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Comment se fait-il que Draq5 colore le cytoplasme et les membranes sous confocal

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Juste une question d'imagerie à l'arrière de ma tête. Pour le contre-tache nucléaire, Draq5 a été un excellent choix pour de nombreuses personnes depuis de nombreuses années. Et moi aussi j'adore.

Le principe de fonctionnement de Draq5 est le colorant nucléaire que Draq5 se lie à l'ADN double brin, en particulier d-A et d-T. C'est-à-dire qu'il est très spécifique pour colorer l'ADN du noyau, se lie peu à l'ADN des mitochondries et ne se lie pas à l'ARN. C'est aussi un très bon colorant perméable aux cellules vivantes.

En pratique, nous l'utilisons pour colorer le noyau cellulaire puis effectuer une analyse d'image, l'objectif principal de l'analyse d'image est l'identification de l'objet cellulaire, généralement par coloration du noyau. Pas de problème, Draq5 le fait parfaitement, je peux voir mon image parfaitement nette.

Ensuite, il s'agit d'estimer la cellule entière, c'est-à-dire de trouver les limites de la membrane cellulaire. Un énorme avantage de Draq 5 est qu'il colore également faiblement le cytoplasme et la membrane cellulaire, permettant une détection précise des limites cellulaires. Comparé au colorant Hoechst, qui colore également le noyau et faiblement le cytoplasme uniquement pour l'estimation des limites cellulaires. Il est peu probable qu'il s'agisse d'une liaison non spécifique de Draq5, car les données provenant de cellules cancéreuses résistantes dotées de pompes à médicaments membranaires retiennent toujours très bien Draq5.

Je ne suis pas chimiste, alors une chose me vient à l'esprit : pourquoi Draq5 se lie-t-il au cytoplasme et décrit-il si bien les membranes cellulaires ? Étant donné qu'il est hautement spécifique de lier A/T dans les sillons d'ADN double brin. Vraisemblablement, le colorant se lie à sa cible cytoplasmique et à sa cible membranaire via différents mécanismes. Quelqu'un peut-il expliquer cela?


Discrimination de l'ADN et de l'ARN dans les cellules par une sonde fluorescente vitale : Imagerie à vie de SYTO13 dans des cellules saines et apoptotiques

Parmi les quelques sondes vitales d'ADN et d'ARN, les colorants SYTO sont les plus spécifiques des acides nucléiques. Cependant, ils ne montrent aucun contraste spectral lors de la liaison à l'ADN ou à l'ARN. Nous montrons que l'imagerie de fluorescence à vie utilisant une excitation à deux photons de SYTO13 permet une imagerie différentielle et simultanée de l'ADN et de l'ARN dans les cellules vivantes, ainsi qu'une évaluation séquentielle et répétitive des modèles de coloration.

Méthodes

L'imagerie à deux photons de SYTO13 est combinée à un contraste à vie, en utilisant une détection temporelle. Nous nous concentrons sur la distinction de l'ADN et de l'ARN dans des cellules ovariennes saines et apoptotiques de hamster chinois.

Résultats

Dans les cellules saines, SYTO13 a une durée de vie de fluorescence de 3,4 ± 0,2 ns lorsqu'il est associé à l'ADN nucléaire. Lié à l'ARN, sa durée de vie est de 4,1 ± 0,1 ns. Après induction de l'apoptose, des amas de SYTO13 avec une durée de vie de fluorescence de 3,4 ± 0,2 ns deviennent apparents dans le cytoplasme. Ils sont identifiés comme de l'ADN mitochondrial sur la base d'expériences de colocalisation avec le colorant spécifique de l'ADN, DRAQ5, et le colorant spécifique des mitochondries, CMXRos. Lors de la progression de l'apoptose, la durée de vie du SYTO13 attaché à l'ADN se raccourcit considérablement, ce qui indique des changements dans l'environnement moléculaire du colorant.

Conclusion

Nous avons caractérisé SYTO13 comme une sonde vitale à vie, permettant une imagerie répétitive et différentielle de l'ADN et de l'ARN. Cytométrie 47:226-235, 2002. © 2002 Wiley-Liss, Inc.

L'imagerie simultanée et différentielle des propriétés dynamiques de l'ADN et de l'ARN dans divers compartiments des cellules vitales est intéressante pour un certain nombre de raisons. Par exemple, la visualisation de la compartimentation de l'activité transcriptionnelle dans le noyau des cellules vivantes est encore difficile avec les sondes d'acides nucléiques disponibles (1). Ces colorants présentent souvent des affinités similaires pour l'ADN et l'ARN. De plus, l'agrégation, le clivage et la ségrégation de l'ADN dans le noyau apoptotique (2) ne peuvent pas être étudiés correctement dans les cellules vivantes en combinaison avec des changements dans la structure de l'ARN. En effet, aucune sonde d'imagerie vitale n'est disponible pour distinguer l'ADN nucléaire de l'ARN nucléolaire ou de l'ADN mitochondrial. Par conséquent, la ségrégation de l'ADN et de l'ARN nucléaires vers le cytoplasme est difficile à surveiller. L'étude de la dynamique du comportement des acides nucléiques dans les cellules vivantes bénéficiera grandement de sondes ou de méthodes permettant la détection séparée, mais simultanée, de l'ADN et de l'ARN (3-5).

Un contraste spectroscopique ou à vie peut être utilisé pour distinguer les sites de liaison d'une sonde fluorescente. En imagerie spectroscopique (6, 7) des différences d'intensité de fluorescence à deux longueurs d'onde d'excitation ou d'émission différentes sont détectées. En imagerie à vie (8-14), la constante de temps typique des processus de décroissance de la fluorescence est utilisée comme mécanisme de contraste. Les deux principes peuvent être appliqués pour l'imagerie simultanée de plusieurs sondes ou pour une seule sonde qui présente différentes propriétés spectrales ou de durée de vie, en fonction de son partenaire de liaison.

Étant donné que seules quelques sondes d'imagerie vitales sont disponibles qui se lient exclusivement à l'ADN ou à l'ARN, l'utilisation d'une seule sonde est préférée. Les sondes de la famille SYTO (15, 16) sont des colorants d'acide nucléique perméables aux cellules avec des caractéristiques variables, telles que la perméabilité cellulaire, l'amélioration de la fluorescence lors de la liaison, les spectres d'excitation et d'émission et l'affinité de liaison ADN/ARN. Cependant, ils ne présentent aucun contraste spectral dans la liaison à l'ADN ou à l'ARN. Par conséquent, la question se pose : les sondes SYTO présentent-elles un contraste de durée de vie sur les sites de liaison ?

La durée de vie de fluorescence d'une sonde est indépendante des caractéristiques qui modulent l'intensité de fluorescence détectée (par exemple, les fluctuations d'intensité laser, le photoblanchiment, les fuites de sonde, les mouvements hors foyer). D'autre part, il peut être sensible aux paramètres chimiques de son environnement, comme le pH (14, 17-19) et les concentrations en ions ou en oxygène (12, 20-27). Il peut fournir des informations quantitatives sur l'environnement chimique local et l'état des molécules fluorescentes dans la cellule (13, 14, 28-30) et donc offrir un outil pour discriminer entre les colorants SYTO liés à l'ADN et à l'ARN.

Nous avons appliqué une combinaison (31) d'imagerie de fluorescence à vie et d'excitation à deux photons pour étudier l'effet de la liaison de l'ADN et de l'ARN sur les propriétés de l'une des sondes SYTO, c'est-à-dire SYTO13. La microscopie d'excitation à deux photons (32) est maintenant largement utilisée dans les sciences de la vie (33-36). Il a non seulement une résolution axiale intrinsèquement élevée (37) sans avoir besoin d'un trou d'épingle confocal dans le chemin de détection, mais son utilisation peut également réduire considérablement les dommages cellulaires, à la fois en raison de l'utilisation d'une lumière d'excitation de longueur d'onde plus longue (en évitant l'utilisation de dommages UV ou lumière d'excitation bleue) et la réduction de l'irradiation hors foyer (38, 39). Cela rend la microscopie à fluorescence à deux photons très appropriée pour l'imagerie répétitive des cellules (35, 39), sans affecter sérieusement leur vitalité. Étant donné que la microscopie à deux photons nécessite l'utilisation de lasers pulsés femtosecondes (32), la combinaison de l'imagerie à contraste à deux photons et à vie avec l'application de la technique de détection temporelle (14) est simple.

SYTO13 (15) devient fluorescent lorsqu'il est lié à l'ADN ou à l'ARN. Les rendements quantiques sont égaux lorsqu'ils sont liés à l'ARN et à l'ADN, son spectre d'excitation a un maximum à 488 nm et le spectre d'émission culmine à 510 nm. De plus, les caractéristiques d'affinité de liaison pour l'ADN et l'ARN sont comparables. Enfin, SYTO13 marque l'ADN, à la fois dans le noyau et dans les mitochondries, et l'ARN dans le cytoplasme et les nucléoles. Notre étude a été réalisée sur des cellules saines d'ovaire de hamster chinois (CHO). Sur la base d'observations antérieures selon lesquelles certaines sondes d'ADN montrent des changements dans les propriétés de durée de vie de la fluorescence lors de l'apoptose (40-42), nous avons étendu l'étude aux cellules induites à entrer dans la mort cellulaire programmée. Le cas échéant, les observations ont été vérifiées par des expériences de double marquage avec des sondes aux propriétés de marquage connues, c'est-à-dire DRAQ5 (une sonde d'ADN 43) et CMXRos (une sonde mitochondriale 15,44). La colocalisation était présente lorsque le transfert d'énergie, tel que visualisé par les changements dans la durée de vie de la fluorescence SYTO13, se produisait entre les deux colorants ou lorsque les structures coïncidaient. Nous montrons que l'imagerie à vie de fluorescence à deux photons de SYTO13 a un potentiel d'imagerie vitale et différentielle de la dynamique de l'ADN et de l'ARN sans effets dommageables sur les cellules.


MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Cultures cellulaires

Les cellules CHO ont été cultivées sur des lamelles dans du milieu F12 de HAM (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA) additionné de 10 % de sérum de veau foetal (FCS Gibco Life Technologies, Paisley, Royaume-Uni) et de 2 mM de L-glutamine. Les cultures cellulaires ont été maintenues dans un incubateur à 5% de CO2 et 37°C. Avant l'apoptose, les cellules ont été maintenues pendant la nuit dans du milieu F12 de HAM complété avec 1 % de FCS et 2 mM de L-glutamine. L'apoptose a été induite par l'ajout de staurosporine (concentration finale 1 M, Sigma, Zwijndrecht, Pays-Bas) 2 h avant le début des expériences d'imagerie.

Procédures d'étiquetage et préparation des échantillons

Pour déterminer les caractéristiques de durée de vie de SYTO13 interagissant avec l'ADN ou l'ARN, indépendamment de son environnement cellulaire, l'ADN et l'ARNt isolés ont été marqués avec SYTO13 par l'ajout de la sonde à l'ADN ou à l'ARNt dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration finale de 2 M. L'ARNt de levure (10 mg/ml) a été obtenu auprès de Roche Molecular Biochemicals (Bâle, Suisse), tandis que l'ADN de testicule de saumon (10 mg/ml) a été obtenu auprès de Sigma. Le SYTO13 (dans le diméthylsulfoxyde [DMSO], 5 mM) et le CMXRos (dans le méthanol, 5 mM) ont été obtenus auprès de Molecular Probes (Leiden, Pays-Bas). DRAQ5 (5 mM dans HCl) était un cadeau du Prof. dr. Paul J. Smith (Département de pathologie, Université du Pays de Galles, Collège de médecine, Cardiff, Royaume-Uni).

Les cellules saines et apoptotiques ont été marquées par l'ajout de SYTO13-DMSO (concentration finale 1 M) aux cellules sur des lamelles en milieu. Après 30 min d'incubation, SYTO13 a été lavé avec un milieu sans sonde et des images ont été prises. Le marquage des cellules CHO avec SYTO13 et l'imagerie répétitive des cellules n'ont induit aucun changement morphologique.

En utilisant la procédure de marquage standard (43) pour la sonde d'ADN, DRAQ5, les cellules meurent rapidement, vraisemblablement par nécrose. Par conséquent, une procédure de coloration alternative a été développée. Les cellules saines et apoptotiques ont été colorées avec DRAQ5 par l'ajout de la sonde aux cellules sur des lamelles dans un milieu à une concentration finale de 1 M. Après seulement 3 min, le milieu de coloration a été retiré et remplacé par un milieu frais sans sonde. En appliquant cette procédure, les cellules n'ont présenté aucun changement morphologique dans le laps de temps des expériences d'imagerie.

Le double marquage des cellules avec à la fois SYTO13 et DRAQ5 a été réalisé par un premier marquage avec SYTO13, suivi par l'ajout de DRAQ5 selon la procédure décrite ci-dessus. Après seulement 3 min, le milieu de coloration contenant à la fois SYTO13 et DRAQ5 a été retiré et remplacé par un milieu sans sonde.

Les mitochondries des cellules apoptotiques ont été marquées pendant 1 h par addition de CMXRos (15) aux cellules sur des lamelles dans un milieu à une concentration finale de 0,5 mM, avant l'ajout de staurosporine. Dans les expériences de double marquage de CMXRos et SYTO13, ce dernier a été ajouté aux cellules déjà marquées avec CMXRos avant l'observation au microscope, en utilisant la procédure de marquage SYTO13 décrite ci-dessus. Des lamelles avec des cellules ou des gouttelettes de solutions d'ADN/ARN isolées ont été montées dans un porte-échantillon fabriqué à la maison et examinées au microscope.

Microscopie à vie à deux photons

Des expériences ont été réalisées sur un microscope inversé à excitation à deux photons de fabrication artisanale, comme décrit en détail ailleurs (31). En bref, le système est équipé d'un laser titane:saphir (Ti:Sa) à mode verrouillé (Tsunami, Spectra-Physics, Mountain View, CA) qui produit des impulsions de 80 fs à une fréquence de répétition de 82 MHz. Après avoir traversé un extenseur de faisceau et des filtres à densité neutre, la lumière d'excitation est dirigée vers un miroir dichroïque hautement réfléchissant dans le proche infrarouge et transparent en dessous de 700 nm. Ainsi, la lumière d'excitation est réfléchie et focalisée par un objectif à immersion dans l'eau plan-apochromatique 60x (NA1.2, Nikon/Uvikon, Bunnik, Pays-Bas) et balayée sur l'échantillon. La lumière de fluorescence est collectée par le même objectif. La résolution optique était de 0,27 µm latéralement et de 0,72 µm axialement à une longueur d'onde d'excitation de 800 nm (45). Toute la lumière de fluorescence inférieure à 700 nm est transmise à travers le miroir dichroïque décrit ci-dessus et collectée par un photomultiplicateur (Hamamatsu R1894, Toyooka Village, Japon) en mode comptage de photons. Un blocage supplémentaire de la lumière d'excitation est obtenu au moyen d'une série de filtres passe-court interférentiels de 750 nm dans le chemin d'imagerie derrière le miroir. Si vous le souhaitez, une plage de longueurs d'onde d'émission plus étroite peut être sélectionnée en plaçant des filtres d'interférence (IF) ou passe-long (LP) supplémentaires (Optosigma, Santa Anna, CA) dans la voie d'émission.

