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Les tissus colorés à l'hématoxyline/à l'éosine sont-ils utilisés pour la notation du cancer ?

Les tissus colorés à l'hématoxyline/à l'éosine sont-ils utilisés pour la notation du cancer ?



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Je suis une étudiante en ingénierie travaillant pour la première fois dans le domaine du cancer du sein. J'essaie d'apprendre le score du cancer du sein (par exemple le score Allred). J'ai rencontré 2 types d'images :

D'abord (soit A) :

Deuxième (soit B) :

Les images proviennent du site VitroVivo.

Ma confusion : Pour la notation du cancer du sein, l'image A est-elle utilisée ?

Ce que je pense comprendre : Dans le score du cancer (au sein), nous essayons de trouver un score. Par exemple, dans l'image B, nous avons des noyaux immunopositifs (bruns) et des noyaux immunonégatifs (bleus) et le rapport du brun au total est un indicateur. Ce noyau brun peut être Ki67, HER2, œstrogène, progestérone protéine/antigène. Mais dans les images colorées H&E, les noyaux sont séparés du cytoplasme. Il n'y a pas de noyaux positifs/négatifs, un seul type de noyau. Alors, y a-t-il un moyen d'utiliser les tissus colorés H&E pour la notation ?


Immunohistochimie et immunocytochimie

Contre-colorants pour l'immunocoloration enzymatique/chromogène

Hématoxyline est sans doute la contre-coloration nucléaire la plus couramment utilisée lors de l'utilisation d'un système de détection d'enzyme/chromogène. Il existe différentes formulations disponibles, classées selon le type de mordant utilisé et selon qu'elles sont progressives ou régressives. Tous donnent finalement aux noyaux cellulaires une agréable coloration bleue de teinte et d'intensité variables, selon le type d'hématoxyline utilisé.

L'hématoxyline seule (ou plus précisément son produit d'oxydation, l'hématine) est anionique et n'a donc pas beaucoup d'affinité pour l'ADN. Les mordants sont des sels de fer, à savoir ceux de fer, d'aluminium, de tungstène et de plomb. Les mordants se combinent avec l'hématine, ce qui donne un complexe colorant-mordant chargé positivement, lui permettant ainsi de se lier à la chromatine anionique. Les hématoxylines d'alun (aluminium mordancé) peuvent être utilisées de manière progressive ou régressive. Avec les hématoxylines progressives (telles que Mayer, Carazzi et Gill), les tissus ou les cellules sont incubés dans l'hématoxyline jusqu'à ce que le degré souhaité de coloration nucléaire soit atteint, avant d'être bleuis. En comparaison, dans le cas des hématoxylines régressives (telles que celles de Harris), les tissus ou les cellules sont incubés jusqu'à ce qu'un degré de surcoloration soit atteint, avant d'avoir une partie de l'excès d'hématoxyline éliminée par immersion dans une solution acide, telle que 1% d'alcool acide. Ce processus est connu sous le nom différenciation. Les hématoxylines progressives sont donc plus pratiques à utiliser que régressives, en raison de l'absence d'étape de différenciation et de la compatibilité qui en résulte avec les produits finaux enzyme/substrat solubles dans l'alcool, tels que ceux produits par HRP et AEC.

Qu'elles soient progressives ou régressives, une fois le niveau de coloration nucléaire souhaité atteint, les hématoxylines sont « bleuies ». A pH acide, les hématoxylines colorent les noyaux en rouge. Cependant, une fois exposée à un environnement alcalin, l'hématoxyline prend une agréable couleur bleue. L'eau courante du robinet est couramment utilisée à cette fin car elle a une alcalinité suffisante, en particulier dans les zones d'eau «dure». Dans les zones d'eau « douce », une solution alcaline appropriée peut être utilisée pour bleuir l'hématoxyline, telle que 0,05 % (v/v) d'ammoniac.

D'autres contre-colorations nucléaires tinctoriales couramment utilisées sont les noyaux de coloration vert clair, rouge rapide, bleu de toluidine et bleu de méthylène, respectivement vert, rouge ou bleu.

Une considération importante lors de l'utilisation d'une contre-coloration nucléaire est de ne pas rendre la coloration trop intense si vous démontrez un antigène nucléaire, car la contre-coloration peut potentiellement masquer le signal positif du système de détection.


Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine de coupes de tissus et de cellules

Les colorations à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) sont utilisées depuis au moins un siècle et sont toujours essentielles pour reconnaître divers types de tissus et les changements morphologiques qui constituent la base du diagnostic contemporain du cancer. La coloration est inchangée depuis de nombreuses années car elle fonctionne bien avec une variété de fixateurs et présente une large gamme de caractéristiques de matrice cytoplasmique, nucléaire et extracellulaire. L'hématoxyline a une couleur bleu-violet profond et colore les acides nucléiques par une réaction complexe et incomplètement comprise. L'éosine est rose et colore les protéines de manière non spécifique. Dans un tissu typique, les noyaux sont colorés en bleu, tandis que le cytoplasme et la matrice extracellulaire ont des degrés variables de coloration rose. Les cellules bien fixées présentent des détails intranucléaires considérables. Les noyaux présentent divers types de condensation de l'hétérochromatine (coloration à l'hématoxyline) spécifiques au type de cellule et au type de cancer qui sont très importants sur le plan du diagnostic. Coloration des nucléoles à l'éosine. Si des polyribosomes abondants sont présents, le cytoplasme aura une dominante bleue distincte. La zone de Golgi peut être identifiée provisoirement par l'absence de coloration dans une région à côté du noyau. Ainsi, la tache révèle des informations structurelles abondantes, avec des implications fonctionnelles spécifiques. Une limitation de la coloration à l'hématoxyline est qu'elle est incompatible avec l'immunofluorescence. Il est cependant utile de colorer une coupe en série de paraffine à partir d'un tissu dans lequel l'immunofluorescence sera effectuée. L'hématoxyline, généralement sans éosine, est utile comme contre-colorant pour de nombreuses procédures immunohistochimiques ou d'hybridation qui utilisent des substrats colorimétriques (tels que la phosphatase alcaline ou la peroxydase). Ce protocole décrit la coloration H & ampE des coupes de tissus et de cellules.


