Informations

10.4 : Exercice 1 - Isolement plasmidique avec le kit ZyppyTM - Biologie

10.4 : Exercice 1 - Isolement plasmidique avec le kit ZyppyTM - Biologie



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Obtenir les cellules bactériennes porteuses de plasmides

1. Recueillez les trois cultures bactériennes attribuées à votre groupe. Les bactéries ont été transformées avec des plasmides contenant soit un S. cerevisiae MET gène, son S. pombe orthologue ou bactérien LacZ. Chaque culture contient 0,6 mL de milieu Luria Bertani (LB) avec 100 g/mL d'ampicilline. Les cultures ont été cultivées pendant la nuit à 37 degrés C et la densité cellulaire devrait être de 3 à 4 x 109 cellules/mL.

Quel est le but de l'ampicilline? Comment ça marche?

Lyse alcaline des cellules bactériennes abritant les plasmides

2. Ajouter 100 L de tampon de lyse 7X Blue Zyppy dans le tube. Mélanger le tampon et les cellules en retournant doucement le tube 4 à 6 fois. Sois gentil! Trop de stress mécanique pourrait fragmenter l'ADN chromosomique bactérien et contaminer votre préparation de plasmide. La solution devrait passer d'un bleu trouble à un bleu clair.

REMARQUE: Cette étape est urgente !! Passez à l'étape suivante dans les 2 minutes.

Séparer l'ADN plasmidique des protéines dénaturées et de l'ADN chromosomique

3. Ajouter 350 L de tampon de neutralisation Yellow Zyppy froid (avec ARNase A) dans le tube et bien mélanger le contenu en retournant plusieurs fois. La solution virera au jaune une fois la neutralisation terminée et un précipité jaunâtre se formera. Inverser l'échantillon 3 à 4 fois supplémentaires pour assurer une neutralisation complète. Assurez-vous qu'il n'y a plus de couleur bleue.

4. Centrifuger le mélange à vitesse maximale pendant 3 minutes pour éliminer les protéines dénaturées et l'ADN chromosomique. Notez que le tube contient un précipité blanc qui s'est accumulé sur un côté du tube. Le surnageant jaune pâle contient l'ADN plasmidique.

Purifier l'ADN plasmidique par adsorption sur une résine de silice.

5. À l'aide d'une pipette, transférez soigneusement le surnageant jaune pâle (~ 900 L) sur une colonne de centrifugation Zyppy. Attention à ne pas transférer le précipité jaune ! Étiquetez la colonne - PAS le tube de prélèvement que vous utiliserez à l'étape suivante.

6. Placer la colonne avec le tube de collecte attaché dans une centrifugeuse et faire tourner à vitesse maximale pendant ~ 1 minute.

7. Retirez la colonne et jetez le flux dans le tube de collecte.

8. Replacez la colonne dans le tube de prélèvement et ajoutez 200 L de solution Zyppy Endo-Wash. (Endo-Wash contient du chlorhydrate de guanidine et de l'isopropanol, qui élimineront les protéines dénaturées de la résine.)

9. Centrifuger pendant environ 1 minute et jeter le flux.

10. Replacez la colonne dans le tube de collecte puis ajoutez 400 L de tampon de lavage de colonne Zyppy. (Cette étape élimine les sels contaminants.) Centrifuger pendant environ 1 minute. Videz le tube collecteur.

11. Répétez l'étape de centrifugation pour éliminer tout éthanol résiduel.

Éluer l'ADN plasmidique

12. Transférer la colonne Zyppy dans un tube à centrifuger propre (et correctement étiqueté) de 1,5 ml, en laissant le couvercle du tube ouvert.

13. Avec précaution, ajouter 100 L de tampon d'élution directement sur le lit de la colonne blanche. Placez la pointe de la pipette aussi près que possible du lit de la colonne blanche sans la piquer. Distribuer lentement le tampon au-dessus du lit de résine.

14. Laisser le tampon s'infiltrer dans la colonne en laissant la colonne reposer dans le tube de microcentrifugation pendant 1 minute.

15. Centrifuger la colonne à vitesse maximale pendant 30 secondes. Encore une fois, il est bon de laisser le capuchon ouvert pendant cette rotation.

16. Retirez la colonne, bouchez le tube et placez-le sur de la glace. Ce tube doit maintenant contenir de l'ADN plasmidique. Étiquetez le tube. CONSERVEZ l'ADN pour de futures expériences.


Intégration des devoirs Internet dans un cours de laboratoire de biochimie/biologie moléculaire

L'un des principaux défis de l'éducation des étudiants de premier cycle est de leur faire découvrir Internet et de leur apprendre à l'utiliser efficacement dans le cadre de la recherche. À cette fin, un devoir Internet a été développé qui présente aux étudiants des sites Web liés à la recherche biomédicale au début d'un cours de laboratoire de biochimie/biologie moléculaire. Les sites de base introduits couvrent de nombreux sujets, notamment la recherche de séquences d'ADN spécifiques, la cartographie des enzymes de restriction, le repliement de l'ARN, l'analyse d'images de protéines tridimensionnelles et les recherches bibliographiques. Ces compétences Internet nouvellement acquises sont intégrées à d'autres aspects du cours de laboratoire. Dans l'exemple illustré ici, les élèves séquencent des inserts d'ADN à partir de colonies bactériennes choisies au hasard et préparées à partir d'une bibliothèque de plasmides d'ADNc humain. La séquence d'ADN obtenue est utilisée pour rechercher des bases de données en ligne introduites dans l'affectation Internet initiale afin de déterminer si les ADNc ont déjà été identifiés. Le module de séquençage « wet-lab », couplé au devoir Internet, offre aux étudiants une expérience dans quatre domaines. 1) purification de l'ADN plasmidique, 2) réalisation de digestions par endonucléase de restriction sur l'ADN plasmidique, 3) séquençage de l'ADN double brin, et 4) comparaison des données de séquence obtenues avec des séquences d'ADN connues dans la base de données du génome humain d'une manière qui simule une recherche vivre.