Toutes les expériences d'imagerie par fluorescence (durée de vie) ont été réalisées à une longueur d'onde d'excitation de 800 nm. L'émission de fluorescence après excitation pulsée peut être décrite par une décroissance exponentielle avec une durée de vie typique. Les durées de vie de fluorescence des colorants couramment utilisés sont généralement de l'ordre de quelques nanosecondes. La méthode utilisée ici pour déterminer la durée de vie de la fluorescence est basée sur la détection temporelle de la fluorescence. Après chaque impulsion d'excitation, la décroissance de la fluorescence est détectée dans quatre fenêtres temporelles (portes) qui sont activées séquentiellement, rendant la durée de vie acquise intrinsèquement indépendante des fluctuations d'intensité laser. Les détails du module de durée de vie sont donnés ailleurs (14). Le signal de nombreuses impulsions d'excitation est intégré pour chaque pixel. L'intensité intégrée dans les quatre portes temporelles est ajustée à une décroissance monoexponentielle à l'aide d'un algorithme d'ajustement de Levenberg-Marquardt non linéaire des moindres carrés (46). L'intensité accumulée des quatre portes donne l'intensité de fluorescence pour chaque pixel de l'échantillon. La durée de vie ajustée pour chaque pixel donne l'image de durée de vie correspondante. Les marges d'erreur (SEM) sont déterminées à partir des résultats d'ajustement dans une zone (10 × 10 pixels) de durées de vie similaires. Des images de durée de vie de fluorescence de bonne qualité de 256 × 256 pixels sont enregistrées en environ 30 s. Toutes les images présentées sont des images en coupe unique d'une cellule, utilisant ainsi la haute résolution axiale de l'excitation à deux photons. En général, des zones de courte durée de vie et de forte intensité sont présentes à côté de zones de courte durée de vie et de faible intensité. Une observation similaire est faite pour les longues durées de vie. Cela indique que les différences observées dans la durée de vie ne sont généralement pas corrélées avec des variations d'intensité dues au blanchiment ou aux différences de concentrations de sondes locales. Les données ont été traitées à l'aide de programmes écrits à la maison sous le progiciel IDL (Creaso B.V., Apeldoorn, Pays-Bas).

Spectres de fluorescence de SYTO13, DRAQ5 et CMXRos

Les spectres d'excitation à deux photons peuvent différer (en forme et en longueurs d'onde de crête) d'une version à longueur d'onde doublée des spectres d'excitation à un photon car les règles de sélection sont différentes (36). Bien que les spectres d'excitation à un photon des sondes utilisées ici diffèrent significativement les uns des autres (15, 43), tous semblent être excitables avec une excitation à deux photons à 800 nm. Pour CMXRos et DRAQ5, l'intensité de fluorescence obtenue est relativement faible.

Les fluorophores présentent le même spectre d'émission avec l'un ou l'autre mode d'excitation (36). La figure 1 montre le spectre d'émission de SYTO13-ADN (15), CMXRos-méthanol (15) et DRAQ5-PBS dans des solutions. Des mesures spectrales sur DRAQ5 dilué dans du PBS (1 µM) ont été réalisées sur un fluoromètre SPF-8100 série 2 (SLM-Aminco, Beun de Ronde, Culemborg, Pays-Bas). Pour la détermination du spectre d'émission, la sonde a été excitée à 568 nm. Pour le spectre d'excitation, la fluorescence émise a été détectée à 670 nm. Dans les cellules, les spectres d'émission de SYTO13, CMXRos et DRAQ5 ont été mesurés à l'aide d'un microscope spectral (7) avec une excitation à 488 nm pour SYTO13 et CMXRos et 568 nm pour DRAQ5 (spectres non représentés). Nous avons constaté que les spectres d'émission de SYTO13 et CMXRos ne sont pas altérés dans les cellules, tandis que le spectre d'émission de DRAQ5 montre un décalage vers le rouge significatif de 20 nm, en accord avec des observations antérieures (43). L'apoptose n'a eu aucune influence sur la forme ou la position des pics des spectres d'émission pour aucune des sondes.

Spectres d'émission des sondes SYTO13-DNA (⧫, excitation à 488 nm), CMXRos-méthanol ( ▪, excitation à 488 nm), et DRAQ5-PBS (•, excitation à 568 nm). La position de l'impulsion d'excitation à 800 nm dans les expériences à deux photons est également indiquée (-⧫-).

Autofluorescence des cellules CHO

Nous avons déterminé l'intensité, la gamme de longueurs d'onde et les durées de vie de l'autofluorescence des cellules saines et apoptotiques et les avons comparées aux caractéristiques de fluorescence des différentes sondes. Lors d'une excitation à deux photons à 800 nm, les cellules CHO saines et apoptotiques présentent une faible autofluorescence dans la plage de longueurs d'onde de 500 à 600 nm. Aucune autofluorescence n'a été détectée au-dessus de 600 nm. Aucune différence dans la distribution de l'autofluorescence et les durées de vie entre les cellules saines et apoptotiques n'a été observée. L'autofluorescence est répartie de manière homogène sur le cytoplasme, avec des taches occasionnellement dispersées d'intensité plus élevée. La durée de vie de l'autofluorescence varie : 2,5 ± 0,4 ns (diffuse) et 4,0 ± 0,5 ns (spots). Dans une étude antérieure (34), la valeur de 2,2 ns a été attribuée à la fluorescence de la liaison du NADH aux protéines (par exemple, dans les mitochondries).

Utilisation de filtres d'émission dans les expériences à sonde simple et double

Sur la base du chevauchement de la région spectrale d'autofluorescence cellulaire et des spectres d'émission du SYTO13 (pour ce dernier, voir Fig. 1), l'utilisation d'un filtre d'émission (IF530 ± 60) nm pour la suppression de l'autofluorescence par rapport au SYTO13 la fluorescence n'est pas possible. Cependant, parce que l'autofluorescence est très faible, une configuration d'installation spécifique a pu être trouvée (par exemple, l'intensité de la lumière d'excitation, le temps de séjour) dans laquelle l'autofluorescence n'a pas dépassé la limite de détection et n'a donc pas contribué au signal de fluorescence de SYTO13. En revanche, pour les sondes faiblement fluorescentes DRAQ5 et CMXRos, les filtres LP650 et IF600 ± 30 nm ont dû être utilisés, respectivement, pour supprimer la contribution de l'autofluorescence.

Dans les expériences de colocalisation, les cellules ont été marquées simultanément avec deux sondes (SYTO13/DRAQ5 et SYTO13/CMXRos). Dans ces paires, les sondes ont des caractéristiques d'émission différentes (Fig. 1) et, par conséquent, les filtres d'émission donnés ci-dessus peuvent être utilisés pour séparer leur fluorescence. L'observation séquentielle à travers l'un ou l'autre des filtres permet maintenant la colocalisation des sondes.


Comment se fait-il que Draq5 colore le cytoplasme et les membranes sous confocal - Biologie

Des travaux récents ont souligné l'importance des événements de trafic membranaire au cours de la cytokinèse. Par exemple, une sécrétion membranaire ciblée se produit au niveau du sillon de clivage dans les cellules animales, et les protéines qui régulent l'endocytose influencent également le processus de cytokinèse. Néanmoins, le dogme dominant est que le trafic membranaire endosomal cesse pendant la mitose et reprend une fois la division cellulaire terminée.Dans cette étude, nous avons caractérisé les événements de trafic membranaire endocytaire qui se produisent au cours de la cytokinèse des cellules de mammifères. Nous avons découvert que, bien que l'endocytose cesse au cours des premiers stades de la mitose, elle reprend au cours de la fin de la mitose selon un schéma régulé dans le temps et dans l'espace à mesure que les cellules progressent de l'anaphase à la cytokinèse. En utilisant l'imagerie cellulaire fixe et vivante, nous avons constaté que, lors de l'entrée du sillon de clivage, les vésicules sont internalisées de la région polaire et ensuite acheminées vers la zone médiane du corps au cours des stades ultérieurs de la cytokinèse. De plus, nous avons démontré que la cytokinèse est inhibée lorsque l'endocytose médiée par la clathrine est bloquée en utilisant une série de mutants négatifs dominants. Contrairement à la pensée précédente, nous concluons que l'endocytose reprend au cours des derniers stades de la mitose, avant que la cytokinèse ne soit terminée. En outre, sur la base de nos résultats, nous proposons que la régulation appropriée du trafic membranaire endosomal est nécessaire pour la réussite de la cytokinèse.

Ce travail a été financé en partie par des subventions du Département de la défense des États-Unis et de l'American Cancer Society (RSG 03-023-01-CSM) (à C. D-S.). Les frais de publication de cet article ont été couverts en partie par le paiement des frais de page. Cet article doit donc être marqué par la présente «publicité» conformément à 18 U.S.C. L'article 1734 uniquement pour indiquer ce fait.

La version en ligne de cet article (disponible sur http://www.jbc.org) contient des figures supplémentaires. 1-7, dont les Figs. 3-6 se composent à la fois d'images fixes et de vidéos.

Récipiendaire d'un prix spécial pour le développement de carrière d'un boursier de la Société de leucémie et lymphome.


Une fois secs, les micro-organismes peuvent être observés au microscope. Cette procédure est très différente de celle d'une coloration différentielle. Une tache différentielle commune a.

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Les sulfamides, par exemple, les sulfamides entravent un composé basique - la dihydroptéroate synthase - dans cette procédure. Une fois la procédure arrêtée, le m.


Structure cellulaire

Les premières formes de vie sur Terre existaient sous forme de cellules individuelles qui étaient essentiellement une chaîne d'ADN enfermée dans une paroi cellulaire, semblable aux cellules bactériennes modernes (procaryotes). Après des millions d'années, des organismes multicellulaires ont commencé à se former contenant des organites aux fonctions spécifiques. En fait, les scientifiques pensent que les organites tels que les mitochondries et les chloroplastes sont apparus lorsque des cellules eucaryotes ont englouti une bactérie. Les bactéries sont restées dans la cellule, fournissant à l'organisme une source d'énergie pratique.

Microscopie

Le microscope a été inventé il y a plus de quatre cents ans et il a révolutionné la science. Pour la première fois, les scientifiques ont pu visualiser et confirmer l'existence de bactéries, jetant les bases de la théorie des germes de la maladie qui a sauvé des millions de vies. Le tout premier microscope était essentiellement composé de deux lentilles à l'intérieur d'un tube qui ressemblait à un rouleau de toilettes vide, mais depuis lors, les microscopes ont parcouru un long chemin avec des pouvoirs de grossissement incroyables.

Les microscope optique est le type de microscope que vous aurez utilisé à l'école. Il utilise la lumière pour agrandir les objets jusqu'à 1 500 fois leur taille réelle. Ils ont une résolution d'environ 0,2 m, ce qui n'est pas assez grand pour visualiser l'un des plus petits organites, tels que les ribosomes et les lysosomes. Ils sont plus couramment utilisés pour visualiser des cellules ou des tissus entiers. Un avantage de la microscopie optique est qu'elle peut visualiser des cellules vivantes afin que nous puissions observer des comportements tels que la division cellulaire en temps réel.

Microscopes confocaux à balayage laser sont un type avancé de microscope optique qui utilise un faisceau de lumière intense (un laser) pour balayer des échantillons marqués avec un colorant fluorescent. Lorsque le laser frappe le colorant, le colorant émet de la lumière qui peut être utilisée pour former une image.

Image en microscopie confocale d'une plante carnivore. Crédit : Dr Igor Siwanowicz

Les microscope électronique à transmission (MET) est plus puissant qu'un microscope optique et a une résolution suffisamment élevée (environ 0,0002 m) pour visualiser des organites individuels. Un MET utilise des électro-aimants pour focaliser un faisceau d'électrons sur un échantillon. Les électrons ont une longueur d'onde beaucoup plus courte que la lumière visible, ce qui signifie que des images détaillées et à plus haute résolution peuvent être produites. Un inconvénient de la MET est que l'échantillon doit être fixé et placé sous vide, ce qui signifie que les cellules vivantes ne peuvent pas être utilisées.

Les Microscope électronique à balayage (SEM) a une résolution inférieure (environ 0,002 m) que le MET mais ils peuvent produire des images 3D de cellules et d'organites. Ils émettent un faisceau d'électrons vers un échantillon, en faisant tomber des électrons qui sont utilisés pour construire une image. Comme les TEM, les SEM ne peuvent pas être utilisés avec des cellules vivantes. Les deux types de microscopes électroniques sont assez gros et chers, vous ne les trouverez donc que dans des centres de recherche spécialisés et des hôpitaux.

Microscope optique TEM SEM
Grossissement maximal 1 500 x 1 000 000 x 500 000 x
Résolution maximale 0,2 µm 0,0002 µm 0.002

Préparation d'une lame de microscope

Coupez une très fine couche de votre échantillon. Si l'échantillon est trop épais, la lumière ne pourra pas le traverser.

Placer une goutte d'eau sur la lame du microscope.

À l'aide d'une pince à épiler, placez votre spécimen sur la goutte d'eau et placez une lamelle dessus.

Ajoutez une tache si nécessaire - placez une gouttelette à côté de la lamelle et laissez-la absorber à travers l'échantillon.

Calibrage du réticule oculaire et du micromètre de platine

Si vous vouliez mesurer la taille de votre spécimen, vous devrez d'abord aligner le réticule oculaire et le micromètre d'étage qui sont de petites règles qui se trouvent respectivement sur l'objectif et la scène. Pour effectuer l'étalonnage, vous devez effectuer les étapes suivantes :

Placez le micromètre de scène sur la scène et concentrez l'objectif afin que vous puissiez clairement voir les divisions.

Alignez le réticule de l'oculaire avec le micromètre de la platine.

Chaque division du micromètre d'étage est de 0,1 mm. Si le réticule de l'oculaire s'étend sur un total de trois divisions, alors nous savons que la longueur totale du réticule de l'oculaire est de 0,2 mm.

Le graticule est divisé par une échelle de 0 à 100, ce qui signifie que chaque division individuelle a une longueur de 0,002 mm.

Nous pouvons maintenant retirer le micromètre de la platine et ajouter notre échantillon, en utilisant le réticule de l'oculaire pour mesurer sa taille.

Les noyaux de ces cellules de la joue peuvent être facilement identifiés après coloration au bleu de méthylène. Crédit : microscopemaster

Coloration

La plupart des échantillons biologiques sont transparents et doivent être colorés pour augmenter le contraste entre les différents organites afin qu'ils puissent être facilement vus au microscope. Différentes colorations sont utilisées pour différents organites : bleu de méthylène est utilisé pour visualiser l'ADN alors que éosine colore le cytoplasme. Iode est souvent utilisé pour colorer les tissus végétaux.

Grossissement

Assurez-vous de bien comprendre la différence entre grossissement et résolution. Grossissement est la façon dont l'image est agrandie par rapport à l'objet d'origine. Résolution est défini comme la capacité d'un microscope à distinguer deux points proches l'un de l'autre (c'est-à-dire le niveau de détail qu'il peut distinguer). Les microscopes optiques ont une résolution beaucoup plus faible et produisent donc des images moins détaillées que les microscopes électroniques.

