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Problème d'hétérodimère d'amorce

Problème d'hétérodimère d'amorce


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Je conçois mes amorces dans Primer3PLUS et les analyse dans Oligoanalyzer3.1, Un gros problème que j'ai c'est que j'ai obtenu une très belle sortie dans NCBI-Primer BLAST pour leur spécificité mais un G très négatif pour l'auto ou l'hétrodimère même sous -7 ou -13. est-il possible de les utiliser pour la PCR en ajoutant du DMSO ou du formamide ? quel autre moyen peut être utile?


Appel de base, mappage de lecture et analyse de couverture

Séquence utilisable

En plus des FAI polyclonaux, Torrent filtre également les lectures de dimères d'amorce et de faible qualité, et la « séquence utilisable » est le pourcentage de FAI de bibliothèque qui passent les filtres polyclonaux, de faible qualité et de dimère d'amorce. Le filtre de faible qualité élimine les lectures avec des appels de base incertains, au moins certaines de ces lectures sont générées par des FAI qui contiennent des niveaux inférieurs aux niveaux optimaux de séquence de modèles. Le logiciel scanne également les lectures pour la séquence de l'adaptateur 3′. Les fragments de bibliothèque d'une longueur inférieure à 8 pb sont considérés comme des dimères d'amorces et sont filtrés.


Récepteurs nucléaires

Neil J. Mckenna , David D. Moore , dans Endocrinologie (sixième édition) , 2010

SHP et DAX-1

Le petit partenaire hétérodimère (SHP) et la région critique d'inversion sexuelle–hypoplasie congénitale des surrénales sensibles au dosage sur le chromosome X (DAX-1) sont des récepteurs orphelins uniques qui manquent d'un domaine de liaison à l'ADN du récepteur nucléaire. SHP peut interagir directement avec un certain nombre d'autres récepteurs nucléaires et inhiber leur capacité à activer la transcription. 45 Comme indiqué précédemment, les résultats avec les knock-out SHP ont soutenu un rôle spécifique proposé pour SHP dans une voie dépendante de FXR pour la régulation par rétroaction négative de la biosynthèse des acides biliaires. Il est intéressant de noter qu'il existe apparemment des mécanismes redondants supplémentaires pour ce processus, car les souris SHP null montrent la perte attendue de répression en réponse à un agoniste synthétique du FXR, mais maintiennent largement l'effet répressif des niveaux élevés d'acides biliaires alimentaires. 46,47

Contrairement à SHP, qui se compose uniquement d'un domaine de liaison au ligand, DAX-1 comprend un domaine N-terminal supplémentaire qui a été associé à diverses activités de liaison à l'ADN, mais la signification de cette fonction potentielle reste incertaine. 48 Perte de fonction de l'humain DAX1 gène provoque une forme liée à l'X d'hypoplasie congénitale des surrénales qui est associée à un hypogonadisme hypogonadotrope. 48 Comme SHP, DAX-1 fonctionne comme un répresseur transcriptionnel, et on pense que la perte de cette fonction de répression explique ce phénotype. Les cibles transcriptionnelles de DAX-1 restent inconnues, mais plusieurs éléments de preuve, y compris une interaction directe et des modèles d'expression similaires, suggèrent qu'il module la fonction SF-1. 49


Problème d'hétérodimère d'amorces - Biologie

Le composant le plus simple de l'ADN est un nucléotide. Plus précisément, il s'agit d'un désoxyribonucléotide. Il a une épine dorsale constituée d'un groupe phosphate attaché au carbone 5' d'un sucre. Ceux-ci forment l'épine dorsale de l'ADN, ou les côtés de l'échelle. Le code de l'ADN est déterminé par les bases azotées. Et ceux-ci pourraient être constitués d'adénine, de thymine, de guanine ou de cytosi

Chaque nucléotide est lié à un autre par ce qu'on appelle une liaison phosphodiester. Et l'ADN a une direction. L'ADN est lu à partir d'une direction 5 premiers vers 3 premiers. Cela signifie que l'ADN est lu un peu comme nous liions un livre. Il commence à la 5ème extrémité du brin. C'est le brin qui commence par le groupe phosphate. Et puis l'ADN est lu vers la direction 3, ou vers l'extrémité sucrée de l'ADN.

Jusque dans les années 1950, on ne savait pas grand-chose de l'ADN. Nous savions que l'ADN était le code de la vie. Mais nous n'avions aucune idée de comment cela fonctionnait. Tout ce que nous savions vraiment, c'est qu'il était composé de sucre, de phosphate et des quatre bases azotées. Une grande partie du travail fondamental sur l'ADN a été réalisée par James Watson et Francis Crick. En 1953, Watson et Crick ont ​​identifié la structure de l'ADN. Tout au long de leur collaboration, Watson et Crick ont ​​proposé trois caractéristiques.

On savait que les deux squelettes de la molécule d'ADN s'alignaient côte à côte. Cependant, ils pourraient théoriquement aligner deux manières différentes. Ils pourraient s'aligner dans la même direction, c'est-à-dire que les deux côtés de l'échelle seraient 5 premiers à 3 premiers dans la même direction. Watson et Crick, cependant, ont proposé que les 2 brins d'ADN soient antiparallèles. Cela ne veut pas dire qu'ils étaient perpendiculaires. Cela signifie plutôt que la ligne s'aligne côte à côte, mais que la direction de l'épine dorsale de l'ADN va dans deux directions différentes. Et si cela devait être vrai, Watson et Crick ont ​​proposé que l'appariement des bases azotées était complémentaire. C'est-à-dire que l'adénine se lie à la thymine et la guanine se lie à la cytosine. Si l'ADN était parallèle plutôt qu'antiparallèle, il est théoriquement possible que des bases azotées similaires se soient associées les unes aux autres. Ce serait un A avec un A, un C avec un C, et ainsi de suite.

Watson et Crick ont ​​ensuite partagé un prix Nobel. Leur découverte dépendait en grande partie du travail d'une femme, la chimiste Rosalind Franklin, dont les recherches ont été utilisées à son insu ou sans sa permission. Pire encore, elle n'a pas été créditée pour son travail. Elle n'était pas l'auteur de leur publication historique identifiant la structure de l'ADN. C'est la photographie de Franklin de la molécule d'ADN qui a déclenché une révolution scientifique menée par Watson et Crick. En ce qui concerne la première vue de cette photo, Watson a déclaré: "Ma mâchoire s'est ouverte et mon pouls a commencé à s'accélérer." La photo montrait, pour la première fois, la structure essentielle de l'ADN - la forme en double hélice, qui indiquait également sa méthode de réplication. Ce sont les compétences photographiques de Franklin qui ont rendu la découverte possible. Elle ne savait pas que les autres hommes utilisaient ses recherches pour fonder l'article paru dans le journal. La nature. Elle ne partagerait pas non plus le prix Nobel. Cependant, ce n'est pas parce que Franklin a été négligé, mais parce qu'elle était morte. Le prix n'est pas décerné à titre posthume. Franklin a reçu un diagnostic de cancer de l'ovaire en 1956 à l'âge de 37 ans et est décédée deux ans plus tard (probablement à cause de son exposition aux radiations pendant ses travaux de laboratoire.

Aussi scandaleuse que fût la situation avec Rosalind Franklin, James Watson et Francis Crick étaient de véritables scientifiques révolutionnaires. Watson et Crick ont ​​proposé que les deux brins d'ADN servent de modèles (ou de modèles) pour la production de nouveaux brins d'ADN. De cette façon, l'ADN pourrait être copié maintes et maintes fois. La vie exige cela. Ils ont fait valoir que ces brins sont copiés en fonction de cet appariement de bases complémentaires. En d'autres termes, une molécule d'ADN s'ouvre et les paires de bases azotées correspondent à leur complément (As avec Ts, et Cs avec Gs).

Hypothèses de réplication de l'ADN

Une fois la structure de l'ADN établie, l'exploit majeur suivant était de comprendre comment il était répliqué. Et il y a trois façons possibles pour l'ADN de se répliquer. Celles-ci sont connues sous le nom d'hypothèses alternatives pour la réplication de l'ADN. L'hypothèse de la réplication semi-conservatrice prédit que l'ADN parental se sépare et que chaque brin sert de matrice, dans laquelle une nouvelle copie est faite à partir de chacun des anciens brins. Ainsi, sur l'image, les brins roses représentent les brins d'ADN parentaux tandis que le brin jaune représente les chromosomes copiés (les chromosomes filles). Les brins roses se séparent, une copie est faite puis chaque nouveau double brin d'ADN a un brin parental et un brin fille.