Préparer les étudiants de premier cycle en biochimie et en biologie moléculaire à des carrières productives au 21e siècle nécessite bien plus qu'un enseignement traditionnel en classe. Les étudiants ont besoin d'une expérience pratique pour poser des questions de recherche pertinentes et formuler des hypothèses viables. Les étudiants doivent également apprendre à trouver, comprendre et évaluer de manière critique les recherches déjà effectuées, ainsi qu'être en mesure d'accéder à des bases de données d'informations. Au cours des dernières années, ces informations sont devenues largement disponibles sur Internet. Les élèves doivent apprendre à utiliser Internet de manière efficace et efficiente dès que possible dans le processus éducatif.

L'un de mes objectifs d'enseignement a été d'organiser un cours qui permettrait aux étudiants d'apprendre à travailler dans un cadre de recherche et de pouvoir ensuite utiliser ces compétences pour travailler dans un laboratoire de recherche sur ou hors campus. À cette fin, j'ai développé Chem 486 (Nucleic Acid Laboratory voir Réf. 1 pour plus d'informations). L'une des premières missions confiées est d'utiliser Internet pour récupérer divers types d'informations concernant les gènes et les produits géniques. Divers laboratoires humides sont effectués tout au long du semestre. Dans l'exemple donné ici, un module d'enseignement en laboratoire humide est présenté dans lequel les étudiants apprennent les principes de la préparation et de la manipulation de l'ADN plasmidique, les principes de la bibliothèque d'ADNc et le séquençage de l'ADN. À l'aide des données obtenues du séquençage de l'ADN, les élèves recherchent dans la base de données du génome humain si l'ADNc séquencé a déjà été identifié. Le point principal de cet exercice est de montrer aux étudiants qu'ils peuvent générer des informations de séquence à partir de clones d'ADNc inconnus et utiliser les informations de séquençage pour rechercher des bases de données accessibles via Internet.


Introduction

Les protéines sont les éléments constitutifs de base de la vie, impliquées dans presque toutes les réactions biochimiques de la vie et sont considérées comme l'une des macromolécules les plus polyvalentes découvertes 1 . Les protéines peuvent fonctionner comme un catalyseur biologique (par exemple l'amylase), un moyen de transport (par exemple l'hémoglobine) ou même comme un composant structurel des échafaudages mécaniques (par exemple le muscle squelettique) d'un organisme. Les protéines contiennent une large gamme de groupes fonctionnels sur leurs monomères d'acides aminés. Les thiols, les thioéthers, les carboxamides, l'alcool et les acides carboxyliques sont tous couramment présents dans les molécules de protéines 2 . L'arrangement des groupes fonctionnels détermine généralement les propriétés finales de la protéine. Un groupe intéressant de protéines contient un grand nombre du groupe fonctionnel hydrophobe qui leur permet de former un motif protéique transmembranaire capable de transférer des signaux de la matrice extracellulaire dans le corps cellulaire (Fig. 1) 3 . Ceci est particulièrement important pour les cellules car cela facilite la détection de la présence d'un agent pathogène avant qu'une infection ne se produise 4 .

Le NBS et le LRR détectent les protéines effectrices des agents pathogènes. La protéine NBS-LRR possède également souvent un domaine TIR ou CC à son extrémité N-terminale important pour l'activation de la réponse immunitaire. L'infection par des agents pathogènes transfère des signaux à médiation protéique dans la cellule végétale qui active la protéine R et conduit à l'activation de l'immunité déclenchée par un effecteur. TIR, domaine CC de type récepteur Toll/interleukine-1, domaine en spirale NBS, site de liaison nucléotidique LRR, protéine R répétée riche en leucine, protéine de résistance. La figure a été reconstruite à partir de Spoel et Dong 3 .

La signification structurelle des protéines est incluse dans de nombreux matériels pédagogiques scientifiques. Dans les domaines de la chimie, de la biochimie et de la biologie moléculaire, les fonctions centrales de la structure des protéines sont souvent expliquées comme des concepts abstraits. Par conséquent, les élèves peuvent souvent avoir des difficultés à comprendre les concepts fondamentaux des protéines au-delà du concept couramment utilisé de « Serrures et clés » 5 . Une compréhension plus approfondie et une meilleure appréciation des concepts impliqués dans de nombreuses interactions protéine-protéine peuvent être obtenues en fournissant une expérience pratique 6 et en la reliant à des applications de recherche réelles.

