2017) peut être observé à une faible concentration d'AIA. En revanche, à des concentrations supérieures à 0,5 mM, l'IAA entraîne une nette inhibition du flux de la voie. Le flux diminue brusquement à des concentrations d'IAA comprises entre 1 et 2 mM, atteignant des valeurs presque nulles à environ 5 mM.

IAA Flux glycolytique
(mm) (μM min −1 )
Un groupe d'étudiants (2017) cohorte 2016 cohorte 2017
0.00 14.0 ± 1.2 une 11.7 ± 1.4 b 10.6 ± 3.0 13.6 ± 2.3
0.05 11.7 ± 0.8 13.5 ± 1.3 10.4 ± 3.4 14.1 ± 1.6
0.10 13.9 ± 1.4 14.5 ± 1.2 10.4 ± 2.7 14.5 ± 1.5
0.50 15.1 ± 0.7 14.4 ± 1.5 8.8 ± 3.3 13.6 ± 1.3
0.75 14.0 ± 2.1 12.2 ± 3.2 5.8 ± 1.9 13.6 ± 1.3
1.00 13.3 ± 1.9 10.6 ± 2.8 2.7 ± 1.1 12.2 ± 1.7
2.00 2.6 ± 0.7 1.8 ± 0.4 0.4 ± 0.6 2.7 ± 0.9
5.00 0.4 ± 0.7 0.3 ± 0.3 0.0 ± 0.4 0.4 ± 1.4
  • Les flux glycolytiques mesurés en tant que production de lactate ont été calculés à partir des pentes des droites montrées sur la figure 2. Ce tableau montre les flux calculés par un groupe de 20 étudiants pour une microplaque et b pour sa double. De plus, les moyennes des flux calculés pour chaque concentration IAA par tous les groupes d'étudiants ayant terminé le cours en 2016 ou 2017 sont présentées. Les écarts types de chaque résultat sont également indiqués.

Réponse du système à l'IAA de l'inhibiteur GAPDH

Une analyse plus approfondie a été menée pour résoudre le problème de la sensibilité du flux à la présence d'inhibiteurs. La Fig. 6 montre l'ajustement de l'Eq. 6 aux données de flux glycolytique et au comportement de la réponse de flux calculée à la concentration d'IAA (R IAA J). Cet exercice de régression non linéaire permet de retrouver, de manière simple, la fonction dérivée ∂ J ss ∂ IAA [Eq. 7] et le coefficient de réponse R IAA J [Eq. 8]. Après l'ajustement initial, ce dernier peut être calculé plus directement avec l'équation. 9.

Là encore, trois régions différentes peuvent être observées dans la courbe R IAA J. La première (dans la gamme de concentrations d'IAA entre 0 et 1 mM) est caractérisée par des valeurs légèrement positives du coefficient de réponse. Dans la seconde région (la plage entre 1 et 2 mM) des valeurs très négatives du coefficient sont observées, indiquant que le flux glycolytique devient très sensible à une modification de la concentration en inhibiteur. Cette région met en évidence le fait que des changements subtils de la concentration d'inhibiteur peuvent produire un grand changement dans le flux glycolytique. En d'autres termes, dans cette condition métabolique, par exemple, le flux à l'état d'équilibre mesuré à 1,5 mM d'IAA, le flux glycolytique présente une sensibilité élevée à l'inhibition, probablement en raison d'un petit changement dans l'activité GAPDH. La troisième région (concentrations d'IAA supérieures à 2,2 mM) est dominée par de très faibles flux glycolytiques et les coefficients de réponse approchent de zéro à des concentrations d'IAA supérieures à 3 mM.

La variation observée dans le flux glycolytique peut être principalement attribuée à un effet de l'inhibiteur ciblant l'activité GAPDH. Cependant, dans la cellule, il a été rapporté que l'IAA réagit également avec la forme réduite du glutathion (GSH), affectant ainsi le potentiel redox du compartiment cytoplasmique et compromettant le métabolisme du GSH 29 . Dans ce contexte complexe, l'IAA ne peut pas être considéré comme un inhibiteur enzymatique spécifique, ce qui exclut le calcul du coefficient de contrôle du flux de GAPDH C GAPDH J sur la voie glycolytique en prenant simplement en considération le coefficient de flux de réponse R IAA J et la valeur d'élasticité de GAPDH en IAA IAA GAPDH , comme dans l'Éq. 5.

Différentes réponses à l'IA et aux inhibiteurs de l'IAA

Nous analysons également l'effet de l'IA en tant qu'inhibiteur potentiel de la voie de la glycolyse et de la fermentation du lactate (Fig. 7).Il a été rapporté que l'IA se comporte comme un inhibiteur plus puissant de la GAPDH car il interagit plus favorablement avec cette enzyme que l'IAA 29 . Dans la figure 7 , le flux glycolytique en fonction des concentrations d'IAA ou d'IAA est tracé côte à côte pour comparaison. De façon frappante, l'effet maximal de l'IA est observé à une concentration d'inhibiteur très faible (environ 0,1 mM), bien en deçà de celle où l'IAA montre son effet maximal (2,2 mM : plus de 20 fois plus élevé que le premier). Bien que similaire en ce qui concerne leur réactivité chimique, la réponse à chaque inhibiteur est complètement différente. Ces résultats concordent bien avec ceux observés dans d'autres types cellulaires comme les astrocytes, qui ont montré l'effet différentiel de ces inhibiteurs sur le système redox cellulaire à base de thiol-disulfure 29 . L'IAA peut compromettre le métabolisme cellulaire du glutathion beaucoup plus sévèrement que l'IA29. Pour cette raison, il est probable que la concentration effective d'IA à l'intérieur des globules rouges soit plus élevée que celle atteinte par l'IAA car ce dernier réagit dans une plus grande mesure que le premier avec le groupe thiol du glutathion réduit. En revanche, IA et IAA pourraient différer au niveau de leur action sur le transport de l'acide lactique. On peut supposer que l'effet IA amélioré pourrait bénéficier de la cooptation de la machinerie de transport d'anions (le MCT, Fig. 2), facilitant son entrée dans le compartiment cytosolique et/ou modifiant le flux sortant d'acide lactique. Bien que nous n'ayons trouvé aucun rapport spécifique sur ce point, cela peut être une question intéressante à discuter avec les étudiants en classe. Fait intéressant, pour IAA, il a été trouvé l'état d'équilibre avec le coefficient de réponse le plus élevé atteignant la valeur R IAA J

− 3,0 , alors que pour IA le coefficient prend une valeur de R IA J

Comme il a été mentionné précédemment, il serait utile de profiter du coefficient de réponse pour évaluer le coefficient de contrôle de flux de GAPDH. Cependant, pour effectuer cette analyse de la manière la plus simple, il est nécessaire que la modulation du flux glycolytique soit provoquée par un inhibiteur spécifique de l'enzyme [permettant ainsi l'application valide des Eqs. 4, 5], car, uniquement dans ce cas, le changement produit dans le flux serait entièrement déclenché par le changement de l'activité d'une seule enzyme (numériquement décrite par le élasticité de cette enzyme à l'inhibiteur). Seulement de cette façon Eq. 4 pourrait être appliqué pour calculer le coefficient de contrôle de cette enzyme. À cet égard, il sera extrêmement intéressant d'étudier le comportement de l'inhibiteur irréversible de l'acide koningique (KA), un produit naturel, qui s'est avéré être un inhibiteur sélectif de la GAPDH 33-35. Le coefficient d'élasticité de GAPDH des globules rouges pour KA peut être calculé expérimentalement. En fin de compte, l'utilisation de l'Eq. 4 nous permettrait de déduire si la GAPDH se comporte effectivement comme une enzyme de contrôle du flux de la glycolyse et, plus important encore, dans quelle amplitude l'enzyme exerce ce contrôle.

Points de vue

Au cours des trois dernières décennies, la MCA a été étendue pour traiter pratiquement tous les types de structures métaboliques, y compris les interactions enzyme-enzyme et la canalisation 36 et les processus physiologiques complexes tels que l'excitation-contraction et l'énergie mitochondriale dans les myocytes 37 . Les enseignants doivent évaluer le niveau de détail de la théorie qui doit être inclus dans un niveau de biochimie de premier cycle, en fonction du contexte académique.

Bien que le MCA reste encore peu connu des biotechnologues, il pourrait bien fournir la clé pour comprendre pourquoi l'impact des manipulations génétiques sur la production de métabolites commerciaux a été plutôt décevant 8, 41 . À cet égard, les étudiants pourraient utiliser des modèles mathématiques organisés de glycolyse de levure de divers degrés de complexité, qui contiennent l'ensemble complet d'équations décrivant les vitesses de chaque étape métabolique. Ces modèles peuvent ensuite être chargés dans des programmes de modélisation tels que COPASI 14, afin de simuler les changements dynamiques des variables du système lorsque l'amplitude des paramètres du système est modifiée. Cette approche pourrait être utilisée pour identifier des cibles clés qui permettent d'augmenter la production de produits biotechnologiquement pertinents, tels que l'éthanol 11 ou le glycérol 42, et d'analyser l'adéquation des souches de levure déjà disponibles. Ce peut aussi être l'occasion de comparer la sensibilité de la glycolyse chez la levure, par opposition à celle observée dans les globules rouges.

Limites de l'application de l'approche MCA

L'ACM a été couramment utilisée pour décrire comment les changements dans les activités enzymatiques d'une voie métabolique donnée déterminent la forme sous laquelle les variables métaboliques (flux et concentrations de métabolites) réagissent. Ceci est défini au moyen des coefficients de réponse et de contrôle. Cependant, la stratégie a été développée à l'origine pour prédire l'effet sur les variables du système de changements infinitésimaux en activités [a δv je donne lieu à unJ ss , Éq. 1]. Dans certains cas, l'incapacité d'augmenter un flux donné en modifiant l'activité d'une enzyme particulière est due à une diminution inattendue du coefficient de contrôle de cette enzyme lorsque son activité a été augmentée. De manière remarquable, d'autres approches ont également été développées, qui considèrent les coefficients de de grands changements. En effet, ici, des différences quantitatives et qualitatives ont été trouvées dans la réponse par rapport à l'infinitésimal traitement 43, 44 . Cela devrait être pris en compte dans l'ingénierie des voies métaboliques lorsque des réponses plus importantes sont requises, par exemple, dans le cas d'applications biotechnologiques.


OBJECTIFS

Pour favoriser une connexion facile entre enzymologie et métabolisme

Construire un modèle de voie métabolique à partir des paramètres cinétiques des enzymes impliquées et de quelques données sur les concentrations de substrats et de modulateurs

Montrer clairement qu'il existe une relation étroite entre le comportement local de toute enzyme et les réponses systémiques des voies métaboliques

Obtenir, par simulation, une méthode simple, rapide et peu coûteuse pour obtenir les données nécessaires à l'application de la théorie MCA

Utiliser des concepts qui ne sont pas toujours clairement assimilés par les élèves

Faciliter l'apprentissage des différents coefficients et théorèmes de l'ACM


Discussion

Le métabolisme est un phénomène complexe régulé à plusieurs niveaux. Ces dernières années, une famille de facteurs de transcription activés par des ligands appelés récepteurs nucléaires a émergé en tant que régulateurs clés des processus métaboliques. Les récepteurs nucléaires sont activés par des métabolites tels que les acides gras et le glucose, et ils contrôlent les boucles de rétroaction négative 12,33, offrant une opportunité de reprogrammer le métabolisme au niveau transcriptionnel. Cette approche est intéressante dans le contexte des maladies métaboliques et des infections virales, où le ciblage pharmaceutique des régulateurs transcriptionnels pourrait recâbler les états métaboliques chroniques.