Dans la réplication conservatrice, l'ADN parental est utilisé comme matrice pour la synthèse d'une nouvelle molécule. En d'autres termes, les deux brins d'ADN parentaux sont copiés, et nous nous retrouverions avec deux brins d'ADN, l'un était l'ADN parental d'origine et l'autre est une copie complète du double brin d'ADN parental.

L'autre possibilité de réplication de l'ADN est connue sous le nom de réplication dispersive. Dans ce modèle, les nouvelles molécules d'ADN sont une combinaison de segments d'ADN parental et d'ADN fille. … Alors, comment l'ADN est-il répliqué. Nous le savons grâce aux résultats d'une expérience ingénieuse.

En 1958, Matthew Meselson et Franklin Stahl ont conçu une expérience pour déterminer laquelle de ces hypothèses serait soutenue. L'azote est un constituant majeur de l'ADN. Le 14N est de loin l'isotope le plus abondant de l'azote, mais l'ADN avec l'isotope 15N plus lourd (mais non radioactif) est également fonctionnel. Meselson et Stahl ont cultivé E. coli dans de l'azote « lourd » (15N). Cela a créé un brin d'E. coli avec seulement 15N dans l'ADN. Après avoir cultivé E. coli en 15N pendant de nombreuses générations, l'azote lourd E. coli a été cultivé dans un milieu azoté normal 14N. Ensuite, ils ont suivi les E. coli pendant quelques générations et ont pu déterminer le rapport de 15N et 14N dans chaque génération. La comparaison de ce ratio permettrait aux chercheurs de déterminer laquelle de ces hypothèses alternatives serait appuyée. Voyons comment cela se passerait.

Ainsi, lorsque la nouvelle génération d'E. coli est arrivée à maturité, la moitié de l'ADN serait parentale et la moitié de l'ADN serait une copie. Meselson et Wahl pourraient mesurer la quantité de 15N et 14N et déterminer le pourcentage de chromosomes parent/fille. Cela serait vrai pour toutes les hypothèses alternatives pour la réplication de l'ADN. Cependant, après 2 générations, ces ratios seraient différents. Chacun de ces trois modèles fait une prédiction différente sur la distribution de l'ADN "15N" dans les molécules formées après réplication. Dans l'hypothèse conservatrice, après réplication, une molécule est la molécule "15N" entièrement conservée, et l'autre est tout l'ADN nouvellement synthétisé. L'hypothèse semi-conservatrice prédit que chaque molécule après réplication contiendra un ancien et un nouveau brin. Cela signifierait que la moitié de la deuxième génération serait un ADN de faible densité (ceux entièrement constitués de 14N), et la moitié aurait une densité intermédiaire d'ADN. Une densité intermédiaire aurait ½ de l'ADN 14N et ½ de l'ADN 15N.

L'hypothèse conservatrice prédit que chaque double brin d'ADN fait une copie exacte de lui-même à chaque génération. Si l'ADN était copié de cette manière, le rapport 15N et 14N serait différent. Dans la deuxième génération, ¼ de l'ADN serait de haute densité (c'est-à-dire que l'ADN serait composé à 100 % d'ADN 15N), tandis que ¾ de l'échantillon serait d'ADN de basse densité (c'est-à-dire composé d'ADN 14N). Le modèle dispersif prédit que chaque brin de chaque nouvelle molécule contiendra un mélange d'ADN ancien et nouveau. Si l'ADN était copié par réplication dispersive, chaque génération serait constituée d'ADN de densité intermédiaire. C'est tout l'ADN qui serait composé de parties de l'ADN 15N et de parties de l'ADN 14N.

E. coli ont été cultivées pendant plusieurs générations dans un milieu à 15N. Lorsque l'ADN est extrait de ces cellules et centrifugé sur un gradient de densité saline, l'ADN se sépare au point où sa densité est égale à celle de la solution saline. L'ADN des cellules cultivées dans un milieu 15N avait une densité plus élevée que les cellules cultivées dans un milieu 14N normal. Après ça, E. coli les cellules avec seulement 15N dans leur ADN ont été transférées dans un milieu 14N et ont pu se diviser. L'ADN a été extrait périodiquement et a été comparé à l'ADN pur 14N et à l'ADN 15N. Après une réplication, l'ADN s'est avéré avoir une densité proche de la densité intermédiaire. Étant donné que la réplication conservatrice entraînerait des quantités égales d'ADN de densités supérieure et inférieure (mais pas d'ADN de densité intermédiaire), la réplication conservatrice a été exclue.

Cependant, ce résultat était cohérent à la fois avec une réplication semi-conservative et dispersive. La réplication semi-conservatrice donnerait un ADN double brin avec un brin d'ADN 15N et un brin d'ADN 14N, tandis que la réplication dispersive donnerait un ADN double brin avec les deux brins ayant des mélanges d'ADN 15N et 14N, l'un ou l'autre étant apparu comme ADN d'une densité intermédiaire. Les auteurs ont continué à échantillonner les cellules au fur et à mesure que la réplication se poursuivait. L'ADN des cellules après deux réplications s'est avéré être constitué de quantités égales d'ADN avec deux densités différentes, l'une correspondant à la densité intermédiaire d'ADN des cellules cultivées pour une seule division dans un milieu 14N, l'autre correspondant à l'ADN des cellules cultivées exclusivement en milieu 14N. Cela était incompatible avec la réplication dispersive, qui aurait entraîné une densité unique, inférieure à la densité intermédiaire des cellules d'une génération, mais toujours supérieure à celle des cellules cultivées uniquement dans un milieu d'ADN 14N, car l'ADN 15N d'origine aurait été divisé de manière uniforme. parmi tous les brins d'ADN. Le résultat était cohérent avec l'hypothèse de réplication semi-conservative.

Meselson et Stahl ont montré que chaque brin d'ADN parental est copié dans son intégralité, ce qui suggère que l'ADN est répliqué via l'hypothèse semi-conservatrice. Cependant, ils n'ont pas donné de mécanisme. La découverte de l'ADN polymérase a ouvert la voie au mécanisme de synthèse de l'ADN. La découverte de l'enzyme, l'ADN polymérase, a permis de comprendre plus précisément le mécanisme par lequel l'ADN est répliqué. Il a été découvert que les nucléotides ne sont ajoutés qu'à l'extrémité 3' du squelette nucléique. De cette façon, l'ADN est toujours synthétisé dans la direction 5' à 3'. En d'autres termes, l'ADN se lit comme un livre d'avant en arrière (jamais d'arrière en avant).

Lancement de la réplication

L'ADN est répliqué dans des bulles de réplication dans les chromosomes. Et la synthèse procède dans deux directions. Étant donné que la réplication se produit de la direction 5 'à 3' et que l'ADN est antiparallèle, la synthèse se produit dans les deux sens. Les bactéries ont une seule origine de réplication chez les eucaryotes, l'ADN est répliqué à plusieurs origines de réplication. Regardons les détails de la façon dont l'ADN est répliqué. L'ADN commence la réplication en étant ouvert, déroulé et amorcé pour la réplication. La double hélice d'ADN est ouverte par une enzyme appelée hélicase. Il s'agit d'une enzyme spécialisée qui rompt les liaisons entre les deux brins d'ADN. L'hélice d'ADN est alors stabilisée. Cela signifie que des protéines spéciales appelées protéines de liaison à l'ADN simple brin, se fixent aux brins d'ADN ouverts pour les empêcher de se recoller automatiquement. Imaginez que vous essayez de dérouler un slinky en une ficelle de métal avec rien d'autre que vos mains. On s'apercevrait vite que le déroulement du slinky créerait de sérieuses tensions. Vous pouvez utiliser des outils pour faciliter le processus de déroulement du slinky.

L'ADN utilise une protéine spéciale pour lutter contre ce problème. Cette protéine est appelée topoisomérase, et elle coupe et rejoint l'ADN en aval de la fourche de réplication, soulageant ainsi la tension causée par le déroulement de l'hélice. Dans la dernière étape d'initiation, l'ADN polymérase est amorcée. Une protéine spéciale, connue sous le nom de primase, démarre le processus de réplication en fournissant un groupe hydroxyle 3 'qui peut un nucléotide afin de former la première liaison phosphodiester. L'ADN est maintenant prêt à être répliqué.