Une application importante et pertinente dans le monde réel implique la détection et l'identification de motifs protéiques conservés qui sont en corrélation avec l'expression de gènes de résistance aux maladies dans les plantes cultivées. Il existe plusieurs structures de motifs qui sont responsables du système de transduction du signal des systèmes immunitaires des plantes 7, 8 . Cet article se concentre sur deux motifs protéiques conservés, le motif caractéristique du site de liaison des nucléotides (NBS) et le motif des répétitions riches en leucine (LRR). Les motifs NBS et LRR sont connectés en un complexe qui médie l'immunité déclenchée par les effecteurs chez les plantes (Fig. 1). Le motif NBS est responsable de l'activation des kinases dans les voies de transduction du signal 9 tandis que le domaine LRR fonctionne dans la liaison aux ligands et la reconnaissance des agents pathogènes des protéines de résistance 10 .

Les séquences globales parmi les membres de la famille des gènes de résistance (NBS-LRR) sont soumises à de nombreuses variations et n'ont pas pu être détectées directement par la technique d'hybridation croisée. Cependant, de courts segments de séquences protéiques dans le gène sont bien conservés entre la plupart des gènes de résistance 8, 9 . Ces motifs conservés permettent l'utilisation d'une technique basée sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour l'isolement d'analogues de gènes de résistance (RGA) à partir de plantes résistantes connues ou pour une utilisation comme marqueurs pour cribler le matériel de sélection pour les plantes potentiellement résistantes/sensibles. L'utilisation d'amorces dégénérées, qui sont un mélange d'amorces avec différentes substitutions sur des nucléotides sélectionnés ciblés sur le domaine NBS, est possible pour amplifier de nouveaux gènes NBS-LRR sur la base de l'homologie de séquence. Ici, nous rapportons un exercice de laboratoire complet englobant à la fois des techniques moléculaires et des programmes bioinformatiques pour l'analyse de séquences de protéines qui comprend l'isolement de l'ARN total, l'amplification par PCR de séquences d'ADNc ciblées correspondant aux motifs protéiques des gènes de résistance aux maladies des plantes et la visualisation sur gel d'agarose des amplicons PCR de le parent sauvage du poivre noir, Piper colubrinum.


AP Lab 3 Échantillon 3 Mitose

Lab 3 Mitose et méiose

Toutes les nouvelles cellules proviennent de cellules déjà existantes. De nouvelles cellules sont formées par caryocinèse - le processus de division cellulaire qui implique la réplication du noyau de la cellule et la cytokinèse - le processus de division cellulaire qui implique la division du cytoplasme. Deux types de division nucléaire comprennent la mitose et la méiose. La mitose se traduit généralement par de nouvelles cellules somatiques ou corporelles. La division cellulaire mitotique est impliquée dans la formation d'un organisme adulte à partir d'un œuf fécondé, la reproduction asexuée, la régénération et l'entretien ou la réparation de parties du corps. La méiose entraîne la formation de gamètes chez les animaux ou de spores chez les plantes. Les cellules formées ont la moitié du nombre de chromosomes de la cellule mère.

La mitose est mieux observée dans les cellules qui se développent à un rythme rapide, comme dans la blastula de corégone ou les extrémités des cellules de racine d'oignon. Les extrémités des racines contiennent une région de croissance spéciale appelée méristème apical où le pourcentage le plus élevé de cellules est en mitose. La blastula de corégone se forme immédiatement après la fécondation de l'œuf, une période de croissance rapide et de nombreuses divisions cellulaires où la mitose peut être observée.

Il y a plusieurs étapes incluses avant, pendant et après la mitose. L'interphase se produit juste avant qu'une cellule entre en mitose. Pendant l'interphase, la cellule aura un noyau distinct avec un ou plusieurs nucléoles, qui est rempli d'un fin réseau de fils de chromatine. Pendant l'interphase, la réplication de l'ADN se produit. Après la duplication, la cellule est prête à commencer la mitose. La prophase est lorsque la chromatine s'épaissit jusqu'à ce qu'elle se condense en chromosomes distincts. L'enveloppe nucléaire se dissout et les chromosomes sont dans le cytoplasme. Les premiers signes du fuseau contenant des microtubules commencent également à apparaître. Ensuite, la cellule commence la métaphase. Au cours de cette phase, le centromère de chaque chromosome s'attache au fuseau et est déplacé vers le centre de la cellule. Cette position de niveau est appelée la plaque métaphasique. Les chromatides se séparent et tirent vers les pôles opposés au début de l'anaphase. Une fois que les deux chromatides sont séparées, chacune s'appelle un chromosome. La dernière étape de la mitose est la télophase. A ce moment, une nouvelle enveloppe nucléaire se forme et les chromosomes se déroulent progressivement, formant le fin réseau de chromatine vu en interphase. La cytokinèse peut se produire en formant un sillon de clivage qui formera deux cellules filles lorsqu'elles seront séparées.

La méiose est plus complexe que les stades mitotiques et implique deux divisions nucléaires appelées Méiose I et Méiose II. Ils entraînent la production de quatre gamètes haploïdes et permettent une variation génétique en raison du croisement de matériel génétique. Avant le processus, l'interphase réplique l'ADN. Au cours de la prophase I, la première étape méiotique, les chromosomes homologues se déplacent ensemble pour former une tétrade et la synapsis commence également. C'est là que se produit le croisement, entraînant la recombinaison des gènes. Dans la métaphase I, les tétrades se déplacent vers la plaque métaphasique au milieu de la cellule comme lors de la métaphase mitotique. L'anaphase I ramène les tétrades à leur forme originale à deux brins et les déplace vers des pôles opposés. Au cours de la télophase I, le centriole est terminé et la cellule se prépare à une deuxième division. Dans la méiose II, dans la prophase II, les centrioles se déplacent vers les extrémités opposées du groupe chromosomique. Dans la métaphase II, les chromosomes sont centrés au centre de chaque cellule fille. L'anaphase II implique la séparation du centromère des chromatides. La télophase II se produit lorsque les chromosomes divisés se séparent en différentes cellules, appelées cellules haploïdes.