Dans ce travail, nous avons étudié les effets de l'infection par le VHC sur les hépatocytes humains primaires. Nos cocultures d'hépatocytes humains primaires avec des cellules endothéliales L-SIGN + ont montré une infection robuste, affectant 50 % des cellules (Fig. 1), par rapport aux taux d'infection précédemment rapportés de 6 à 10 % (réf. 10). Des taux d'infection similaires, allant de 20% à 50%, ont été trouvés in vivo 34,35 . Contrairement aux travaux antérieurs sur les cellules Huh7, l'infection des hépatocytes primaires a reproduit l'accumulation de lipides et l'hypolipidémie, signes cliniques de l'infection, correspondant à la signature transcriptionnelle et métabolique des échantillons de patients (Fig. 6). Cela nous a permis de suivre les changements métaboliques en toute confiance et de corréler ces changements à leurs régulateurs transcriptionnels sous-jacents (Figs. 3, 4, 5).

L'effet de l'infection par le VHC sur l'expression du CYP450 est un domaine d'intérêt majeur pour le développement pharmaceutique, et il n'a pas pu être étudié dans les cellules Huh7, car les tumeurs montrent une expression minimale des enzymes CYP450. Nous montrons que le VHC régule positivement le CYP3A4 à la fois in vitro et in vivo (Fig. 5). Cette augmentation affecterait les taux de clairance des médicaments antiviraux émergents qui sont des substrats du CYP3A4, tels que le télaprévir, le bocéprévir et le siméprévir.

Nous montrons également que l'infection par le VHC des hépatocytes primaires induit la glycolyse sur la phosphorylation oxydative d'une manière similaire à l'infection par le VHC des fibroblastes 2 et l'effet Warburg dans le cancer 36,37. Bien qu'une régulation positive de la glycolyse ait été précédemment observée dans les cellules Huh7.5 infectées par le VHC via une analyse protéomique 6 , la phosphorylation oxydative et le métabolisme de la glutamine 6 ont également été observés. Cela suggère que la régulation à la hausse globale des voies métaboliques précédemment rapportée était le résultat de la régulation à la hausse induite par le VHC de la prolifération de Huh7.5, plutôt que de la réponse de l'hôte à l'infection 38 . En revanche, notre modèle montre une induction frappante de la glycolyse par rapport à la phosphorylation oxydative dans les hépatocytes humains primaires et les cellules Huh7.5 à croissance arrêtée (Fig. 10 supplémentaire), renforçant les preuves antérieures de la glycolyse induite par le HCMV dans les fibroblastes affamés de sérum 2 .

Une recherche impartiale de régulateurs métaboliques a montré que HNF4α, un récepteur nucléaire associé à MODY 39 , joue un rôle essentiel dans la réponse glycolytique de l'hôte. Bien qu'il existe des rapports contradictoires concernant les HNF dans l'infection par le VHC 40,41, notre travail montre clairement que l'inhibition de HNF4α inverse la glycolyse dans les cellules infectées. La suppression de la glycolyse par Medica16, BI6015 ou les inhibiteurs glycolytiques 2DG et BrPA a bloqué la réplication du VHC en raison de la limitation du substrat (Fig. 3). Il est important de noter que le traitement a également augmenté l'apoptose dans les cellules infectées par le VHC, ce qui suggère que le processus est entraîné par la dépendance de l'hôte à l'énergie non oxydante (Fig. 2) plutôt que par les besoins du virus.

Démêler le métabolisme des lipides s'est avéré plus complexe. Une analyse précoce des cellules infectées par le VHC a suggéré une induction croisée de l'oxydation des acides gras et de la lipogenèse 6 . La lipogenèse est induite de manière similaire dans l'infection par le HCMV et certains types de cancer 42 , mais pas dans l'infection par le VHC des hépatocytes primaires. En fait, il a récemment été démontré que la peroxydation lipidique atténue la réplication et la sortie du VHC 43,44. Nos résultats montrent une induction dépendante de PPARα de l'oxydation des acides gras et une suppression dépendante du FXR de la biosynthèse du cholestérol (Fig. 4). Une activation similaire de FXR a un rôle critique dans la carcinogenèse hépatique 45 . Ces résultats sont surprenants, car le VHC repose sur la biosynthèse du cholestérol pour ancrer son cofacteur NS5A via FBL2 (réf. 46) et sur les gouttelettes lipidiques pour la réplication et la sortie dépendante des lipoprotéines 29,47. Il est important de noter que l'inhibition du récepteur nucléaire ou de l'oxydation directe des acides gras a provoqué une régulation à la hausse considérable de la réplication du VHC, suggérant que contrairement à HNF4α, les effets de PPARα et FXR font partie d'une réponse antivirale de l'hôte.

En résumé, notre travail fournit une empreinte métabolique de l'infection par le VHC dans les hépatocytes humains primaires, la mappant aux régulateurs transcriptionnels qui peuvent être modulés pharmaceutiquement. Nous montrons que l'infection virale affecte considérablement le métabolisme de l'hôte, mais pas toujours au profit du virus. Les résultats montrent que les besoins du virus peuvent entrer en conflit avec les besoins énergétiques de l'hôte et que la réplication du virus peut être étroitement contrôlée par des interactions positives et négatives avec l'hôte 48 .


Introduction

Les maladies oncologiques telles que les cancers du sein et colorectal sont toujours l'une des principales causes de décès prématuré chez les personnes. La faible efficacité de la médecine contemporaine dans le traitement de ces tumeurs malignes est largement due à une mauvaise compréhension des processus impliqués dans la dissémination métastatique des cellules cancéreuses ainsi que des propriétés énergétiques uniques des mitochondries des tumeurs. Les connaissances actuelles soutiennent l'idée que les cellules humaines du cancer du sein et du cancer colorectal présentent des taux accrus de consommation de glucose affichant un phénotype Warburg, c'est-à-dire une glycolyse élevée même en présence d'oxygène (Warburg et Dickens, 1930 Warburg, 1956 Izuishi et al., 2012). Néanmoins, il existe certaines preuves que dans ces tumeurs malignes, la phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS) est la principale source d'ATP plutôt que la glycolyse. Les cellules cancéreuses ont été classées selon leur schéma de remodelage métabolique en fonction de l'équilibre relatif entre la glycolyse aérobie et l'OXPHOS (Bellance et al., 2012). Le premier type de cellules tumorales est hautement glycolytique, le second déficient en OXPHOS et le troisième type de tumeurs présente un OXPHOS amélioré. Des études récentes suggèrent fortement que les cellules cancéreuses peuvent utiliser le lactate, les acides gras libres, les corps cétoniques, le butyrate et la glutamine comme substrats respiratoires clés provoquant un remodelage métabolique des cellules environnantes normales vers l'effet de la glycolyse aérobie (Whitaker-Menezes et al. , 2011 Salem et al., 2012 Sotgia et al., 2012 Witkiewicz et al., 2012). Dans les cellules normales, le système OXPHOS est généralement étroitement lié aux systèmes de phosphotransfert, y compris divers isotypes de créatine kinase (CK), qui assurent un fonctionnement sûr de l'énergétique sur une large gamme fonctionnelle d'activités cellulaires (Dzeja et Terzic, 2003). Cependant, nos connaissances actuelles sur la fonction du système CK/créatine (Cr) dans le cancer du sein humain et le cancer colorectal sont insuffisantes. Dans certaines tumeurs malignes, par exemple les sarcomes, le système CK/Cr s'est avéré fortement régulé à la baisse (Bera et al., 2008 Patra et al., 2008). Nos études précédentes ont montré que l'activité de la CK liée aux mitochondries (MtCK) était significativement diminuée dans les cellules tumorales HL-1 (Monge et al., 2009), par rapport aux cellules cardiaques parentes normales où l'OXPHOS est la principale source d'ATP et le Le système CK est un vecteur énergétique principal. Dans la présente étude, nous avons estimé le rôle de MtCK dans le maintien de l'homéostasie énergétique dans les cellules cancéreuses colorectales humaines.

Comprendre le contrôle et la régulation du métabolisme énergétique nécessite des outils analytiques qui prennent en compte les interactions existantes entre les composants individuels du réseau et leur impact sur la fonction du réseau systémique. L'analyse du contrôle métabolique (ACM) est un cadre théorique reliant les propriétés des systèmes métaboliques aux caractéristiques cinétiques de leurs composants enzymatiques individuels (Fell, 2005). Une approche expérimentale de l'ACM a déjà été appliquée avec succès aux études d'OXPHOS dans des mitochondries isolées (Tager et al., 1983 Kunz et al., 1999 Rossignol et al., 2000) et dans des fibres musculaires écorchées (Kuznetsov et al., 1997 Tepp et al., 2010).

Des travaux récents des groupes Moreno-Sanchez et Westerhoff ont appliqué l'ACM pour étudier le contrôle du flux glycolytique et de la respiration mitochondriale dans différents types de cellules tumorales en culture. Une conclusion principale de ces études est que l'importance d'OXPHOS dans la bioénergétique des cellules cancéreuses doit être réévaluée et déterminée expérimentalement pour chaque type particulier de néoplasme (Marin-Hernandez et al., 2006 Moreno-Sanchez et al., 2007, 2008 , 2010). Ces résultats ont également indiqué que l'ACM peut être une approche très utile pour étudier in situ respiration mitochondriale et flux d'énergie.

Dans le présent travail, nous avons appliqué l'ACM pour in situ étudie le métabolisme énergétique dans les cellules cancéreuses humaines. En utilisant l'oxygraphie et l'ACM dans des cellules cancéreuses du sein et du cancer colorectal humaines perméabilisées (Kuznetsov et al., 1997), nous avons caractérisé quantitativement le contrôle exercé par les différents composants de la chaîne respiratoire et le synthasome ATP (Tepp et al., 2011).


15.2 : Analyse du contrôle métabolique - Biologie

Une seule mutation du gène GSTe2 permet de suivre la résistance aux insecticides d'origine métabolique dans un vecteur majeur du paludisme

15 2 R27 http://genomebiology.com/2014/15/2/R27

2014 Riveron et al. titulaire de la licence BioMed Central Ltd. Il s'agit d'un article en libre accès distribué selon les termes de la Creative Commons Attribution License ( http://creativecommons.org/licenses/by/2.0 ), qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur tout support, à condition que l'œuvre originale soit correctement citée. La dérogation Creative Commons Public Domain Dedication (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) s'applique aux données mises à disposition dans cet article, sauf indication contraire.

La résistance métabolique aux insecticides est la plus grande menace pour l'efficacité continue de la lutte contre les vecteurs du paludisme. Cependant, sa base moléculaire sous-jacente, cruciale pour une gestion réussie de la résistance, reste mal caractérisée.

Ici, nous démontrons que le seul changement d'acide aminé L119F dans un gène de glutathion S-transférase régulé à la hausse, GSTe2, confère des niveaux élevés de résistance métabolique au DDT dans le vecteur du paludisme Anopheles funestus. L'analyse de la transcription à l'échelle du génome a révélé que GSTe2 était le gène de détoxification le plus surexprimé chez les moustiques résistants au DDT et à la perméthrine du Bénin. L'expression transgénique de GSTe2 chez Drosophila melanogaster a démontré que la sur-transcription de ce gène à lui seul confère une résistance au DDT et une résistance croisée aux pyréthroïdes. L'analyse du polymorphisme de GSTe2 a établi que la mutation ponctuelle est étroitement associée à la résistance métabolique au DDT et que sa répartition géographique est fortement corrélée avec les schémas de résistance au DDT à travers l'Afrique. La caractérisation fonctionnelle de la GSTe2 recombinante soutient en outre le rôle de la mutation L119F, l'allèle résistant étant plus efficace pour métaboliser le DDT que l'allèle sensible. Surtout, nous montrons également que GSTe2 métabolise directement la perméthrine pyréthroïde. L'analyse structurale révèle que la mutation confère une résistance en agrandissant la cavité de liaison au DDT de GSTe2, conduisant à un accès et un métabolisme accrus du DDT. De plus, nous montrons que GSTe2 est soumis à une forte sélection directionnelle dans les populations résistantes, et une restriction du flux de gènes est observée entre les régions africaines, permettant de prédire la propagation future de cette résistance.