Le réplisome est une machine moléculaire complexe qui effectue la réplication de l'ADN. Il est composé de deux complexes d'ADN polymérase, dont l'un synthétise le brin leader, tandis que l'autre synthétise le brin retardé.

Chaque nucléoïde en division nécessite deux réplisomes pour une réplication bidirectionnelle. Les deux réplisomes continuent la réplication aux deux fourches au milieu de la cellule. Enfin, lorsque le site de terminaison se réplique, les deux réplisomes se séparent de l'ADN.

La matrice de brin principale est le brin d'ADN répliqué en continu. C'est le brin qui est continuellement polymérisé vers la fourche de réplication. Toute la synthèse d'ADN se produit 5'-3'. Le brin retardé croît dans le sens opposé au mouvement de la fourche en croissance. Il se développe à partir de la fourche de réplication et il est synthétisé de manière discontinue. On l'appelle le brin retardé car il est synthétisé loin du brin et est en retard sur la fourche.

Synthèse du brin retardé

Parce que le brin s'éloigne de la fourche de réplication, il doit être répliqué en fragments car la Primase (qui ajoute l'amorce d'ARN) doit attendre que la fourche s'ouvre pour pouvoir ajouter l'amorce. Une fois que la Primase s'attache, l'ADN polymérase commence à ajouter des bases à l'extrémité 3' de l'amorce et ajoute des nucléotides loin de la fourche de réplication, produisant des segments d'ADN.

Ces fragments d'ADN produits sur le brin retardé sont appelés fragments d'Okazaki. L'orientation de l'ADN d'origine sur le brin retardé empêche une synthèse continue. En conséquence, la réplication du brin retardé est plus compliquée que la réplication du brin leader. Ce processus se répète à la fourche avec un déroulement supplémentaire de l'ADN. Ce qui reste, c'est un tas de fragments d'Okazaki le long de la matrice d'ADN. Enfin, les segments d'ADN sont attachés les uns aux autres avec de l'ADN ligase.


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Problème: Pour qu'une amorce d'ARN soit synthétisée sur l'ADN, laquelle des enzymes suivantes est nécessaire : a. Gyraseb. ADN polymérase Ic. ADN ligaturé. Primase

Pour qu'une amorce d'ARN soit synthétisée sur l'ADN, laquelle des enzymes suivantes est nécessaire :

Questions fréquemment posées

Quel concept scientifique devez-vous connaître pour résoudre ce problème ?

Nos tuteurs ont indiqué que pour résoudre ce problème, vous devrez appliquer le concept d'introduction à la réplication de l'ADN. Vous pouvez visionner des leçons vidéo pour apprendre l'introduction à la réplication de l'ADN. Ou si vous avez besoin de plus de pratique d'introduction à la réplication de l'ADN, vous pouvez également pratiquer les problèmes pratiques d'introduction à la réplication de l'ADN.

Quelle est la difficulté de ce problème ?

Nos tuteurs ont évalué la difficulté deAfin qu'une amorce d'ARN soit synthétisée sur l'ADN whic. comme de faible difficulté.

Combien de temps faut-il pour résoudre ce problème ?

Notre tutrice experte en biologie, Kaitlyn, a pris 3 minutes et 30 secondes pour résoudre ce problème. Vous pouvez suivre leurs étapes dans l'explication vidéo ci-dessus.

Pour quel professeur ce problème est-il pertinent ?

Sur la base de nos données, nous pensons que ce problème est pertinent pour la classe du professeur Flores à l'UCF.


INTRODUCTION

P54nrb (NONO chez la souris) a été impliqué dans de nombreux processus au sein du noyau, notamment la régulation transcriptionnelle, l'épissage, le déroulement de l'ADN, la rétention nucléaire d'ARN double brin hyperédité, le traitement de l'ARN viral, le contrôle de la prolifération cellulaire et le maintien du rythme circadien (Shav-Tal et Zipori, 2002 Brown et al., 2005). P54nrb est abondant et omniprésent, peut se lier à l'ARN et à l'ADN simple et double brin et possède une activité anhydrase carbonique inhérente. A l'origine, p54nrb a été purifié sous forme d'hétérodimère avec PSF (Zhang et al., 1993), une protéine avec une homologie de séquence étendue avec p54nrb, et de nombreux rapports ont indiqué que p54nrb et PSF se copurifient dans les nombreux complexes nucléaires dans lesquels p54nrb est trouvé.

Une énigme majeure est de savoir comment p54nrb exerce toutes ses activités disparates au sein du noyau. Il a été supposé que l'état de phosphorylation et la localisation intranucléaire de p54nrb sont critiques à cet égard (Shav-Tal et Zipori, 2002). Nous avons précédemment rapporté un enrichissement de p54nrb dans les paraspeckles, un nouveau compartiment subnucléaire (Fox et al., 2002). Les paraspckles ont été identifiés à l'origine dans les cellules HeLa, mais se trouvent également dans les cellules primaires, d'autres lignées cellulaires transformées et des coupes de tissus (Fox et al., 2002). Les cellules de mammifères contiennent généralement 2 à 20 parapeckles dans l'espace interchromatine, généralement à proximité des speckles d'épissage. Paraspeckle Protein 1 (PSP1), est un marqueur pour les paraspeckles qui partage une similarité de séquence avec p54nrb et PSF (Fox et al., 2002). La PSP1 est généralement accumulée dans les parapeckles et distribuée de manière diffuse dans le nucléoplasme. Cependant, lorsque la transcription de l'ARN polymérase (Pol) II est inhibée par un traitement médicamenteux, la PSP1 laisse des parasites et s'accumule au niveau du nucléole, se concentrant dans des structures en forme de croissant appelées « capuchons périnucléolaires ». FLIP (perte de fluorescence après photoblanchiment) montre que les molécules de PSP1 circulent en permanence entre les parapeckles et les nucléoles lorsque la transcription est active (Fox et al., 2002). De même, les protéines paraspeckle PSP1 et p54nrb sont également présentes dans le protéome nucléolaire humain (Andersen et al., 2002) et p54nrb s'accumule au niveau des mêmes coiffes périnucléolaires lors de l'inhibition de la transcription. Au-delà de sa présence dans les parapeckles, on sait peu de choses sur la fonction de la PSP1. Au moins deux isoformes différentes, PSP1α (l'isoforme principale dans les cellules HeLa, dans cette étude dénommée "PSP1") et PSP1β, ont été détectées chez la souris et l'homme (Fox et al., 2002 Myojin et al., 2004) et peuvent être spécifiques d'un tissu (Myojin et al., 2004).

P54nrb, PSP1 et PSF partagent une identité de séquence 50 %, cependant, PSF possède un grand domaine N-terminal supplémentaire qui le différencie à la fois de PSP1 et de p54nrb. La similitude majeure réside dans un soi-disant « DBHS » (rosophilebcomportement et hhomme splicing), comprenant deux motifs RRM suivis d'un module d'interaction protéine-protéine chargé. Conformément à un rôle d'entretien, les trois protéines sont exprimées de manière ubiquitaire et sont conservées chez les vertébrés. Les espèces d'invertébrés telles que Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, et les moustiques n'ont qu'un seul gène représentant la famille p54nrb/PSF/PSP1. Dans D. melanogaster, NONA, est impliqué dans le développement et le comportement des yeux (Jones et Rubin, 1990) et a un rôle dans le maintien du rythme circadien, similaire à p54nrb (Brown et al., 2005). Dans Chironomus tentans, l'homologue est Hrp65, qui s'exprime sous la forme de trois isoformes (Miralles et Visa, 2001) et l'une d'entre elles, Hrp65-2, lie l'actine (Miralles et al., 2000 Percipale et al., 2003). Hrp65 se localise dans les fibres qui s'associent aux transcrits naissants de l'anneau Balbiani et s'auto-associe via la partie C-terminale de son domaine DBHS (Kiesler et al., 2003).