Sordaria fimicola, un champignon ascomycète, peut être utilisé pour démontrer les résultats du croisement pendant la méiose. Il passe la majeure partie de sa vie haploïde et ne devient diploïde que lorsque la fusion des mycéliums de deux souches différentes entraîne la fusion de deux types différents de noyaux haploïdes pour former un noyau diploïde. La méiose, suivie de la mitose, chez Sordaria entraîne la formation de huit ascospores haploïdes contenues dans un sac appelé asque. Ils sont contenus dans un périthèce, un organe de fructification, jusqu'à ce qu'ils soient suffisamment mûrs pour être libérés. L'arrangement des spores reflète directement si oui ou non le croisement a eu lieu. Si un asque a quatre ascospores beiges d'affilée et quatre ascospores noires d'affilée -4:4, alors aucun croisement n'a eu lieu. Si les asques ont des ascospores noires et feu dans des ensembles de deux agencements -2:2:2:2, ou deux paires d'ascospores noires et quatre ascospores beiges dans l'agencement -2:4:2, alors le croisement a eu lieu.

Les stades de la mitose peuvent être examinés dans la blastula de corégone et les extrémités des cellules de racine d'oignon à l'aide d'un microscope. Le processus de croisement et les étapes de la méiose ne se produisent que lors de la création de gamètes et de spores.

Le matériel nécessaire pour cet exercice est un microscope optique, des lames préparées de blastula de corégone, des pointes de cellules de racine d'oignon, un crayon et du papier.

Pour cette partie du laboratoire, les matériaux nécessaires sont un sac de billes de connexion codées par couleur et des centromères magnétisés, plusieurs plateaux et des étiquettes marquées interphase, prophase, métaphase, anaphase et télophase.

Exercice 3A.1 : Observer la mitose

Au cours de cette expérience, des lames préparées de blastula de corégone et de pointes de racines d'oignon doivent être observées sous les objectifs 10X et 40X d'un microscope optique. Une cellule à chaque stade de la mitose doit être identifiée et esquissée.

Exercice 3A.2 : Temps pour la réplication cellulaire

Dans cette section du laboratoire, utilisez l'objectif le plus puissant du microscope pour observer et compter chaque cellule dans le champ de vision. Les cellules doivent être comptées en fonction du stade de mitose dans lequel elles se trouvent. Au moins 200 cellules et 2 champs de vision doivent être examinés et comptés. Le pourcentage de cellules dans chaque étape est ensuite enregistré et le temps passé dans chaque phase est calculé.

Exercice 3B.1 : Simulation de la méiose

Pour cette partie de l'expérience, un kit de simulation chromosomique sera utilisé pour démontrer la méiose. Deux ensembles de deux brins avec chacun une couleur différente, sont connectés pour simuler la réplication de l'ADN dans les deux paires homologues, l'étape appelée interphase. Ensuite, les chromosomes ont été entrelacés pour représenter la synapsis au stade connu sous le nom de prophase. Des sections de billes ont été entrelacées entre les paires comme lors d'un croisement et alignées à l'équateur. Les perles de chaque paire échangent leurs places, représentant la métaphase. Ensuite, l'anaphase a été simulée en séparant les paires homologues des côtés opposés du plateau, ou en termes de « chromosomes », la cellule. Le fait de pousser les chromosomes dans deux cellules séparées, ou plateaux, imitait la télophase.

La méiose II a également été simulée. La prophase II est représentée par la séparation des deux billes, mais pas de véritable changement. Les chromosomes se déplacent à nouveau vers l'équateur pendant la métaphase II, et dans l'anaphase II, les deux chromatides sont séparées et déplacées vers des pôles opposés. La télophase II sépare les chromosomes en quatre cellules différentes.

Exercice 3B.2 : Traversée pendant la méiose à Sordaria

Des lames préparées de Sordaria fimicola ont été observées au microscope optique. Les asques ont été identifiés comme 4:4 ou asques montrant un croisement. Ces lectures ont été enregistrées. Le pourcentage de chacun et les unités de la carte ont été calculés.

Pourquoi est-il plus exact d'appeler la mitose "réplication nucléaire" plutôt que "division cellulaire" ? Il est plus précis de décrire la mitose comme une « réplication nucléaire » car la cellule ne se divise à aucune des étapes mitotiques. L'ensemble du processus de la mitose est une série d'étapes qui divise le noyau en deux noyaux séparés aux pôles opposés. Lorsqu'une cellule est vraiment divisée, le processus est connu sous le nom de cytokinèse.

Expliquez pourquoi la blastula de corégone et les pointes de racine d'oignon sont sélectionnées pour une étude de la mitose. La blastula est ce qui se forme directement après la fécondation et, par conséquent, la cellule se développe et de nombreuses phases peuvent être observées à ce moment-là. Les cellules de pointe de racine d'oignon sont également des spécimens qui incluent une grande quantité de croissance cellulaire et un pourcentage élevé de cellules éprouvant des activités mitotiques.