Vous pouvez calculer le grossissement d'un échantillon observé au microscope en utilisant l'équation :

Disons que nous agrandissons une cellule bactérienne de 2 µm pour former une image de 16 cm de long. Le grossissement que nous avons dû utiliser est :

Convertissez les deux dans les mêmes unités. 16 cm = 160 mm = 160 000 µm

160 000 / 2 = 80 000 x grossissement

Ultrastructure des cellules eucaryotes

Tous les organismes sont divisés en deux domaines différents : les eucaryotes et les procaryotes. Les organismes multicellulaires plus complexes sont classés comme eucaryotes alors que les bactéries unicellulaires sont des procaryotes. Les cellules eucaryotes, telles que les cellules d'animaux, de plantes et de champignons, peuvent contenir les organites suivants :

Noyau - contient de l'ADN qui contrôle les activités de la cellule en contenant les séquences de bases (les « instructions » nécessaires à la fabrication des protéines. L'ADN est associé aux protéines histones et appelé chromatine qui est enroulée dans des structures appelées chromosomes.

Nucléole - c'est une région du noyau où sont fabriqués les ribosomes.

Enveloppe nucléaire - une double membrane qui entoure le noyau. Il contient des pores qui permettent aux petites molécules (comme l'ARN simple brin) de passer dans le cytoplasme, mais conserve les gros chromosomes en toute sécurité à l'intérieur de ses parois.

Réticulum endoplasmique rugueux (RER) - le RER est une extension de l'enveloppe nucléaire et est recouvert de ribosomes. Il facilite la synthèse des protéines en fournissant une grande surface pour les ribosomes. Il transporte ensuite les protéines nouvellement synthétisées vers l'appareil de Golgi pour modification.

Réticulum endoplasmique lisse (SER) - synthétise des lipides dont le cholestérol et des hormones stéroïdes (telles que les œstrogènes).

Appareil de Golgi - constitué d'un groupe de sacs aplatis membranaires remplis de liquide et entourés de vésicules. Il reçoit des protéines du RER et des lipides du SER. Il modifie les protéines et les lipides et les reconditionne en vésicules. L'appareil de Golgi est également le siège de la synthèse des lysosomes.

Ribosomes - les ribosomes sont responsables de la traduction de l'ARN en protéine (synthèse des protéines). Ils flottent librement dans le cytoplasme ou sont collés sur le réticulum endoplasmique rugueux.

Mitochondries - site de production d'ATP au cours de la respiration aérobie. Il s'auto-réplique et peut donc devenir nombreux dans les cellules à fort besoin énergétique. Il contient une double membrane avec des plis appelés crêtes, qui offre une grande surface pour la respiration.

Lysosomes - des anneaux phospholipidiques qui contiennent des enzymes digestives séparées du reste du cytoplasme. Les lysosomes engloutissent et détruisent les vieux organites ou les matières étrangères.

Chloroplastes - le site de la photosynthèse. Il est entouré d'une double membrane et possède des membranes thylakoïdes internes disposées en piles pour former des grana reliés par des lamelles. Ces structures ne se trouvent que dans les plantes et certains types de bactéries photosynthétiques ou protoctistes.

Membrane plasma - se compose d'une bicouche phospholipidique avec des protéines supplémentaires pour servir de supports. Il contient également du cholestérol pour réguler la fluidité membranaire. La membrane plasmique contient le contenu cellulaire et maintient la cellule ensemble, tout en contrôlant le mouvement des substances dans et hors de la cellule.

Centrioles - ce sont des faisceaux de microtubules qui forment des fibres fusiformes lors de la mitose afin de séparer les chromatides sœurs. Ils sont également importants pour la formation des cils et des flagelles. On ne les trouve pas dans les cellules végétales et bactériennes.

Paroi cellulaire - une structure rigide constituée de cellulose (chez les végétaux), de chitine (chez les champignons) et de muréine (chez les procaryotes) qui soutient la cellule.

Flagelles - une structure en forme de queue constituée de faisceaux de microtubules. Les microtubules se contractent pour faire bouger le flagelle et propulser la cellule vers l'avant. Les cellules avec un flagelle comprennent les spermatozoïdes, qui l'utilisent pour remonter les trompes de Fallope afin de féconder l'ovule.

cils - des projections en forme de doigt trouvées à la surface de certaines cellules. Ceux-ci contiennent également des faisceaux de microtubules qui se contractent pour faire bouger les cils. Les cils se trouvent sur les cellules épithéliales tapissant la trachée et se déplacent pour balayer le mucus dans la trachée.

Lamelle moyenne - la lamelle moyenne se trouve à l'extérieur des parois cellulaires dans les cellules végétales. Il est responsable du collage des cellules végétales entre elles et de leur stabilité. Il est principalement composé d'une substance appelée pectate de calcium.

Amyoplastes - ce sont des granulés de conservation des plantes qui contiennent de l'amidon et se trouvent principalement dans les bulbes et tubercules. Les amyoplastes peuvent reconvertir l'amidon en glucose lorsque la cellule végétale a besoin de plus de glucose pour respirer.

Vacuole - la vacuole est un organite qui stocke la sève cellulaire et peut également stocker des nutriments et des protéines. Il aide à garder les cellules végétales turgescentes. Certaines vacuoles peuvent remplir une fonction similaire aux lysosomes et digérer de grosses molécules.

Tonoplaste - le tonoplaste est une membrane qui entoure la vacuole et qui a pour fonction de séparer la vacuole du reste de la cellule.

Plasmodesmes - les plasmodesmes sont des canaux étroits de cytoplasme à l'intérieur des parois cellulaires des plantes. Il permet à deux cellules végétales voisines de transporter des substances entre elles et de communiquer.

Fosses - les fosses sont des régions d'une cellule végétale où la paroi cellulaire devient très fine. Les fosses sont disposées par paires de sorte que la fosse d'une cellule végétale soit alignée avec la fosse d'une autre cellule végétale. Comme les plasmodesmes, les fosses permettent aux cellules végétales voisines d'échanger des substances.

Production de protéines

Pendant la production de protéines, différents organites fonctionnent comme une chaîne de montage dans une usine, chacun taillant un peu la protéine jusqu'à ce qu'elle se retrouve soigneusement emballée dans une vésicule et libérée de l'usine et prête à faire son travail dans la cellule. Les protéines sont d'abord fabriquées sur ribosomes qui flottent soit seuls dans le cytoplasme, soit attachés au urgence rugueuse. La longue chaîne polypeptidique est repliée au niveau du RE rugueux et transportée vers le Appareil de Golgi à l'intérieur vésicules. Au Golgi, ils sont modifiés et transformés par diverses enzymes. La protéine peut avoir une chaîne glucidique collée à sa surface, ou l'ajout d'un groupe sulfate ou phosphate. La protéine pompée est ensuite placée dans une autre vésicule qui se déplace vers la partie de la cellule où la protéine est nécessaire. Si la protéine est une protéine porteuse, la vésicule va livrer la protéine à la membrane plasmique où elle sera incorporée.

Cytosquelette

Les cellules contiennent une structure importante dans son cytoplasme appelée le cytosquelette. C'est un squelette miniature qui donne la forme de la cellule et maintient les organites en place. Il est composé de petits tubes de protéines appelés microtubules qui forment un réseau dans toute la cellule. Les principales fonctions du cytosquelette sont :

Fournit une résistance mécanique aux cellules

Permet le mouvement des organites à l'intérieur de la cellule

Permet le mouvement de la cellule

Comparaison des cellules eucaryotes et procaryotes

Les procaryotes et les eucaryotes partagent certains des mêmes organites (cytoplasme, membrane cellulaire, ribosomes) mais il existe des différences importantes :

  • Les procaryotes ont pas d'organites liés à la membrane (donc pas de mitochondries, de Golgi, de réticulum endoplasmique, de noyau etc). Leur ADN flotte librement dans le cytoplasme.
  • Leur ADN est constitué d'un chromosome circulaire unique alors que l'ADN chez les eucaryotes est linéaire et enroulé autour des chromosomes.
  • Les procaryotes ont des morceaux d'ADN supplémentaires sous la forme de petits cercles plasmides.
  • Les procaryotes ont ribosomes plus petits (70S) par rapport aux ribosomes eucaryotes (80S).
  • Les eucaryotes comme les plantes et les champignons ont des parois cellulaires constituées de cellulose et de chitine. Les parois cellulaires bactériennes sont constituées de murein (un type de glycoprotéine).
  • Les cellules procaryotes sont beaucoup plus petite que les cellules eucaryotes.
  • Les procaryotes et les eucaryotes peuvent avoir des flagelles, mais ceux que l'on trouve chez les procaryotes sont constitués d'une protéine appelée flagelline alors que chez les eucaryotes, ils sont formés de microtubules.

Les procaryotes ont des organites absents des cellules eucaryotes. Ceux-ci inclus:

Pili - les pili sont des structures ressemblant à des cheveux qui dépassent de la membrane plasmique. Ils sont utilisés pour communiquer avec d'autres cellules (notamment pour le transfert de plasmides entre bactéries).

Mésosomes - le mésosome est une portion repliée de la membrane interne. Alors que certains scientifiques pensent qu'il joue un rôle dans les réactions chimiques, telles que la respiration, d'autres scientifiques doutent de son existence et pensent qu'il pourrait s'agir simplement d'un artefact produit lors de la préparation d'échantillons bactériens pour la microscopie.

Plasmides - les plasmides sont de petits anneaux circulaires d'ADN qui sont séparés du chromosome principal. Ils abritent des gènes qui ne sont pas cruciaux pour la survie mais pourraient s'avérer utiles - comme les gènes de résistance aux antibiotiques, par exemple. Les plasmides peuvent se répliquer indépendamment de l'ADN chromosomique principal.

Capsule visqueuse - en plus d'une paroi cellulaire, certaines bactéries possèdent également une capsule qui est constituée de boue. La fonction principale de la capsule est de protéger la bactérie contre une attaque du système immunitaire.

Fractionnement cellulaire

Le fractionnement cellulaire est une technique qui sépare l'organelles selon leur densité - vous pouvez le faire si vous souhaitez visualiser séparément certains organites au microscope. Il s'agit de faire éclater la membrane de la surface cellulaire pour libérer les organites et de faire tourner la solution cellulaire à des vitesses très élevées.

Homogénéisation - la première étape du fractionnement cellulaire est l'homogénéisation. C'est là que vous brisez la membrane plasmique pour libérer les organites. Cela peut être fait en faisant vibrer les cellules ou en les séparant dans un mélangeur. Il est important que ces cellules soient placées dans une solution glacée, isotonique et tamponnée.

Glace froide - la solution doit être glacée pour ralentir l'activité des enzymes. Ceci est important car certaines enzymes vont dégrader les organites (comme les enzymes trouvées à l'intérieur des lysosomes), nous devons donc réduire leur activité pour préserver les organites de la cellule.

Isotonique - la concentration en soluté (et donc le potentiel en eau) de la solution doit être la même que les cellules qui ont été décomposées, sinon l'eau se déplacerait dans les organites par osmose, entraînant des dommages

Tamponné - l'ajout d'un tampon à une solution garantit que le pH reste constant. Ceci est important car les protéines sont dénaturées par les changements de pH - rappelez-vous que les protéines sont un composant clé de divers organites.

Filtration - la solution homogénéisée est filtrée pour éliminer tout débris tissulaire. Les organites sont suffisamment petits pour passer à travers les trous du papier filtre et seront donc présents dans le filtrat.

Ultracentrifugation - c'est là que l'on fait tourner le filtrat à des vitesses croissantes. Les organites les plus lourds vont couler au fond de l'éprouvette, formant une pastille.Nous pouvons transférer la solution restante (le surnageant) dans un tube à essai séparé, qui sera tourné à une vitesse légèrement plus élevée. Ceci est répété jusqu'à ce que vous obteniez l'organelle que vous souhaitez. N'oubliez pas que les organites seront séparés de la solution du plus lourd au plus léger. Les noyaux sortiront d'abord de la solution, suivis des mitochondries, puis des lysosomes, puis du réticulum endoplasmique. Les ribosomes seront les derniers organites à former un culot, car ce sont les organites les plus légers d'une cellule.


Informations sur l'examen par les pairs Protocoles naturels remercie Gary Laevsky, Timo Zimmermann et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Liens connexes

Guidance for Quantitative Confocal Microscopy (https://doi.org/10.1038/s41596-020-0307-7) : Cette affiche est un résumé visuel de cet article.

Molecular Expressions Optical Microscopy Primer (https://micro.magnet.fsu.edu/primer/): Développé par Michael W. Davidson et son équipe à la Florida State University, ce site Web héberge une vaste quantité de connaissances sur tous les aspects de l'optique la microscopie de la physique de la lumière et de la couleur et de l'anatomie d'un microscope à lumière transmise de base aux techniques avancées telles que FRET et TIRF.

iBiology Microscopy Series (https://www.ibiology.org/online-biology-courses/microscopy-series/) : Réalisé par Ron Vale, Nico Stuurman et Kurt Thorn, cette série de 72 vidéos (et en pleine croissance !) bases de la microscopie optique et se termine par certaines des dernières techniques, telles que la microscopie à super-résolution. Leur série courte de microscopie de seulement 14 vidéos peut être plus gérable pour certains.

iBiology BioImage Analysis Course (https://www.ibiology.org/online-biology-courses/bioimage-analysis-course/): Créé par Anne Carpenter (responsable du projet CellProfiler) et Kevin Eliceiri (responsable du projet ImageJ), cette série se concentre sur les étapes générales du traitement d'image ainsi que des introductions à CellProfiler et ImageJ en particulier.

Sites Web des fournisseurs de microscopes : de nombreux fournisseurs de microscopes ont du matériel éducatif sur leurs sites Web. Certains d'entre eux licencient des sections de Molecular Expressions, mais complétés par les attributs uniques de leurs propres microscopes. D'autres ont écrit leur propre matériel à partir de zéro.

Le Confocal Microscopy Listserv (https://lists.umn.edu/cgi-bin/wa?A0=confocalmicroscopy) : Avec une base d'abonnés actifs de près de 4 000 participants et des archives qui remontent à 1991, le Confocal Listserv est un précieux ressource pour les questions confocales et connexes. L'inscription (gratuite) est obligatoire.

Microforum (https://forum.microlist.org/) : ce nouveau forum Web dirigé par Jennifer Waters et Tally Lambert a été créé en 2019. Il se concentre sur les aspects liés au matériel, à l'acquisition et aux spécimens de l'imagerie scientifique, en particulier (mais pas limité à) la théorie et l'utilisation pratique des microscopes optiques et des détecteurs, des protéines et des sondes fluorescentes et la préparation des échantillons.


Résultats

Identification des phénotypes CUP-2 et mutants

Les tasse-2 gène a été identifié sur la base de la ar506 mutation qui entraîne une diminution de l'endocytose dans les cellules charognardes appelées coelomocytes dans Caenorhabditis elegans (Fares et Greenwald, 2001a). tasse-2(ar506) les vers ont un défaut thermosensible dans l'endocytose par les coelomocytes (Fig. 1A, B). pmyo-3::ssGFP les vers transgéniques expriment la GFP fusionnée à une séquence signal et exprimée dans les muscles de la paroi corporelle : cette GFP est sécrétée dans la cavité corporelle et est endocytosée, puis dégradée, principalement par les coelomocytes (Fares et Greenwald, 2001a). Les mutations qui diminuent l'endocytose par les coelomocytes entraînent l'accumulation de GFP dans la cavité corporelle et une diminution de la taille des compartiments remplis de GFP dans les coelomocytes (Dang et al., 2004 Fares et Greenwald, 2001a Patton et al., 2005). En plus de ce défaut d'endocytose thermosensible, tasse-2(ar506) les vers sont malades ou non viables à 25 °C, de sorte que 90 à 95 % des larves L4 passées de 20 °C à 25 °C meurent, le reste des vers survivent et pondent des œufs, dont la plupart sont non viables.