Ce premier marqueur de résistance métabolique basé sur l'ADN chez les moustiques fournit un outil essentiel pour suivre l'évolution de la résistance et concevoir des stratégies de gestion de la résistance adaptées.

Les interventions de lutte à base d'insecticides, notamment les moustiquaires insecticides longue durée (MILD) et la pulvérisation intradomiciliaire à effet rémanent (IRS), sont des éléments clés de la lutte contre le paludisme en Afrique. Malheureusement, la résistance croissante aux classes d'insecticides disponibles à travers l'Afrique chez les principaux vecteurs du paludisme, tels que le moustique Anopheles funestus, menace l'efficacité continue de ces outils de contrôle. Il est essentiel d'élucider la base moléculaire de la résistance aux insecticides de ces vecteurs pour concevoir des stratégies de gestion de la résistance adaptées et prévenir des conséquences potentiellement dévastatrices pour la santé publique 1 .

Profil de résistance au DDT d'Anopheles funestus chez les moustiques du Bénin et du Cameroun

Analyse de microarray de transcription à l'échelle du génome

Fichier supplémentaire 1 : Figure S1

Profilage de transcription et analyses fonctionnelles de GSTe2. (UNE) Graphique du volcan montrant le modèle d'expression différentiel entre les moustiques béninois résistants au DDT et la souche FANG sensible, avec un seuil de changement double et P  <𔁚.01. GSTe2 est mis en évidence comme l'un des gènes les plus régulés à la hausse chez les moustiques du Bénin. (B) Validation qRT-PCR de la régulation positive par microarray des principaux gènes de détoxification exprimés de manière différentielle entre les échantillons de DDT résistants et sensibles. c738 est une déshydrogénase à chaîne courte (combined_c738) qui est régulée à la hausse selon le microarray. (C) L'expression relative du transgène GSTe2 dans la souche transgénique D. melanogaster Act5C-GSTe2 et l'échantillon témoin sans expression transgénique. Les données affichées sont l'erreur standard moyenne ± de la moyenne ( n  =𔁝). (RÉ) Tests biologiques de deltaméthrine sur des mouches transgéniques Act5C-GSTe2 (Exp-GSTe2) et des souches témoins (deux souches parentales (UAS-GSTe2 et GAL4-Actin) et F1 descendance qui n'exprime pas le transgène GSTe2 (Cont-NO)).

Gènes régulés à la hausse dans la population béninoise résistante au DDT Anophèle funeste après microarray

Orthologues en Anopheles gambiae

Corrigée P valeur

Enregistrer 2changement de pli

Glutathion S-transférases

Glutathion S-transférase gste2

Glutathion S-transférase gste2

Déshydrogénases à chaîne courte

Protéine cuticulaire spécifique à l'adulte acp-20

Protéine cuticulaire spécifique à l'adulte acp-20

Protéines de liaison odorantes

Récepteur odorant candidat

Protéine de liaison odorante 4

Protéine de liaison odorante 4

Sérine protéinase à domaine clip

Sérine thréonine-protéine kinase rio1

Isoforme a apparentée à la protéine de choc thermique

UDP (uridine diphosphate) glucosyltransférases

Protéine de biosynthèse de purine bifonctionnelle

Protéine de biosynthèse de purine bifonctionnelle

Précurseur mitochondrial liant les lipides de l'ATP synthase

Fiche complémentaire 2 : Tableau S1

Gènes régulés à la baisse dans la population béninoise résistante au DDT d'An. funeste.

Le gène de détoxification le plus régulé à la hausse au Bénin était un gène de la glutathion S-transférase, GSTe2 , avec un facteur de changement (FC) de 11,9 ( P  =𔁚.0076) (tableau  1 et fichier supplémentaire 3 : tableau S2 supplémentaire fichier 1 : Figure S1A). La cohérence de cette régulation à la hausse est en outre confirmée par le fait que les deux sondes conçues pour GSTe2 ont été régulées à la hausse dans la population de Pahou (tableau & 160 1 ). De plus, les orthologues de GSTe2 étaient également régulés à la hausse dans les souches résistantes au DDT chez d'autres espèces de moustiques telles que An. gambiae 3 7 et Aedes aegypti 8 , suggérant que ce gène joue très probablement un rôle clé dans la résistance au DDT chez de nombreuses espèces de moustiques.

Fiche complémentaire 3 : Tableau S2

Paramètres de variabilité génétique du GSTe2 pour les moustiques résistants (vivants) et sensibles (morts) de Kpome (Bénin).

Un document PDF contenant des résultats supplémentaires et une discussion.

Validation de la régulation positive des puces à ADN par RT-PCR quantitative

La PCR quantitative reverse-transcriptase (qRT-PCR) a confirmé la régulation positive significative de la GSTe2 au Bénin (FC =󈎰.8, P  =𔁚.007) (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1B) par rapport au FANG sensible souche. Le gène GSTe2 est significativement surtranscrit chez les moustiques exposés au DDT par rapport aux moustiques non exposés (FC =󈏖.0 vs 44,8, P <𔁚.05) (Figure  1 A), suggérant que l'induction de GSTe2 se produit dans en plus de la surexpression constitutive chez les moustiques résistants. Le modèle d'expression de GSTe2 à travers l'Afrique est en corrélation significative avec les modèles de résistance au DDT. Ce gène est régulé à la hausse par 69,5 et 79,1 fois chez les moustiques hautement résistants au DDT du Bénin (P  <𔁚.05) par rapport aux échantillons du Mozambique et du Malawi entièrement sensibles au DDT, respectivement (Figure  1 A). Il est régulé à la hausse par 35 (P  <𔁚.05) par rapport aux échantillons ougandais (résistance modérée au DDT 9 ). De même, les deux P450 CYP6P9a et CYP6P9b avaient 2,96 et 7,13 fois plus d'expression chez les moustiques de Pahou que chez les moustiques FANG sensibles.

Expression GSTe2 et analyse fonctionnelle

GSTe2 expression et analyse fonctionnelle. (UNE) Comparatif qRT-PCR examinant les moustiques résistants au DDT (Bénin) et sensibles au DDT (Mozambique, Malawi et Ouganda). (B) Tests biologiques du DDT sur des mouches transgéniques Act5C-GSTe2 (Exp-GSTe2) et des souches témoins (deux souches parentales (UAS-GSTe2 et GAL4-actine) et F1 descendance qui n'exprime pas le transgène GSTe2 (Cont-NO)). (C) Les mêmes bioessais avec la perméthrine. (RÉ) Activité métabolique du DDT (taux d'épuisement après 1 & 160 h) des allèles GSTe2 (moyenne & # 8201 & # 177 # 8201 écart-type). (E) Cinétique enzymatique de Michaelis–Menten pour les allèles GSTe2 résistants et sensibles (F) Activité métabolique de la perméthrine (taux d'épuisement après 1 160 h) pour l'allèle 119 ° 160F GSTe2 (écart-type moyen ). DDT, dichlorodiphényltrichloroéthane MAL, Malawi MOZ, Mozambique qRT-PCR, amplification en chaîne par polymérase de la transcriptase inverse quantitative UG, Ouganda, DDE, dichlorodiphényldichloroéthylène.

Expression transgénique de GSTe2 chez les mouches drosophiles

Pour établir si la régulation positive de GSTe2 seule peut conférer une résistance au DDT et aux pyréthroïdes, des mouches transgéniques Drosophila melanogaster exprimant GSTe2 clonées du Bénin ont été générées à l'aide du système GAL4/UAS sous le pilote omniprésent Act5C-GAL4 (Act5C-GSTe2). Après avoir confirmé l'expression de GSTe2 dans F transgénique1 descendance par qRT-PCR (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1C), les bio-essais ont révélé que les mouches transgéniques Act5C-GSTe2 étaient résistantes à 4% de DDT (19,1% de mortalité après 24 heures d'exposition), alors que tous les témoins qui n'ont pas trop express GSTe2 étaient sensibles (mortalité de 83,5% à 97,9%, P  <𔁚.0001) (Figure  1 B). Ces résultats indiquent que la régulation à la hausse de GSTe2 à elle seule est suffisante pour conférer une résistance au DDT. Une telle approche d'expression transgénique a également été récemment utilisée avec succès pour confirmer l'implication de deux P450 (CYP6P9a et CYP6P9b) en conférant une résistance aux pyréthroïdes chez An. funestus 5 et précédemment chez Drosophila 13 , indiquant l'utilité de cette technique.

Détection de marqueurs de résistance dans GSTe2

Pour détecter les marqueurs de résistance pour GSTe2, nous avons analysé l'ADNc complet (666 bp) de moustiques résistants du Bénin et quatre souches de moustiques sensibles d'Ouganda, du Malawi, du Mozambique et de Zambie. Il y avait 19 sites polymorphes (8 substitutions de remplacement) provenant de 24 clones. La principale différence dans la souche béninoise était un remplacement fixe de la leucine (CTT) par la phénylalanine (TTT) (L119F). Les haplotypes béninois forment un clade unique par rapport aux haplotypes des autres pays (Figure  2 A).

Polymorphisme GSTe2 et résistance au DDT

GSTe2 polymorphisme et résistance au DDT. (UNE) Arbre de probabilité maximale de l'ADNc de GSTe2 à travers l'Afrique. (B) Identique à (A), mais avec des moustiques résistants au DDT (AL) et sensibles au DDT (DE) au Bénin (ADN génomique). (C) Réseau d'haplotypes GSTe2 (TCS) entre moustiques sensibles et résistants (Bénin). La taille du polygone reflète la fréquence des haplotypes. Chaque nœud représente une mutation (nombre). (RÉ) Profil d'expression GSTe2 des trois génotypes L119F au Cameroun (Gounougou). BN, Bénin DDT, dichlorodiphényltrichloroéthane MAL, Malawi UG, Ouganda ZB Zambie.

L'analyse du GSTe2 complet (881 pbp, y compris les introns) de six moustiques résistants et de six moustiques sensibles provenant d'un autre site du Bénin (Kpome, 6䓷′N, 2䓓′E, car aucun moustique sensible n'était disponible à Pahou) a été confirmée que le polymorphisme GSTe2 était associé à la résistance au DDT. Aucun polymorphisme n'a été identifié pour les moustiques résistants et il y avait un seul haplotype (Hap1-R) portant l'allèle résistant 119 F (Figure  2 B,C Fichier supplémentaire 3 : Tableau S2). Cinq sites polymorphes hétérozygotes ont été identifiés pour les moustiques sensibles avec un seul changement d'acide aminé, L119F. La présence d'un haplotype sensible Hap2-S portant l'allèle sensible L119 a également été observée (Figure & 160 2 B, C).

Corrélation entre la mutation L119F et la résistance au DDT et aux pyréthroïdes

Le test TaqMan, conçu pour génotyper la mutation L119F, a détecté sans ambiguïté les trois génotypes (Fichier supplémentaire 5 : Figure S2A) chez 35 moustiques sensibles et 35 résistants de Gounougou (9䓅′N, 13䓨′E) au Cameroun (ouest -Afrique centrale) (car très peu de moustiques sensibles ont été obtenus du Bénin). La distribution des fréquences de génotypes entre les moustiques sensibles et résistants différait significativement (χ 2  =󈏧.7, degrés de liberté =𔁜 et P  <𔁚.0001) (Figure  3 B) . Une association significative a été observée entre la mutation L119F et la résistance au DDT, avec un rapport de cotes de 5,74 ( P  <&# 82010.0001) en comparant la fréquence des allèles résistants et sensibles dans les deux ensembles d'échantillons. En comparant la fréquence des deux génotypes homozygotes (T/T et C/C), le génotype mutant T/T était plus fortement associé à la résistance au DDT que le génotype sauvage C/C avec un rapport de cotes de 22,3 ( P  <& #82010.0001). En effet, 72,5% des moustiques avec l'allèle mutant homozygote (T/T) étaient résistants au DDT alors qu'environ la moitié des moustiques hétérozygotes étaient résistants au DDT (54,5%), et seulement 10% des moustiques homozygotes de type sauvage (C/ C) étaient résistants au DDT, suggérant une co-dominance de cet allèle (Figure & 160 3 B). La corrélation de la mutation L119F avec la résistance au DDT indique que ce test TaqMan pourrait être utilisé comme outil de diagnostic pour détecter et cartographier la distribution de la résistance au DDT chez An. funestus en Afrique.