Aperçu général

La coloration de coupes de tissus à l'aide de colorants chimiques et biologiques est utilisée depuis plus d'un siècle pour visualiser divers types de tissus et les changements morphologiques associés au diagnostic contemporain du cancer. Cependant, la procédure de coloration demande beaucoup de travail, nécessite des techniciens qualifiés, est coûteuse et entraîne souvent la perte d'échantillons irremplaçables et retarde les diagnostics. En collaboration avec le Brigham and Women's Hospital (Boston, MA), nous décrivons une approche de « coloration informatique » pour colorer numériquement des photographies de biopsies tissulaires non colorées avec des colorants à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) pour diagnostiquer le cancer.

Notre méthode utilise des réseaux de neurones pour colorer rapidement des photographies de tissus non colorés, fournissant aux médecins des informations opportunes sur l'anatomie et la structure du tissu. Nous rapportons également un algorithme de « décoloration informatique » qui peut éliminer les colorants et les taches des photographies de tissus précédemment colorés, permettant la réutilisation des échantillons de patients.

Ces méthodes et réseaux de neurones aident les médecins et les patients grâce à de nouveaux processus informatiques au point de service, qui peuvent s'intégrer de manière transparente dans les flux de travail cliniques dans les hôpitaux du monde entier.


Résultats et discussion

Efficacité de l'iHE

Nous avons établi un système de coloration simple mais efficace (Fig. 1A). Les tissus ont été immergés dans une solution de colorant dans un tube à centrifuger, qui a été fixé dans un récipient en acier inoxydable. Un transducteur à ultrasons a été collé à la face inférieure d'un récipient en acier inoxydable et à un radiateur, qui a été utilisé pour refroidir le transducteur à ultrasons. Le conteneur en acier inoxydable a été rempli d'eau pour assurer une meilleure transmission des ultrasons. La puissance électrique maximale du transducteur à ultrasons était de 60 watts. Pendant le processus de coloration du tissu avec de l'hématoxyline ou de rinçage, nous avons ajusté la tension d'entrée de l'alimentation à ultrasons et contrôlé la densité de puissance acoustique dans le conteneur en acier inoxydable à 1,2

1,5 W/cm 2 . Lors de la coloration des tissus à l'éosine, la densité de puissance acoustique était de 0,8

En général, il est difficile de colorer uniformément les tissus intacts (Fig. 1C). Ici, nous avons utilisé deux moyens pour améliorer la teinture : la délipidation du DCM et les ultrasons. Le DCM est un solvant qui peut dissoudre facilement les lipides dans la membrane cellulaire 5,11,15,31. Une comparaison de la figure 1C-I avec la figure 1C-III montre que le cerveau traité avec la délipidation DCM pourrait être coloré plus profondément, probablement parce que le cerveau devient poreux et que la diffusion du colorant a tendance à être améliorée après la délipidation. Une comparaison de la figure 1C-III avec la figure 1C-IV montre que le cerveau coloré par ultrasons avait une coloration plus uniforme en un temps plus court. Sur la figure 1C-II, l'image montre que le tissu cérébral traité avec une délipidation DCM et coloré aux ultrasons pendant 6 h présentait une coloration uniforme à l'hématoxyline. En d'autres termes, la délipidation et les ultrasons étaient indispensables pour l'iHE, et les deux ont contribué aux résultats de la coloration. En comparant la figure 1C-II avec la figure 1C-III, nous avons également constaté que l'encéphalocèle du cerveau avec ultrasons et délipidation était plus grande que celle du cerveau sans ultrasons et délipidation, probablement en raison du rétrécissement du cerveau pendant la déshydratation et la délipidation.

Un autre effet des ultrasons était le rinçage accéléré (Fig. 1B). Des cerveaux de souris adultes présentant une délipidation ont d'abord été colorés à l'hématoxyline pendant 6 h, puis coupés à la ligne médiane. Une moitié a été rincée sous ultrasons, tandis que l'autre moitié a été rincée sans ultrasons. La température de rinçage était de 50°C. Pour obtenir l'absorbance de la solution de rinçage ultrasonore et de la solution de rinçage statique (contrôle), nous avons transféré la solution supérieure et mesuré l'absorbance à l'aide du spectromètre Lambda 950 UV/VIS à une longueur d'onde de 445 nm. Au fil du temps, l'absorbance de la solution de rinçage à ultrasons est devenue beaucoup plus élevée que celle de la solution de rinçage statique. Ainsi, le cerveau sous ultrasons a libéré plus de colorants que celui à l'état statique.

Comparaison de l'iHE avec la coloration H&E traditionnelle

L'échographie peut entraîner une rupture des tissus et des cellules, un problème non négligeable est donc de savoir si la structure cellulaire est détruite après l'iHE. Comme le montre la figure 2, nous avons constaté que la structure cellulaire était préservée sans distorsion significative par rapport à celle de la coloration H&E traditionnelle. Les effets de coloration de l'iHE et de la coloration H&E traditionnelle sont similaires, indiquant que l'iHE est une méthode réalisable. Les fibres nerveuses périsomatiques montrées sur la figure 2D sont moins nombreuses que celles de la figure 2A, probablement parce que la cytomembrane a été partiellement dissoute après la délipidation. Pour évaluer davantage le sacrifice de la structure subcellulaire, nous avons comparé 100 noyaux de neurones du cortex à l'aide des méthodes H&E et iHE, mais nous n'avons trouvé aucune différence significative entre ces deux méthodes (données non présentées).

Comparaison de la coloration iHE et H&E traditionnelle. (A–C), Images de tranches de cerveau de souris de 7 m d'épaisseur colorées à l'aide de la méthode traditionnelle H&E. (D–F), Images de tissus cérébraux de souris intacts après coloration iHE, tranchage et imagerie 2D. La matière rouge apparaissant dans (UNE

F) représente les cellules sanguines qui n'ont pas été complètement éliminées pendant la perfusion cardiaque. Objectif, 20× N.A., distance de travail 0,75, 1 mm. Barre d'échelle : 50 m.

Cerveau de souris intact coloré avec iHE

Un cerveau de souris C57BL/6 intact a été coloré avec iHE, et les images de la figure 3 montrent que le cerveau a été coloré uniformément. L'hippocampe était distinguable et la morphologie des noyaux cellulaires était claire (Fig. 3D-F). Ainsi, nous avons pu acquérir des informations de coloration H&E pour un cerveau de souris en fonction de son contexte spatial naturel. Une encéphalocèle du cerveau était apparente (Fig. 3C).