Outre PSP1 et p54nrb, deux autres protéines de liaison à l'ARN se localisent dans les para-peckles des cellules HeLa. Premièrement, la PSP2 (SIP/CoAA), qui contient également deux motifs RRM et a été trouvée dans des complexes de corépression et de coactivation transcriptionnelles qui modulent la régulation transcriptionnelle dépendante des récepteurs stéroïdiens (Iwasaki et al., 2001 Auboeuf et al., 2004). Un autre lien entre la famille PSP1/PSF/p54nrb et PSP2 est leur copurification mutuelle dans une recherche de protéines de liaison aux récepteurs androgènes (Ishitani et al., 2003). Enfin, un facteur impliqué dans la première étape du traitement de l'extrémité 3′ du pré-ARNm, le CFI(m)68, s'est accumulé dans les foyers qui colocalisent en partie avec les para-peckles (Dettwiler et al., 2004).

Pour caractériser la localisation du paraspeckle de la famille de protéines p54nrb/PSP1/PSF, nous avons analysé la formation et le maintien du paraspeckle tout au long du cycle cellulaire. Nous constatons que PSP1 forme un nouvel hétérodimère avec p54nrb et cible les paraspeckles d'une manière dépendante de l'ARN, alors que son accumulation au niveau des calottes périnucléolaires ne nécessite pas d'ARN.


7.1 : Présentation de la réaction en chaîne par polymérase

  • Contribution de Clare M. O&rsquoConnor
  • Professeur agrégé émérite (biologie) au Boston College

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) a révolutionné la biologie moléculaire. Avec la PCR, les chercheurs disposaient d'un outil pour amplifier des séquences d'ADN d'intérêt à partir de quantités extrêmement faibles
d'une matrice d'ADN. En effet, des milliards de copies peuvent être synthétisées à partir d'une seule molécule d'ADN dans une réaction PCR typique. Le développement de la PCR est né de la recherche sur les ADN polymérases et de la découverte d'ADN polymérases thermostables capables de résister à des traitements thermiques prolongés qui dénaturent la plupart des protéines (Sakai et al., 1988). Aujourd'hui, la PCR est une technique standard largement utilisée pour analyser des molécules d'ADN et construire de nouvelles molécules recombinantes.

Les ADN polymérases thermostables sont au cœur de la PCR. La première description de la PCR utilisée
une ADN polymérase de E. coli, qui se dénaturait et devait être remplacé après chaque tour de
Synthèse de l'ADN (Sakai et al., 1985). La procédure a été grandement améliorée en remplaçant le E.
coli
polymérase avec une ADN polymérase de Thermus aquatique, une bactérie qui se développe
dans les sources thermales du parc national de Yellowstone. Les T. aquaticus ADN polymérase, ou Taqpolymérase, fonctionne mieux à des températures de 70-75 ̊C et peut résister à une incubation prolongée (mais pas indéfinie) à des températures supérieures à 90 ̊C sans dénaturation. En quelques années, leTaq polymérase avait été clonée et surexprimée dans E. coli, augmentant considérablement sa disponibilité. Aujourd'hui, la sélection de polymérases disponibles pour la PCR a considérablement augmenté, car de nouvelles ADN polymérases ont été identifiées dans d'autres organismes thermophiles et des modifications génétiques ont été introduites dans Taq polymérase pour améliorer ses propriétés.

La PCR implique plusieurs cycles de synthèse d'ADN à partir des deux extrémités du segment d'ADN en cours d'amplification. Rappelez-vous ce qui se passe lors de la synthèse de l'ADN : une amorce oligonucléotidique simple brin se lie à une séquence complémentaire de l'ADN. Cette région double brin fournit
une ancre pour l'ADN polymérase, qui prolonge l'amorce, TOUJOURSvoyager dans le sens 5&rsquo à 3&rsquo. Les enquêteurs contrôlent les sites de départ pour la réplication de l'ADN en fournissant des oligonucléotides pour servir d'amorces pour la réaction (illustré ci-dessous pour Votre gène préféré Yfg). Pour concevoir des amorces PCR, les chercheurs ont besoin d'informations de séquence précises pour les sites de liaison des amorces dans l'ADN cible. (Remarque : les informations sur la séquence ne sont pas nécessaires pour la séquence entière qui sera amplifiée. La PCR est souvent utilisée pour identifier les séquences qui se produisent entre deux sites de liaison d'amorce connus.) Deux amorces sont nécessaires pour la PCR. Une amorce se lie à chaque brin de l'hélice d'ADN.

La PCR commence par une période de dénaturation de plusieurs minutes, au cours de laquelle le mélange réactionnel est incubé à une température suffisamment élevée pour rompre les liaisons hydrogène qui maintiennent ensemble les deux brins de l'hélice d'ADN. Une dénaturation efficace est essentielle, car l'ADN polymérase nécessite un ADN simple brin comme matrice. Le segment de dénaturation initial est plus long que les étapes de dénaturation suivantes, car les matrices biologiques pour la PCR, telles que l'ADN génomique, sont souvent de longues molécules complexes maintenues ensemble par de nombreuses liaisons hydrogène. Dans les cycles de PCR suivants, les produits (plus courts) des cycles précédents deviennent les modèles prédominants.

Après la dénaturation initiale, la PCR implique une série de 30 à 35 cycles avec trois segments, effectués à différentes températures. Les réactions de PCR sont incubées dans des thermocycleurs qui ajustent rapidement la température d'un bloc de réaction métallique. Un cycle typique comprend :

  • une étape de dénaturation - généralement 94 ̊C
  • une étape de recuit d'amorce - généralement 55 ̊C
  • une étape d'extension - généralement 72 ̊C

Les réactions PCR comprennent plusieurs cycles de dénaturation, d'hybridation et d'extension.

la séquence d'amorce. Les ADN polymérases deviennent plus actives à la température d'extension, qui est plus proche de leur température optimale. Les chercheurs adaptent les températures et le calendrier des étapes ci-dessus pour s'adapter à différentes amorces, matrices et ADN polymérases.

Les produits PCR de la taille prévue s'accumulent de façon exponentielle

La PCR est en effet une réaction en chaîne, puisque la séquence d'ADN d'intérêt double à peu près
à chaque cycle. En dix cycles, une séquence sera amplifiée

1000 fois (2 10 = 1024). En vingt cycles, une séquence sera amplifiée

million de fois. En trente cycles, une séquence peut être théoriquement amplifiée

milliard de fois. Les réactions PCR en laboratoire impliquent généralement 30 à 35 cycles de dénaturation, d'hybridation et d'extension. Pour comprendre la PCR, il est important de se concentrer sur les premiers cycles. Les produits PCR de la taille prévue apparaissent d'abord dans le deuxième cycle. L'amplification exponentielle du produit de PCR prévu commence au troisième cycle.

Au cours du premier cycle, les ADN polymérases thermostables synthétisent l'ADN, prolongeant les extrémités 3&rsquo des amorces. Les ADN polymérases sont des enzymes processives qui continueront à synthétiser l'ADN jusqu'à ce qu'elles tombent littéralement de l'ADN. Par conséquent, les molécules d'ADN complémentaires synthétisées dans le premier cycle ont une grande variété de longueurs. Chacun des produits, cependant, a une position de départ définie, puisqu'il commence par la séquence d'amorce. Ces séquences " ancrées " deviendront des matrices pour la synthèse d'ADN au cours du cycle suivant, lorsque les produits PCR de la longueur voulue apparaîtront pour la première fois. Le modèle de départ pour la PCR continuera d'être copié dans chaque cycle de PCR suivant, produisant deux nouveaux produits &ldquoanchored&rdquo à chaque cycle. Étant donné que les longueurs des produits « ancrés » sont assez variables, cependant, ils ne seront pas détectables dans les produits finaux de la réaction PCR.

Des brins d'ADN de la longueur voulue apparaissent pour la première fois au cours du deuxième cycle. La réplication à partir des fragments &ldquoanchored&rdquo génère des produits PCR de la longueur souhaitée. Le nombre de ces fragments de longueur définie doublera à chaque nouveau cycle et deviendra rapidement le produit prédominant dans la réaction.

La plupart des protocoles PCR impliquent 30-35 cycles d'amplification. Au cours des derniers cycles, les produits PCR souhaités ne s'accumulent plus de manière exponentielle pour plusieurs raisons. Comme dans toute réaction enzymatique, les substrats de PCR se sont épuisés et les cycles répétés d'incubation à 94 °C ont commencé à se dénaturer Taq polymérase.