Nous avons déterminé que CUP-2 correspond au cadre de lecture ouvert F25D7.1 basé sur la phénocopie par interférence ARN (ARNi), l'analyse de séquence de la ar506 allèle et sauvetage transgénique des phénotypes mutants (Fig. 1C matériel supplémentaire Fig. S1A Fig. 2). Les ar506 allèle est un changement de nucléotide dans le premier exon qui se traduit par un codon d'arrêt précoce et représente donc un mutant nul prédit de tasse-2 (Fig. 1C matériel supplémentaire Fig. S1B). CUP-2 est l'un des deux C. elegans Protéines Derlin et montre l'identité la plus élevée avec Derlin-1 humain (Fig. 1D matériel supplémentaire Fig. S1B). Les protéines Derlin sont des protéines conservées qui fonctionnent dans ERAD et ont quatre domaines transmembranaires prédits, les extrémités N et C étant cytoplasmiques (Fig. 1D, matériel supplémentaire Fig. S1B) (Hitt et Wolf, 2004 Knop et al., 1996 Lilley et Ploegh, 2004 Lilley et Ploegh, 2005 Ye et al., 2004). Conformément à cette fonction biologique cellulaire de base, la fusion de la GFP au promoteur CUP-2 a entraîné une expression omniprésente de la GFP dans tous les tissus, y compris les coelomocytes (Fig. 1E).

Nous avons confirmé que CUP-2 fonctionne dans ERAD sur la base de deux critères. D'abord, tasse-2(ar506) était synthétiquement létal à 20°C avec une mutation nulle dans ire-1, l'orthologue du ver du capteur UPR IRE1 (Fig. 1F) (Shen et al., 2001). De même, une levure Δder1 ??ire1 n'était pas viable à 37°C (Hitt et Wolf, 2004). tasse-2 pek-1 et tasse-2 atf-6 les doubles mutants n'ont montré que de légères augmentations de la létalité (Fig. 1F). Deuxièmement, dans le tasse-2(ar506) mutant, ou après avoir réduit les niveaux de CUP-2 par ARNi, l'UPR a été activé dans la plupart des cellules, y compris les coelomocytes, comme déterminé par l'induction de l'expression de la GFP à partir d'un hsp-4::GFP rapporteur (Fig. 1G, H matériel supplémentaire Fig. S1A). Un effet similaire de tasse-2 ARNi sur l'induction de hsp-4::GFP l'expression dans les cellules intestinales a été rapportée précédemment (Ye et al., 2004). Contrairement au défaut d'endocytose, l'induction de l'UPR due à tasse-2(ar506) n'est pas sensible à la température. De plus, l'activation de la réponse UPR est absente dans un xbp-1 mutant nul, indiquant qu'il dépend du clivage et de l'activation spécifiques au site de xbp-1 ARNm par IRE-1 (matériel supplémentaire Fig. S1A) (Calfon et al., 2002).

L'ARNi de R151.6, la deuxième protéine Derlin du ver, n'a pas entraîné d'activation de l'UPR détectable dans les cellules d'animaux de type sauvage, il n'a pas non plus affecté l'endocytose par les coelomocytes (matériel supplémentaire Fig. S1A). Cependant, CUP-2 et R151.6 présentaient une fonction partiellement redondante dans l'activation de l'UPR, car l'ARNi de R151.6 dans tasse-2(ar506) a entraîné une augmentation spectaculaire de l'expression de hsp-4::GFP dépendante de XBP-1 (matériel supplémentaire Fig. S1A).

Sauvetage des défauts d'endocytose et d'ERAD par des homologues de CUP-2. (A) Quantification des tailles des vésicules remplies de GFP dans les coelomocytes de tasse-2(ar506) pmyo-3::ssGFP déformations montrées dans le matériel supplémentaire Fig. S2. 1 pixel = 0,001 µm 2 . (B) Quantification de l'intensité moyenne par pixel de GFP dans les noyaux de coelomocytes du cup-2(ar506) hsp-4::GFP déformations montrées dans le matériel supplémentaire Fig. S2.

Sauvetage des défauts d'endocytose et d'ERAD par des homologues de CUP-2. (A) Quantification des tailles des vésicules remplies de GFP dans les coelomocytes de tasse-2(ar506) pmyo-3::ssGFP déformations montrées dans le matériel supplémentaire Fig. S2. 1 pixel = 0,001 µm 2 . (B) Quantification de l'intensité moyenne par pixel de GFP dans les noyaux de coelomocytes du cup-2(ar506) hsp-4::GFP déformations montrées dans le matériel supplémentaire Fig. S2.

Sauvetage des défauts d'activation de l'UPR et d'endocytose par les protéines de Derlin

Pour déterminer si la fonction de CUP-2 est conservée, nous avons exprimé plusieurs protéines Derlin d'autres espèces dans tasse-2 vers mutants. Le promoteur CUP-2 a conduit l'expression de l'homologue de Derlin chez ces animaux transgéniques. Nous avons observé essentiellement deux schémas de sauvetage (Fig. 2 matériel supplémentaire Fig. S2). C. elegans CUP-2 et R151.6, et Derlin-1 et Derlin-3 humains ont sauvé à la fois les phénotypes d'endocytose et d'activation UPR. Ces résultats indiquent que les deux activités de CUP-2 sont également présentes dans les protéines Derlin de mammifères. La levure Der1p et Dfm1p, et le Derlin-2 humain n'ont sauvé aucun des défauts. De plus, la levure Dfm1p a exacerbé l'activation de l'UPR, mais pas le défaut d'endocytose, suggérant qu'elle pourrait fonctionner comme une protéine dominante négative qui interfère avec l'activité de R151.6 dans le RE.

Analyse des taux de MCA-3 au niveau de la membrane plasmique

Pour déterminer si la perte de CUP-2 affecte également le trafic endocytaire des protéines transmembranaires, nous avons analysé les niveaux de la pompe Ca 2+ CUP-7/MCA-3. MCA-3 a été identifié à l'origine sur la base de mutations qui perturbent l'endocytose (Fares et Greenwald, 2001a). Une fusion GFP::MCA-3 fonctionnelle se localise au niveau de la membrane plasmique (matériau supplémentaire Fig. S3A) (Bednarek et al., 2007). GFP::MCA-3 ne se localise pas dans les grandes vacuoles d'un tasse-5 mutant défectueux dans la dégradation médiée par le lysosome, indiquant qu'il n'est pas normalement transporté vers le lysosome avant ou après l'endocytose (matériel supplémentaire Fig. S3A) (Fares et Greenwald, 2001b Treusch et al., 2004). En revanche, GFP::MCA-3 s'accumule dans les membranes des endosomes de recyclage mCherry::RAB-11-positifs expansés dans un rme-1 mutant, indiquant que le MCA-3 effectue un cycle continu entre la membrane plasmique et les endosomes (matériel supplémentaire Fig. S3A,B) (Grant et al., 2001 Lin et al., 2001). RME-1 est une protéine contenant le domaine EH qui est requise pour la sortie des endosomes de recyclage. La perte de RME-1 entraîne l'expansion des endosomes de recyclage (Grant et al., 2001 Lin et al., 2001).

tasse-2(ar506) (ou tasse-2 RNAi) entraîne une augmentation des niveaux de GFP::MCA-3 au niveau de la membrane plasmique, tel que mesuré par microscopie quantitative (Fig. 3A, B et données non présentées). L'analyse par transfert Western de la GFP::MCA-3 immunoprécipitée a indiqué que l'augmentation du signal GFP::MCA-3 est due à des niveaux accrus de protéine GFP::MCA-3 dans tasse-2 vers mutants (Fig. 3C, D). À partir de trois expériences d'immunoprécipitation indépendantes, il y avait une augmentation de 1,73 ± 0,06 des niveaux de GFP::MCA-3 dans les coelomocytes de tasse-2 les vers mutants par rapport au type sauvage, cela est en accord avec les mesures de la microscopie (Fig. 3A, B). En revanche, GFP::MCA-3 ne s'accumule pas au niveau de la membrane plasmique de tasse-5 mutants avec une fonction lysosome fortement réduite ni dans un tasse-4 mutant, qui présente un défaut d'endocytose général encore plus sévère que le tasse-2 mutant (matériel supplémentaire Fig. S3A,C) (Patton et al., 2005 Treusch et al., 2004). Ni tasse-2 ni tasse-4 les mutations bloquent complètement l'endocytose dans les coelomocytes. Cela indique que l'accumulation de GFP::MCA-3 au niveau de la membrane plasmique n'est pas une conséquence générale de la diminution des taux d'internalisation. De plus, l'augmentation de GFP::MCA-3 au niveau de la membrane plasmique est probablement indépendante du défaut d'activation de l'UPR de tasse-2(ar506) car cette augmentation est évidente à 20°C et non à 15°C, ce qui est en corrélation avec le phénotype de l'endocytose et non avec le défaut d'activation de l'UPR (Fig. 3A,B). Enfin, nous avons vérifié les niveaux de deux autres protéines membranaires intégrales qui sont exprimées sous le contrôle du même promoteur de coelomocyte utilisé pour exprimer GFP::MCA-3. La mannosidase II::GFP se localise dans le complexe de Golgi alors que la GFP::CUP-5 se localise dans les lysosomes des coelomocytes (Treusch et al., 2004). Aucune des deux protéines n'a montré des niveaux accrus dans tasse-2 mutants, indiquant que l'augmentation des taux de MCA-3 n'est pas due à une augmentation de la sécrétion générale ou de l'activité du promoteur (matériel supplémentaire Fig. S4A-D).

Analyse des marqueurs endocytiques. (A) Micrographies confocales de coelomocytes chez des hermaphrodites adultes des génotypes indiqués, cultivés à 15°C ou 20°C, et exprimant des fusions GFP à MCA-3. (B) Quantification de la fluorescence de la membrane plasmique des cellules montrées en A. (C) Western blot sondé avec des anticorps anti-GFP des souches indiquées portant le même transgène GFP::MCA-3. Les bandes indiquées sont GFP::MCA-3 (197 kDa) et GFP (27 kDa). Le transgène GFP::MCA-3 comprend également de l'ADN qui exprime la GFP dans le pharynx des vers. L'intensité de fluorescence de cette GFP pharyngée était identique dans les différentes souches. (D) Micrographies confocales de coelomocytes de type sauvage (PO) ou tasse-2(ar506) (tasse-2) hermaphrodites adultes cultivés à 20°C et exprimant des fusions GFP aux protéines indiquées. CHC, clathrine chaîne lourde sER, cytochrome b5 Golgi, mannosidase II. (E) Western blot de protéines isolées de type sauvage et tasse-2(ar506) des vers exprimant la chaîne lourde de la clathrine fusionnés à la GFP et sondés avec des anticorps contre la GFP, la RME-1 ou l'actine. Des quantités égales de protéines ont été chargées dans chaque piste. (F) Images confocales de coelomocytes aux moments indiqués après l'injection de BSA-Rhodamine dans les cavités corporelles des vers. Les pointes de flèche indiquent la BSA-Rhodamine localisée dans les lysosomes. Rouge, BSA-Rhodamine, Vert, RME-8::GFP ou GFP::CUP-5. Barres d'échelle : 5 m.

Analyse des marqueurs endocytiques. (A) Micrographies confocales de coelomocytes chez des hermaphrodites adultes des génotypes indiqués, cultivés à 15°C ou 20°C, et exprimant des fusions GFP à MCA-3. (B) Quantification de la fluorescence de la membrane plasmique des cellules montrées en A. (C) Western blot sondé avec des anticorps anti-GFP des souches indiquées portant le même transgène GFP::MCA-3. Les bandes indiquées sont GFP::MCA-3 (197 kDa) et GFP (27 kDa). Le transgène GFP::MCA-3 comprend également de l'ADN qui exprime la GFP dans le pharynx des vers. L'intensité de fluorescence de cette GFP pharyngée était identique dans les différentes souches. (D) Micrographies confocales de coelomocytes de type sauvage (PO) ou tasse-2(ar506) (tasse-2) hermaphrodites adultes cultivés à 20°C et exprimant des fusions GFP aux protéines indiquées. CHC, clathrine chaîne lourde sER, cytochrome b5 Golgi, mannosidase II. (E) Western blot de protéines isolées de type sauvage et tasse-2(ar506) des vers exprimant la chaîne lourde de la clathrine fusionnés à la GFP et sondés avec des anticorps contre la GFP, la RME-1 ou l'actine. Des quantités égales de protéines ont été chargées dans chaque piste. (F) Images confocales de coelomocytes aux moments indiqués après l'injection de BSA-Rhodamine dans les cavités corporelles des vers. Les pointes de flèches indiquent la BSA-Rhodamine localisée dans les lysosomes. Rouge, BSA-Rhodamine, Vert, RME-8::GFP ou GFP::CUP-5. Barres d'échelle : 5 m.

Par conséquent, au moins une protéine transmembranaire, MCA-3, s'accumule à la surface des coelomocytes en l'absence de CUP-2. Compte tenu de ce résultat et du défaut d'endocytose, nous avons dosé d'autres marqueurs de la voie endocytaire dans les coelomocytes.

Analyse des marqueurs d'endocytose dans tasse-2 coelomocytes mutants

Pour mieux comprendre la nature du défaut d'endocytose dans tasse-2 mutants, nous avons analysé les morphologies de tous les principaux organites liés à la membrane des voies endocytiques et sécrétoires dans tasse-2(ar506) coelomocytes en utilisant un ensemble de marqueurs marqués GFP que nous avons développés (Fig. 3D). Il n'y a eu aucun changement dans la localisation de la GFP-RME-1, un endosome de recyclage et une protéine contenant le domaine EH localisée dans la membrane plasmatique requise pour le trafic endocytique dans les coelomocytes (Fares et Greenwald, 2001a Grant et al., 2001). En revanche, il y a eu une augmentation significative des niveaux de chaîne lourde de clathrine (CHC) marquée à la GFP à la surface de tasse-2(ar506) coelomocytes (Greener et al., 2001). Cette augmentation de la localisation des CHC membranaires ne s'est pas accompagnée d'un changement des niveaux absolus de CHC dans tasse-2(ar506) vers, indiquant que l'augmentation du signal de clathrine indique probablement une augmentation de l'assemblage de clathrine sur les membranes (Fig. 3E).

RAB-7, un marqueur pour les endosomes tardifs, et CUP-5, un marqueur pour les lysosomes, ont tous deux montré des motifs de coloration normaux, bien que des compartiments aient été réduits en taille, cette réduction de la taille des endosomes ou des lysosomes est un défaut général observé dans les mutations qui bloquent l'endocytose des coelomocytes (Grant et Hirsh, 1999 Patton et al., 2005 Treusch et al., 2004) (Fig. 3D). Il y a eu une élaboration et une dispersion de l'ER dans tasse-2(ar506) coelomocytes (Fig. 3D). Ces deux phénotypes sont observés lors de l'hyperactivation de l'UPR dans les plasmocytes de mammifères et dans d'autres mutations qui bloquent l'endocytose des coelomocytes (Patton et al., 2005 Shaffer et al., 2004 Sriburi et al., 2004). Enfin, il n'y a pas eu de changement évident dans la localisation de la mannosidase II, un marqueur transmembranaire de Golgi (Fig. 3D) (Patton et al., 2005 Rolls et al., 2002).