Tranches d'un cerveau de souris intact coloré avec iHE, suivi d'une imagerie 2D. (UNE) Projection 3D de 20 tranches en (B). (B) Les tranches du plan coronal du cerveau de la souris C57BL/6 après iHE. Objectif, 4× et 20× N.A., 0,2 et 0,75. Le cerveau a été tranché au niveau du plan coronal sur 8 m, et nous avons sélectionné une tranche tous les 400 m du bulbe olfactif à l'épencéphale. (F) Grossissement de (C).

Autres tissus de souris intacts colorés avec iHE

Pour générer un modèle de métastase hépatique, nous avons injecté des cellules cancéreuses mammaires 4T-1 à des souris BALB/c âgées de 7 semaines, élevé les souris pendant 40 jours et perfusé les souris à l'âge de 3 mois. Ensuite, le foie a été coloré et des tranches ont été préparées pour une imagerie ultérieure à l'aide de la microscopie Nikon NIS-Elements. Les résultats sont présentés sur la figure 4A-C. Dans l'image, la ligne pointillée noire est utilisée pour diviser la zone tumorale et la zone normale, et les résultats montrent que le rapport nucléaire-cytoplasmique de la zone tumorale était différent de celui de la zone normale. Les poumons, les reins, l'estomac, la patte avant, le cœur et les globes oculaires de la souris ont été colorés à l'aide d'iHE (figures 4D-G et S4A-H). Le lobe pulmonaire et les alvéoles, structures pulmonaires classiques, peuvent être observés sur les Fig. 4D,E. Les tubules rénaux sont clairement présentés sur les Fig. 4F,G. L'estomac de la souris a été coloré et les villosités du pylore sont illustrées sur la figure supplémentaire 4G,H. La structure musculaire classique de la patte avant de la souris a été révélée après iHE, et la microstructure de la peau a également été observée (Fig. supplémentaire S4A,B). Le cœur est un organe composé de cardiomyocytes, et les types de cellules de la chambre et du myocarde ont été clairement observés (Fig. supplémentaire S4C, D). Nous avons également appliqué iHE aux globes oculaires de souris, et la stratification cellulaire de la rétine a pu être observée (Fig. supplémentaire S4E, F).

Images d'autres tissus de souris colorés avec iHE. (UNEC) Images de foie de souris avec une tumeur. (,E) iHE pour poumon de souris. (F,g) iHE pour le rein de souris. Objectif, 20× N.A., distance de travail 0,75, 1 mm.

Compatibilité de l'iHE avec la coloration des vaisseaux sanguins

La croissance des cellules cancéreuses est associée à des changements importants dans les vaisseaux sanguins 30 . Comme discuté ci-dessus, la coloration H&E est un moyen classique de présenter les détails d'une tumeur. Ici, nous avons combiné la coloration H&E avec la coloration des vaisseaux sanguins (Fig. 5) pour observer simultanément les informations sur les vaisseaux sanguins et les noyaux cellulaires. Cette méthode de double coloration a le potentiel de fournir des informations significatives sur l'état de la tumeur.

Cerveau de souris perfusé avec de l'encre de carbone avant iHE. (UNE,B) Hippocampe, (B) est le grossissement de la boîte dans (UNE). (C,) Thalami, () est le grossissement de la boîte dans (C). Objectif, 20× N.A., distance de travail 0,75, 1 mm.

Le principe de l'iHE est illustré à la figure 6. Après la délipidation du DCM, la cytomembrane est partiellement dissoute et le tissu devient poreux 25 . Nous supposons que les ultrasons provoquent une cavitation stable (densité d'énergie ultrasonore <10 Watt/cm 2 ). Les pores du tissu peuvent changer de diamètre dans le champ ultrasonore car les ultrasons sont une onde longitudinale. Semblable à un ressort qui s'étire et se comprime en raison d'une force externe, le tissu est étiré et comprimé au niveau microscopique. Ainsi, les pores de la crête des ondes des ultrasons sont étirés, tandis que les pores du creux des ondes sont comprimés 26,32,33. Pendant ce temps, avec l'onde ultrasonore, il y a une compression et une raréfaction périodiques dans le liquide. Ainsi, le transfert de masse dans et hors du tissu est facilité 34 . Par conséquent, la diffusion entraînée par la différence de concentration dans les particules est accélérée dans le champ ultrasonore et les colorants se diffusent plus rapidement dans les tissus.

Principe possible de l'iHE. Un tissu fixe est utilisé comme tissu d'origine. Après déshydratation, le tissu est soumis à une délipidation, suivie de la procédure de coloration H&E. Le processus de coloration H&E a été simplifié afin que le lecteur puisse mieux comprendre le principe de l'implication des ultrasons dans le processus. Le dichlorométhane peut provoquer un état poreux de la membrane cellulaire, égal à l'état poreux du tissu. Les pores du tissu changent dans le champ ultrasonore car les ultrasons sont une onde longitudinale. Ainsi, les pores de la crête des ondes des ultrasons sont étirés, tandis que les pores du creux des ondes sont comprimés. Pendant ce temps, le mouvement aléatoire des particules est amélioré dans le champ ultrasonore. Le processus de diffusion est amélioré et permet d'obtenir une coloration rapide et uniforme.

Dans l'ensemble, la méthode iHE crée un tissu poreux pour la coloration et améliore le mouvement aléatoire. Par conséquent, le processus de diffusion est amélioré et permet d'obtenir une coloration H&E rapide et uniforme. Nous avons établi un ensemble de méthodes (iHE) pour obtenir des informations de coloration H&E de tissus intacts pour l'imagerie de volume. L'échographie a été utilisée pour faciliter la coloration du tissu de la monture entière, et sa capacité à améliorer le rinçage a été évaluée quantitativement. En conséquence, cette méthode peut classer le stade d'invasion de la tumeur en fonction de sa limite 3D naturelle et mieux élucider les métastases tumorales à grande échelle sur la base d'un modèle murin. iHE était également compatible avec la coloration des vaisseaux sanguins, ce qui implique que nous pourrions obtenir simultanément la coloration H&E et les informations sur les vaisseaux sanguins pour un seul tissu. Ainsi, nos résultats fournissent un nouvel outil pour étudier les métastases tumorales et l'infiltration dans un modèle murin. En outre, les ultrasons sont prometteurs pour faciliter d'autres types de traitement des tissus biologiques, tels que la compensation optique, l'immunomarquage et la coloration chimique des tissus intacts.