Tableau 1 : Nombre de cellules à chaque étape de la mitose et temps passé à chaque étape


Résultats

La Pbk a été identifiée comme une protéine clé pour la médiation de la prolifération des cellules bêta compensatoire induite par le HFD à l'aide d'un modèle murin dysfonctionnel de la Pbk kinase. Mécaniquement, le facteur de transcription JunD recrute la ménine et le complexe HDAC3 vers le promoteur Pbk pour réduire l'acétylation de l'histone H3, conduisant à une répression épigénétique de l'expression de Pbk. En bloquant pharmacologiquement l'interaction ménine-JunD, les inhibiteurs de la ménine (IM) ont augmenté la prolifération compensatoire des cellules bêta, entraînant à la fois une hyperglycémie et une tolérance au glucose améliorées chez les souris diabétiques induites par HFD, démontrant l'impact clé des IM sur l'influence de l'expression de la Pbk et de la prolifération des cellules bêta chez la souris des modèles.


Fond

Électrophorèse

Comme vous le savez du laboratoire de tyrosinase PAGE, l'électrophorèse est le processus de séparation des particules dans un champ électrique. Comme PAGE, presque toutes les formes courantes d'électrophorèse effectuent la séparation dans une matrice de gel semi-solide dans laquelle le gel est constitué d'une phase aqueuse (tampon) et d'une phase solide composée d'un polymère naturel ou artificiel (agarose, polyacrylamide, amidon, etc. ). La phase solide a deux rôles : (1) elle agit comme un "tamis" pour séparer les molécules selon une propriété physique ou chimique spécifique et (2) elle agit comme un "piège" pour empêcher les molécules séparées de se diffuser à la fin du traitement électrophorétique.

Dans un champ électrique E, une particule de charge q subit une force (F) de F = qE. C'est-à-dire qu'une molécule chargée négativement « ressentira » une force la poussant contre les lignes de champ électrique positives à négatives. Toute molécule chargée négativement migre vers l'extrémité « " " " ( " " " ( ) " (+) extrémité du champ, tandis que les molécules chargées positivement migrent vers l'extrémité « " " " " " (« cathode » (-)).

L'ADN étant chargé négativement, il migre vers l'anode. La vitesse à laquelle un fragment d'ADN particulier migre à travers un gel est déterminée par sa taille. Plus la molécule est grosse, plus elle a d'interaction avec la matrice de gel et plus elle se déplace lentement. Les petits objets glissent facilement à travers les pores du gel, tandis que les plus gros sont piégés et se déplacent plus lentement. La distance parcourue pendant une durée définie est inversement proportionnelle à la taille du fragment. La taille réelle des pores dans le gel influence la vitesse de migration et peut donc être ajustée en faisant varier la concentration de la matrice dans le gel. L'agarose, parce qu'il est sûr, efficace et facile à manipuler, est la matrice de choix pour les gels pour l'analyse de l'ADN de base.

Visualisation de l'ADN

Une fois l'électrophorèse terminée, l'ADN doit être coloré afin de visualiser les fragments de restriction séparés. La méthode la plus courante de coloration directe est l'incubation du gel dans une solution faible de bromure d'éthidium (EtBr). Ce composé a des maxima d'absorbance UV à 300 et 360 nm, et peut également absorber l'énergie des nucléotides excités à 260 nm. Cette énergie absorbée est réémise sous forme de fluorescence orange/jaune à 590 nm. Plus l'éclairage UV est proche de 260 nm, plus vous risquez d'endommager l'ADN. Éclairage

300 nm donne la fluorescence la plus forte, cependant, de nombreux chercheurs éclairent avec 360 nm pour protéger leur échantillon des dommages (360 nm donne une fluorescence considérablement plus faible). Les cations éthidium ont une affinité élevée pour la liaison à l'ADN. En leur présence, l'ADN ouvre dynamiquement un espace entre ses paires de bases en se déroulant. Le cation éthidium déroule l'ADN d'environ 26 & 176. L'ion s'insère dans une ouverture de 0,34 nm (3,4 Å) créée par ce déroulement qui est stabilisée par des interactions hydrophobes entre l'éthidium et les bases nucléotidiques (voir photo). Ce déroulement induit des modifications structurelles locales du brin d'ADN, telles que l'allongement du brin d'ADN ou la torsion des paires de bases. Ces modifications structurelles peuvent conduire à des changements fonctionnels, souvent à l'inhibition des processus de transcription et de réplication et de réparation de l'ADN, ce qui fait des intercalateurs de puissants mutagènes. Pour cette raison, les intercalateurs d'ADN sont généralement considérés comme cancérigènes et doivent être manipulés avec précaution.

Cartographie de restriction de l'ADN plasmidique

Un plasmide est une molécule d'ADN qui est séparée de l'ADN chromosomique et peut se répliquer indépendamment de celui-ci. Ils sont à double brin et, dans la plupart des cas, circulaires. Les plasmides sont généralement présents naturellement dans les bactéries, mais se trouvent parfois dans les organismes eucaryotes. La semaine dernière, nous avons mis en place un scénario hypothétique dans lequel les étiquettes ont déteint sur des tubes de E. coli chacun portant un plasmide que votre laboratoire utilise pour la recherche. Les quatre cartes de restriction plasmidiques possibles sont données ci-dessous (les images sont également disponibles sur la page principale de D2L).