Nous avons également déterminé si la perte de CUP-2 entraîne un retard dans le transport de la BSA-Rhodamine endocytosée vers les lysosomes. Cette expérience était réalisable car bien que le taux d'endocytose des molécules solubles ait été réduit dans le tasse-2 mutant, l'internalisation n'a pas été bloquée. de type sauvage et tasse-2 des vers mutants qui expriment le marqueur endosomal RME-8::GFP ou le marqueur lysosomal GFP::CUP-5 ont reçu une injection de BSA-Rhodamine dans leurs pseudocoelomes. Dans le type sauvage et tasse-2 vers mutants, la totalité de la BSA-Rhodamine a été trouvée dans les endosomes RME-8-positifs et CUP-5-négatifs après 5 minutes d'absorption, comme cela a été démontré précédemment (Dang et al., 2004 Treusch et al., 2004). Dans le type sauvage et tasse-2 vers mutants, nous avons d'abord détecté la BSA-Rhodamine dans les lysosomes RME-8-négatifs, CUP-5-positifs 10 minutes après le début de l'évolution temporelle (pointes de flèche sur la figure 3F). Par conséquent, la perte de CUP-2 n'affecte pas la progression des solutés endocytosés et de la membrane à travers la voie endo-lysosomale.

Par conséquent, le seul défaut que nous détectons en l'absence de CUP-2, jusqu'à présent, est une accumulation de CHC à la surface des coelomocytes. Cette accumulation n'a pas été observée chez d'autres mutants qui perturbent l'endocytose des coelomocytes et n'est donc pas due à une réduction générale de l'internalisation (Bednarek et al., 2007 Grant et al., 2001 Patton et al., 2005 Sato et al., 2005 Xue et al., 2003 Zhang et al., 2001).

Compte tenu du rôle des protéines de Derlin dans la dégradation des protéines mal repliées dans le RE, nous avons émis l'hypothèse que l'accumulation de protéines mal repliées pourrait expliquer les niveaux accrus de MCA-3 à la surface de tasse-2 coelomocytes mutants. Nous avons donc fait des études sur des cellules en culture où cette idée a pu être testée.

Mammifère Derl1 Phénotypes ARNi

Le sauvetage de tasse-2 les phénotypes mutants des protéines Derlin de mammifères suggèrent une conservation fonctionnelle. Nous avons donc lancé des études dans des cellules de mammifères pour permettre la poursuite des impulsions et des manipulations biochimiques qui ne sont actuellement pas réalisables chez les vers. Nous avons choisi les macrophages murins RAW264.7 car ils sont analogues aux coelomocytes et permettent donc une transition en douceur pour l'analyse comparative entre le ver et le travail des mammifères.

Nous avons fait une écurie Derl1 Clone d'ARNi dans des cellules RAW264.7. Dans ces cellules, les niveaux de Derlin-1 étaient de 8,2 ± 0,9 % et les niveaux de Derlin-2 étaient de 133,5 ± 14,8 % de ceux du type sauvage (figure 4A). Derlin-3 n'était pas détectable dans le clone d'ARNi de type sauvage ou Derlin-1 (figure 4A).L'augmentation des niveaux de Derlin-2 est cohérente avec les résultats précédents montrant que Derlin-2 et Derlin-3 sont régulés à la hausse par l'UPR, qui a probablement été activé en raison des niveaux réduits de Derlin-1 (Oda et al., 2006).

Des études antérieures ont montré qu'au moins une partie du récepteur des lipoprotéines de basse densité (LDLR) au niveau de la membrane plasmique est dégradée par le protéasome (Martin de Llano et al., 2006 Miura et al., 1996). Nous avons donc vérifié les niveaux de LDLR au niveau de la membrane plasmique en incubant des cellules vivantes avec des anticorps à 4°C, suivi d'une fixation et d'une imagerie. Nous avons détecté une multiplication par sept des niveaux de LDLR à la membrane plasmique du Derl1 Clones d'ARNi relatifs aux cellules RAW264.7 ou aux Mcoln1 Clones stables d'ARNi qui ont été utilisés comme contrôle (Fig. 4B, C). Mcoln1 code pour la mucolipine 1, qui est une protéine endosomale/lysosomale localisée requise pour un trafic lysosomal efficace et une dégradation lysosomale des protéines endocytosées dans les cellules RAW264.7 (Thompson et al., 2007). Nous avons également vérifié les niveaux de récepteurs Fcgamma (FcR) à l'aide d'un anticorps qui reconnaît CD16, CD32 et CD64 (Unkeless, 1979). Bien que l'itinéraire de trafic à partir de la membrane plasmique de ces protéines ne soit pas clair, nous avons également détecté une multiplication par quatre des niveaux de FcR au niveau de la membrane plasmique de la Derl1 Clone d'ARNi par rapport à des cellules RAW264.7 ou à un Mcoln1 Clone stable d'ARNi qui a été utilisé comme contrôle (Fig. 4B, C). Par conséquent, de la même manière que le ver tasse-2 mutants, des taux réduits de Derlin-1 entraînent une augmentation des taux membranaires plasmiques d'au moins deux protéines membranaires intégrales.

L'augmentation des taux de LDLR au niveau de la membrane plasmique du Derl1 Le clone ARNi n'a pas entraîné d'augmentation de la liaison des LDL à la membrane plasmique. Nous avons incubé les cellules avec des LDL fluorescentes à 4°C avant de laver et de fixer les cellules à 4°C. Nous avons détecté des niveaux similaires de liaison de LDL aux surfaces de RAW264.7, Derl1 ARNi, et Mcoln1 Cellules ARNi (Fig. 4D, E). Cela suggère que le nombre substantiel de LDLR à la membrane plasmique de Derl1 Les cellules ARNi qui sont incapables de se lier aux LDL représentent probablement des molécules LDLR dont le domaine extracellulaire de liaison au ligand est mal replié.

Nous voulions tester directement le devenir des protéines transmembranaires au niveau de la membrane plasmique qui se replient mal. Nous avons d'abord testé un tampon à haute teneur en sel et à faible pH (741 mM d'acide citrique, 258,7 mM de citrate de sodium, pH 3,5) qui devrait affecter la conformation des domaines extracellulaires de nombreux récepteurs. Le traitement des cellules avec ce tampon de mauvais repliement pendant 15 minutes à 4 °C a entraîné la liaison d'environ un cinquième de la LDL aux surfaces cellulaires par rapport aux échantillons traités au D-PBS (Fig. 4D, E). Ceci indique que ce tampon, bien que non létal pour les cellules (données non présentées), provoque des changements de conformation dans les domaines extracellulaires des récepteurs.

Nous avons ensuite utilisé ce tampon de mauvais repliement pour déterminer les paramètres de dégradation du LDLR mal replié au niveau de la membrane plasmique. Nous avons pré-incubé les cellules pendant 2 heures dans du cycloheximide pour bloquer la traduction et les avons traitées avec du D-PBS (contrôle) ou avec un tampon de repliement. Ces cellules ont été replacées dans un milieu contenant du cycloheximide seul, avec l'inhibiteur protéasomal MG132, ou avec l'inhibiteur lysosomal leupeptine. Des échantillons ont été prélevés toutes les 2 heures pour des tests de transfert Western pour mesurer les taux de disparition de la forme mature localisée dans la membrane plasmatique du LDLR (confirmé en utilisant des tests de biotinylation de surface, données non présentées). Il y a trois conclusions principales de cette analyse (Fig. 4F, G). Premièrement, l'induction d'un mauvais repliement du LDLR de surface entraîne une forte augmentation du taux de sa dégradation dans les cellules normales (lignes continues rouges vs noires sur la figure 4G). Deuxièmement, le LDLR mal replié est principalement dégradé par le protéasome (ligne continue orange sur la figure 4G) et dépend moins de la fonction lysosomale (ligne continue verte sur la figure 4G). Ceci est cohérent avec les études précédentes sur le renouvellement du LDLR localisé dans la membrane plasmatique dans les cellules CHO dans des conditions normales, où une voie protéasomale dégrade 70 % de ces récepteurs et le reste est dégradé dans les lysosomes (Martin de Llano et al., 2006). Troisièmement, la réduction des niveaux de Derlin-1 stabilise le LDLR de la membrane plasmique dans des conditions normales (lignes pointillées noires sur la figure 4G) et après un mauvais repliement (lignes pointillées rouges sur la figure 4G). Par conséquent, un mauvais repliement du LDLR au niveau de la membrane plasmique entraîne son renouvellement rapide d'une manière dépendante du protéasome et de Derlin-1.

La perte de CUP-2 entraîne une accumulation de MCA-3 à la surface des cellules. Des niveaux réduits de Derlin-1 entraînent une accumulation de LDLR mal replié au niveau de la membrane plasmique et une réduction de son taux de dégradation. Une explication possible de ces données est que certaines molécules de Derlin se localisent dans la membrane plasmique et/ou les endosomes où elles régulent le destin des protéines mal repliées à la surface cellulaire. Nous avons donc testé plus en détail la localisation des protéines de Derlin.

Mammifère Derl1 Phénotypes ARNi. (A) Western blots de protéines isolées de cellules RAW264.7 ou Derl1 Clones stables pour l'ARNsh et sondés avec des anticorps anti-Derlin-1, anti-Derlin-2 ou anti-Derlin-3. Des anticorps anti-actine ont été utilisés comme contrôle de charge. (B) Images confocales de RAW264.7, Derl1 clones d'ARNi, ou Mcoln1 Clones d'ARNi colorés avec des anticorps polyclonaux qui détectent les domaines extracellulaires des récepteurs LDLR ou Fcgamma (FcR) et avec des anticorps secondaires marqués au FITC. Pour chaque anticorps, les images ont été prises en utilisant la même exposition et le même grossissement. (C) Quantification de la coloration par fluorescence de la membrane plasmique de LDLR et FcR montrée dans B. (D) Images confocales de RAW264.7, Derl1 clones d'ARNi, ou Mcoln1 Clones d'ARNi colorés avec Bodipy FL-LDL après traitement des cellules avec du D-PBS ou avec un tampon de mauvais repliement à haute teneur en sel et à faible pH. Toutes les images ont été prises en utilisant la même exposition et le même grossissement. (E) Quantification de la coloration par fluorescence de la membrane plasmique du LDLR et du FcR montrée en B. (F) Western blots représentatifs de la cinétique de dégradation du LDLR mature. MF fait référence au traitement des cellules avec un tampon de mauvais repliement. (G) Quantification des niveaux de LDLR matures au fil du temps à partir de trois expériences de cinétique de dégradation. Cellules RAW, RAW264.7 Derlin1KD, clone shRNA Derlin-1 MCOLN1KD, clone shRNA MCOLN1 PBS, traitement D-PBS MF, traitement tampon de repliement.

Mammifère Derl1 Phénotypes ARNi. (A) Western blots de protéines isolées de cellules RAW264.7 ou Derl1 Clones stables pour l'ARNsh et sondés avec des anticorps anti-Derlin-1, anti-Derlin-2 ou anti-Derlin-3. Des anticorps anti-actine ont été utilisés comme contrôle de charge. (B) Images confocales de RAW264.7, Derl1 clones d'ARNi, ou Mcoln1 Clones d'ARNi colorés avec des anticorps polyclonaux qui détectent les domaines extracellulaires des récepteurs LDLR ou Fcgamma (FcR) et avec des anticorps secondaires marqués au FITC. Pour chaque anticorps, les images ont été prises en utilisant la même exposition et le même grossissement. (C) Quantification de la coloration par fluorescence de la membrane plasmique de LDLR et FcR montrée dans B. (D) Images confocales de RAW264.7, Derl1 clones d'ARNi, ou Mcoln1 Clones d'ARNi colorés avec Bodipy FL-LDL après traitement des cellules avec du D-PBS ou avec un tampon de mauvais repliement à haute teneur en sel et à faible pH. Toutes les images ont été prises en utilisant la même exposition et le même grossissement. (E) Quantification de la coloration par fluorescence de la membrane plasmique du LDLR et du FcR montrée en B. (F) Western blots représentatifs de la cinétique de dégradation du LDLR mature. MF fait référence au traitement des cellules avec un tampon de mauvais repliement. (G) Quantification des niveaux de LDLR matures au fil du temps à partir de trois expériences de cinétique de dégradation. Cellules RAW, RAW264.7 Derlin1KD, clone shRNA Derlin-1 MCOLN1KD, clone shRNA MCOLN1 PBS, traitement D-PBS MF, traitement tampon de repliement.

Localisation subcellulaire des protéines CUP-2 et Derlin

Der1p et Dfm1p chez la levure, et Derlin-1 et Derlin-2 chez l'homme, se localisent dans le RE (Hitt et Wolf, 2004 Knop et al., 1996 Lilley et Ploegh, 2004 Lilley et Ploegh, 2005 Ye et al., 2004) . Pour confirmer la localisation ER de CUP-2, nous avons fusionné la GFP à son extrémité C-terminale. L'expression de cette fusion CUP-2::GFP sous le contrôle du promoteur coelomocyte sauve à la fois l'endocytose et les défauts d'activation de l'UPR de tasse-2(ar506) dans les coelomocytes, indiquant que la protéine de fusion est fonctionnelle et que CUP-2 agit de manière autonome sur la cellule (Fig. 5A-C). Dans les coelomocytes de type sauvage, CUP-2::GFP colocalise largement avec le marqueur ER lisse cytochrome b5 et le marqueur ER rugueux TRAM, indiquant qu'à l'état d'équilibre, la majorité des molécules CUP-2 résident dans le RE (Fig. 5D) (Rolls et al., 2002). Cependant, en plus de la coloration ER, nous avons systématiquement détecté CUP-2::GFP, mais pas les autres marqueurs ER, dans les organites périphériques, suggérant que CUP-2 se localise dans d'autres compartiments en plus du RE (Fig. 5D, flèches). Cette coloration périphérique n'était pas celle du complexe de Golgi que nous avons visualisé sous forme de puncta centralisé discret dans les coelomocytes (voir Fig. 3D) (Bednarek et al., 2007 Dang et al., 2004 Patton et al., 2005 Treusch et al., 2004) . Au moins une partie de la coloration périphérique de CUP-2 était endosomale car elle semblait colocaliser avec RAB-5, bien que la nature élaborée du RE dans les coelomocytes empêche une détermination sans ambiguïté (Fig. 5D, flèches).

Localisation subcellulaire de CUP-2. (A) images confocales de pmyo-3::ssGFP ou tasse-2(ar506) pmyo-3::ssGFP hermaphrodites adultes (panneaux de gauche) et coelomocytes individuels (panneaux de droite) exprimant une fusion traductionnelle CUP-2::GFP à partir d'un promoteur spécifique du coelomocyte. Les vers ont été cultivés à 20°C. (B) Quantification des tailles des vésicules remplies de GFP dans les coelomocytes des souches montrées dans A. 1 pixel = 0,001 m 2 . (C) Intensité moyenne par pixel de GFP dans les noyaux de coelomocytes de souches des génotypes indiqués exprimant HSP-4::GFP. Les vers ont été cultivés à 20°C. (D) Images confocales de coelomocytes co-exprimant CUP-2::GFP et le marqueur lisse ER (sER) cytochrome b5 ou CUP-2::GFP et le marqueur rugueux ER (rER) TRAM ou CUP-2::GFP et le marqueur endosome précoce RAB-5, fusionné à mCherry. Les flèches indiquent les structures qui contiennent uniquement CUP-2::GFP dans les images de localisation ER et les endosomes qui contiennent à la fois CUP-2 et RAB-5 dans les panneaux inférieurs. Les vers ont été cultivés à 20°C.