Fichier supplémentaire 5 : Figure S2

Détection de l'allèle de résistance 119 F GSTe2 chez An. funeste. (UNE) Les résultats du test de diagnostic TaqMan pour le génotypage de L119F, avec trois génotypes identifiés sans ambiguïté (trois clusters). (B) La distribution des génotypes des allèles L119F dans neuf pays d'Afrique montre qu'il existe une forte corrélation entre les génotypes L119F et les modèles connus de résistance au DDT. Par exemple, le génotype 119 F (T/T) est fixé dans la population béninoise hautement résistante au DDT, mais est complètement absent dans les populations d'Afrique australe entièrement sensibles (Malawi, Mozambique et Zambie). (C) Évaluation de la corrélation entre les allèles L119F et le phénotype résistant à la perméthrine (pyréthroïde de type I). (RÉ) Évaluation de la corrélation entre les allèles L119F et le phénotype résistant à la lambda-cyhalothrine (pyréthroïde de type II).

Association L119F avec la résistance au DDT et la variabilité GSTe2 en Afrique

Association L119F avec la résistance au DDT et GSTe2 variabilité à travers l'Afrique. (UNE) Preuve de la forte corrélation entre les génotypes L119F et la résistance au DDT à Gounougou (Cameroun) (25 résistants et 25 sensibles). (B) Distribution différentielle des génotypes L119F entre les moustiques résistants au DDT et sensibles au DDT. (C) La répartition géographique de L119F à travers l'Afrique est en corrélation avec la répartition de la résistance au DDT. (RÉ) Réseau d'haplotypes GSTe2 (TCS) (régions codantes uniquement) à travers l'Afrique, avec des clades résistants (gris) et sensibles (marron) définis par L119F. Chaque haplotype est représenté par une forme circulaire ou rectangulaire et la taille proportionnelle à sa fréquence dans l'échantillon tandis que les étapes mutationnelles sont représentées par des numéros de ligne. (E) Distances génétiques entre six populations africaines basées sur les séquences GSTe2 (estimations Nst). DDT, dichlorodiphényltrichloroéthane.

En revanche, la résistance au DDT était plus étroitement associée à la mutation L119F qu'au niveau de surexpression de GSTe2 (Figure & 160 2 D). En effet, malgré un moindre facteur de changement dans le génotype L119 sensible, aucune différence significative (P  >𔁚.05) dans le niveau d'expression de GSTe2 n'a été observée entre le RR homozygote résistant (FC =󈎞.6), l'hétérozygote RS (FC =󈎛) et le SS sensible aux homozygotes (FC =󈎔.5) (Figure  2 D). Ces résultats suggèrent que la mutation L119F pourrait être la cause prédominante de la résistance au DDT.

Répartition géographique de L119F à travers l'Afrique

Essais métaboliques avec l'enzyme GSTe2 hétérologue

Une évaluation de l'activité DDT déshydrochlorinase de l'enzyme recombinante résistante au 119 F (Bénin) et de celle du L119 sensible a révélé que l'allèle 119 F est 3,4 fois plus efficace pour métaboliser le DDT (déplétion de 82,9% du DDT après 1 h de réaction dans le présence du cofacteur glutathion (GSH) P  <𔁚.001) que l'allèle L119 (déplétion de 24,4%) (Figure  1 D et Fichier additionnel 6 : Figure S3A). Ceci est confirmé par leurs paramètres cinétiques respectifs (Figure & 160 1 E), avec l'allèle 119 & 160 F ayant une efficacité catalytique plus élevée (kcat/ K m rapport) pour le DDT (316,3 μM 𕒵 .s 𕒵 vs 92,0 μM 𕒵 .s 𕒵 ) (tableau  2 ).

Fichier complémentaire 6 : Figure S3

Activité métabolique de la GSTe2. (UNE) Le métabolisme du DDT par le GSTe2 du Bénin présente un pic élevé pour le produit métabolite DDE. (B) Il y a une réduction du pic pour le métabolisme de la perméthrine de 119 F-GSTe2 dans la réaction avec GSTe2 (bleu) par rapport au témoin (noir) (trois répétitions) en utilisant des conditions isocratiques. La flèche indique les métabolites potentiels. (C) Métabolisme supplémentaire de la perméthrine par l'enzyme béninoise GSTe2 en utilisant des conditions de gradient. Les pics bleus se réfèrent au profil métabolique de la GSTe2 active tandis que les pics noirs se réfèrent au mélange d'incubation de sérum bovin (contrôle négatif). Les flèches indiquent les trois métabolites potentiels. Les analytes ont été élués avec un programme de gradient d'augmentation linéaire.

Paramètres cinétiques des résistants (119 F) et sensibles (L119) GSTe2 allèles

V max(DDE μmol.min 𕒵 .mg 𕒵 )

Kcat (s 𕒵 )

Kcat/ K m(μM 𕒵 .s 𕒵 )

Trois tests indépendants ont été effectués pour les deux allèles et les résultats montrent l'écart-type moyen.

En revanche, aucun métabolisme significatif n'a été observé pour la deltaméthrine, ce qui est en ligne avec la faible résistance à la deltaméthrine observée sur le terrain à Pahou (88% de mortalité pour la deltaméthrine vs 66% pour la perméthrine), mais aussi la moindre résistance à la deltaméthrine observée chez les UAS-transgéniques. La drosophile GSTe2 vole.

Diversité génétique de GSTe2 à travers l'Afrique

Signature de sélection positive sur GSTe2 au Bénin

L'analyse de la séquence complète de 882 pb de GSTe2 (663 pb pour les trois exons et 219 pb pour les deux introns et une partie de l'UTR 3 8242) à partir de moustiques collectés sur le terrain dans six pays a révélé que GSTe2 est sous forte sélection directionnelle au Bénin contrairement aux autres pays (Tableau  3 et Fichier complémentaire 7 : Tableau S3, Fichier complémentaire 8 : Figure S4A). En effet, la réduction significative de la diversité génétique de GSTe2 au Bénin est apparente avec un seul site polymorphe observé chez un seul moustique sur 12 de Pahou, contrairement aux sept à dix-neuf sites polymorphes dans les autres populations. Seuls deux haplotypes étaient présents chez les moustiques Pahou (l'haplotype mineur n'était présent en tant qu'hétérozygote que chez un individu sur douze), contrairement aux sept à dix haplotypes pour les autres pays (Fichier supplémentaire 8 : Figure S4A Tableau  3 ) . Les paramètres de diversité génétique tels que la diversité des haplotypes (hd) et la diversité des nucléotides pour le Bénin sont significativement plus faibles que pour les cinq autres pays (Fichier supplémentaire 8 : Figure S4A). Cette diversité réduite de GSTe2 pour les moustiques béninois suggère la présence d'un balayage sélectif à travers et autour de ce gène. Une évaluation future établira l'étendue de ce balayage sélectif dans cette région génomique sur le chromosome 2 & 160L.

Paramètres génétiques entre les régions codantes et non codantes pour les trois gènes dans les trois pays

Fragment séquencé complet (882 bp)

Région non codante (219 bp)

2n, nombre de séquences D, statistiques Tajima’s D*, statistiques Fu et Li’s h, nombre d'haplotypes hd, diversité haplotypique ns, non significatif π, diversité nucléotidique multipliée par 10 3 S, nombre de sites polymorphes & #952, estimateur de Watterson (par site) multiplié par 10 3 .

Fiche complémentaire 7 : Tableau S3

Paramètres de sélection pour GSTe2 à travers l'Afrique.

Fichier supplémentaire 8 : Figure S4

Modèles de polymorphisme de GSTe2 en Afrique. (UNE) Graphique des paramètres de diversité génétique de GSTe2 à travers l'Afrique qui indique qu'il existe une forte sélection directionnelle de GSTe2 chez les moustiques du Bénin. hd, diversité des haplotypes π, diversité des nucléotides. (B) Haplotypes de GSTe2 (codants et non-codants) dans six pays d'Afrique avec des phénotypes DDT contrastés. Les positions polymorphes sont indiquées par des chiffres au-dessus du nucléotide, et les haplotypes sont étiquetés de 1 à 39 avec les initiales précédentes du pays où l'haplotype est prédominant. Un astérisque (*) indique que l'haplotype a été observé dans d'autres pays. N est le nombre d'individus qui partagent l'haplotype. (C) La même chose mais en ne considérant que les régions de codage. (RÉ) La même chose mais en ne considérant que les substitutions non synonymes fournissant les différentes variantes protéiques de GSTe2 à travers l'Afrique.

Cependant, d'autres tests de sélection tels que McDonald et Kreitman (MK), Hudson–Kreitman–Aguade (HKA), dN/dS et K une /K s les ratios et les tests D de Tajima n'ont montré aucune signature de sélection positive au Bénin (Fichier supplémentaire 7 : Tableau S3). Cela pourrait être dû au fait que le balayage autour de GSTe2 dans la population béninoise est proche de la fixation, comme le montre la fréquence de 100 % de l'allèle résistant 119 F dans cette population. Dans une situation de quasi-fixation du balayage sélectif, la sélection directionnelle est mieux illustrée par des niveaux réduits de variation génétique 24 . Aucune preuve de sélection par réduction de la diversité génétique n'a été observée au Cameroun et au Ghana, où une résistance au DDT a également été détectée, bien que pas à un niveau élevé comme au Bénin. Cependant, la présence de l'haplotype prédominant résistant au Bénin dans ces pays d'Afrique de l'Ouest, bien qu'à une fréquence plus faible, pourrait résulter de l'effet combiné de la sélection locale du DDT et de la migration.

Distribution des haplotypes de GSTe2 à travers l'Afrique

Un total de 39 haplotypes ont été observés pour le gène complet (Fichier supplémentaire 8 : Figure S4B), 16 pour les régions codantes uniquement (Fichier supplémentaire 8 : Figure S4C), et il y avait sept variantes de protéines (Fichier supplémentaire 8 : Figure S4D) à travers l'Afrique . Les haplotypes résistants (avec l'allèle résistant 119 & 160F) se résolvant autour d'un haplotype prédominant BN23 (presque fixé au Bénin et présent uniquement dans les emplacements résistants au DDT) avaient tous une diversité réduite, ce qui indique une sélection récente avec moins d'haplotypes (11 sur 39) et plus d'homogénéité (moins de différences d'étapes mutationnelles 𕟬). Les haplotypes sensibles (avec l'allèle L119) se sont résolus autour d'un haplotype prédominant MAL3 et étaient plus diversifiés, avec plus d'haplotypes (29 sur 39) et une plus grande hétérogénéité (jusqu'à 13 différences d'étapes mutationnelles). Dans l'ensemble, la distribution des haplotypes de GSTe2 à travers l'Afrique (Fichier supplémentaire 8 : Figure S4B,C,D) révèle que la mutation L119F est le principal polymorphisme façonnant la diversité génétique de GSTe2 avec l'étape mutationnelle à cet allèle définissant systématiquement un groupe résistant et sensible de haplotypes (Figure  3 D et Fichier additionnel 9 : Figure S5).