Le recuit des amorces est essentiel à la spécificité de la PCR

Une bonne conception d'amorce est essentielle au succès de la PCR. La PCR fonctionne mieux lorsque les amorces sont hautement spécifiques de la séquence cible dans l'ADN matrice. Une erreur d'amorçage se produit lorsque les amorces se lient à des séquences qui ne sont que partiellement complémentaires, ce qui amène l'ADN polymérase à copier les mauvaises séquences d'ADN. Heureusement, les chercheurs sont généralement capables d'ajuster les paramètres expérimentaux pour maximiser la probabilité que les amorces s'hybrident avec les bonnes cibles.

Les amorces de PCR sont typiquement des oligonucléotides synthétiques d'une longueur comprise entre 18 et 25 bases. Lors de la conception d'une amorce, les chercheurs considèrent son Tm, la température à laquelle la moitié des hybrides formés entre l'amorce et la matrice fondra. En général, la stabilité thermique d'un hybride augmente avec la longueur de l'amorce et sa teneur en GC. (Rappelez-vous qu'une paire GC-base est stabilisée par trois liaisons H, contre deux pour une paire AT.) La formule suivante fournit une estimation approximative de la Tm d'hybrides d'oligonucléotides. Dans cette formule, m fait référence au nombre de nucléotides, et la concentration de cations monovalents est exprimée en unités molaires (M).


Problème d'hétérodimère d'amorces - Biologie

C2005/F2401 '10 Conférence n°12 -- Conclusion de la PCR de synthèse d'ADN Qu'est-ce que l'ARN et à quoi sert-il ? La prochaine fois : comment l'ARN est-il fabriqué ?

Copyright 2010 Deborah Mowshowitz et Lawrence Chasin, Département des sciences biologiques, Columbia University New York, NY. Dernière mise à jour 19/10/2010 15:10

Documents : 11-3 -- Réplication de l'ADN - Détails sur Fork &
12-A -- PCR
12-B = Comparaison de la synthèse d'ARN et d'ADN
Des copies de tous les documents sont placées dans les boîtes à l'extérieur du bureau du Dr M (7e étage de Mudd) après chaque conférence. Des copies numérisées de tous les documents sont affichées, mais pas nécessairement avant la fin de la conférence.

Pour toutes les corrections dans les notes, les éditions actuelles et précédentes du livre de problèmes, etc., voir la page des corrections. Si vous trouvez des erreurs, n'hésitez pas à envoyer un courriel au Dr M.


Partie I : réplication de l'ADN, suite. -- Comment l'ADN fait-il le travail #2 ?

I. Événements à une fourche de réplication d'ADN -- Synthèse discontinue et rôle de la ligase.

Comment fonctionne la réplication avec une vraie molécule d'ADN longue de millions de paires de bases ? Points importants de la dernière fois (voir les notes de la leçon 10 pour plus de détails) :

Vous ne déroulez pas la molécule entière et ne répliquez pas chaque brin modèle séparément. Au lieu de cela, vous déroulez une petite partie de la double hélice à la fois, en commençant par une extrémité.

Toutes les nouvelles chaînes poussent de 5' à 3', antiparallèlement au gabarit.

Une nouvelle chaîne (le brin principal) est synthétisée en continu et un nouveau brin (le brin en retard) est synthétisé de manière discontinue.

L'enzyme ligase rejoint les sections du brin retardé (fragments d'Okazaki).

Pour les diagrammes, voir Sadava fig 13.16 (11.18) ou Becker 19-9. Regarde aussi document 11-3. Les étapes et les lettres énumérées ci-dessous et la dernière fois se réfèrent au diagramme du haut sur le document.

Les étapes 5 et 6 du document ont été omises la dernière fois qu'elles sont expliquées ci-dessous.


II. Amorces & amp Primase. (En haut du document 11-3. Étapes 5 et 6)

Si vous mettez de l'ADN polymérase, ligase, pyrophosphatase, dATP, dGTP, dTTP et dCTP dans un tube à essai (+ toutes les enzymes de déroulement), obtiendrez-vous de l'ADN ? Non, car l'ADN polymérase ne peut pas démarrer une nouvelle chaîne - elle ne peut que s'ajouter à l'extrémité 3' d'une chaîne préexistante. (Il existe plusieurs ADN polymérases, mais toutes ont cette propriété.) Alors, comment démarrer de nouveaux brins d'ADN ? Utilisation d'un apprêt et d'un primase.

B. La solution in vivo

1. Comment Primase fabrique Primer -- voir Sadava fig. 13.13 (11-16) ou Becker 19-11.

b. Apprêt: L'étirement court de l'ARN produit par la primase est appelé amorce. Sur le polycopié (11-3) des événements à la fourche, l'amorce d'ARN est représentée par un point. (Dans le diagramme ci-dessous, l'amorce est une ligne ondulée rouge.) La primase catalyse la synthèse de l'amorce, puis l'ADN polymérase s'ajoute à l'extrémité 3' de l'amorce d'ARN.

2. Comment l'apprêt est retiré et remplacé
L'amorce (la courte section d'ARN) doit être retirée et remplacée par de l'ADN. Le processus est illustré aux étapes 5 et 6 du document 11-3 et dans le schéma ci-dessous. Certaines des étapes ci-dessous peuvent se produire simultanément, mais sont décrites séparément pour rendre le processus plus clair.

Étape 5 : L'amorce est retirée, laissant un espace entre l'extrémité 3' du fragment Okazaki #2 et l'extrémité 5' du fragment #1, donnant la molécule E.

Étape 6 : l'ADN polymérase s'ajoute à l'extrémité 3' de l'amorce #2 pour combler le vide, donnant la molécule F.

Étape 7: La ligase rejoint les extrémités libres du brin retardé, donnant la molécule G.

L'élimination de l'amorce d'ARN (étape 5) et le remplissage de l'espace avec de l'ADN (étape 6) peuvent se produire en même temps, en utilisant deux parties catalytiques différentes d'une seule enzyme. L'enzyme responsable est une ADN polymérase, mais pas nécessairement la même qui s'ajoute à l'extrémité 3' de la chaîne de croissance régulière. (Les enzymes peuvent avoir plus d'une activité catalytique. Voir ci-dessous pour plus de détails.)

3. Images récapitulatives de l'utilisation et du remplacement de l'apprêt
S
ee Becker Fig 19-13 ou Sadava fig. 13.17 (11.19) ou image ci-dessous. Remarque : Certaines des images des anciennes éditions des textes n'ont pas tous les détails corrects. Certaines des figures impliquent que l'ADN peut remplacer l'amorce d'ARN sans avoir besoin d'une extrémité 3' libre pour l'ADN polymérase à ajouter. D'autres figures montrent la ligase rejoignant les fragments d'Okazaki au mauvais endroit. (Voir l'image ci-dessous ou la solution au problème 6-14, partie B-3, pour la position correcte de la ligature. Notez que la fourche de réplication du problème 6-14 va dans la direction opposée à la fourche de l'image ci-dessous.)

Dans l'image ci-dessous, qui résume le processus de synthèse et de remplacement des amorces, toutes les flèches vont de 5' à 3'. Un seul côté de la fourche de réplication est représenté - le côté effectuant la synthèse du brin retardé. Le côté réalisant la synthèse en continu est omis. Notez que la fourche de réplication ci-dessous va de droite à gauche -- l'ADN se décompresse de droite à gauche.

Fonction & Remplacement de l'amorce voir aussi le document 11-3.

Pour des animations de retrait d'amorce et d'autres événements à la fourche de réplication, voir les liens donnés ci-dessus au début de la conférence.


C. Le problème final -- une conséquence biologique (chez les eucaryotes) du besoin d'amorces.

1. Le problème de "l'extrémité libre"

Il n'y a pas de moyen facile de remplacer l'amorce à l'extrémité gauche du nouveau brin (dans l'image ci-dessus) voir également Becker fig. 19-15. L'ARN peut être retiré, mais aucun ADN ne peut être fabriqué pour combler le vide.

2. Solutions

une. Les petits ADN (et la plupart des chromosomes procaryotes) sont généralement circulaires, qui contourne ce problème.

b. Télomères et télomérase. Les chromosomes linéaires (la norme chez les eucaryotes) ont tendance à raccourcir à chaque réplication - au prochain tour, la chaîne qui vient d'être faite sera un modèle, et elle est plus courte que l'originale de la longueur de l'amorce. Comment les organismes avec des chromosomes linéaires évitent les conséquences : les molécules d'ADN dans les chromosomes ont des séquences répétées spéciales (appelées télomères) aux extrémités. Les répétitions sont progressivement perdues à moins d'être remplacées par une enzyme appelée télomérase. Plus de détails seront discutés le trimestre prochain lorsque nous nous concentrerons sur les eucaryotes.