Localisation subcellulaire de CUP-2. (A) images confocales de pmyo-3::ssGFP ou tasse-2(ar506) pmyo-3::ssGFP hermaphrodites adultes (panneaux de gauche) et coelomocytes individuels (panneaux de droite) exprimant une fusion traductionnelle CUP-2::GFP à partir d'un promoteur spécifique du coelomocyte. Les vers ont été cultivés à 20°C. (B) Quantification des tailles des vésicules remplies de GFP dans les coelomocytes des souches montrées dans A. 1 pixel = 0,001 m 2 . (C) Intensité moyenne par pixel de GFP dans les noyaux de coelomocytes de souches des génotypes indiqués exprimant HSP-4::GFP. Les vers ont été cultivés à 20°C. (D) Images confocales de coelomocytes co-exprimant CUP-2::GFP et le marqueur lisse ER (sER) cytochrome b5 ou CUP-2::GFP et le marqueur rugueux ER (rER) TRAM ou CUP-2::GFP et le marqueur endosome précoce RAB-5, fusionné à mCherry. Les flèches indiquent les structures qui contiennent uniquement CUP-2::GFP dans les images de localisation ER et les endosomes qui contiennent à la fois CUP-2 et RAB-5 dans les panneaux inférieurs. Les vers ont été cultivés à 20°C.

Nous avons déterminé la localisation subcellulaire des protéines Derlin mammifères endogènes pour confirmer cette localisation extra-ER. Nous avons d'abord utilisé l'immunofluorescence comparant la localisation des protéines de Derlin au marqueur ER calréticuline. Nous avons observé une colocalisation significative de Derlin-1 avec la calréticuline et de Derlin-2 avec la calréticuline dans les macrophages RAW264.7 (Fig. 6A). Cependant, il y avait des structures vésiculaires marquées pour les protéines Derlin endogènes mais qui ne contenaient pas de calréticuline (flèches sur la figure 6A). Nous avons ensuite transfecté des cellules RAW264.7 avec Rab5 (endosomes précoces) marqués GFP ou YFP, Rab7 (endosomes tardifs) et Rab11a (endosomes de recyclage), qui avaient été fixés et immunocolorés pour détecter les protéines Derlin endogènes et GFP ou YFP. Nous avons vu une colocalisation significative entre les protéines Derlin et Rab5 et Rab7, indiquant que les protéines Derlin se trouvent également sur les endosomes (flèches sur la figure 6B). Les protéines Derlin et Rab11a ont montré une colocalisation très limitée, voire inexistante, dans la région périnucléaire (Fig. 6B). La colocalisation des protéines Derlin avec les protéines Rab n'est pas une conséquence indirecte de la surexpression de Rab affectant l'intégrité du RE car nous n'avons observé aucune colocalisation entre les protéines Rab et la calréticuline dans les mêmes cellules transfectées par Rab (matériel supplémentaire Fig. S5).

Nous avons utilisé la microscopie immuno-électronique pour déterminer la localisation de la protéine Derlin à une résolution plus élevée. Nous avons d'abord laissé les cellules endocytoser le BSA-or (15 nm) pendant 10 minutes pour marquer sans ambiguïté les compartiments endosomaux (Fig. 6C). Nous avons ensuite ajouté de l'anti-Derlin-1, de l'anti-Derlin-2 ou du PBS (contrôle) aux cellules avant la visualisation à l'aide d'anticorps secondaires conjugués à l'or de 6 nm. Les endosomes RAW264.7 contenant les particules d'or de 15 nm ont montré une coloration périphérique pour Derlin-1 (25/27 endosomes) et pour Derlin-2 (24/25 endosomes). Seul 1 endosome sur 16 avait des particules d'or de 6 nm dans le contrôle. Une coloration similaire du Derl1 Les cellules ARNi ont révélé une coloration réduite pour Derlin-1 (6/17 endosomes) mais pas pour Derlin-2 (14/14 endosomes) (données non présentées). Bien que nous ayons détecté un marquage spécifique de Derlin-1 et Derlin-2 près de la membrane plasmique, nous n'avons pas pu déterminer s'il s'agissait d'un marquage réel de la membrane plasmique ou du marquage des membranes organellaires sous-corticales (ER, endosomes).

Enfin, nous avons fractionné la fraction membranaire post-nucléaire des macrophages RAW264.7 murins sur un gradient continu d'iodixanol pour sonder biochimiquement la présence de protéines Derlin dans des compartiments en dehors du RE. Derlin-1 et Derlin-2 endogènes ont été séparés en deux pools (encadrés sur la figure 6D). Le pool I (fractions 9-16) comprenait des membranes ER. Le pool II (fractions 2-5) n'incluait pas la membrane du RE mais comprenait le complexe de Golgi, les endosomes et la membrane plasmique. Derlin-3 n'a pas été exprimé dans ces cellules (voir figure 4A). Ces résultats indiquent que les protéines Derlin ont une localisation conservée dans les compartiments endosomaux en plus du RE.

Localisation subcellulaire des protéines Derlin de souris. (A) Images confocales de RAW264.7 ou Derl1 Cellules ARNi colorées pour les protéines de Derlin et la calréticuline (CRT). Les flèches indiquent les structures vésiculaires qui ne colorent que les protéines de Derlin. (B) Images confocales de cellules RAW264.7 transfectées avec GFP-Rab5 (canin), YFP-Rab7a (canin) ou GFP-Rab11a (canin), puis fixées au méthanol et colorées pour les protéines Derlin et GFP ou YFP. Les flèches indiquent la colocalisation. (C) Micrographies électroniques de cellules RAW264.7 qui ont endocytosé des particules d'or BSA-15-nm et qui ont été immunocolorées pour détecter Derlin-1 ou Derlin-2. Les anticorps secondaires ont été conjugués à des particules d'or de 6 nm. Les flèches indiquent des particules d'or de 6 nm sur les périphéries des endosomes. Barre d'échelle : 0,1 m. (D) Western blots des fractions subcellulaires des membranes RAW264.7. Les gradients ont été fractionnés à partir du haut (haut=1).

Localisation subcellulaire des protéines Derlin de souris. (A) Images confocales de RAW264.7 ou Derl1 Cellules ARNi colorées pour les protéines de Derlin et la calréticuline (CRT). Les flèches indiquent les structures vésiculaires qui ne colorent que les protéines de Derlin. (B) Images confocales de cellules RAW264.7 transfectées avec GFP-Rab5 (canin), YFP-Rab7a (canin) ou GFP-Rab11a (canin), puis fixées au méthanol et colorées pour les protéines Derlin et GFP ou YFP. Les flèches indiquent la colocalisation. (C) Micrographies électroniques de cellules RAW264.7 qui ont endocytosé des particules d'or BSA-15-nm et qui ont été immunocolorées pour détecter Derlin-1 ou Derlin-2. Les anticorps secondaires ont été conjugués à des particules d'or de 6 nm. Les flèches indiquent des particules d'or de 6 nm sur les périphéries des endosomes. Barre d'échelle : 0,1 m. (D) Western blots des fractions subcellulaires des membranes RAW264.7. Les gradients ont été fractionnés à partir du haut (haut=1).


Discussion

Nos études peuvent être résumées dans le modèle présenté sur la figure 6E–G. Notre étude précédente a démontré que l'inhibition mutuelle entre l'activité Ras et PI(3,4)P2 établit la polarité même dans les cellules immobilisées traitées à la latrunculine A en présence d'un gradient chimioattractif ou de caféine (Fig 6E Arai et al, 2010 Wang et al, 2013 Li et al, 2018 ). Nous proposons maintenant un mécanisme supplémentaire impliquant un chemin de recyclage spécifique des vésicules qui accentue le gradient d'arrière en avant lors de la migration. Dictyostelium cellules. PI(3,4)P2 disparaît des protubérances aux bords d'attaque des cupules macropinocytaires, puis s'accumule sur les macropinosomes à la fin du processus d'internalisation. Les macropinosomes sont transformés en vésicules satellites plus petites marquées par PI(3,4)P2 qui s'arriment ensuite à l'arrière. Les molécules PI(3,4)P2 incorporées à l'arrière diffusent le long de la membrane vers l'avant, où elles sont dégradées (Fig 6F). Dans les cellules plus polarisées, en raison d'un temps d'arrivée plus lent des vésicules PI(3,4)P2 et d'un taux de décroissance plus lent de PI(3,4)P2 sur la membrane, le signal PI(3,4)P2 à l'arrière s'élargit et s'étend plus loin vers l'avant (Fig 6G). Nos résultats suggèrent qu'un mécanisme similaire pourrait exister dans les cellules de mammifères en migration polarisée.

Hypothèse du réseau excitable et formation de cupules macropinocytaires

Ce modèle est cohérent avec l'hypothèse du réseau excitable, qui a été proposée pour expliquer les comportements des cellules en migration (Li et al, 2020 ). Selon cette hypothèse, les ondes en propagation ont une région active où les molécules avant sont élevées et les molécules arrière sont faibles. Cette région est suivie d'une région réfractaire, où les molécules avant sont très faibles et les composants arrière s'accumulent fortement (Xiong et al, 2010 Huang et al, 2013 Tang et al, 2014 Li et al, 2018 ). Ici, nos résultats suggèrent que les macropinosomes sont formés par une onde qui s'étend dont le bord de fuite forme la base des cupules macropinocytaires. Cela suggère que la base des cupules macropinocytaires serait dans un état réfractaire, qui est fortement décoré par la molécule arrière PI(3,4)P2. Si PI(3,4)P2 est délivré à l'arrière de la cellule comme nous le proposons, cela fermerait cette région et polariserait davantage la cellule.

De nombreuses autres molécules de signalisation telles que PTEN, Myosin II, IQGAP1 et 2, la cortexilline I et II, RasGAP2 (RG2) et RapGAP3 (RG3) se localisent à l'arrière des cellules (Ramalingam et al, 2015 Li et al, 2018 , 2020 ). Parmi ces molécules, PTEN, RG2, RG3 et Myosin II se localisent également à la base des cupules ou des protubérances rétractables. De plus, RG2 et RG3 se lient à PI(3,4)P2 in vitro. Nos résultats soulèvent la possibilité que les cellules puissent amener l'état réfractaire en transportant bon nombre de ces molécules d'avant en arrière.

La régulation du recyclage des vésicules contrôle la polarité

Dans le modèle d'écoulement en fontaine inversée, nous proposions que le trafic vésiculaire joue un rôle important dans la polarité. Pourtant, le mécanisme de recyclage des vésicules que nous avons décrit est plus évident dans les cellules moins polarisées. Comment expliquer cet apparent décalage ? Les cellules fortement polarisées sont généralement caractérisées par leur morphologie allongée typique, qui est le résultat d'une plus grande proportion de la cellule avec des backmarkers élevés. En fait, nos simulations ont montré que le temps d'arrivée relativement plus long des vésicules et le taux de décroissance plus lent augmentaient la région arrière.Par la suite, les mesures expérimentales ont montré un taux de décroissance plus lent dans les cellules fortement polarisées. Ainsi, les données expérimentales et les résultats de simulation sont cohérents pour soutenir le modèle d'écoulement en fontaine inversée (Fig 6 et Annexe Fig S6).

PI(3,4)P2 est un composant de signalisation distinct pendant la migration cellulaire

Dans certaines études sur la motilité cellulaire et les événements cytosquelettiques, PI(3,4)P2 agit comme un régulateur négatif (Lam et al, 2012 Putain et al, 2018 ). Le groupe de Huttenlocher a signalé que l'homologie Src 2 contenant de l'inositol 5′ phosphatase (SHIP) limite la motilité des neutrophiles et leur recrutement aux blessures chez le poisson zèbre vivant (Yoo et al, 2010 ). Les observations de Wu ont montré que PI(3,4)P2 définit la période réfractaire de l'oscillation des ondes corticales dans les mastocytes (Xiong et al, 2016 Yang et al, 2017 ). Notre laboratoire a rapporté que PI(3,4)P2 régule négativement la motilité cellulaire en inhibant l'activité Ras, même en l'absence de PIP3.

Nos résultats s'écartent du point de vue canonique selon lequel PI(3,4)P2 n'est qu'un sous-produit de l'hydrolyse de PIP3 (Czech, 2000). Nous avons démontré dans les neutrophiles de mammifères et dans Dictyostelium cellules que le niveau de PI(3,4)P2 a été maintenu sur la membrane plasmique sous inhibition de PI3K (Fig 3A-E). De plus, dans PI3K12Dictyostelium cellules, PI(3,4)P2 encore accumulé sur la membrane à l'arrière des cellules et les macropinosomes (Fig 3F-I). Cela suggère qu'une fraction de PI(3,4)P2 doit provenir d'une source autre que PIP3 et qu'il existe une régulation des enzymes qui génèrent PI(3,4)P2 à partir de PI3P ou PI4P. Comme il existe plusieurs phosphoinositides kinases dans Dictyostelium qui n'ont pas été caractérisés, il est possible que l'un d'entre eux corresponde à un nouveau PI3K.

Trafic endocytaire de PI(3,4)P2 comme moyen universel d'établir la polarité

Nos résultats actuels révèlent que les macropinosomes décorés PI(3,4)P2 et sa connexion avec le gradient PI(3,4)P2 à l'arrière de la membrane plasmique dans la régulation de la polarité pendant la migration cellulaire. De manière cohérente, des rapports suggèrent que le recyclage des vésicules marquées par PI(3,4)P2 et d'autres événements endocytaires jouent un rôle important dans la polarité des cellules épithéliales. Une étude du groupe Bryant a récemment décrit la fonction de PI(3,4)P2 dans la morphogenèse du domaine apical dans les kystes MDCK. Le PI(3,4)P2 apical est fourni par le pool endosomal, plutôt que la conversion du PIP3 basolatéral par SHIP1 et est un déterminant de l'identité de la membrane apicale (Roman-Fernandez et al, 2018 ). Ces observations renforcent les parallèles entre les surfaces basolatérales et apicales des cellules épithéliales et l'avant et l'arrière des cellules en migration (Martin-Belmonte et al, 2007 Nelson, 2009 Bryant et al, 2014 ). Un autre parallèle pourrait être l'établissement de la polarité au cours de la cytokinèse, où PI(3,4)P2 se trouve élevé dans le sillon de clivage (Li et al, 2020 ). Le rôle potentiel du trafic vésiculaire dans la cytokinèse n'a pas été étudié.

Modèle d'écoulement en fontaine inversée de PI(3,4)P2

Au cours de la migration, la membrane supplémentaire requise pour permettre l'expansion des protubérances pourrait provenir du dépliement des invaginations de la membrane ou du trafic vésiculaire.

Plusieurs études différentes ont suggéré que les cellules migrent suivant un modèle d'écoulement en fontaine : les vésicules précurseurs membranaires fusionnent avec la membrane cellulaire antérieure au niveau des saillies, les membranes dorsale et ventrale s'écoulent vers l'arrière et la membrane est internalisée à l'arrière (Lee et al, 1990 Tanaka et al, 2017 ). À l'appui des modèles d'écoulement en fontaine, il a été démontré que le blocage du trafic vésiculaire est nécessaire pour le mouvement et que les particules collées à l'extérieur des cellules ainsi que les plaques membranaires photoblanchies s'écoulent de l'avant vers l'arrière.