3. RÉSULTATS

3.1 Wndchrm-analyse basée sur la morphologie dans les tissus cancéreux non cancéreux et gastriques

Pour évaluer quantitativement la morphologie biologique des conditions cellulaires et tissulaires, nous avons effectué une analyse d'apprentissage automatique en utilisant le wndchrm algorithme et mesures d'images spécifiques (Figure 1A). Des ensembles de données d'images ont été construits conformément au diagnostic pathologique, en utilisant des puces à ADN tissulaires dérivées de patients atteints d'adénocarcinome de l'estomac humain. Cinquante-quatre images de tissus colorées H&E de 1360 × 1024 pixels ont été collectées pour chaque classe : Non cancéreux, Grade 1 (bien différencié), Grade 2 (modérément différencié) et Grade 3 (peu différencié) (Figure 1B, Figure S1A et Tableau S1). Brièvement, wndchrm extrait des caractéristiques d'image de toutes les images de chaque classe définie et entraîné un classificateur pour discriminer entre les classes à l'aide d'ensembles de données d'apprentissage. Les performances de classification ont ensuite été validées avec des images de test sélectionnées au hasard, où ces étapes ont été effectuées automatiquement. Nous avons effectué 20 analyses de validation croisée parmi les cancers non cancéreux et les grades 1-3 du cancer gastrique (Figure 1A, la gauche). Comme première étape de l'analyse, nous avons examiné le nombre optimal d'images nécessaires pour une classification efficace. Les résultats ont montré que la valeur de la précision de la classification (CA) s'améliorait avec l'augmentation du nombre d'images d'entraînement (figure S1B), tandis que celle des erreurs types diminuait comme souvent dans les analyses d'apprentissage automatique. 31 La meilleure classification a été trouvée avec 54 images d'entraînement à CA 0,78 (le CA maximum est peut-être 1,0), et cette valeur CA était nettement plus élevée que la classification aléatoire à CA 0,25. En outre, les similitudes relatives entre les classes ont été visualisées avec des dendrogrammes (figure 1C). De plus, en utilisant 20 images dans chaque classe, nous avons confirmé la similitude de classification entre le non-cancer, la gastrite chronique et les grades 1-3 (Figure S1C). La performance du test de classification était suffisante, car sa spécificité et sa sensibilité pour discriminer les grades de cancer des tissus non cancéreux étaient respectivement de 100 % et de 92 % (tableau S2, supérieur). Pour une évaluation supplémentaire des caractéristiques morphologiques, nous avons divisé chaque classe en deux sous-classes et mesuré le degré de dissemblance des grades 1 à 3 à partir de tissus non cancéreux, comme indiqué par la distance morphologique (MD) (figure 1D). Le MD de Non-cancer_1 a montré une similitude avec Noncancer l_2 et une dissemblance avec les tissus cancéreux de trois grades. De plus, lorsque les images étaient en mosaïque numérique (voir Méthodes), le nombre d'images d'entraînement augmentait, mais la vue d'ensemble des tissus était perdue. Cependant, les valeurs CA sont restées en grande partie inchangées à 0,79-0,69 en utilisant ces images en mosaïque (Figure S1D), suggérant que la morphologie locale ainsi que la vue d'ensemble histologique sont des indicateurs pour faire la distinction entre les tissus non cancéreux et cancéreux.

Nous avons ensuite effectué des comparaisons binaires détaillées entre des échantillons non cancéreux et chaque grade de cancer gastrique pour évaluer l'efficacité de wndchrm en utilisant chacune des 54 images qui ont montré des valeurs CA suffisantes (Figure S1E). Les analyses de la courbe ROC ont vérifié l'exactitude des classifications, car les AUC étaient de 0,99, 0,98 et 0,99 pour les non-cancéreux par rapport aux grades 1, 2 et 3, respectivement (l'AUC maximale est de 1,0, contrairement à l'assignation aléatoire de 0,5) (Figure 1E). Des listes représentatives de caractéristiques d'image informatives dans chaque test de classification ont été indiquées en fonction des scores de discrimination relatifs de Fisher (figure 1F). De nombreux ensembles de caractéristiques d'image ont été couramment utilisés pour discriminer les grades 1, 2 et 3 des non-cancer (r > 0,7), bien que certaines caractéristiques distinctes aient également été impliquées (données non présentées). Nos résultats ont montré que wndchrm les analyses ont récapitulé fortement les examens pathologiques basés sur l'homme des images H&E des tissus cancéreux.

3.2 Wndchrm-L'analyse basée sur l'analyse révèle les caractéristiques informatives des images colorées H&E

Pour comprendre quelles caractéristiques morphologiques contribuent à la classification des grades non cancéreux et cancéreux, nous avons déconvolué numériquement les images H&E RVB (rouge, vert, bleu) en canaux d'hématoxyline et d'éosine en niveaux de gris (figure 2A). 30 Les noyaux cellulaires et les composants cytoplasmiques sont généralement colorés à l'hématoxyline et à l'éosine, respectivement. 4, 10 À l'aide des images déconvoluées pour les non-cancer et les grades 1 à 3, comme illustré à la figure 2B et à la figure S2, nous avons mesuré l'AC parmi les non cancéreux et les grades 1 à 3 (figure 2C). Les tests de validation croisée des images d'hématoxyline et d'éosine ont indiqué des valeurs CA équivalentes (0,72 et 0,69, respectivement). La sensibilité et la spécificité étaient également élevées à 82 % à 98 % (tableau S2, seconde en partant du haut), suggérant que les images d'hématoxyline et d'éosine contiennent des caractéristiques morphologiques faisant la distinction entre les tissus cancéreux et non cancéreux.

Une liste typique de caractéristiques d'image informatives dans le test de classification a été créée en fonction des scores de discrimination relatifs de Fisher et a montré des similitudes globales (figure 2D). La valeur du coefficient de corrélation de Pearson était faible entre les images d'hématoxyline et d'éosine (r = 0,55), suggérant la présence de caractéristiques morphologiques uniques dans l'une ou l'autre image. De manière cohérente, les DM de Non-cancer_1 dans les images d'hématoxyline et d'éosine ont montré une dissemblance entre les tissus non cancéreux et cancéreux dans une mesure similaire (Figure 2E, F). Ainsi, wndchrm les analyses impliquaient la présence de caractéristiques informatives dans les images colorées à l'hématoxyline et à l'éosine des tissus cancéreux.