Le prix Nobel 2009 des sciences médicales a été décerné aux chercheurs qui ont identifié les télomères et la télomérase. Accédez à la page d'accueil officielle du prix Nobel pour obtenir des liens vers les descriptions de toutes les récompenses en chimie et en sciences médicales. Plusieurs de ces prix ont été décernés pour des découvertes couvertes dans ce cours.

Pour info uniquement : les chromosomes eucaryotes raccourcissent parfois à chaque réplication, mais cela n'a généralement pas d'importance car les sections perdues (répétitions télomériques) ne contiennent pas d'informations génétiques (codantes). Voir Sadava fig. 13.20 (11.21) ou Becker 19-16. (Remarque : dans la photo de Purves dans la 6e édition, le mauvais brin est "trop ​​court". L'extrémité 3' doit être plus longue que l'extrémité 5', pas l'inverse.) une durée de vie finie de 50 à 60 divisions. Les cellules germinales, qui produisent les ovules et les spermatozoïdes, fabriquent la télomérase, donc une nouvelle génération commence toujours avec des télomères de pleine longueur. Pour une animation du fonctionnement de la télomérase, voir http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Telomerase.html. (Notez que cette animation est pour les eucaryotes dans ce cas, il existe deux ADN polymérases différentes pour les brins principaux et retardés. Les deux poussent des chaînes dans le sens 5 'à 3'.)

Pour revoir les amorces, voir le problème 6-12, A-D et le problème 6-14. Si vous avez l'éd. du livre de problèmes, il y a une faute de frappe dans le problème 6-12, partie D. Les éditions ultérieures sont corrigées.

RÉ . Activités catalytiques de l'ADN polymérase

1. Les ADN polymérases sont des enzymes complexes. Les ADN polymérases ont de multiples sous-unités (chaînes peptidiques) et de multiples activités enzymatiques. Les différentes activités enzymatiques peuvent être catalysées par différentes sous-unités de la même enzyme ou par différentes enzymes. Dans cette classe, nous regroupons toutes les ADN polymérases et les traitons comme une seule enzyme. In more advanced classes the properties of the different DNA polymerases will be distinguished.

2. How many Catalytic Activities?

DNA polymerases have at least two different catalytic activities:
(1) polymerase: adds to 3' end of growing chain, using dXTP and releasing PPje.
(2) 5' to 3' exonuclease: removes nucleotides from 5' end of primer by hydrolysis.

DNA polymerases can have an additional catalytic activity:
(3) 3' to 5' exonuclease: removes nucleotides from 3' end of growing chain by hydrolysis. This allows the enzyme to proofread -- to 'back up' and remove nucleotides that were added in error by hydrolyzing the phosphodiester bonds it has just made (if the wrong base was put in). When it backs up, DNA pol. catalyzes the following reaction:

rxn A: chain (n+1 units long) + H2O ↔ chain (n units long) + XMP

The 3' to 5' exonuclease is important in correcting mistakes and maintaining a high accuracy during DNA synthesis. Note that reaction A is NOT the reverse of the polymerase reaction. See 4 below.

3. Terminology: The ability to remove nucleotides one at a time from the end of a chain is called exonuclease activity. (exo = from the exterior or end). There are two types of exonuclease:

une. 3' to 5' exo. The enzymatic ability of DNA polymerase used in proof reading removes nucleotides one at a time from the 3' end of a chain. Therefore it is called 3' to 5' exonuclease activity.

b. 5' to 3' exo. The enzymatic activity of DNA polymerase that removes RNA primer has a different exonuclease activity -- this enzyme removes nucleotides one at a time from the 5' end of the primer (not from the 3' end). It has 5' to 3' exonuclease activity.

4. The 3' to 5' exonuclease reaction is not the same as the reverse of the polymerization reaction.

Here is the normal elongation reaction catalyzed by DNA polymerase (to the right):

rxn B: Chain (n units long) + XTP ↔ Chain (n+1 units long) +PPje

Any enzyme can catalyze its reaction in both directions, given the right concentration of substrates and products. Reversing the polymerase reaction would mean breaking the phosphodiester bond by adding pyrophosphate back and regenerating a dXTP like so:

(rxn B to the left): Chain (n+1 units long) +PPje ↔ Chain (n units long) + XTP

However, what the 3' to 5 exo catalyzes is not the reverse of rxn B (rxn B to the left) -- it's the hydrolysis of the phosphodiester bond (rxn A). Hydrolyzing or adding water across the newly made phosphodiester bond releases a dXMP (not a dXTP). The 3' to 5' exo takes off the end nucleotide, if it was the 'wrong one' but it doesn't regenerate the dXTP. Therefore hydrolysis is different from reversing the polymerase reaction.


III. Bi-directional Replication. (Bottom of handout 11-3). Multiple Replication Forks

A. How many replication forks per DNA? The more forks, the faster replication is. Most small genomes (such as bacterial and viral DNA's) are circular, and replicate bi-directionally -- 2 forks emanate from a single origin as shown on the bottom of handout 11-3 or Sadava fig. 13.19A (11.13A) or Becker 19-4 (19-5). Longer DNA molecules are usually linear and often have multiple bidirectional origins of replication as shown in Sadava fig. 13.19B (11.14B) or Becker fig. 19-5 (19-6) -- this will be discussed later when we get to eukaryotes.

B. How does bi-directional Replication go? In the top picture on the handout you have one fork or zipper moving down the DNA. In the bottom picture, you have 2 zippers or forks. Both start from the same point (the dotted line = origin of DNA replication = ori) but one fork goes to the left and one fork goes to the right. The events at each fork are the same as those shown in the top of the handout, but the forks go left and right instead of down. At each fork you have unwinding, continuous synthesis on one strand and discontinuous synthesis & ligation on the other strand, just as before. If the DNA is circular, the right fork is really going clockwise and the left fork counterclockwise, and the 2 forks proceed until they meet in the middle of the molecule, approximately 180 degrees from where they started. (See Becker fig. 19-4 (19-5).)

C. An Important Definition: Bidirectional replication means that there are 2 fourchettes that move in opposite directions. It does NOT refer to the fact that the 2 DNA brins (leading and lagging strands) are made in opposite directions. That is called discontinu synthesis, and it always happens at every fork whether there is one fork (unidirectional replication as in the top panel of handout 11-3) or two (bidirectional replication as on the bottom of the handout.)

To be sure you understand what is happening in the bottom picture, it is a good idea to write in all the 5' and 3' ends on the DNA's shown and also to number the Okazaki fragments at each fork to montrer l'ordre dans which they are made.

To review bi-directional replication, see problem 6-13, part A.


Part II -- PCR (Handout 12A) -- Note: Handout 12A was revised on 10/18, and the steps in B below were re-written to match the revised version. You should reprint B below if you printed it before 10/18/10. The remainder is unchanged.

IV. PCR (Polymerase Chain Reaction) A Practical Application of the need for Primers.

The inventor, Kary Mullis, received the Nobel prize in 1993. For his acceptance speech, biography, etc. see the Nobel Prize official site. For uses of the technique, see class handout.

A. Idea of prefab primer, hybridization.

DNA synthesis will not start without a primer. In a living cell, primase (a type of RNA polymerase) makes the necessary ARN primer. Then DNA polymerase can take over, adding on to the 3' end of the primer. In a test tube, you can omit primase and use an oligonucleotide (short polynucleotide, usually ADN) as primer (= prefab ADN primer) to force replication to begin wherever you want. The primer you add will hybridize to its complementary sequence, wherever that happens to be (not necessarily at the end of the DNA) and DNA polymerase will add on to the 3' end of the primer, thereby starting elongation of a chain from wherever the primer is.

B. Steps of PCR -- see PCR handout (12A), Sadava fig. 13.22 (11.23), and/or Becker Box 19 A. For an animation, go to http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html

The site listed above (The Dolan DNA Learning Center) has many good features you may want to check out. There is a list of additional animations on PCR, DNA replication, etc. at http://www.dna.utah.edu/PCR_Animation_Links.htm. Please let Dr. M know if you find any of these sites (or any others) particularly useful.