Fichier complémentaire 9 : Figure S5

Réseau d'haplotypes pour la GSTe2 pleine longueur (régions codantes et non codantes) à travers l'Afrique. La fréquence de chaque haplotype est reflétée par la taille de son polygone. Chaque nœud représente une mutation ségrégatrice (la position polymorphe est donnée au-dessus des branches). Les polygones en gris sont des haplotypes résistants qui hébergent l'allèle résistant 119 & 160F tandis que les haplotypes en blanc sont sensibles. La position mutationnelle de 499 est encerclée pour indiquer que cette position polymorphe, qui correspond à L119F, est la clé pour façonner la distribution des haplotypes GSTe2.

Sous-structure de la population de GSTe2 à travers l'Afrique

L'analyse de la diversité génétique de GSTe2 a indiqué qu'An. funestus sont clairement structurées en fonction de leur profil de résistance au DDT et de la distance géographique. La construction d'un arbre phylogénétique à maximum de vraisemblance des séquences GSTe2 a révélé que les moustiques du Cameroun et du Ghana se regroupent avec les moustiques du Bénin (Figure & 160 4 ), en corrélation avec les profils de résistance au DDT. Les populations sensibles du Mozambique et du Malawi ont la plus faible différenciation génétique ( K st  = .016) (Fichier supplémentaire 10 : Tableau S4 Figure  3 E). La population ougandaise d'Afrique de l'Est modérément résistante présente une différenciation intermédiaire par rapport à toutes les populations. Ce modèle de flux de gènes est en corrélation avec les modèles de structure génétique d'An. funestus à travers l'Afrique sur la base de marqueurs microsatellites 26 , suggérant qu'il existe des barrières au flux de gènes entre An. funestus, ce qui affectera la propagation des gènes de résistance aux insecticides.

Arbre phylogénétique de vraisemblance maximale de GSTe2 (régions codantes et non codantes) à travers l'Afrique

Arbre phylogénétique de vraisemblance maximale de GSTe2 (régions codantes et non codantes) à travers l'Afrique. L'analyse a porté sur 92 séquences (2n) marquées. Tous les postes comportant des lacunes et des données manquantes ont été éliminés. Il y avait un total de 881 positions dans l'ensemble de données final. Un clade résistant moins polymorphe et dominé par la population béninoise est clairement identifiable à droite de l'arbre alors qu'un clade sensible plus polymorphe et plus cosmopolite est à gauche de l'arbre. BN, Bénin CAM, Cameroun GH, Ghana MAL, Malawi MOZ, Mozambique UG, Ouganda.

Fiche complémentaire 10 : Tableau S4

Différenciation génétique par K st.

Base structurelle de la résistance au DDT conférée par GSTe2

Purification GSTe2 et structure tridimensionnelle aux rayons X

Purification GSTe2 et structure tridimensionnelle aux rayons X. (UNE) Chromatogramme d'exclusion de taille des allèles GSTe2 des allèles du Bénin (BN), de l'Ouganda (UG) et du Malawi (MAL). Les lignes montrent l'absorbance enregistrée à 280 nm. Les marqueurs de poids moléculaire (Bio-Rad, Hercules, CA, US) sont indiqués en kilodaltons. (B) Gel SDS-PAGE des trois allèles GSTe2 purifiés (26,8 & 160 kDa). (C) Topologie de GSTe2 montrant les terminaisons C et N, la poche de liaison GSH (site G) et la poche de liaison au substrat (site H). AU, unités arbitraires BN, Bénin GSH, glutathion MAL, Malawi MW, poids moléculaire UG, Ouganda vol, volume.

Dans l'ensemble, la structure de BN-GSTe2 et UG-GSTe2 est très similaire (Figure  5 C, Fichier supplémentaire 11 : Figure S6). Cependant, des différences locales significatives peuvent être observées entre les allèles aux extrémités C-terminales de H4 (contenant les résidus de mutation L119F de 113 à 128) et H8 (résidus de 213 à 220) (Figure & 160 6 A). Ces différences peuvent être décrites comme un mouvement concerté des hélices BN-GSTe2 H4 et H8 par rapport à celles de UG-GSTe2, qui ouvre la fente du site actif. L'écart quadratique moyen (RMSD) entre les structures est de 0,64 & 160 & 197 pour tous les atomes de C & 945. Il y a une diminution significative du RMSD entre les allèles de 0,64 à 0,42 Å en excluant H4 (contenant la mutation 119 F) et le RMSD n'est que de 0,33 Å en excluant à la fois H4 et H8. Un RMSD plus élevé est observé lorsque les deux allèles sont comparés uniquement pour l'hélice H4 (RMSD =𔁚.9 Å) (Figure  6 A). De plus, la différence significative entre les allèles BN-GSTe2 et UG-GSTe2 est encore aggravée par l'observation que la structure de l'allèle UG-GSTe2 est plus similaire à la structure de l'An. gambiae GSTe2 [PDB:2imi] (RMSD =𔁚.4 Å) qu'à Benin-GSTe2 (RMSD =𔁚.64 Å) malgré une différence de 20 acides aminés ( 92% de similarité) (Figure  6 B), indiquant que la mutation L119F est le facteur clé qui modifie la structure de GSTe2 (Figure  6 C).

Fichier complémentaire 11 : Figure S6

Les conformations de la poche de liaison GSH (site G) de l'allèle résistant BN-GSTe2 (violet) et de l'allèle sensible UG-GSTe2 (vert) n'ont pas de différences significatives. Le cofacteur GSH et les acides aminés protéiques et les molécules d'eau liés à l'hydrogène sont représentés en mode boule et bâton.

Les variations de la structure tridimensionnelle GSTe2 révèlent que L119F est important pour la résistance au DDT

Les variations de la structure tridimensionnelle GSTe2 révèlent que L119F est important pour la résistance au DDT. (UNE) Superposition des structures Bénin-GSTe2 (violet) et Ouganda-GSTe2 (vert) et un gros plan des hélices H4/H8 contenant la mutation L119F. (B) Superposition de Uganda-GSTe2 (vert) et An. gambiae GSTe2 (grise) structures montrant leur conformation très similaire. (C) Comparaison des poches de liaison au substrat du Bénin-GSTe2 (violet) et de l'Ouganda-GSTe2 (vert). (À gauche) La représentation de la surface moléculaire du site H montre que le DDT s'ancre bien dans le site de liaison Bénin-GSTe2 mais se heurte à la structure Ouganda-GSTe2. (À droite) Gros plan sur l'effet de L119F sur le site H (cette mutation courbe H4, entraînant une augmentation de la cavité de liaison au DDT au Bénin-GSTe2 mais pas pour l'Ouganda-GSTe2). Ct, DDT C-terminal, dichlorodiphényltrichloroéthane GSH, glutathion Nt, N-terminal.

Le site actif de GSTe2 peut être divisé en deux sous-sites. Premièrement, il y a le site de liaison du glutathion, appelé site G, où une molécule de GSH est liée. Deuxièmement, il y a le site H, qui reconnaît le substrat hydrophobe. L'architecture du site G de cette superfamille de protéines est bien décrite et presque identique à celle observée dans BN-GSTe2 et UG-GSTe2. Bien que de légères variations aient été observées entre les sites G des deux allèles, il n'y a pas de différence conformationnelle significative, et ces poches de liaison G n'ont pas de réarrangement majeur (Fichier supplémentaire 11 : Figure S6). Le site H est une grande cavité hydrophobe légèrement ouverte adjacente au site G. Il est constitué de résidus de différentes boucles au niveau du domaine N-terminal et comprend sensiblement les extrémités C-terminales variables des hélices H4 et H8 au niveau du domaine C-terminal (Figure & 160 5 C). Par conséquent, les différences observées entre BN-GSTe2 et UG-GSTe2 affectent principalement la structure de la poche de liaison au substrat (site H) (Figure  6 A).

Poche putative de liaison au DDT (site H) et réaction métabolique du DDT

Leu119 fait normalement partie du noyau hydrophobe inaccessible aux solvants qui stabilise la conformation des hélices H4, H5 et H8 de Uganda-GSTe2 (Figure & 160 6 A). Cependant, pour accueillir la chaîne latérale Phe119 plus volumineuse dans la structure Bénin-GSTe2, l'extrémité N-terminale de H4 a une courbure spectaculaire, ce qui augmente la taille du site H par rapport à l'allèle UG, où la cavité est plus étroite ( Figure  6 C). La représentation de surface du site H des deux protéines avec un GSH lié confirme que l'allèle BN résistant a une cavité DDT putative plus grande que l'allèle UG sensible (Figure & 160 6 C).

Les tentatives de co-cristallisation du substrat DDT ou du produit DDE avec BN-GSTe2 et UG-GSTe2 ont échoué. Par conséquent, pour étudier les propriétés de liaison au substrat des deux allèles et évaluer leur capacité à hydrolyser le DDT, une molécule de substrat a été ancrée dans le site H (Figure & 160 6 C). Cet amarrage d'une molécule de DDT dans le site H des deux allèles a démontré que le Benin-GSTe2 a la taille et la forme appropriées pour mieux accueillir le DDT dans une conformation proche de réactive. Cela inclut la stabilisation appropriée des anneaux chlorure-phényle du DDT et le positionnement optimal du DDT Cα, pointant vers le thiolate du glutathion (Figure  6 C) conduisant à une augmentation du métabolisme du DDT. En revanche, le site H plus petit de l'Ouganda-GSTe2 ne permet pas la reconnaissance du DDT dans cette conformation (Figure & 160 6 C), ce qui entraîne une réduction de l'accès et du métabolisme du DDT. Cette différence au site H explique l'accessibilité accrue au site actif, l'activité plus élevée et par conséquent la résistance élevée au DDT de la population béninoise par rapport à d'autres populations comme celles de l'Ouganda ou du Malawi.

Fichier supplémentaire 12 : Figure S7

Analyse comparative de la structure du site H de différents allèles GSTe2 et agGSTd1-6. La taille et la forme du site sont des déterminants clés de la capacité de métabolisme du DDT. (Haut) Les représentations de surface moléculaire de ces résidus constituant le site H de Uganda-GSTe2 (vert), Bénin-GSTe2 (violet), agGSTe2 (blanc) et agGSTd1-6 (jaune). Les atomes d'oxygène et d'azote à la surface sont représentés respectivement en rouge et en bleu. (En bas) Superpositions des structures de Uganda-GSTe2 (vert) avec Benin-GSTe2 (violet), agGSTe2 (blanc) et agGSTd1-6 (jaune) montrant que la plupart des différences se situent dans les éléments structuraux secondaires liés au site H.

Les protéines des allèles BN-GSTe2 et UG-GSTe2 sont séparées par deux changements d'acides aminés, L119F et I131V. Cependant, seul L119F est situé dans l'hélice H4 alors que I131V est situé dans l'hélice H5, où aucun changement de conformation n'est observé entre les formes BN et UG. De plus, la forme AgGSTe2, qui est structurellement similaire à UG-GSTe2, contient I131, comme la forme BN. Par conséquent, cela indique que la mutation I131V ne joue pas de rôle dans l'activité métabolique du DDT de l'allèle BN et confirme que la base moléculaire de la résistance élevée au DDT conférée par l'allèle BN-GSTe2 par rapport à l'allèle sensible s'explique uniquement par la des changements conformationnels significatifs induits par la mutation L119F. Ce résultat est en accord avec ce qui avait été prédit précédemment par 27 . Cette étude précédente a suggéré que pour l'An. gambiae GSTe2 pour être plus actif contre le DDT, plus de changements conformationnels dans la poche de liaison au DDT étaient nécessaires pour mieux accueillir un substrat de DDT et que de tels ajustements ne devraient pas être à grande échelle car la poche était déjà bien formée. Ces changements sont exactement ce qui s'est passé dans la forme béninoise, où un seul changement d'acide aminé a induit l'ajustement nécessaire pour accueillir plus de DDT dans cet An résistant. funestus, conférant un niveau élevé de résistance au DDT contrairement à l'allèle UG, où cet ajustement est absent. Dans l'ensemble, ces analyses structurelles démontrent que la mutation L119F est la mutation causale qui confère la résistance au DDT.