3.3 Caractérisation de la morphologie nucléaire dans les tissus cancéreux gastriques

Notre analyse de classification des images colorées à l'hématoxyline a indiqué que les morphologies nucléaires sont distinctes dans les cancers non cancéreux et gastriques (grades 1-3), comme le montrent les valeurs CA (figure 2C). Pour évaluer la morphologie nucléaire, nous avons mesuré deux caractéristiques de la zone du noyau et de l'intensité totale (figure 1A, droit). À l'aide d'un logiciel d'analyse d'image (Cellomics CellInsight), chaque région de mesure a été détectée avec une taille fixe de 1024 × 1024 pixels à partir d'images de tissus d'origine (figure 3A). En comptant >12 000 noyaux, nous avons constaté que la zone nucléaire était significativement plus grande dans les tissus cancéreux, par rapport aux tissus non cancéreux (figure 3B), et que l'intensité du signal était également plus élevée dans les cellules cancéreuses (figure 3C). Parce que les noyaux étaient densément distribués et se chevauchaient parfois dans les tissus cancéreux, probablement en raison d'activités de croissance élevées, nous avons ensuite tenté de mesurer cette caractéristique, en utilisant la zone nucléaire qui était continuellement colorée à l'hématoxyline. Nous avons configuré le logiciel pour reconnaître la zone positive à l'hématoxyline qui était plus grande que le seuil défini (13 200 pixels), comme le montre la figure 3D. La zone avec des noyaux groupés était présente en évidence dans les grades 1 et 2 des cancers gastriques, mais à peine dans le grade 3 (Figure 3E,F). Les statistiques récapitulatives pour la zone et l'intensité totale sont présentées dans le tableau S3, indiquant que la morphologie nucléaire est un paramètre avantageux pour la classification du cancer.

3.4 Les niveaux d'expression de l'ATF7IP/MCAF1 nucléaire sont corrélés avec les images H&E

Il a été rapporté que divers facteurs nucléaires 37, 38 et facteurs membranaires/solubles 39, 40 sont impliqués dans la morphologie des cellules et des tissus. Nous avons ensuite étudié les liens biologiques entre l'expression moléculaire et les caractéristiques morphologiques dans les tissus cancéreux gastriques, en utilisant une analyse basée sur des marqueurs moléculaires ou une analyse factuelle.

Pour examiner comment les images H&E peuvent être classées en fonction de l'expression moléculaire, nous avons choisi deux protéines associées au cancer : ATF7IP/MCAF1 nucléaire et PD-L1 membranaire (Figures 4 et 5). ATF7IP/MCAF1 est un facteur épigénétique impliqué dans la formation de l'hétérochromatine et la régulation des gènes, qui est fréquemment surexprimé dans divers types de tumeurs, y compris les cancers gastriques. ATF7IP/MCAF1 fonctionne soit pour la répression génique basée sur la méthylation de l'ADN, soit pour l'activation génique médiée par le facteur de transcription Sp1. 36 D'autre part, la PD-L1 est généralement produite par les cellules cancéreuses pour échapper à la surveillance immunitaire et constitue une cible moléculaire pour l'immunothérapie anticancéreuse. 41-43 Le rapport précédent montrait que le PD-L1Le promoteur du gène est régulé par la méthylation de l'ADN ou la liaison Sp1 dans les cellules cancéreuses. 44, 45 Il est possible que ATF7IP/MCAF1 contrôle PD-L1 expression via Sp1, comme indiqué par les données publiées ChIP-seq du cancer du côlon (Figure S3A).

Nous avons effectué à la fois la coloration H&E et l'IHC en utilisant des coupes en série de tissus (tableau S4). Après que les tranches de section aient été faites à partir d'un bloc de paraffine et colorées, nous avons soigneusement aligné manuellement les images H&E avec les images IHC (Figure S3B-D). Nous avons sélectionné 32 sites à partir d'images H&E (chacune 1360 × 1024 pixels) et les images IHC correspondantes pour l'expression ATF7IP/MCAF1. Le tissu du cancer gastrique et les régions non cancéreuses adjacentes ont montré une expression élevée et faible d'ATF7IP/MCAF1, respectivement (Figure 4A, Figure S3E, F). Les niveaux de signaux IHC ont été confirmés par la quantification de leurs signaux (figure 4B). Sur la base des niveaux d'expression d'ATF7IP/MCAF1, nous avons ensuite classé les images H&E en utilisant wndchrm à une expression faible et élevée de cette protéine (CA 0,95-1,00, ce qui montre une grande précision, quel que soit le nombre d'images) (Figure S3G), suggérant que les tissus cancéreux gastriques testés peuvent être clairement divisés en ces deux classes. De plus, la sensibilité et la spécificité des signaux ATF7IP/MCAF1 étaient respectivement de 100 % et 98 % (tableau S2,seconde à partir du bas). Pour évaluer le CA entre les classes basses et élevées d'ATF7IP/MCAF1, nous avons organisé des sous-classes dans les images H&E (Low 1, Low 2, High 1 et High 2). Low 2 avait une similitude avec Low 1, mais une différence significative avec High 1 (Figure 4C). De plus, l'alignement des scores relatifs de Fisher a indiqué une faible corrélation entre les deux comparaisons (figure 4D, r = 0,44), suggérant la présence de différences de caractéristiques. De plus, chaque MD de Low 1 dans l'espace des caractéristiques et le dendrogramme ont montré une dissemblance morphologique entre les classes basses et élevées d'ATF7IP/MCAF1 (Figure 4E, F). Celles-ci suggèrent que les niveaux d'expression de cette protéine sont corrélés avec la morphologie des tissus.