Sur chaque carte, vous voyez les emplacements relatifs où différentes enzymes de restriction coupent. Les flèches indiquent les emplacements des caractéristiques génétiques importantes. "AmpR" exprime une protéine appelée bêta-lactamase, qui confère une résistance à l'ampicilline à la bactérie portant le plasmide. Le trait de résistance à l'ampicilline est utilisé pour sélectionner des bactéries contenant des plasmides qui se développent en présence de cet antibiotique. La région étiquetée "ori" est la E. coli « origine de réplication », une séquence à laquelle l'ADN polymérase se lie. L'origine de réplication est requise pour E. coli transmettre le plasmide aux cellules filles. Le gène "quotrop" exprime une petite protéine qui aide à maintenir un nombre élevé de copies d'environ 20 plasmides par cellule. Cette fonctionnalité garantit que nous sommes en mesure d'isoler plus d'ADN par cellule. Les autres caractéristiques expriment des protéines qui intéressent votre laboratoire dans ce scénario hypothétique. Ils ont été insérés dans les plasmides en utilisant les méthodes décrites dans Lehninger Section 9.1.

Regardez attentivement le différences entre les quatre plasmides. Nous utiliserons le modèle qui résulte de la réaction avec des enzymes de restriction pour identifier notre plasmide. À titre d'exemple, de ce que nous pouvons voir, les digestions par EcoRI ou AvaI vous donneront simplement un morceau de la taille du plasmide entier car il n'y a qu'un seul site de coupure pour chacun d'eux. Cependant, une double digestion avec EcoRI et AvaI vous permettra de distinguer pAB125 des autres. Le plasmide pAB125 donnera un gros fragment

4000 pb de longueur et un petit fragment

300 pb de longueur. En revanche, le plus petit fragment résultant d'une double digestion avec les trois autres plasmides serait un fragment clairement distinguable

La semaine dernière, vous avez effectué un isolement à petite échelle de l'ADN plasmidique. Cette semaine, vous allez cartographier les sites de restriction de quatre enzymes disponibles : EcoRI, AvaI, HincII, et Rsal. Vous utiliserez les longueurs des fragments d'ADN résultant de vos digestions de restriction pour cartographier leurs emplacements relatifs des sites sur le plasmide. Avec ces informations, vous identifierez votre plasmide "inconnu" parmi les quatre possibilités. Vous compléterez également la carte en attribuant des numéros de position aux sites.

Votre gel d'agarose aura un total de dix voies. Assurez-vous d'effectuer des contrôles appropriés sur chaque gel, y compris des digestions simples à comparer avec des digestions doubles ou des digestions doubles à comparer les unes aux autres. Plus vous avez de digests sur votre gel, plus vous obtiendrez d'informations en comparant directement les tailles de fragments. Vous générerez une courbe standard de tailles de fragments en exécutant un mélange d'échelle d'ADN sur chaque gel. Notre mélange d'ADN de référence sera "2-log DNA Ladder" (produit N32000 de New England Biolabs). Visitez le site Web du fabricant pour plus d'informations sur la composition de ce mélange d'ADN de référence (lien sur la page principale du D2L).

Enzymes endonucléases de restriction

Alors, qu'est-ce qu'une enzyme de restriction ? Ces enzymes sont des endonucléases (enzymes de dégradation des polynucléotides) qui reconnaissent une séquence d'ADN spécifique et introduisent des coupures double brin. Les chercheurs sont tombés sur ces enzymes en observant la croissance d'un virus bactériophage et ont constaté que sa croissance était "restreinte" dans certaines cultures bactériennes. Après enquête, ils ont découvert que dans ces cultures, les endonucléases dégradaient l'ADN viral non méthylé lors de l'entrée dans la cellule bactérienne, limitant la croissance des phages (d'où le nom d'enzyme de restriction). 1 La méthylation de l'ADN de la bactérie empêche les enzymes de détruire l'ADN de l'hôte, tout en leur permettant de cibler tout ADN étranger qui envahit la cellule.

Comme on peut le voir dans le tableau ci-dessus, il existe une multitude d'enzymes de restriction, chacune reconnaissant sa propre "séquence coupée". est le même pour les brins supérieur et inférieur). Dans le tableau ci-dessus, les flèches indiquent où l'enzyme de restriction clive la liaison phosphodiester dans le squelette de l'ADN, deux liaisons étant hydrolysées afin d'obtenir la coupe double brin. Les brins d'ADN coupés résultants peuvent soit former des extrémités franches (pas de bases non appariées) soit des extrémités collantes (plusieurs bases non appariées). Les extrémités collantes sont particulièrement utiles en raison de leur capacité à créer des liaisons hydrogène avec des séquences complémentaires digérées par la même enzyme. Comme nous le verrons plus tard, cela joue un rôle important dans le clonage d'ADN basé sur la restriction.

L'enzyme illustrée à droite, EcoRI, donne un aperçu de la nature palindromique des sites de reconnaissance de séquence. Les enzymes de restriction sont des homodimères, chaque sous-unité reconnaissant la même séquence d'ADN sur chaque brin. Les boules violettes de ce modèle sont des ions Mg 2+, qui, comme vous vous en souvenez la semaine dernière, sont essentiels pour stabiliser les charges négatives dans le complexe de réaction enzyme-ADN.