Dans notre modèle d'écoulement en fontaine inversée, les vésicules enrichies en PI(3,4)P2 sont extraites des macropinosomes au niveau de la protrusion antérieure et finissent par fusionner avec la membrane à l'arrière. De plus, la membrane plasmique PI(3,4)P2 à l'arrière diffuse vers l'avant. Alors que ce modèle d'écoulement en fontaine inversée de PI(3,4)P2 met en lumière le rôle de ce phospholipide dans la régulation de la polarité pendant la migration cellulaire, une étude plus approfondie est nécessaire pour déterminer la direction d'écoulement des autres composants de la membrane. Une étude a montré que la photoactivation de cAR1 s'est déplacée vers l'avant, ce qui soutient le modèle d'écoulement en fontaine inversée (Traynor et Kay, 2007). De plus, des vésicules contenant de l'adénylyl cyclase fusionnent avec le dos de Dictyostelium les cellules et les vésicules portant le récepteur du facteur de croissance fusionnent à l'arrière des cellules (Kriebel et al, 2008 Zoncu et al, 2009 ). Une étude récente de Moreau et al (2019) ont montré que les cellules dendritiques immatures en migration forment des macropinosomes à leur bord avant qui traversent le cytoplasme et libèrent finalement leur contenu fluide à l'arrière. Ceci est en accord avec notre modèle. Le repliement membranaire, le modèle d'écoulement en fontaine ou les modèles d'écoulement en fontaine inversée peuvent fonctionner dans des cellules spécifiques au cours de différents modes de migration.


Préparation d'échantillons pour la microscopie à fluorescence : une introduction - Concepts et astuces pour de meilleurs résultats d'imagerie d'échantillons fixes

Plusieurs étapes de traitement sont nécessaires pour préparer des cellules de culture tissulaire pour la microscopie à fluorescence. Les expériences sont généralement classées en microscopie à cellules vivantes ou à cellules fixes. La microscopie à fluorescence de cellules vivantes utilise soit des protéines fluorescentes génétiquement codées (par exemple GFP, mcherry, YFP, RFP, etc.) soit des colorants fluorescents perméables à la membrane cellulaire et non toxiques. La microscopie à fluorescence des cellules fixées utilise un agent fixateur qui rend les cellules mortes, mais maintient la structure cellulaire, permettant l'utilisation d'anticorps et de colorants spécifiques pour étudier la morphologie et la structure des cellules. Une préparation appropriée des échantillons est nécessaire pour garantir la capture d'images de haute qualité. Nous décrivons ici un certain nombre de concepts et de considérations concernant le processus de préparation des échantillons qui peuvent aider à la microscopie à fluorescence numérique automatisée de cellules fixes.

Fixation cellulaire

L'objectif de la fixation est de maintenir la structure cellulaire autant que possible à celle de l'état natif ou non fixé pendant les étapes de traitement et l'imagerie ultérieure. Il existe un certain nombre de méthodes de fixation adaptées à la microscopie à fluorescence qui se répartissent en deux catégories de base : les fixateurs à l'aldéhyde et les fixateurs à l'alcool. Les solvants organiques tels que les alcools et l'acétone éliminent les lipides et déshydratent les cellules, tout en précipitant les protéines sur l'architecture cellulaire. Les réactifs aldéhydes de réticulation forment des ponts intermoléculaires, normalement via des groupes amino libres, créant un réseau d'antigènes liés. Les agents de réticulation préservent mieux la structure cellulaire que les solvants organiques, mais peuvent réduire l'antigénicité de certains composants cellulaires et nécessitent une étape de perméabilisation pour permettre à l'anticorps d'accéder à l'échantillon. La fixation avec les deux méthodes peut dénaturer les antigènes protéiques, et pour cette raison, les anticorps préparés contre les protéines dénaturées peuvent être plus utiles pour la coloration cellulaire. Comme chaque méthode a ses avantages et ses inconvénients et parce que différentes méthodes de fixation peuvent détruire ou masquer différents épitopes, plusieurs méthodes différentes peuvent devoir être testées pour des résultats optimaux.

Les fixateurs d'aldéhydes réticulent les protéines et font généralement un excellent travail de préservation de la morphologie cellulaire. Bien qu'ils agissent généralement plus lentement que les fixateurs à base organique, 4% de formaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante est un bon point de départ. Le glutaraldéhyde réticulera également les protéines, mais entraîne une autofluorescence significative et doit généralement être évité ou utilisé en faible concentration en conjonction avec le formaldéhyde. Notez que le glutaraldéhyde est le fixateur préféré de choix pour la microscopie électronique.

Formaldéhyde vs Paraformaldéhyde vs Formol

Le paraformaldéhyde est un polymère du formaldéhyde. Il existe sous forme de poudre sèche adaptée au stockage et doit être décomposé en son composant monomère, le formaldéhyde. Ceci est accompli en chauffant dans des conditions basiques jusqu'à ce qu'il soit solubilisé. Les solutions commerciales de formaldéhyde, généralement appelées formol, contiennent souvent du méthanol pour empêcher la repolymérisation en paraformaldéhyde. Une solution de formol saturée a une teneur en formaldéhyde dans l'eau ou un tampon de 37 à 40 % et est parfois appelée « formol à 100 % ». Par conséquent, utiliser du formol à 10 % (dilution 1:10) équivaut à utiliser du formaldéhyde à 3,7 à 4 % pour la fixation. Étant donné que le &ldquo100% formol &rdquo contient jusqu'à 15% de méthanol comme stabilisant, il peut avoir un impact significatif sur la fixation. Ceci est principalement le résultat de la perméabilisation membranaire par le méthanol, ce qui entraîne une interférence dans la coloration des protéines liées à la membrane.

Préparez une nouvelle solution de formaldéhyde à 4% en dissolvant la poudre de paraformaldéhyde dans du PBS (PH 7,4) à l'aide d'une plaque chauffante en agitant avec le chauffage réglé à un réglage moyen jusqu'à ce que le liquide atteigne environ 60 °C. Au fur et à mesure que le paraformaldéhyde se décompose en formaldéhyde, il se dissoudra. Une fois la solution complètement dissoute (environ 30 min), la solution est rapidement refroidie sur de la glace à température ambiante avant utilisation. Typiquement, les cellules de culture tissulaire sont fixées pendant 10 minutes à température ambiante avec du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS suivi de 2 à 3 lavages avec du PBS pour éliminer l'excès de formaldéhyde et arrêter la réaction de fixation.

Les solvants organiques tels que le méthanol précipitent rapidement les protéines, maintenant ainsi leur structure. Alors que la structure cytosquelettique de la protéine cellulaire est maintenue avec la fixation du méthanol, les petites molécules à l'intérieur seront perdues au cours des étapes de traitement ultérieures car elles ne sont pas précipitées. Étant donné que le méthanol précipite les protéines, n'utilisez jamais cette méthode si des protéines fluorescentes codées génétiquement doivent être imagées ou détectées - l'activité de ces protéines sera abolie avec la fixation du méthanol. Le méthanol est utilisé à froid (-20 °C) pendant 10-20 minutes. L'utilisation d'une combinaison de méthanol et d'acétone (1:1) peut parfois améliorer les résultats. Le méthanol est le meilleur pour préserver la structure tandis que l'acétone améliore la perméabilisation. Après la fixation, les échantillons sont lavés avec du PBS 2 à 3 fois pour éliminer l'alcool et réhydrater l'échantillon.

Une autre considération importante d'un protocole de fixation est la sélection du tampon. Idéalement, le tampon est de nature isotonique afin de ne pas perturber la structure cellulaire, tout en maintenant un pH aussi proche que possible du physiologique. Le tampon le plus fréquemment utilisé est une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Lorsque vous utilisez des aldéhydes comme fixateurs, évitez d'utiliser des tampons contenant des amines, tels que le Tris, car ils réagiront avec le fixateur.

Perméabilisation

La fixation avec l'utilisation d'agents de réticulation ne diminue pas efficacement la structure de la membrane cellulaire. Par conséquent, la fixation du formaldéhyde nécessite que les cellules soient perméabilisées pour permettre aux anticorps d'accéder à l'intérieur des cellules. La grande taille et la nature ionique des protéines d'anticorps les empêchent d'accéder sans rupture de la membrane (Figure 1-2). La fixation à base d'alcool et d'acétone ne nécessite généralement pas cette étape.

La digitonine, le leucoperm et la saponine sont des détergents relativement doux qui génèrent des pores suffisamment grands pour que les anticorps passent à travers sans dissoudre complètement la membrane plasmique. Ceux-ci conviennent aux antigènes du cytoplasme ou de la face cytoplasmique de la membrane plasmique (Figure 1). La saponine agit en dissolvant le cholestérol présent dans la membrane plasmique. Lorsqu'elles sont utilisées à de faibles concentrations, les membranes internes restent intactes, il est donc utile pour marquer des molécules plus petites qui existent à l'état soluble dans le cytoplasme. Il doit être préparé sous forme de stock dans du DMSO et est généralement utilisé à raison de 0,5 à 1 mg/mL à température ambiante pendant 10 à 30 minutes.

Le Triton X-100 est probablement l'agent de perméabilisation le plus couramment utilisé pour la coloration immunofluorescente. Ce détergent dissout efficacement les membranes cellulaires sans perturber les interactions protéine-protéine (Figure 1). Le triton est généralement utilisé à des concentrations allant de 0,1 à 1 % pour la perméabilisation. Nous utilisons généralement du Triton X-100 ou du NP-40 à 0,1% dans du PBS à température ambiante pendant 10 minutes. Outre la perméabilisation de la membrane cellulaire, ces détergents dissoudront partiellement la membrane nucléaire, ce qui les rend adaptés à la coloration de l'antigène nucléaire.

Figure 1. Accessibilité des anticorps avec cellules non perméabilisées et Digitonine ou Triton X-100 perméabilisées. Les anticorps ne peuvent accéder qu'à l'extérieur des cellules non perméabilisées fixées par des aldéhydes, tandis que des agents doux tels que la digitonine perméabilisent la membrane plasmique, permettant l'accès à l'intérieur du cytoplasme, mais pas aux organites liés à la membrane intérieure tels que le noyau des mitochondries. Des détergents non ioniques plus puissants, tels que le Triton X-100, perméabilisent à la fois la membrane plasmique et les membranes intérieures, permettant un accès complet tout en préservant la structure cellulaire.

Le SDS est un détergent anionique couramment utilisé pour dénaturer les protéines et leur fournir une grande charge négative pour l'électrophorèse. Il est utile en tant qu'agent perméabilisant pour induire une légère dénaturation des cellules fixées afin de révéler des épitopes qui peuvent normalement être masqués par un anticorps. Il peut extraire de petites protéines faiblement réticulées à partir d'échantillons fixés et ne doit pas être utilisé sur des échantillons fixés par précipitation (par exemple, le méthanol).

Lors de l'utilisation d'anticorps pour colorer des objets cellulaires dans des échantillons, il est nécessaire de "bloquer" l'échantillon afin de réduire la liaison non spécifique. Une liaison non spécifique peut se produire pour plusieurs raisons : les aldéhydes fixateurs n'ayant pas réagi peuvent réticuler les anticorps à des structures inappropriées dans les échantillons peuvent « récupérer » les anticorps ou, si vous utilisez des anticorps polyclonaux, des molécules d'IgG de faible affinité peuvent se lier à des structures inappropriées. Ces problèmes potentiels peuvent être évités en traitant les échantillons avec une solution de protéines qui entrera en compétition pour les sites de liaison non spécifiques avant la coloration avec des anticorps. Les agents bloquants couramment utilisés sont l'albumine de sérum bovin (BSA), la caséine (ou une solution de lait en poudre écrémé), la gélatine ou le sérum normal obtenu à partir de l'espèce animale dans laquelle les anticorps secondaires sont fabriqués. Évitez d'utiliser du sérum de la même espèce que les anticorps primaires. Typiquement, les solutions de protéines sont utilisées à des concentrations de 1 à 10 % en tampon et les échantillons sont traités après perméabilisation pendant 10 à 30 minutes. Il est également conseillé d'inclure une petite quantité de détergent (si l'échantillon doit être perméabilisé) pour entrer en compétition pour les interactions hydrophobes avec les anticorps. Dans ce cas, de faibles concentrations (environ 0,1%) de Triton X-100 doivent être utilisées, par exemple 3% de BSA dans du PBS avec 0,1% de Triton X-100 ou 5% de sérum de veau foetal (FBS) dans du PBS avec 0,1% de Triton X -100 pendant 30 minutes à température ambiante fonctionne bien.

Les anticorps pour l'immunofluorescence sont divisés en deux catégories : les anticorps primaires et secondaires. Ces deux groupes sont classés selon qu'ils se lient directement à des antigènes ou à des protéines ou ciblent un autre anticorps (primaire) qui, à son tour, est lié à un antigène ou à une protéine. Les anticorps primaires peuvent être marqués ou non marqués. Les anticorps primaires qui ont été liés de manière covalente avec une fraction fluorescente auront une spécificité et se lieront directement à la cible ainsi qu'à l'étiquette nécessaire pour l'imagerie. C'est ce qu'on appelle l'immunofluorescence directe (figure 2). En couplant l'anticorps primaire avec un fluorophore, l'immunofluorescence directe est plus rapide que la version indirecte car les étapes de lavage et d'incubation fastidieuses sont omises. Ainsi, l'immunofluorescence directe est plus facile à manipuler et donc adaptée à l'analyse rapide d'échantillons dans des expériences standardisées, par exemple en pratique clinique. D'autre part, les anticorps primaires non marqués se lieront à la cible mais nécessiteront un anticorps secondaire qui reconnaîtra spécifiquement l'anticorps. Cette situation est appelée immunofluorescence indirecte.

Figure 2. Fluorescence d'anticorps directement marqués sur des cellules SK-BR-3 non perméabilisées. Anticorps anti-EGFR marqué de manière covalente avec FITC et incubé avec des cellules SK-BR-3 non perméables colorées avec Hoechst 33342. Les cellules ont été imagées avec un lecteur multimode d'imagerie cellulaire Cytation&trade 3 (BioTek Instruments). La fluorescence verte n'est localisée qu'à la périphérie externe des cellules car l'EGFR est un récepteur de la membrane plasmique.

La liaison de l'anticorps primaire à l'antigène spécifique implique le domaine Fab de l'anticorps, qui à son tour laisse le domaine Fc exposé (figure 3). L'anticorps secondaire&rsquos Fab a été développé pour reconnaître le domaine Fc de l'anticorps primaire. Étant donné que le domaine Fc de l'anticorps est constant au sein de la même classe animale, un seul type d'anticorps secondaire est nécessaire pour se lier à de nombreux types d'anticorps primaires. Cela réduit le coût en ne marquant qu'un seul type d'anticorps secondaire, plutôt que de marquer divers types d'anticorps primaires.


Figure 3. Structure de la protéine IgG.