3.5 Les niveaux d'expression de PD-L1 cytoplasmique sont corrélés avec les images H&E

Nous avons en outre étudié si l'expression de la protéine membranaire PD-L1 dans le cancer est liée à la morphologie des tissus. Nous avons de nouveau effectué la coloration H&E et l'IHC avec des anticorps anti-PD-L1, en utilisant des coupes en série de puces à ADN tissulaires dans des échantillons de cancer gastrique (figure 5A et tableau S5). Nous avons quantifié les niveaux de signal IHC de la coloration PD-L1, regroupés en expression faible et élevée de cette protéine, et avons en outre créé des ensembles de données de l'image H&E correspondante (1360 × 1024 pixels) (Figure 5B, Figure S4A, B). De plus, nous avons évalué le score de proportion de tumeur (TPS) en comptant les cellules colorées positivement dans 100 cellules par image et avons constaté que PD-L1 High présentait un TPS significativement plus élevé, tandis que PD-L1 Low avait un TPS très faible (Figure S4C). Les images H&E ont été classés comme PD-L1 faible et élevé, à CA 0,86 en utilisant 60 images (Figure S4D). La sensibilité et la spécificité des signaux PD-L1 étaient respectivement de 88 % et 84 % (tableau S2, inférieur). Nous avons confirmé la dissemblance morphologique entre les sous-classes PD-L1 Low et High, comme le montre l'AC (Figure 5C). Les scores discriminants relatifs de Fisher des caractéristiques de l'image suggèrent la présence de caractéristiques responsables de la dissemblance (Figure 5D, r = 0,59). Chaque MD de Low 1 dans l'espace des caractéristiques et le dendrogramme ont montré des dissemblances morphologiques entre les classes Low et High de PD-L1 (Figure 5E, F).

Collectivement, ces résultats ont indiqué que l'expression d'ATF7IP/MCAF1 et de PD-L1 est corrélée aux caractéristiques des tissus, suggérant que l'apparence spatiale des protéines associées au cancer reflète les informations morphologiques des tissus pathologiques.


Classification des images microscopiques d'histologie du cancer du sein coloré à l'hématoxyline et à l'éosine à l'aide de l'apprentissage par transfert avec EfficientNets

Le cancer du sein est une maladie mortelle et l'une des principales causes de décès chez les femmes dans le monde. Le processus de diagnostic basé sur le tissu de biopsie n'est pas trivial, prend du temps et est sujet à des erreurs humaines, et il peut y avoir des conflits sur le diagnostic final en raison de la variabilité interobservateur. Des systèmes de diagnostic assisté par ordinateur ont été conçus et mis en œuvre pour lutter contre ces problèmes. Ces systèmes contribuent de manière significative à augmenter l'efficacité et la précision et à réduire le coût du diagnostic. De plus, ces systèmes doivent être plus performants pour que leur diagnostic déterminé soit plus fiable. Cette recherche étudie l'application de l'architecture EfficientNet pour la classification des images histologiques du cancer du sein colorées à l'hématoxyline et à l'éosine fournies par l'ensemble de données ICIAR2018. Plus précisément, sept EfficientNets ont été affinés et évalués sur leur capacité à classer les images en quatre classes : carcinome normal, bénin, in situ, et carcinome invasif. De plus, deux techniques standard de normalisation des taches, Reinhard et Macenko, ont été observées pour mesurer l'impact de la normalisation des taches sur les performances. Le résultat de cette approche révèle que le modèle EfficientNet-B2 a donné une précision et une sensibilité de 98,33 % en utilisant la méthode de normalisation de coloration de Reinhard sur les images d'entraînement et une précision et une sensibilité de 96,67 % en utilisant la méthode de normalisation de coloration de Macenko. Ces résultats satisfaisants indiquent que le transfert de caractéristiques génériques d'images naturelles vers des images médicales par le biais d'un réglage fin sur EfficientNets peut obtenir des résultats satisfaisants.

1. Introduction et contexte

L'une des principales causes de décès chez les femmes dans le monde est le cancer du sein [1]. Elle est définie comme un groupe de maladies dans lesquelles les cellules du tissu mammaire s'altèrent et se divisent de manière incontrôlée, entraînant généralement des grumeaux ou des excroissances. Ce type de cancer commence souvent dans les glandes lactiques ou les canaux reliant ces glandes au mamelon. Aux premiers stades de la maladie, la petite tumeur qui apparaît est beaucoup plus facile à traiter efficacement, évitant la progression de la maladie et diminuant les taux de morbidité, c'est pourquoi le dépistage est crucial pour une détection précoce [2].

Le processus de diagnostic du cancer du sein commence par la palpation, la mammographie périodique et l'examen d'imagerie par ultrasons. Les résultats de ces procédures indiquent si des tests supplémentaires sont nécessaires. Si un cancer est suspecté chez un patient, une biopsie est réalisée et du tissu pour analyse microscopique est obtenu afin qu'un pathologiste puisse procéder à un examen histologique du tissu extrait pour confirmer le diagnostic [2, 3]. Une fois la biopsie terminée, le tissu est analysé en laboratoire. Le processus de préparation des tissus doit commencer par la fixation au formol et, après cela, l'inclusion dans des coupes de paraffine. Les blocs de paraffine sont ensuite tranchés et fixés sur des lames de verre. Malheureusement, des structures intéressantes telles que le cytoplasme et les noyaux dans le tissu ne sont pas encore apparentes à ce stade. Le manque de clarté dans le tissu nécessite une coloration du tissu afin que les structures puissent devenir plus visibles. Typically, a standard and well-known staining protocol, using hematoxylin and eosin, is applied. When added to the tissue, the hematoxylin can bind itself to deoxyribonucleic acid, which results in the nuclei in the tissue being dyed a blue/purple color. On the other hand, the eosin can bind itself to proteins, and, as a result, other relevant structures such as the stroma and cytoplasm are dyed a pink color. Traditionally, after staining, the glass slide is coverslipped and forwarded to a pathologist for examination [4]. Routinely, the expert gathers information on the texture, size, shape, organization, interactions, and spatial arrangements of the nuclei. Additionally, the variability within, density of, and overall structure of the tissue is analyzed. In particular, the information concerning the nuclei features is relevant for distinguishing between noncarcinoma and carcinoma cells. In contrast, the information concerning the tissue structure is relevant for distinguishing between in situ and invasive carcinoma cells [5].

The noncarcinoma class consists of normal tissue and benign lesions these tissues are nonmalignant and do not require immediate medical attention. In situ and invasive carcinoma, on the other hand, are malignant and become continuously more lethal without treatment. Spécifiquement, in situ carcinoma refers to the presence of atypical cells that are confined to the layer of tissue in the breast from which it stemmed. Invasive carcinoma refers to the presence of atypical cells that invades the surrounding normal tissue, beyond the glands or ducts from where the cells originated [2]. Invasive carcinoma is complicated to treat, as it poses a risk to the entire body [3]. This threat means that the odds of surviving this level of cancer decreases as the progression stages increase. Moreover, without proper and adequate treatment, a patient’s in situ carcinoma tissue can develop into invasive carcinoma tissue. Therefore, it is of paramount importance that biopsy tissue is examined correctly and efficiently so that a diagnosis can be confirmed and, subsequently, treatment can begin. Examples of histology images belonging to each of these classes are shown in Figure 1.