1. First Cycle: You take your template (A) and denature it. (Step 1 = denaturation results in B.) Then you add primers (one to each strand) to the denatured DNA and cool the mixture. When you cool the mix down, each oligonucleotide primer hybridizes to its complement. (Step 2 = hybridization to primer results in D*.) Under the conditions used, the two long strands of template do not renature to each other. Then the DNA polymerase adds on to the 3' end of primer until it reaches the end of the template strand. (Step 3 = elongation results in E.) This completes the first cycle (ends at E). The new strands you just made (dashed on handout in E) include the target sequence, plus some extra DNA on their 3' ends. (This "extra" corresponds to the sequence between the target area and the 5' end of the modèle strand.)

*Note: There is no (C) on the handout to avoid confusion with Watson (W) and Crick (C) strands.

2. Second Cycle: Same procedure as before in cycle 1. You heat the DNA to denature it (step 4 = step 1), and add more of the same primers as before (step 5 = step 2). Then you allow DNA polymerase to add on to the 3' ends of the primers (step 6 = step 3). This completes the second cycle (ends at H). On the handout, only the fate of the new strands made in cycle two is shown after F. The old strands simultaneously go through another cycle just like the one above (steps 2 & 3), but this is not shown on the handout. Les Nouveau strands you made in cycle 2 (shorter strand of each molecule of H) include only the target sequence.

3. Third Cycle: Same procedure as before in cycles 1 & 2. You heat the DNA again to denature it (step 7), add primers (step 8) and allow DNA polymerase to add to the primers (step 9. This completes the 3rd cycle (ends at K). On the handout, only the fate of the new strands made in cycle two is shown after I. (The fate of the complementary strands, left over from the previous cycle, is to repeat steps 5 & 6.) At the end of this cycle, you finally have double-stranded DNA molecules the length of the target sequence (see K).

4. Additional Cycles: Same procedure as in previous cycles (repeat of steps 1-3). After each cycle you heat the reaction mixture to denature the DNA, and then you cool the mixture down to start the next cycle. In each cycle, primer sticks to the appropriate spot (its complement) and polymerase starts at the 3' end of the primer and goes to the end of the template. Note that primers are complementary to sequences in the middle of the original chain, but that after two cycles the parts beyond the primers are no longer copied. .

5. How reaction is actually carried out . All components (template and excess of heat resistant polymerase, primers & dXTP's ) are present from the very beginning. The mixture is heated and cooled repeatedly to end and start subsequent cycles. You don't have to add primers, polymerase, etc. to start each cycle.

6. How many Primers? New molecules of primer are used in each round. However, the primer molecules used in each round have the same sequences as the ones used in all the previous rounds. The primers are not reused -- new primers (with the same sequences as before) are needed for each cycle. You need only two types (sequences) of primer, but you need many molecules of each, just as you need many molecules of dATP, dTTP, etc.

7. Identification of Product. The products of the PCR reaction are usually identified by their lengths, which are determined by gel electrophoresis without SDS. (Why no SDS needed? Think about it.) Gels are used that separate DNA molecules on the basis of their molecular weights (which depends on chain length). Hybridization to labeled probes is often used to detect the positions of the bands of DNA on the gel. (More on this later.) An animation of DNA gel electrophoresis is at http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/electrophoresis.html.

C. Special Features of PCR (as vs. regular DNA synthesis)

1. Special Polymerase. The DNA polymerase used in this procedure is a special heat-resistant one (called Taq polymerase) that is not denatured when the temperature is raised to separate the two strands of the DNA. This special polymerase was isolated from bacteria that live in a hot spring.

2. No replication fork or discontinuous synthesis. Note that the entire template molecule is denatured (or 'unzipped') completely before each cycle, so the complement to each strand can be made continuously. There is no replication fork and thus no discontinuous synthesis here.

3. Preformed DNA primer. Primase is absent, so no RNA primers are made. Oligonucleotides of DNA (not RNA) are added instead to act as primers.

To review the PCR technique, see problem 6-13, C-1 and 6-15.

For an animation of PCR and links to animations of other DNA techniques, see the urls listed above or go to the links page.)

1. Amplification: Uses small number of starting molecules & produces large number of copies of target sequence. You need amplification to get enough target DNA to hybridize to a probe.

The beauty of this scheme (PCR) is that the desired (target) sequence is copied exponentially and the other parts of the original DNA are copied linearly. So after a few cycles you have lots of copies of the target sequence (and not much of anything else). To convince yourself of this, see the answer to problem 6-13, part C-2. To use this technique and make many copies of the target sequence all you need (in theory) is ONE starting DNA molecule (and appropriate primers). Given current technology, you need 10-50 starting DNA molecules. You can use the multiple copies for many different purposes such as characterization and/or identification as explained below. Before PCR, you couldn't get enough DNA to do chemical tests, so you couldn't compare different DNA samples.

2. Detection -- Can be Used to see if a particular target DNA is present or not.

You can add primers to a sample that you suspect contains some particular target DNA, such as HIV DNA, or DNA from genetically modified corn, or DNA from pond water. The primers are complementary to a sequence found only in the target DNA -- the one you are testing for. (In the cases mentioned, the primers would be complementary to a sequence in HIV DNA, or a sequence added to ordinary corn DNA by genetic engineering methods to make the special corn, or to a DNA sequence unique to American bullfrogs.) Then you see if polymerase can make DNA. If no target DNA is present, primers will have nothing to hybridize to, so polymerase will have nothing to add on to, and no copies of DNA will be made. Alors si vous ne pas get multiple copies, it indicates there was nothing to copy -- your target DNA was not there. Si tu faire get multiple copies, your target DNA was in the sample.

Notes: (1) The standard HIV screening test is not for HIV itself or for HIV DNA but for antibodies to proteins of HIV. (PCR is used as a backup to confirm a positive result with the standard screening test, or to measure the actual levels of HIV.)

(2). Why would you test for genetically modified corn? StarLink corn is a type of genetically modified corn that was approved for animal feed, but not for human use. In spite of attempts to keep it separate, it has turned up in many human foods. It is probably harmless to humans, but no one wants to take any chances. Testing for the modified DNA is the only way to tell if StarLink corn (or any other genetically modified food) is present in a mixture or not. A site with an explanation of the StarLink fiasco is at http://www.geo-pie.cornell.edu/issues/starlink.html.

3. Forensics -- Can be Used for identification -- DNA fingerprinting

une. Basic idea: PCR can be used to copy specific sections of the DNA from different samples -- for example, from DNA left at the scene of a crime and from DNA from a suspect. The sections of amplified DNA can then be compared to see if they match or not (in length, sequence, etc.). The sections that are compared are highly variable ones that probably don't carry any information and are merely spacers in the DNA. If enough sections are checked, you can determine (to a very high degree of certainty) whether the two DNA samples came from the same person or not. DNA testing can be used to identify the guilty (inclusions) and to clear the innocent (exclusions). Alec Jeffreys, who first came up with the idea of using DNA testing for identifications, received a Lasker award in '05. For a pdf with details see the Lasker site.

b. Exemples: See articles handed out in class and article from the San Francisco Chronicle of 10/19/99. (Note: you'll need to go to the SFChronicle web site itself if you want to see the pictures or get some of the older articles.)

c. Inclusions: If the samples match at enough highly variable spots, then there is a very high probability the samples came from the same person, because the degree of variation is so high that only a few different people in the world should have the same pattern.

ré. Exclusions: If the two samples do not match, then it is clear that the two samples came from different individuals and the suspect could not have committed the crime (since the DNA at the scene came from someone else).

e. STR's: The variable sections that are tested are often ones that have different numbers of short tandem repeats (STR's). The primers hybridize to regions outside the section with the repeats. The number of repeats in each DNA can be figured out from the length of the sections amplified by PCR. The new FBI data base contains the information from checking 13 sections with variable numbers of STR's.

For a great site from the Dolan Learning Center with examples of how DNA is used for identification and forensics click here.