Clonage avec des enzymes de restriction

Ce n'est pas un euphémisme de dire que la découverte des enzymes de restriction a révolutionné la biochimie et la biologie moléculaire. Les progrès de la technologie de l'ADN ont rapidement suivi la découverte des enzymes de restriction : le clonage, l'analyse de la fragmentation de l'ADN et la cartographie de la restriction de l'ADN ne sont que quelques-unes des nombreuses applications des enzymes de restriction. 2

Le clonage implique la combinaison de deux ou plusieurs ensembles d'ADN en un seul morceau d'ADN recombinant. En termes de création de plasmides recombinants, les deux morceaux d'ADN sont généralement un squelette de vecteur (1) et un insert de gène (2). L'insert code pour la protéine, l'enzyme ou la fonction d'intérêt tandis que le squelette permet la transformation du plasmide en cellules bactériennes et la réplication du plasmide lors de la transformation.

Afin d'effectuer ce type de clonage, le vecteur et l'insert doivent être digérés avec la même enzyme(3). Cela produit des extrémités collantes à la fois sur le vecteur et sur l'insert qui se chevaucheront lorsqu'elles seront combinées. Les morceaux sont maintenus en place de manière lâche par ces extrémités collantes et sont ligaturés avec de l'ADN ligase, qui reforme les liaisons phosphodiester dans le squelette de l'ADN. Le plasmide ligaturé peut ensuite être transformé dans une cellule hôte (4), et se copiera en utilisant la machinerie de réplication de l'hôte (5).

Cette méthode peut sembler compliquée, mais elle peut être envisagée en termes assez simples. Les enzymes de restriction agissent comme des ciseaux moléculaires qui coupent les séquences d'ADN de deux sources ou plus. Les extrémités collantes générées à partir de ces coupes agissent comme un adhésif faible qui associe de manière réversible l'insert au vecteur. Enfin, l'ADN ligase agit comme un stratifié, scellant les deux morceaux d'ADN avec une liaison covalente qui ne peut pas être facilement inversée.

Analyse de la fragmentation de l'ADN et cartographie des plasmides

Une deuxième application pour les enzymes de restriction en biochimie est leur capacité à « cartographier » des segments d'ADN à travers leurs schémas de clivage. Des informations sur la taille et les emplacements relatifs des sites de coupure de restriction peuvent être trouvées en digérant l'ADN avec une série d'enzymes de restriction. L'exécution des produits d'une digestion par restriction d'ADN sur un gel d'électrophorèse permettra de visualiser les coupes, car la seule grande bande d'ADN se transformera en plusieurs bandes digérées plus petites. Cette cartographie est ce que vous effectuerez sur le plasmide inconnu dans Lab 8.

L'approche de la cartographie des plasmides sera abordée plus en détail dans la section Analyse des données.

À partir de l'image du gel, les longueurs des bandes peuvent être déterminées en mesurant la distance parcourue par chaque bande. Tout d'abord, les distances de migration des bandes d'échelle doivent être mesurées et tracées dans Excel par rapport aux 10 du nombre de paires de bases. L'image de gauche donne une indication sur la façon de mesurer les distances. Make sure you are consistent with your measurements (i.e. start at the bottom of each well, and end at the middle of each band).


Transduction and Analysis

Once you have generated a lentiviral stock with a suitable titer, you are ready to transduce the lentiviral construct into the mammalian cell line of choice and assay for expression of your recombinant protein. Guidelines are provided below.

Your lentiviral construct contains a deletion in the 3′ LTR that leads to self-inactivation of the lentivirus after transduction into mammalian cells. Once integrated into the genome, the lentivirus can no longer produce packageable virus.

Transient vs. Stable Expression

After transducing your lentiviral construct into the mammalian cell line of choice, you may assay for expression of your gene of interest in the following ways:

  • Pool a heterogeneous population of cells and test for expression directly after transduction (i.e. “transient” expression). Note that you must wait for a minimum of 48–72 hours after transduction before harvesting your cells to allow expressed protein to accumulate in transduced cells.
  • Select for stably transduced cells using Blasticidin or Zeocin, as appropriate. This requires a minimum of 10-12 days after transduction, but allows generation of clonal cell lines that stably express the gene of interest. Noter: We have observed stable expression of a target gene for at least 6 weeks following transduction and selection.

Determining Antibiotic Sensitivity for Your Cell Line

If you wish to select for stably transduced cells, you must first determine the minimum concentration of Blasticidin or Zeocin, as appropriate, required to kill your untransduced mammalian cell line (i.e. perform a kill curve experiment). If you titered your lentiviral construct in the same mammalian cell line that you are using to perform your stable expression experiment, then you may use the same concentration of Blasticidin or Zeocin for selection that you used for titering.

Multiplicity of Infection (MOI)

To obtain optimal expression of your gene of interest, you will need to transduce the lentiviral construct into your mammalian cell line of choice using a suitable MOI. MOI is defined as the number of virus particles per cell and generally correlates with the number of integration events and as a result, expression of your gene of interest. Typically, expression levels increase linearly as the MOI increases.

Determining the Optimal MOI

A number of factors can influence optimal MOI including the nature of your mammalian cell line (e.g. non-dividing vs. dividing cell type see Recommendation below), its transduction efficiency, your application of interest, and the nature of your gene of interest. If you are transducing your lentiviral construct into the mammalian cell line of choice for the first time, we recommend using a range of MOI (e.g. 0, 0.5, 1, 2, 5, 10) to determine the MOI required to obtain the optimal expression of your protein for your application.