The task of performing a practical examination on the tissue is not simple and straightforward. On the contrary, it is rather time-consuming and, above all, prone to human error. The average diagnostic accuracy between professionals is around 75% [6]. These issues can result in severe and fatal consequences for patients who are incorrectly diagnosed [7].

The advancement of image acquisition devices that create whole slide images (WSI) from scanning conventional glass slides has promoted digital pathology [8]. The field of digital pathology focuses on bringing improvement in accuracy and efficiency to the pathology practice [9] by associating histopathological analysis with the study of WSI [8].

An excellent solution to address the limitations of human diagnosis is computer-aided diagnosis (CAD) systems, which are developed to automatically analyze the WSI and provide a potential diagnosis based on the image. These systems currently contribute to improving efficiency and reducing both the cost of diagnosis and interobserver variability [5, 10]. Even though current CAD systems that operate at high sensitivity provide relatively good performance, they will remain a second-opinion clinical procedure until the performance is significantly improved [10].

Recently, deep learning approaches to the development of CAD systems have produced promising results. Previous attempts to classify breast cancer histology images using a combination of handcrafted feature extraction methods and traditional machine learning algorithms required additional knowledge and were time-consuming to develop. Conversely, deep learning methods automate this process. These systems allow pathologists to focus on difficult diagnosis cases [11].

Hence, to ensure early diagnosis in breast cancer candidates, increase treatment success, and lower mortality rates, early detection is imperative. Although the advent of and advancements in computer-aided systems have benefited the medical field, there is plenty of room for improvement.

1.1. Research Problem

In general, the shortage of available medical experts [12], the time-consuming quest to reach a final decision on a diagnosis, and the issue of interobserver variability justify the need for a system that can automatically and accurately classify breast cancer histopathology images. Previous approaches to this problem have been relatively successful considering the available data and return adequate classification accuracies but tend to be computationally expensive. Thus, this work will explore the use of seven lightweight architectures within the EfficientNet family [13]. Since the EfficientNet models were designed to optimize available resources, while maintaining high accuracies, a CAD system that performs at the level of the current state-of-the-art deep learning approaches, while consuming less space and training time, is desirable. Transfer learning techniques have become a popular addition to deep learning solutions for classification tasks. In particular, many state-of-the-art approaches utilize fine-tuning to enhance performance [14]. Therefore, this research explores the application of seven pretrained EfficientNets for the classification of breast cancer histology images. Furthermore, the addition of stain normalization to the preprocessing step will be evaluated. Hence, the primary question that this research will answer is, “Can fine-tuned EfficientNets achieve similar results to current state-of-the-art approaches for the application of classifying breast cancer histology images?”

1.2. Research Contributions

In this research, the application of seven versions of EfficientNets with transfer learning for breast cancer histology image classification is investigated. The proposed architecture was able to effectively extract and learn the global features in an image, such as the tissue and nuclei organization. Of the seven models tested, the EfficientNet-B2 architecture produced superior results with an accuracy of 98.33% and sensitivity of 98.44%.

The key takeaway from this investigation is that the simple and straightforward approach to using EfficientNets for the classification of breast cancer histology images reduces training time while maintaining similar accuracies to previously proposed computationally expensive approaches.

1.3. Paper Structure

The remainder of the paper is structured as follows: Section 2, the literature review, provides details on previous successful approaches. Section 3, the methods and techniques, provides insight into the framework followed in this study. Section 4, the results, provides details of the results that were obtained during the research. Finally, section 5 elaborates on the insights of this work and concludes the paper.

2. Literature Review

Currently, computer-aided diagnosis (CAD) systems occupy the position of aiding physicians during the process of diagnosis, by easing their workload and reducing the disagreement that stems from the subjective interpretation of pathologists. However, the performance of these systems must be enhanced before they can be considered more dependable than a second-opinion system [10].

2.1. Traditional Approaches

In the traditional approach, expert domain knowledge is required so that the correct features may be handcrafted this is a time-consuming endeavor. Nevertheless, the approach yields acceptable results on the datasets used. For instance, Kowal [15] used multiple clustering algorithms to achieve nuclei segmentation on microscopic images. Segmentation made it possible to extract microscopic, textural, and topological features so that classifiers could be trained and images could be classified as either benign or malignant. The accuracy of patient-wise classification was in the range of 96–100%. It is worth noting that this method performs poorly when an image contains overlapping nuclei or a small number of nuclei. In this case, either the approach fails to identify the nuclei or the clustering algorithms could return unreliable results. Therefore, in order to attain an acceptable detection accuracy, a large number of sample images are required. Hence, it is evident that accurate nuclei segmentation is not a straightforward task this can also be attributed to the variability in tissue appearance or the presence of clustered or tightly clumped nuclei [5].

An alternative approach is utilizing information on tissue organization as in the work by Belsare et al. [16], which presents a framework to classify images into malignant and nonmalignant. Firstly, segmentation was done using spatio-color-texture graphs. After that, statistical feature analysis was employed, and classification was achieved with a linear discriminant classifier. The choice of this classifier considerably impacted the outcome of this approach, as the result outperformed the use of k-nearest-neighbor and state vector machine classifiers, especially for the detection of nonmalignant tissue. Accuracies of 100% and 80% were achieved for nonmalignant and malignant images, respectively.

2.2. Deep Learning Approaches

The increase in the availability of computing power has led to the emergence of advanced architectures called convolutional neural networks (CNNs). Contrary to the conventional approach, no expert domain knowledge is required to define algorithms for segmentation, feature extraction, and classification, but instead expert knowledge is needed to annotate the dataset for a CNN to achieve superior results. Instead, these networks can automatically determine and extract discriminative features in an image that contribute to the classification of the image. Generally, a CNN will use a training set of images to learn features that are unique to each class so that when a similar feature is detected in an unseen image, the network will be able to assign the image to a class with confidence.