4. Bar Coding (See the article on handout B from lecture 10. For more details on Fish bar coding, see the FishBol site.)

The tests of the DNA from different organism used a similar principle to the one used in forensics. A particular gene that varies from species to species was amplified and then sequenced. The procedure is called 'Bar coding' because the sequencing procedure produces a pattern that looks like a supermarket bar code. There is enough variation in the sequence (or Bar code) of that particular gene to identify the species of animal or fish from which it came. In this case, the the amplified DNA from the different samples is compared to the DNA from reference samples. The actual base sequences of the various DNAs are compared. In forensics, the amplified DNA from the crime scene is compared to the amplified DNA from the suspect, and the comparisons are based on the lengths of the amplified fragments (not on their actual sequences).

5. Why you can't do this with proteins

There are very sensitive tests for presence of proteins (usually using the catalytic activities of enzymes and/or binding abilities of antibodies), but no way to amplify (make copies of) what you detect. You can't make more protein from a protein template. PCR takes advantage of fact that DNA replicates for a living to make more copies. Tu pouvez make more DNA from a DNA template.

Note: So-called DNA fingerprints are characteristic of the person/DNA from which they came. So-called protein fingerprints are characteristic of the protéine from which they came. That's why both are called 'fingerprints.' However the two types of 'fingerprints' are made differently and used for different purposes.


Part III -- How does DNA do job #1? How does 'DNA make Protein?'

V. Central Dogma -- How does DNA do job # 1?

A. Big Picture . So we have a big DNA that includes a particular gene = stretch of DNA coding for a single peptide how will we make the corresponding peptide?

Note: gene usually means a stretch of DNA encoding 1 polypeptide, but there are complications as we'll see later.

1. Basic idea -- see also Becker fig. 21-1 or Sadava fig. 14.2 (12.2 & 12.3):

  • Replication = DNA synthesis using a DNA template.

  • Transcription = RNA synthesis using a DNA template.

  • Translation has two possible meanings (we will stick to the first):

    (1) Usual meaning = protein synthesis using an RNA template (RNA → protein). Used in contrast to transcription (DNA → RNA).
    (2) In some contexts, translation can mean the entire process (DNA → RNA → protein).

1. Structure: Voir Sadava fig. 4.2 (3.24) and table 4.1 (3.3) ou Becker table 3-5 & fig. 3-17 for comparison of DNA and RNA. RNA is single stranded (although sections may double back on themselves → double stranded regions), has U not T, ribose not deoxy and is generally shorter, but otherwise like DNA. RNA is less stable than DNA -- more easily damaged (because of reactive OH on ribose and because a single strand is more exposed) et less easily repaired (because no 2nd strand to use to correct mistakes on first strand). DNA is also more easily repaired because it has T not U, so damaged C's (which are oxidized to U) can be recognized and removed. En résumé:

ADN ARN Significance/Effect of Difference

Double Stranded

Single Stranded*

For RNA: Ease of repair down likelihood of damage up.

T not U

U pas T

For DNA: Ease of repair of damaged (oxidized) C up. (Damage that coverts C to U can be detected & repaired.)

Deoxyribose

Ribose

For RNA: Reactivity up, stability down

Very long

Relatively Short


For RNA: Less Information carried per molecule but molecule is much more convenient size

* RNA is basically single stranded, but can fold back on itself to form hairpins -- short regions that are double stranded. Voir Sadava fig. 4.3 (3.25)

2. Synthesis. RNA grows just like DNA by adding nucleoside triphosphates (XTP's) to the 3' end of a growing chain. For RNA, enzyme for elongation is called RNA polymerase, XTP's are ribo (not deoxy) and U replaces T. Details to follow.

3. Types. There are 3 major types of RNA involved in translation: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA) and ribosomal RNA (rRNA). The roles of the different types of RNA are outlined below and will be explained in detail next time.


VI. Why mRNA?

A. Basic idea : mRNA = Working, disposable copy vs DNA = archival, permanent master copy. DNA = big fat comprehensive reference book or complex web site. mRNA = Xerox of one (book) page or print out of one web page with information you need for a particular assignment. Book stays safe in library web site remains unchanged. Xerox goes to your room, is actually used, gets covered with coffee stains, smudged, and thrown away.

B. How function of mRNA corresponds to structure

1. Convenience. Small size (1 or a few peptides' worth) is much more convenient than many genes' worth. Xerox of one page much more convenient to work with than big fat book.

2 . Preserve Master. Using mRNA to make protein saves wear and tear on master -- no coffee stains on the archival copy (DNA).

3. Flexibility. D ifferent amounts of mRNA can be made when you need to make different amounts of different proteins. More on this when we get to regulation (operons).

C. Summary: How does RNA make protein?

1. "RNA makes protein" means two things:

  • mRNA to act as template -- determines order of amino acids

  • tRNA to carry the amino acids to the template, and line them up

  • rRNA (in ribosomes) to align the tRNA's carrying the amino acids and hook the amino acids together

  • Of course you need additional proteins (enzymes and other factors) to make protein

2. Hardware vs. Software . rRNA and tRNA are the hardware or tools or machines mRNA is the software or working instructions or tapes/CDs/punchcards. Cells use same old hardware and constantly changing, up to the minute, supply of new software.


VI. Where does RNA come from?
You need lots of RNA to make protein -- tRNA, rRNA & mRNA. How do you make the RNA? All RNA is transcribed from a DNA template. Voir Sadava fig. 14.4 (12.5) or Becker fig. 21-8 (21-9) & 21-10 (21-11).We'll go over how the RNA is made , and then consider how the RNA is used to make protein.

The live lecture in '09 (#12) ended here. If we don't get to it in #12, Topic VII will be covered in lecture #13.

VII. DNA synthesis vs RNA synthesis. The easiest way to go over RNA synthesis, given that we've discussed DNA synthesis at length, is to compare DNA and RNA synthesis. See handout 12-B.

A. Basic mechanism of elongation is the same:

1. Use nucleoside triphosphates (ones with ribose not deoxyribose, but mechanism same) & split off PPje use pyrophosphatase.

2. Chain grows 5' to 3' by addition to 3' end .

3. Need anti-parallel DNA template , put in complementary bases -- A (in template) pairs with U not T, but otherwise same

4. All RNA molecules (mRNA, tRNA and rRNA), not just mRNA's, are made from a DNA template. tRNA and rRNA molecules are ne pas made from an "mRNA" template.

See problems 7-1 & 7-2.

  • Growth of DNA chain is catalyzed by DNA polymerase (and associated enzymes)

  • Growth of RNA chain is catalyzed by RNA polymerase.

  • RNA pol. uses ribonucleoside triphosphates.

  • DNA pol uses deoxyribonucleoside triphosphates.

  • DNA is long and double stranded

  • RNA is short and single stranded

  • Template = short section, one strand at a time (for RNA synth.) vs all of both strands (for DNA synth.)

  • Pourquoi? Because starts and stops are different. Starts & stops = sequences in DNA recognized by the enzymes = places where replication or transcription starts (or ends). These must be different for the two enzymes.

  • Names of start sequences = section where polymerase binds
    Starts for DNA synthesis = Origins. DNA pol. recognizes (binds to) start signals for replication called origins (ori's).
    Starts for RNA synthesis = Promotors. RNA pol. recognizes (binds to) start signals for transcription called promotors (P's).

See problem 7- 6

  • DNA synthesis: Replication fork moves down DNA making complements to les deux strands one new strand is made continuously and one discontinuously. Ligase is needed for synthesis of lagging strand.

  • RNA synthesis: RNA polymerase moves down DNA making complement to one strand ou the other (in any particular region). Therefore RNA synthesis is continuous and doesn't need ligase.

See problems 7-3, 7-4, 7-8 & 7-9.

Next time: We'll finish RNA synthesis vs DNA synthesis, and then consider how the RNA that was transcribed is translated -- how it's used to make protein.

Copyright 2010 Deborah Mowshowitz and Lawrence Chasin Department of Biological Sciences Columbia University New York, NY


Global Sensitivity Analysis. The Primer

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Voir la vidéo: MOOC côté cours: Les différents types de récepteurs cellulaires (Mai 2022).


Commentaires:

  1. Keanu

    En elle quelque chose est. Merci pour l'explication, moi aussi je trouve ça plus facilement mieux...

  2. Stacy

    Hélas! Malheureusement!

  3. Farran

    Désolé pour l'interférence ... j'ai une situation similaire. Je vous invite à une discussion. Écrivez ici ou dans PM.

  4. Giovanni

    I would like to talk to you, I have something to say on this issue.



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