In general, we have found that 80-90% of the cells in an actively dividing cell line (e.g. HT1080) express a target gene when transduced at an MOI of

1. Some nondividing cell types transduce lentiviral constructs less efficiently. For example, only about 50% of the cells in a culture of primary human fibroblasts express a target gene when transduced at an MOI of

1. If you are transducing your lentiviral construct into a non-dividing cell type, you may need to increase the MOI (e.g. MOI = 10) to achieve optimal expression levels for your recombinant protein.

Control lentiviral vectors expressing lacZ or EmGFP are available for optimization. If you have generated a lentiviral stock of a lacZ expression control (e.g. pLenti6/V5-GW/lacZ), we recommend using the stock to help you determine the optimal MOI for your particular cell line and application. Once you have transduced the control lentivirus into your mammalian cell line of choice, the gene encoding β-galactosidase or EmGFP will be constitutively expressed and can be easily assayed (refer to the expression vector or expression control vector manual for assay methods).

Viral supernatants are generated by harvesting spent media containing virus from the 293FT producer cells. Spent media lacks nutrients and may contain some toxic metabolic waste products. If you are using a large volume of viral supernatant to transduce your mammalian cell line (e.g. 1 ml of viral supernatant per well in a 6-well plate), note that growth characteristics or morphology of the cells may be affected during transduction. These effects are generally alleviated after transduction when the media is replaced with fresh, complete media.

You will need the following items:

  • Your titered lentiviral stock (store at –80°C until use)
  • Mammalian cell line of choice
  • Complete culture medium for your cell line
  • 6 mg/ml Polybrene, if desired
  • Appropriately sized tissue culture plates for your application
  • Blasticidin or Zeocin, as appropriate (if selecting for stably transduced cells)

Transduction Procedure

Follow the procedure below to transduce the mammalian cell line of choice with your lentiviral construct. Reminder: If you are performing Zeocin selection, remember that cells should not be confluent at the time of selection (see Step 6 below). Plate your cells accordingly.

  1. Plate cells in complete media as appropriate for your application.
  2. On the day of transduction (Day 1), thaw your lentiviral stock, and if necessary, dilute the appropriate amount of virus into fresh complete medium to obtain a suitable MOI. Keep the total volume of medium containing virus as low as possible to maximize transduction efficiency. DO NOT vortex.
  3. Remove the culture medium from the cells. Mix the medium containing virus gently by pipetting and add to the cells.
  4. Add Polybrene® (if desired) to a final concentration up to 10 μg/ml. Swirl the plate gently to mix. Incubate at 37° in a humidified 5% CO2 incubator overnight. Noter: If you are transducing cells with undiluted viral stock and are concerned about possible toxicity or growth effects caused by overnight incubation, it is possible to incubate cells for as little as 6 hours prior to changing medium.
  5. The following day (Day 2), remove the medium containing virus and replace with fresh, complete culture medium. Incubate at 37°C in a humidified 5% CO2 incubator overnight.
  6. The following day (Day 3), perform one of the following:
    • Harvest the cells and assay for expression of your recombinant protein if you are performing transient expression experiments.
    • Remove the medium and replace with fresh, complete medium containing the appropriate amount of Blasticidin or Zeocin™, as appropriate to select for stably transduced cells. Proceed to Step 7.

Integration of the lentivirus into the genome is random. Depending upon the influence of the surrounding genomic sequences at the integration site, you may see varying levels of recombinant protein expression from different antibiotic-resistant clones. We recommend testing at least 5 antibiotic-resistant clones and selecting the clone that provides the optimal expression of your recombinant protein for further studies.

Detecting Recombinant Protein

You may use any method of choice to detect your recombinant protein of interest including functional analysis, immunofluorescence, or western blot. If you have cloned your gene of interest in frame with an epitope tag, you may easily detect your recombinant protein in a western blot using an antibody to the epitope tag


Possibilités d'accès

Obtenez un accès complet au journal pendant 1 an

Tous les prix sont des prix NET.
La TVA sera ajoutée plus tard dans la caisse.
Le calcul des taxes sera finalisé lors du paiement.

Obtenez un accès limité ou complet aux articles sur ReadCube.

Tous les prix sont des prix NET.


Extending the small-molecule similarity principle to all levels of biology with the Chemical Checker

Small molecules are usually compared by their chemical structure, but there is no unified analytic framework for representing and comparing their biological activity. We present the Chemical Checker (CC), which provides processed, harmonized and integrated bioactivity data on

800,000 small molecules. The CC divides data into five levels of increasing complexity, from the chemical properties of compounds to their clinical outcomes. In between, it includes targets, off-targets, networks and cell-level information, such as omics data, growth inhibition and morphology. Bioactivity data are expressed in a vector format, extending the concept of chemical similarity to similarity between bioactivity signatures. We show how CC signatures can aid drug discovery tasks, including target identification and library characterization. We also demonstrate the discovery of compounds that reverse and mimic biological signatures of disease models and genetic perturbations in cases that could not be addressed using chemical information alone. Overall, the CC signatures facilitate the conversion of bioactivity data to a format that is readily amenable to machine learning methods.


Voir la vidéo: biologie synthetique ou comment programmer des bactéries (Août 2022).