Cette étude présente une dissection complète et détaillée de la base génétique, moléculaire et structurelle de la résistance métabolique à un insecticide dans un vecteur majeur du paludisme. Dans un premier temps, nous avons détecté de manière concluante le gène principal responsable et montré que la résistance est conférée par un changement qualitatif et quantitatif de l'enzyme métabolisant le DDT (GSTe2). Deuxièmement, nous avons détecté, pour la première fois, à notre connaissance, pour une espèce de moustique, un marqueur de résistance moléculaire pour la résistance métabolique et conçu un test de diagnostic fiable basé sur l'ADN qui peut détecter et cartographier avec précision la distribution de la résistance à travers l'Afrique. Cet outil de diagnostic sera précieux pour les programmes de lutte antivectorielle car la résistance peut être détectée à un stade précoce, permettant la mise en œuvre de stratégies de gestion de la résistance adaptées. Troisièmement, nous avons montré que la distribution géographique de la résistance au DDT, son origine et ses futurs modèles de propagation peuvent être établis ou prédits sur la base des modèles de diversité génétique GSTe2, qui sont principalement dus à la seule mutation L119F.

Femelle adulte gavée de sang An. Les moustiques funestus se reposant à l'intérieur ont été collectés dans des maisons entre 6h00 et 12h00 à Pahou (6'17623'8242N, 2'17613'8242E), qui est situé près de la côte atlantique dans le sud du Bénin, en Afrique de l'Ouest. Plusieurs collectes ont été réalisées entre juillet 2009 et avril 2011. Une autre collecte a été réalisée à Kpome (6䓷′N, 2䓓′E), qui est situé à l'intérieur des terres à environ 100 km de Pahou, en décembre 2011. Les autres échantillons utilisés dans cette étude ont été précédemment décrits, et les références respectives sont fournies lorsque les échantillons sont mentionnés. La collecte et l'élevage des moustiques ont été effectués comme décrit précédemment 6 9 . En bref, F1 les adultes ont été générés à partir de moustiques femelles collectés sur le terrain (en utilisant une méthode de ponte forcée 9 ) et ont été mélangés au hasard dans des cages pour des expériences ultérieures. Toutes les femelles utilisées pour la ponte individuelle ont été identifiées morphologiquement et moléculairement comme An. funestus ss, comme décrit précédemment 21 .

Des essais de sensibilité aux insecticides avec 4 % de DDT et 0,75 % de perméthrine ont été effectués sur des F de 2 à 5 jours1 adultes du groupe F1 les moustiques, comme décrit précédemment 21 .

L'ARN a été extrait de trois lots de dix An. funestus qui étaient toutes âgées de 2 à 5 jours dans les deux ensembles d'échantillons en utilisant le kit d'isolement d'ARN Picopure (Arcturus, Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). La quantité et la qualité de l'ARN extrait ont été évaluées à l'aide du spectrophotomètre NanoDrop ND1000 (Thermo Fisher, Waltham, MA, US) et du Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA, USA), respectivement. L'ARNc de chaque échantillon a été amplifié à l'aide du kit de marquage Agilent Quick Amp (bicolore) en suivant le protocole du fabricant. L'ARNc des échantillons de Pahou résistants a été marqué avec le colorant cy5 tandis que la souche sensible FANG (S) a été marquée avec le colorant cy3. La quantité et la qualité des ARNc ont été évaluées avant le marquage à l'aide du NanoDrop et du Bioanalyzer. Les ARNc marqués ont été hybridés aux puces pendant 17 h à 65 °C, selon le protocole du fabricant. Cinq hybridations ont été réalisées en échangeant les réplicats biologiques.

Les données des puces à ADN ont été analysées à l'aide du logiciel Genespring GX 12.0. Pour identifier les gènes exprimés de manière différentielle, un seuil de changement double et un niveau de signification de P  <&# 82010.01 avec correction de Benjamin-Hochberg pour les tests multiples ont été appliqués.

Les gènes les plus associés à la résistance à partir de l'analyse des puces à ADN ont été évalués par qRT-PCR pour valider leur modèle d'expression à l'aide de trois réplicats biologiques pour les moustiques résistants à Pahou (R) (vivants après une exposition de 24 h au DDT), les moustiques de contrôle Pahou (C ) (non exposé à aucun insecticide) et les moustiques FANG sensibles (S). Les amorces sont répertoriées dans le Fichier Additionnel 13 : Tableau S5. Ensuite, 1 & 160 g d'ARN total de chacun des trois réplicats biologiques de moustiques résistants à Pahou, témoins Pahou et sensibles FANG a été utilisé comme modèle pour la synthèse d'ADNc en utilisant Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis) avec oligo-dT20 et RNase H, selon les instructions du fabricant. L'amplification qRT-PCR a été réalisée comme décrit précédemment 5 . L'expression relative et le facteur de changement de chaque gène cible dans R et C par rapport à S ont été calculés selon la méthode 2 -ΔΔCT, incorporant l'efficacité de la PCR 28 après normalisation avec les gènes de ménage RSP7 (protéine ribosomale S7, AGAP010592) et l'actine 5C (AGAP000651).

Fiche complémentaire 13 : Tableau S5

Liste des amorces utilisées dans cette étude.

Expression transgénique de GSTe2 chez les mouches drosophiles

Construction de lignées de drosophiles transgéniques

Le gène GSTe2 de pleine longueur a été amplifié à partir de l'ADNc des moustiques résistants du Bénin en utilisant l'ADN polymérase Phusion High-Fidelity (Fermentas, Burlington, Ontario, Canada) et les conditions suivantes : 1 cycle à 95 °C pendant 5 160 min 35 ° 160 cycles de 94°C pour 20 s, 57°C pour 30 s et 72°C pour 60 s et 1 cycle à 72°C pour 5 min. Les amorces utilisées sont répertoriées dans le Fichier Additionnel 13 : Tableau S5. Les produits de PCR ont été purifiés à l'aide du QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) et clonés dans le vecteur de clonage pJET1.2/blunt à l'aide du CloneJET TM PCR Cloning Kit (Fermentas, Burlington, Ontario, Canada). Cinq clones positifs des deux échantillons ont été purifiés avec un kit QIAprep® Miniprep (Qiagen, Valencia, CA, USA) et séquencés sur les deux brins. Après analyse des séquences, un clone du GSTe2 qui était prédominant chez les moustiques béninois a été sélectionné pour la construction des mouches transgéniques. Ce clone a été ré-amplifié comme décrit ci-dessus avec des amorces contenant des sites de restriction pour Bgl II et Xba I. Les produits PCR purifiés ont été digérés en utilisant les enzymes Bgl II et Xba I (Fermentas, Burlington, Ontario, Canada), clonées dans le vecteur pUASattB (fournies par le Dr J Bischof, Université de Zurich), pré-digérées avec les mêmes enzymes de restriction et transformées en cellules JM109 (Promega, Madison, Wi, US). En utilisant le système PhiC31, des clones ont été injectés dans la lignée germinale de D. melanogaster portant le site d'amarrage attP40 sur le chromosome 2 (y 1 w 67c23 P (CaryP) attP40,12) 29 . Une lignée transgénique, UAS-GSTe2, a été générée et équilibrée. Pour l'expression du transgène GSTe2, une expression ubiquitaire a été obtenue chez les mouches en utilisant la souche Act5C-GAL4 (y 1 w * P (Act5C-GAL4-w) E1/CyO,12) (Bloomington Stock Center, IN, USA).

Confirmation de l'expression de GSTe2 chez les mouches transgéniques par RT-PCR quantitative

Pour confirmer l'expression de GSTe2 dans les groupes expérimentaux et l'absence d'expression dans les groupes témoins, l'ARN total a été extrait de trois pools de cinq mouches. La synthèse d'ADNc a été réalisée comme décrit ci-dessus. La PCR a été réalisée en utilisant l'ADNc synthétisé comme matrice et des amorces spécifiques de GSTe2 (Fichier supplémentaire 13 : Tableau S5). De plus, les niveaux d'expression relatifs du transgène GSTe2 ont été évalués par qRT-PCR dans le F1 descendance sous le pilote Act5C et dans les contrôles respectifs avec normalisation à l'aide du gène de ménage RPL11.

Essais biologiques de contact avec la drosophile

Femelles de F1 exprimant GSTe2 ont été sélectionnés comme groupe expérimental pour les essais biologiques d'insecticides. Les lignées parentales et la descendance femelle du croisement entre les femelles Act5C-GAL4 et les mâles qui ne portaient pas le transgène GSTe2 (mais avec le même background attP40) ont été utilisées comme témoins. Une comparaison des taux de mortalité entre les groupes expérimentaux et les groupes témoins a été utilisée pour évaluer si GSTe2 conférait une résistance. De plus, des femelles de 2 à 5 jours après l'éclosion ont été utilisées dans un essai de contact avec 4 % de DDT et les insecticides pyréthroïdes perméthrine (2 %) et deltaméthrine (0,15 %), comme décrit précédemment 5 . Ensuite, 20 à 25 mouches ont été placées dans chaque flacon, et la mortalité plus knockdown a été notée après 1 160 h, 2 160 h, 3 160 h, 6 160 h, 12 h 160 et 24 h 160 d'exposition à l'insecticide.Pour tous les tests, au moins six répétitions ont été effectuées. Le test t de Student a été utilisé pour comparer la mortalité plus la précipitation dans le groupe expérimental avec chaque groupe témoin.

Analyse des polymorphismes GSTe2 en relation avec la résistance au DDT

Analyse des polymorphismes d'ADNc

L'ADNc complet de GSTe2 a été cloné et séquencé pour les moustiques résistants au DDT du Bénin et pour les An sensibles au DDT. funestus à travers l'Afrique (Ouganda, Malawi, Mozambique et Zambie) pour détecter les mutations potentielles qui pourraient être associées à la résistance au DDT. L'amplification de l'ADNc a été réalisée en utilisant le même ADNc synthétisé pour la qRT-PCR avec la polymérase Phusion, et le produit a été cloné et séquencé comme décrit ci-dessus. Les amorces utilisées sont répertoriées dans le Fichier Additionnel 13 : Tableau S5.

Analyse du polymorphisme entre moustiques de terrain sensibles et résistants au Bénin

Une évaluation supplémentaire de la corrélation du polymorphisme de la résistance à la GSTe2 et au DDT a été menée en amplifiant et en séquençant individuellement la séquence génomique complète de la GSTe2 (tous les exons et les introns) pour six moustiques sensibles (morts après une exposition de 1 à 160 heures) et six moustiques résistants (vivants après une exposition de 1 à 160 heures) de Kpome car aucun moustique sensible n'a été obtenu à Pahou. Les positions polymorphes ont été détectées par une analyse manuelle des traces de séquence en utilisant BioEdit et en tant que différences de séquence dans des alignements multiples en utilisant ClustalW 30. dnaSP 5.10 31 a été utilisé pour définir la phase haplotype (via l'option Phase) et pour évaluer les paramètres génétiques, tels que la diversité nucléotidique π, la diversité haplotype et les estimations de sélection D et D*. Un arbre de probabilité maximale des haplotypes pour les amplifications d'ADNc et génomiques a été construit à l'aide de MEGA 5.2 32, et un réseau d'haplotypes a été construit à l'aide du programme TCS 33 (limite de connexion à 95 %, lacunes traitées comme un cinquième état) pour évaluer la connexion potentielle entre haplotypes et phénotypes de résistance.