Les anticorps primaires peuvent être de nature polyclonale ou monoclonale. Les anticorps polyclonaux sont un mélange hétérogène d'anticorps dirigés contre divers épitopes d'un même antigène. Comme ils sont générés à partir de différents clones de cellules B, ils sont immunochimiquement différents et peuvent avoir des spécificités et des affinités différentes. Alors qu'un certain nombre d'espèces animales différentes, dont la chèvre, le porc, le cobaye et la vache, sont couramment utilisées pour produire des anticorps polyclonaux, les lapins sont le plus souvent utilisés. Les anticorps monoclonaux sont une population homogène d'immunoglobulines dirigées contre un seul épitope. Ces anticorps sont générés à partir d'un seul clone de cellules B isolé d'un seul animal et, en tant que tels, ont la même structure Fab. Alors que la grande majorité des anticorps monoclonaux sont produits à partir de souris, de plus en plus, ils sont également produits à partir de lapins.

L'affinité de liaison et le titre résultant vis-à-vis de son antigène sont différents pour chaque anticorps. L'utilisation d'anticorps monoclonaux supprime une grande partie de la variabilité, mais les concentrations d'un lot à l'autre peuvent varier même avec le même monoclonal en raison de l'agrégation ou de la dénaturation. En conséquence, la concentration d'anticorps requise et le temps d'incubation utilisé peuvent varier d'un lot à l'autre. Le développement optimal du test nécessite que l'anticorps primaire soit titré pour de meilleurs résultats. Trop peu d'anticorps entraîne un signal artificiellement faible, en raison d'un manque de saturation de la cible. Trop d'anticorps peut entraîner une liaison non spécifique malgré l'utilisation d'une étape de blocage. En raison du coût du réactif, il est primordial de n'utiliser que la quantité d'anticorps nécessaire. Cependant, pour une expérience unique ou une petite série d'expériences, le temps, les efforts et les dépenses requis pour un titrage complet des anticorps ne sont souvent pas justifiés. Typiquement, une dilution de 1:1000 pour les anticorps monoclonaux disponibles dans le commerce est utilisée. En raison des faibles quantités de protéines dans l'échantillon, il est préférable d'utiliser un tampon contenant de la BSA pour diluer l'anticorps, par exemple du PBS 0,1% Triton X-100 additionné de 30 mg/mL de BSA. Cela peut être fait en vrac, stérilisé par filtre et aliquoté. Utilisez uniquement une dilution d'anticorps suffisante pour couvrir l'échantillon, - pour un puits typique dans une microplaque à 96 puits, c'est 20-25 &muL. La plupart des anticorps disponibles dans le commerce ont un titre suffisant pour lier des cibles à nombre de copies élevé en 30 à 60 minutes à température ambiante. Les résultats avec des cibles à faible nombre de copies sont souvent améliorés par une incubation d'une nuit à 4 °C, et l'agitation peut également aider. Un temps d'incubation de 60 minutes à température ambiante fonctionne bien pour la plupart des expériences, mais une incubation d'une nuit peut être utilisée comme point d'arrêt pratique en fin de journée pour le traitement des échantillons, même avec des épitopes à nombre cible élevé.

Figure 4. Étiquetage d'anticorps direct ou indirect.

Un anticorps secondaire est requis avec l'immunofluorescence indirecte, où l'anticorps primaire ne fournit aucun moyen de détection et fonctionne en se liant à un anticorps primaire, qui se lie directement à l'antigène cible. L'utilisation d'anticorps secondaires pour détecter indirectement des antigènes cibles nécessite des étapes de processus supplémentaires mais peut également offrir des avantages significatifs par rapport aux anticorps primaires marqués. Les anticorps secondaires augmentent la sensibilité grâce à l'amplification du signal qui se produit lorsque plusieurs anticorps secondaires se lient à un seul anticorps primaire (Figure 4). De plus, un anticorps secondaire donné peut être utilisé avec n'importe quel anticorps primaire du même isotype et espèce cible, ce qui en fait un réactif plus polyvalent que les anticorps primaires marqués individuellement. Cette flexibilité est un avantage important de l'immunofluorescence indirecte. Étant donné que la grande majorité des anticorps primaires sont produits dans quelques espèces animales hôtes et que la plupart sont de la classe IgG, il est économique de produire et de fournir des anticorps secondaires prêts à l'emploi pour de nombreuses méthodes et systèmes de détection. A partir d'un nombre relativement restreint d'anticorps secondaires, de nombreuses options sont disponibles pour le niveau de pureté, la spécificité et le type de marqueur pour une application donnée. Une dilution de 1:500 pour certains anticorps secondaires disponibles dans le commerce (Figure 5). Comme pour les anticorps primaires, les faibles quantités de protéines dans le réactif rendent impératif l'utilisation d'un tampon contenant de la BSA ou d'autres protéines non spécifiques pour diluer l'anticorps, par exemple du PBS 0,1% Triton X-100 additionné de 30 mg/mL de La BSA peut être utilisée pour la dilution des anticorps secondaires.

Figure 5. Cellules HeLa fixes et tricolores fixées et colorées. Mitochondries identifiées par un anticorps primaire anti-mitofiline de souris suivi d'un anticorps monoclonal IgG anti-souris de lapin marqué au Texas Red (Red). Les noyaux et les filaments d'actine sont identifiés par contre-coloration DAPI (bleu) et AlexaFluor®-488-phalloidine (vert) respectivement. La barre d'échelle indique 30 &mum.

Il est important que l'anticorps secondaire utilisé dans l'expérience soit dirigé contre l'espèce hôte utilisée pour générer l'anticorps primaire. Les anticorps primaires polyclonaux sont généralement produits chez le lapin, la chèvre, le mouton ou l'âne et sont généralement des isotypes IgG. L'anticorps secondaire sera donc typiquement un anticorps anti-IgG. Des anticorps primaires monoclonaux sont couramment produits chez la souris, le lapin et le rat. Par exemple, si l'anticorps monoclonal primaire est une IgG de souris, vous aurez besoin d'une IgG anti-souris.

L'utilisation d'anticorps secondaires pré-absorbés réduit le risque de réactivité croisée avec d'autres anticorps et doit être utilisée avec des expériences multicolores lorsque plusieurs anticorps primaires et leurs anticorps secondaires correspondants sont utilisés simultanément.

La pré-adsorption est une étape de traitement supplémentaire au cours de laquelle les anticorps secondaires sont passés à travers une matrice de colonne contenant des protéines sériques immobilisées provenant d'agents potentiellement réactifs. Par exemple, seuls les anticorps spécifiques aux IgG de lapin passeront à travers une colonne pré-absorbante contenant des IgG de souris, humaines et de cheval immobilisées tandis que les anticorps à réaction croisée se lieront et resteront adsorbés à la matrice.

Entre chaque étape du processus, il y a généralement une étape de lavage pour éliminer les réactifs en excès non liés. Le tampon utilisé pour ces étapes doit tenir compte du tampon utilisé pour les étapes du processus. Comme décrit précédemment, il est préférable d'utiliser un système tampon isotonique pour préserver la structure cellulaire et proche du pH physiologique. Le lavage, comme son nom l'indique, consiste en une série d'ajouts de réactifs d'aspiration et de tampon effectués en séquence. Selon le volume utilisé, 2-3 cycles suffisent pour le lavage, l'étape finale étant une aspiration pour éliminer le fluide avant l'ajout du réactif de traitement suivant. Le PBS est couramment utilisé, et un tensioactif tel que 0,1 % de Triton X-100 ou 0,05 % de Tween&trade 20 peut également être ajouté. Notez qu'il est important de faire ces étapes en temps opportun pour éviter que l'échantillon ne se dessèche.

Contre-taches

Les contre-colorations sont utilisées à deux fins différentes, la réduction de la fluorescence de fond ou l'identification des organites cellulaires. Les colorants bleus, tels que le bleu Evans, peuvent être utilisés pour réduire la fluorescence de fond non spécifique avec des échantillons marqués à la fluorescéine. Parce que ces colorants peuvent masquer la liaison désirée faiblement fluorescente, ils ne sont pas recommandés pour une utilisation de routine. Le plus important est l'utilisation de contre-colorants pour identifier les organites cellulaires et fournir des informations concernant la localisation du signal.

Figure 6. Noyaux cellulaires NIH 3T3 colorés au DAPI.

Le noyau est l'organite cellulaire principalement ciblé et peut être identifié grâce à l'utilisation de colorants qui se lient à l'ADN (Figure 6). Le DAPI (diamidino-2-phénylindole) est un contre-colorant nucléaire utile pour les expériences de fluorescence multicolore. Sa fluorescence bleue diffère sensiblement des sondes fluorescentes à la fluorescéine (verte) ou au rouge Texas utilisées pour d'autres structures. Il émet une fluorescence brillante lorsqu'il se lie sélectivement au petit sillon de l'ADN double brin. Sa sélectivité pour l'ADN permet une coloration efficace des noyaux avec peu de bruit de fond du cytoplasme. D'autres colorants nucléaires incluent Hoechst 33342, qui est permanent sur les cellules et peut être utilisé avec des cellules vivantes ainsi que des cellules fixes, et l'iodure de propidium, longtemps utilisé comme marqueur nucléaire pour la cytométrie en flux qui émet une fluorescence dans le rouge. Les colorants rouges lointains tels que Draq5 peuvent également être utilisés comme contre-colorant nucléaire.

La phalloïdine marquée par fluorescence peut être utilisée comme contre-colorant pour l'actine (Figure 7). Ce peptide cyclique isolé du champignon de la mort (Amanita phalloides) a une très grande affinité envers les filaments d'actine F. En raison de sa taille relativement petite et de sa stabilité chimique, les dérivés fluorescents sont extrêmement utiles pour identifier les filaments d'actine avec un marquage à haute densité du cytosquelette qui fournit un moyen pour l'évaluation de la morphologie cellulaire. Comme elles sont disponibles dans le commerce dans une multitude de couleurs différentes, elles peuvent être multiplexées avec plusieurs autres sondes cellulaires.

L'agglutinine de germe de blé (WGA) marquée par fluorescence peut être utilisée pour colorer les membranes cellulaires. La WGA est une protéine de liaison aux glucides qui reconnaît sélectivement les résidus d'acide sialique et de sucre N-acétylglucosaminyle qui se trouvent principalement sur les protéines de la membrane plasmique.

Contrairement aux anticorps, les contre-colorations n'ont généralement pas de réactivité croisée les unes avec les autres et peuvent souvent être combinées en une seule étape de processus - la seule limitation serait la compatibilité des tampons. Par exemple, les colorants de comptoir DAPI (5-10 &mug/mL) et phalloïdine (20 nM) peuvent être combinés dans un mélange de PBS 0,1% Triton X-100 à partir d'une solution mère concentrée, fraîchement préparée le jour de l'expérience. Une incubation de 10 minutes à température ambiante est suffisante pour colorer adéquatement les cellules de culture tissulaire fixées.

Figure 7. Cellules NIH 3T3 fixes exprimant la GFP contre-colorées avec de la phalloïdine marquée au DAPI et au Texas Red. Les cellules NIH3T3 cultivées dans des plaques à 96 puits ont été fixées au formaldéhyde puis contre-colorées avec du DAPI et de la phalloïdine marquée au rouge Texas. Les cellules ont été imagées avec un Cytation&trade 3 en utilisant des cubes de lumière DAPI, GFP et Texas Red.

La fixation et la coloration des lames ou des microplaques est un processus en plusieurs étapes avec un certain nombre d'ajouts de réactifs, d'étapes de lavage et d'incubations (Figure 8). Le traitement des lames ou des lamelles couvre-objet est généralement une opération à faible débit et peut généralement être accompli avec une opération manuelle. Les deux appareils peuvent être traités à l'aide de petits plats ou, dans le cas des lames, des pots Coplin dédiés peuvent être utilisés pour stocker les réactifs ou comme récipients pour les milieux de lavage. Les microplaques, en particulier les plaques à 96 et 384 puits avec des cellules, sont beaucoup plus faciles à automatiser. Étant donné que les microplaques ont une taille de puits, un espacement et une empreinte standardisés, l'automatisation peut être utilisée pour fournir l'ajout et le lavage des réactifs (aspiration et distribution). La petite taille des lamelles permet également de les placer dans les puits de plaques à faible densité (6 et 12 puits) pour le traitement avant de les faire adhérer à une lame.

Figure 8. Flux de travail automatisé pour l'ensemencement cellulaire, la fixation, la perméabilisation et le processus de coloration en trois couleurs. Un distributeur de laveurs combinés EL406&trade (BioTek Instruments) a été utilisé pour effectuer les étapes du processus de fixation cellulaire, de perméabilisation et de coloration avec trois couleurs (DAPI, colorant de phalloïdine Alexa-Fluor® 488 et anticorps secondaire marqué au rouge Texas) sont indiqués en rouge.

Le stockage des échantillons fixés et colorés peut varier en fonction de l'échantillon. Les échantillons sur lames (ou lamelles) peuvent être traités avec un support de montage et scellés pour un stockage à long terme. Le support de montage aide à préserver l'échantillon et augmente l'indice de réfraction, ce qui améliorera les performances avec les objectifs d'huile. Le milieu de montage contient souvent des agents ajoutés pour piéger les radicaux libres et réduire le photoblanchiment. Prolong Gold (Life Technologies) et Fluoromount&ndashG (SouthernBiotech) sont des exemples de supports de montage disponibles dans le commerce. Il est important de rincer la lame/la lamelle dans de l'eau distillée avant de sceller, car le sel du lavage PBS précipitera sous forme de cristaux en séchant. Après avoir collé la lamelle sur la lame, laissez la lame sécher pendant la nuit avant de sceller. Sceller les bords de chaque lamelle avec du vernis à ongles transparent ordinaire et laisser sécher pendant 3 minutes. Les cellules sont maintenant prêtes pour l'imagerie. Les lames doivent être conservées dans un récipient étanche à la lumière pour éviter le photoblanchiment. Cela fournira des préparations semi-permanentes qui dureront des mois si elles sont conservées dans l'obscurité.

Le stockage des microplaques est plus difficile. La petite taille et la profondeur du puits rendent presque impossible le scellement de l'échantillon à l'aide d'une lamelle couvre-objet. Les microplaques sont mieux conservées humides à 4 °C - du PBS avec 0,1% d'azoture de sodium peut être utilisé comme conservateur. Les plaques sont scellées avec un joint de plaque adhésif et les plaques sont enveloppées dans du papier d'aluminium. Bien qu'ils perdent de la résolution avec le temps, des images claires peuvent être obtenues après un mois de stockage.

Commentaires finaux

Il n'y a pas de procédure &ldquobest&rdquo pour l'immunocoloration et la contre-coloration des cellules fixées sur des lames ou des microplaques. Il existe de nombreuses méthodes pour fixer, perméabiliser et colorer les cellules, chacune avec ses forces et ses faiblesses. L'immunocoloration intracellulaire implique la détection de petites molécules sur les structures cellulaires intérieures en utilisant souvent des molécules beaucoup plus grosses, telles que des anticorps. Les structures doivent être stabilisées, tandis qu'en même temps, des trous doivent être ouverts dans des membranes suffisamment grandes pour permettre aux anticorps d'accéder à l'intérieur. Différents anticorps ont des affinités différentes et reconnaîtront souvent différents épitopes sur la même protéine, tandis que différentes méthodes de fixation exposeront ou masqueront différents épitopes dans la cellule. Bien qu'il n'existe pas de technique unique pour l'immunocoloration, il existe un certain nombre de techniques différentes qui peuvent être testées afin d'optimiser les résultats.


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