Test de diagnostic et évaluation de la corrélation entre le L119F et la résistance au DDT

Pour génotyper la mutation GSTe2 L119F dans des populations de terrain d'An. funestus, un test TaqMan personnalisé a été conçu après des échecs répétés du pyroséquençage en raison des nombreux nucléotides de thymine (T) autour du site de mutation C/T. Les séquences d'amorce et de rapporteur sont fournies dans le fichier supplémentaire 14 : tableau S6. Les réactions TaqMan ont été réalisées dans un volume final de 10 μ l contenant 1× SensiMix (Bioline, Londres, Royaume-Uni), 800 nM de chaque amorce et 200 nM de chaque sonde à l'aide d'un appareil Agilent MX3005P. Les conditions de cyclage suivantes ont été utilisées : 10 min à 95°C, 40 cycles de 15 s à 92°C et 1 min à 60°C. Ce test a été utilisé pour évaluer la corrélation entre les génotypes de la mutation L119F et les phénotypes résistants au DDT. Pour ce test, en raison du manque de moustiques sensibles de Pahou et des quelques moustiques sensibles de Kpome (au Bénin), An. funestus ont été collectés dans le nord du Cameroun à Gounougou (9䓅′N, 13䓨′E), comme décrit ci-dessus. Un essai biologique de l'OMS pour le DDT a été effectué comme décrit ci-dessus. Ensuite, 35 moustiques morts après 1 h 160 d'exposition au DDT à 4 % (sensible) et 35 moustiques vivants (résistants) de Gounougou ont été génotypés pour la mutation L119F à l'aide du test TaqMan.

Fiche complémentaire 14 : Tableau S6

Amorces pour le dosage TaqMan L119F GSTe2.

Corrélation L119F avec la résistance aux pyréthroïdes

Pour évaluer la corrélation entre les génotypes de la mutation L119F et les phénotypes résistants aux pyréthroïdes, 25 moustiques morts après 1 h d'exposition à 0,75% de perméthrine (pyréthroïde de type I) (sensible) et 25 moustiques vivants (résistants) de Gounougou ont été génotypés. pour la mutation L119F en utilisant le test TaqMan. Le même génotypage a été réalisé pour la lambda-cyhalothrine (un pyréthroïde de type II). L'association entre les phénotypes de résistance et les génotypes a été évaluée en estimant les rapports de cotes et la signification statistique sur la base du test de probabilité exacte de Fisher 34 .

Contribution de la régulation positive de GSTe2 et de la mutation 119 F au phénotype de résistance

Pour évaluer si la régulation positive de GSTe2 et la présence de la mutation 119 F sont toutes deux nécessaires pour conférer une résistance au DDT, nous avons comparé les niveaux d'expression de GSTe2 pour les trois génotypes de la mutation L119F avec la souche FANG sensible en utilisant qRT-PCR. Trois lots de cinq moustiques de Gounougou ont été utilisés pour les échantillons sensibles aux homozygotes (C/C L119/L119), les échantillons hétérozygotes (C/T L119/119 F) et les échantillons résistants aux homozygotes (T/T 119 F/119 F) suivant le protocole décrit ci-dessus. Le génotype de chaque moustique a d'abord été établi après un test TaqMan utilisant l'ADNg (ADN génomique) extrait des pattes, puis les moustiques du même génotype ont été regroupés pour l'extraction d'ARN et la synthèse d'ADNc.

Répartition géographique de la mutation L119F en Afrique

Pour évaluer la répartition géographique de la mutation L119F à travers l'Afrique, 30 An. Des femelles funestus ss de neuf pays appartenant à différentes régions d'Afrique ont été génotypées par TaqMan : Bénin (Pahou, collecté en 2010–82112011), Ghana (Obuasi, 2009), Burkina (Bobo-Dioualasso, 2010) et Cameroun (Gounougou, 2006) en Afrique du centre-ouest, en Ouganda (Tororo, 2009) et au Kenya (Kisumu, 2012) en Afrique de l'Est et au Malawi (Chikwawa, 2009), en Zambie (district de Katete, 2011) et au Mozambique (Chokwe, 2009) en Afrique australe.

Structure de la population de GSTe2 à travers l'Afrique An. populations funestus

Pour évaluer les modèles de variabilité génétique de GSTe2 dans les populations africaines d'An. funestus en relation avec la résistance au DDT et pour détecter les signatures potentielles de sélection sur ce gène, une GSTe2 pleine longueur (exons et introns) a été amplifiée et directement séquencée pour 10 moustiques femelles collectés sur le terrain dans six pays de différentes régions d'Afrique. Ces pays sont le Bénin, le Ghana et le Cameroun en Afrique centre-ouest, l'Ouganda en Afrique de l'Est et le Mozambique et le Malawi en Afrique australe. Les modèles de variabilité génétique ont été analysés comme décrit ci-dessus en utilisant dnaSP 5.10 31 . Les niveaux de différenciation génétique par paires entre les populations ont été estimés dans dnaSP 5.10 en utilisant le K st statistique 35 , bien que F st et n st des estimations ont également été obtenues à des fins de comparaison. La signification du K st *les estimations ont été évaluées par permutation des identités de sous-population et recalcul de K st * 10 000 fois, comme implémenté dans dnaSP 5.10.

Arbre phylogénétique des haplotypes GSTe2

Test de sélection sur GSTe2

Expression et purification de la protéine GSTe2

Un allèle GSTe2 résistant (119 F-GSTe2) du Bénin (BN) et deux allèles sensibles (L119-GSTe2) d'Ouganda (UG) et du Malawi (MAL) ont été clonés dans un plasmide d'expression pET28a entre les sites Nde I et Xho I pour donnent les constructions pET28a::BN-GSTe2, pET28a::UG-GSTe2 et pET28a::MAL-GSTe2. Les plasmides pET28a::BN-GSTe2, pET28a::UG-GSTe2 et pET28a::MAL-GSTe2 ont été transformés dans la souche Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen, Madison, WI, US) pour l'expression de la protéine en utilisant des protocoles standard. Un total de 5 & 160 ml d'une culture d'une nuit a été sous-cultivé dans 500 & 160 ml de milieu de bouillon 2TY frais plus de la kanamycine (50 & 160 956 g/ml). Les cellules transformées ont été cultivées à 37°C. L'expression de GSTe2 a ensuite été induite avec 0,3 160 mM d'isopropyl-&# 946-D-thiogalactoside lorsque la DO (densité optique) à 600 &# 160 nm était de 0,6 à 0,8 pendant une nuit à 16 176 C. Les cellules ont été récoltées par centrifugation (15 160 min, 4 500 8201 g) remises en suspension dans du TrisHCl 25 160 mM pH 1608,0, du NaCl 500 160 mM, de l'imidazole 20 160 mM et du mercaptoéthanol 5 160 mM et rompues par sonication. Après centrifugation (40 160 min, 40 000 g), le surnageant clair a été filtré et les GSTe2 marqués par His ont été purifiés à l'aide d'agarose Ni-NTA (Qiagen, Valence, CA, États-Unis) selon les instructions du fabricant. Le surnageant filtré a été mélangé avec les billes préalablement équilibrées. Après incubation, une étape de lavage avec dix volumes de tampon TrisHCl 25 mM pHو.0, NaCl 500 mM, imidazole 20 mM et tampon 5 mM β-mercaptoéthanol a été réalisée. Toutes les constructions ont donné des produits de 26,8 kDa. Après une dialyse complète contre 25 mM TrisHCl pHو.0, 200 mM NaCl et 5 mM β-mercaptoéthanol, le His-tag a été clivé en utilisant 7,5 unités de thrombine par mg de protéine marquée. Une étape de purification finale a été réalisée à l'aide d'une colonne Superdex 200 16/60 (Amersham Biosciences Limited, Londres, Royaume-Uni) pour obtenir un échantillon hautement purifié (Figure n°160 5 A). Les évolutions dans le temps de la chromatographie ont été suivies par SDS-PAGE (Figure & 160 5 B). Les protéines GSTe2 ont été concentrées à 23 & 160 mg/ml avec un concentrateur de protéines Amicon à seuil de coupure de 10 kDa (YM-10 Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). La concentration finale en protéines a été déterminée par spectrophotométrie en utilisant le coefficient d'absorption molaire calculé à 280 & 160 nm. Les échantillons ont été conservés à 4°C.

Test métabolique pour évaluer l'effet de la GSTe2 sur le DDT, la perméthrine et la deltaméthrine

L'activité de la GST a été déterminée avec un dosage spectrophotométrique pour examiner la formation du conjugué de 1-chloro-2,4-dinitrobenzène (CDNB) et de GSH réduit. Une unité d'enzyme est définie comme la quantité d'enzyme qui donne 1,0 160 mole de produit conjugué par minute à pH 1606,5 et 30 °C. Les tests de métabolisme ont été effectués à 30 °C pendant 60 à 160 minutes avec agitation à 1 200 à 160 tr/min, dans un volume total de 0,5 à 160 ml. Le système tampon était du tampon phosphate de potassium 0,1 160 M (pH 1606,5), 2,5 160 mM de GSH et 0,2 unité d'enzyme en présence de 10 160 g/ml de DDT, 0,025 / 160 mg/ml de perméthrine ou 0,03 & #160mg/ml de deltaméthrine le tout dans du méthanol (le solvant ne dépasse pas 10 % du volume total de la réaction). L'échantillon témoin contenait le même mélange de réactifs avec l'enzyme recombinante bouillie. Après 1 160 h d'incubation, 500 160 l de méthanol ont été ajoutés pour arrêter la réaction et les échantillons ont ensuite été centrifugés à 13 000 rpm pendant 20 minutes à température ambiante et 200 160 l du surnageant résultant ont été transférés. aux flacons HPLC. La quantité de DDT, DDE et pyréthroïde restant dans les échantillons a été déterminée par HPLC en phase inverse avec une longueur d'onde d'absorbance de contrôle de 232 nm (Chromeleon, Dionex, Sunnyvale, CA, US). Brièvement, 100 & 160 & 956 l d'échantillon ont été injectés dans une colonne C18 de 250 & 160 mm (Acclaim 120, Dionex, Sunnyvale, CA, US) à 23 & 176 C. La séparation du DDT et du DDE a été réalisée en utilisant une phase mobile isocratique de 92% de méthanol et 8% d'eau avec un débit de 1 & 160 ml/min. Des études cinétiques ont été menées comme décrit précédemment 8 . Les résultats ont été analysés par régression non linéaire en utilisant le logiciel GraphPad Prism v4.0 (GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA).

Métabolisme GSTe2 supplémentaire de la perméthrine par gradient run

Pour mieux résoudre les pics de métabolites observés pour la perméthrine avec l'analyse isocratique initiale, une analyse supplémentaire du profil métabolique de la perméthrine par GSTe2 a été réalisée en utilisant une condition d'analyse en gradient. Le composé d'origine et ses métabolites ont été séparés sur une colonne C18 Acclaim en injectant 100 160 de produits de réaction reconstitués dans 1 160 ml de méthanol après une étape d'extraction et d'évaporation à l'acétate d'éthyle. Le mélange réactionnel était de 2 160 ml avec 10 160 g/ml de perméthrine et 0,2 unité de GSTe2. La réaction a été initiée en ajoutant 2,5 & 160 mM de GSH. Un mélange d'incubation de sérum bovin a été utilisé comme témoin négatif. Les phases mobiles utilisées étaient le solvant acétonitrile (A), méthanol (B) et H2O (C). Les analytes ont été élués avec les programmes de gradient suivants (augmentation linéaire) : 0 ° 160 min (0 % A, 5 % B, 95 % C), 15 ° 160 min (37% A, 5 % B, 58 % C), 25 ° 160 min (60% A, 5% B, 35% C), 50 & 160 min (85% A, 5% B, 10% C), 51 & 160 min (95% A, 5% B, 0% C), 56& #160min (95 % A, 5 % B, 0 % C), 61 & 160 min (0 % A, 5 % B, 95 % C) et 69 & 160 min (0 % A, 5 % B, 95 % C), à un débit de 1 ml/min. Les pics ont été détectés à 232 & 160 nm. La collecte et l'analyse des données ont été réalisées à l'aide du logiciel Chromeleon.

Détermination de la structure GSTe2 et amarrage des allèles DDT

Le GSTe2 des moustiques du Bénin, de l'Ouganda et du Malawi a été purifié comme décrit dans les informations supplémentaires pour les tests métaboliques. Les conditions de cristallisation initiales de GSTe2 ont été étudiées par des techniques à haut débit avec un robot NanoDrop (Innovadyne Technologies Inc., Santa Rosa, CA, US) en utilisant les solutions d'écran commerciales Crystal Screen 1 et 2 (Hampton Research, Aliso Viejo, CA, US) , PACT Suite et JCSG Suite (Qiagen, Valence, Californie, États-Unis). Les tests de cristallisation ont été effectués en utilisant la méthode de diffusion de vapeur en gouttes assises à 18°C ​​dans des plaques à 96 puits (microplaques Innovaplate SD-2, Innovadyne Technologies Inc., Santa Rosa, CA, États-Unis). Des gouttes de 250 nl de protéine à 23 nl 160 mg/ml et 250 nl de solution de précipitation ont été mélangées et équilibrées contre 65 n 160 nl de solution de puits. Les conditions de cristallisation préliminaires ont conduit à des amas cristallins de plaques minces. Plusieurs stratégies ont été utilisées pour optimiser les meilleures conditions de cristallisation, qui comprenaient l'ajustement de la composition de l'échantillon de protéines, la concentration du précipitant et les valeurs de pH, et le criblage avec différents additifs (Additive Screen, Hampton Research, Aliso Viejo, CA, US) ou détergents. Les conditions finales ont été agrandies sur des plaques à 24 puits (plaques Linbro, Hampton Research, Aliso Viejo, CA, États-Unis) par le biais d'expériences en gouttes suspendues et sur un microbain de 60 puits sous huile (plaques Terasaki) à 18°C.

Les cristaux utilisés dans notre analyse se sont développés à partir d'un mélange de 1 160 l de solution de protéines à 23 160 mg/ml et 2 160 l d'une solution de précipitation. Après le raffinement de plusieurs paramètres, des cristaux prismatiques isolés et en forme de bâtonnets ont été obtenus. Le BN-GSTe2 a été cristallisé par diffusion de vapeur en gouttes pendantes en utilisant une solution comme précipitant contenant 40 % (v/v) de PEG 300 et 0,1 & 160 M de phosphate-citrate pH&# 1604.2. Cependant, UG-GSTe2 et MAL-GSTe2 ont été cristallisés à l'aide d'une technique de microbatch sous huile avec un tampon précipitant à 25 %  w/v PEG 1500 et 0,1 M PCB (Propionate, Cacodylate, Bis-Tris Propane) pHن.0, et 25% w/v PEG 1500 et 0,1 M MMT (acide L-malique, MES, Tris) tampon pHم,0, respectivement. Pour faire pousser des cristaux holo_GSTe2, 0,5 μl de 10 mM GSH (L-glutathion réduit)/GSSG (L-glutathion oxydé) de Hampton Research ont été ajoutés aux gouttes de cristallisation. Plusieurs cryoprotecteurs ont été testés, dont le glycérol, le MPD (2-Méthyl-2,4-pentanediol) et le polyéthylène glycol. La meilleure solution cryoprotectrice était du glycérol à 20 % sur la liqueur mère cristalline.

Collecte de données et résolution de structure

Les cristaux ont été montés sur une boucle de fibre, transférés dans la solution de cryoprotecteur et congelés rapidement à 100°K dans une vapeur d'azote gazeux. Les données préliminaires de diffraction ont été recueillies à l'aide d'un détecteur interne à plaque d'imagerie Mar345dtb (MarResearch, Norderstedt, Allemagne) avec Cu Kα Rayons X générés par un générateur à anode tournante (MicroStar, Bruker, Billerica, MA, US) avec des miroirs Helios (Bruker, Billerica, MA, US) fonctionnant à 45 kV et 60 mA. Les cristaux apo_UG-GSTe2 et holo_MAL-GSTe2 n'étaient pas adaptés à l'analyse des données de rayons X car leur diffraction était très mauvaise. Cependant, les cristaux d'apo_BN-GSTe2, holo_BN-GSTe2 et holo_UG-GSTe2 avaient de bons diagrammes de diffraction. Un ensemble complet de données de diffraction a été collecté pour chacun à l'aide de l'installation européenne de rayonnement synchrotron (Grenoble, France) (voir les détails dans le fichier supplémentaire 15 : tableau S7). Les données de diffraction ont été traitées avec XDS (X-ray Detector Software) 38 et mises à l'échelle avec SCALA du progiciel CCP4 (Collaborative Computational Project, Numéro 4, 1994). Le remplacement moléculaire avec le programme Phaser 39 a été utilisé pour résoudre les structures GSTe2. Les coordonnées de l'An. gambiae glutathion S-transférase epsilon 2 (agGSTe2) [PDB:2IL3] (92% d'identité de séquence 27) ont été utilisés pour résoudre les structures apo_BN-GSTe2 et holo_UG-GSTe2. La structure holo_BN-GSTe2 a été résolue en utilisant les coordonnées holo_UG-GSTe2. Plusieurs cycles de raffinement restreint avec PHENIX 40 et de modélisation itérative avec COOT ont été nécessaires pour obtenir les modèles finaux. Les molécules d'eau ont également été modélisées. Les statistiques de collecte, de traitement des données et de raffinement du modèle sont résumées dans le fichier additionnel 15 : Tableau S7.

Fiche complémentaire 15 : Tableau S7

Statistiques récapitulatives pour la collecte, le traitement et le raffinement du modèle de données.

La stéréochimie des modèles a été vérifiée avec MolProbity, et les figures du modèle moléculaire ont été produites à l'aide de PyMol (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.5.0.4 Schrödinger, LLC, Portland, OR, US). Les RMSD entre les structures des protéines ont été calculées en COOT. L'algorithme DALI a été utilisé pour l'alignement de séquences basé sur la structure de BN-GSTe2 et UG-GSTe2 avec d'autres GST d'insectes.

L'amarrage du DDT aux différents allèles de GSTe2 a été réalisé à l'aide du logiciel Genetic Optimization for Ligand Docking (GOLD) du Cambridge Crystallographic Data Center, Royaume-Uni. Le DDT et le DDE ont été utilisés dans les calculs d'amarrage. Les structures 3D de ces molécules ont été obtenues à partir de la Cambridge Structural Database avec les codes de référence CPTCEL et DCLPEY, respectivement. La stéréochimie des ligands a été confirmée avec le programme Mercury. Les coordonnées holo_BN-GSTe2 et holo_UG-GSTe2 ont été utilisées pour définir le site de liaison pour les études d'amarrage moléculaire. Toutes les molécules de solvant dans les structures ont été retirées et des atomes d'hydrogène ont été ajoutés à la protéine entière. De plus, des atomes d'hydrogène ont été ajoutés à la molécule de cofacteur et le groupe SH de la cystéine a été déprotoné pour obtenir GS − pour les calculs d'amarrage. La cavité d'amarrage a été définie comme une collection d'acides aminés enfermés dans une sphère avec un rayon de 10 & 160 & 197 autour de la molécule GS & 8722, donnant la liberté de mouvement à F118, R112, E116, L119 ou F119, F120, T165 et L207 et une flexibilité plus restreinte à M111 et F115 dans les rotamers à chaîne latérale. Les paramètres par défaut standard ont été utilisés dans tous les calculs (nombre d'amarrages : 10), mais la résiliation anticipée était autorisée lorsque les trois meilleures solutions étaient à moins de 1,5 / 160 / 197 RMSD les unes des autres.

Les séquences d'ADN rapportées dans cet article ont été déposées dans la base de données GenBank [GenBank:KC800340-GenBank:KC800421], les données des microarrays dans ArrayExpress (E-MTAB-1578) et les structures radiographiques 3D dans la base de données PDB (BN- GSTe2-GSH [PDB:3zmk] et UG-GSTe2-GSH [PDB:3zml]).

BN : Bénin pb : paire de bases CAM : Cameroun ARNc : ARN complémentaire DDT : dichlorodiphényltrichloroéthane FC : fold-change GH : Ghana GSH : glutathion GST : glutathion S-transférase hd : diversité haploïde HKA : test Hudson, Kreitman et Aguade IRS : résidu intérieur pulvérisation kb : kilobase kdr : résistance knockdown LLIN : moustiquaire insecticide longue durée MAL : Malawi MK : test McDonald et Kreitman MOZ : Mozambique PCR : amplification en chaîne par polymérase PDB : Protein Data Bank PEG : poly(éthylène) glycol qRT-PCR : transcriptase inverse quantitative réaction en chaîne par polymérase RDL : résistance à la dieldrine RMSD : écart quadratique moyen UG : Ouganda UTR : région non traduite OMS : Organisation mondiale de la santé.

Les auteurs déclarent ne pas avoir d'intérêts concurrents.

CSW a conçu, conçu et coordonné la recherche. RD, BDM et CSW ont effectué la collecte des échantillons et les essais biologiques. HI et CSW ont effectué les analyses de transcription et effectué l'analyse de la variabilité génétique. JMR a réalisé l'expression transgénique chez la drosophile. CY a réalisé l'étude cristallographique avec AA. HMI, SSI et JMR ont effectué les dosages métaboliques de GSTe2. Les RH et JH ont contribué à l'analyse des données et à des idées importantes. JMR, CY, HMI et CSW ont rédigé le manuscrit avec la contribution de tous les auteurs. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Ce travail a été soutenu par une bourse Wellcome Trust RCD (083515/Z/07/Z) à CSW. JMR a été soutenu par une bourse Fundación Ramón Aceres. Deux subventions (BFU2011-25384/CSD2006-00015) à AA ont contribué à l'étude cristallographique. Nous remercions Mark Paine pour sa perspicacité et ses commentaires.

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La réponse inflammatoire

Chaque fois que des cellules sont endommagées ou détruites, une série d'événements vasculaires et cellulaires connus sous le nom de réponse inflammatoire est déclenchée. Cette réponse protège la santé en ce qu'elle détruit ou éloigne les influences nuisibles et ouvre la voie au rétablissement de la normalité. La séquence des événements est la suivante : dans une zone blessée (comme dans une infection bactérienne), les cellules libèrent des substances qui provoquent la dilatation des petits vaisseaux sanguins de la zone touchée (vasodilatation) et augmentent ainsi le flux sanguin vers la zone blessée. en même temps, un liquide clair s'écoule des vaisseaux dans la zone où ce liquide a tendance à diluer toutes les substances nocives dans la zone de blessure suivante, les globules blancs du sang s'écoulent des vaisseaux sanguins dans la zone endommagée et phagocytent les bactéries et cellules mortes le mélange résultant de débris cellulaires morts et de globules blancs est connu sous le nom de pus.

Les principaux signes d'inflammation sont la rougeur et l'augmentation de la chaleur (causée par la dilatation des vaisseaux sanguins), l'enflure (résultant de l'accumulation de liquide) et la douleur. Le dernier d'entre eux est l'un des signes cardinaux de toutes les réponses inflammatoires. La douleur dans l'inflammation est causée par des substances libérées par les tissus endommagés qui rendent les terminaisons nerveuses locales plus sensibles à la stimulation. L'inflammation peut être classée comme aiguë ou chronique. L'inflammation aiguë, telle qu'on peut l'observer autour d'une coupure cutanée, ne dure que quelques jours et se caractérise au microscope par la présence de leucocytes polymorphonucléaires. L'inflammation chronique dure plus longtemps et est caractérisée au microscope par la présence de lymphocytes, de monocytes et de plasmocytes et, en général, est associée à une faible exsudation de liquide.

En raison de la douleur et de l'enflure, la réponse inflammatoire est souvent considérée comme un événement indésirable à la suite d'une blessure. Pourtant, il est important de reconnaître qu'il s'agit de la première étape du processus de guérison et représente une réponse protectrice importante dans le maintien de la santé.


Voir la vidéo: biochimie metabolique 12 (Février 2023).