2.2.1. Convolutional Neural Network Approaches

The success of convolutional neural networks (CNNs) with general computer vision tasks motivated researchers to employ these models for classifying histopathology images. For the classification of hematoxylin and eosin-stained breast cancer histology images, both Araújo et al. [5] and Vo et al. [17] used the Bioimaging 2015 dataset [18] and classified the images into four classes (normal, benign, in situ, and invasive) and two groups (carcinoma and noncarcinoma). The former work [5] proposes a CNN that can integrate information from multiple histological scales. The process begins with stain normalization via the method proposed by Macenko et al. [19] in a bid to correct color discrepancies. After that, 12

overlapping patches were extracted from each image. The chosen size of the patches ensures that no relevant information is lost during extraction and, therefore, every patch can be appropriately labeled. Then, data augmentation was used to increase the number of images in the dataset. Finally, a patch-wise trained CNN and a fusion of a CNN and support vector machine classifier (CNN + SVM) were used to determine the patch class probability. Image-wise classification was attained through a patch probability fusion method. The evaluation showed that using majority voting strategy as the fusion method produced the best results. Considering all four classes, patch-wise classification with the CNN achieved an accuracy rate of 66.7%, while the CNN + SVM achieved an accuracy rate of 65%. The image-wise classification achieved higher results at 77.8% accuracy for both classifiers. With only two classes, patch-wise accuracy for the CNN was 77.6%, and for the CNN + SVM, the approach yielded 76.9% accuracy. The image-wise classification for the 2-class task produced the best results at 80.6% for the CNN and 83.3% for the CNN + SVM. The reason for the lower patch-wise classification is that images may contain sections of normal-looking tissue. Since during patch generation the extracted patches inherit the image’s label, this may confuse the CNN. The increase in image-wise classification accuracy is due to the fusion method that is applied. The authors also recorded the sensitivity rates for each of the classes. It is worth noting that overall, for image-wise classification, the approach was more sensitive to the carcinoma class than the noncarcinoma class. This outcome, although not ideal, is preferable since the architecture that was proposed focuses on correctly classifying the carcinoma (malignant) instances [5].

The approach taken by Vo and Nguyen [17] proposed a combination of an ensemble of deep CNNs and gradient boosting tree classifiers (GBTCs). Stain normalization via Macenko et al. [19] and data augmentation were the initial steps of the process. Unlike the standard data augmentation method of rotating and flipping images, the proposed method [17] incorporates reflection, translation, and random cropping of the images. The normalized and augmented data was then used to train the proposed architecture. Specifically, three deep CNNs (Inception-ResNet-v2) were trained using three different input sizes:

. Then, visual features were extracted and fed into GBTCs, which increased classification performance. The majority voting strategy was used to merge the outputs of the GBTCs, resulting in a much more robust solution. Recognition rates of 96.4% for the 4-class classification and 99.5% for the 2-class classification were reported. This result surpasses state-of-the-art achievements. An interesting note is that the authors added global average pooling layers in place of dense (fully connected) layers, and this did not negatively impact the accuracy of the ensemble. Similar to Araújo et al. [5], the authors of this work recorded the sensitivities of their approach. The results indicate that, for the 4-class task, the proposed method struggles with the classification of the in situ instances, while the other three classes have incredibly high sensitivities. For the 2-class task, the approach yields a 100% sensitivity on carcinoma instances and 98.9% on noncarcinoma instances. These results indicate that the approach was able to successfully learn both local and global features for the multiclass and binary classification. However, the downfall of this approach is the computational expense.

2.2.2. Convolutional Neural Network with Transfer Learning Approaches

For the TK-AlexNet proposed by Nawaz et al. [3] to classify breast cancer histology images, the classification layers of the AlexNet architecture were replaced with a single convolutional layer, and a max-pooling layer was added before the three fully connected layers with 256, 100, and 4 neurons, respectively. The input size of the proposed network [3] was increased to 512 512. The transfer learning technique used in this application was to fine-tune the last three layers on the ICIAR2018 dataset after having the entire network trained on the ImageNet dataset. The images were stain-normalized with the method proposed in Macenko et al. [19]. An interesting fact is that the authors compared the performance of the model with both non-stain-normalized and stain-normalized images and concluded that using the latter resulted in a gain in performance. After that, data augmentation techniques such as mirroring and rotation were applied, and overlapping patches of size were extracted from each image. Hence, there was a total of 38400 images generated. Evaluation of the model was done using a train-test split of 80%–20%.

The image-wise accuracy reported in [3] was 81.25%, and the patch-wise accuracy was 75.73%. A noteworthy observation is that the normal and benign classes were classified with 85% sensitivity however, the in situ and invasive carcinoma classes were classified with 75% sensitivity. For a model to be practical as a second-opinion system, it should ideally have a higher sensitivity to the carcinoma class given the dangers of misdiagnosis.

For this classification task, the Inception-ResNet-v2 was used by Ferreria et al. [20]. The classification layers of the base model were replaced by a global average pooling layer, a dense (or fully connected) layer with 256 neurons, a dropout layer with a dropout rate of 0.5, and a final dense layer of 4 neurons. Moreover, the input size of the network was changed to . Reshaping the images does not significantly impact the form of the cellular structures however, it does reduce computational cost [20]. The authors did not incorporate stain normalization into their experiments. Data augmentation techniques such as image flips (horizontal and vertical), a 10% zoom range, and shifts (horizontal and vertical) were used to increase the dataset. These particular techniques were chosen with care because if the augmentation causes too much distortion, the anatomical structures in the image could be destroyed [20], and this may result in the network having difficulty extracting discriminative features during training.

Two forms of transfer learning were used in this experiment. At first, only the dense (fully connected) layers of the model were trained. This technique is referred to as feature extraction since the network is using pretrained features (from ImageNet) to classify the breast cancer histology images. The result of this step is that only the weights of the dense layers were adjusted. This aids in overfitting [20]. Afterwards, a certain number of layers were unfrozen so that the network could be fine-tuned. Early stopping with a patience of 20 epochs, and a checkpoint callback monitoring minimum validation loss were the additional techniques implemented to avoid overfitting. The dataset was randomly split into 70% training, 20% validation, and 10% testing. The test set achieved an accuracy of 90%.

In a study by Kassani et al. [21], five different architectures (Inception-v3, Inception-ResNet-v2, Xception, VGG16, and VGG19) were investigated for the classification of the ICIAR2018 dataset. Two stain normalization methods were observed in this study: Macenko et al. [19] and Reinhard et al. [22]. Data augmentation included vertical flips, contrast adjustment, rotation, and brightness correction. The data was split into 75% and 25% for training and testing, respectively. The images were resized to pixels with the help of bicubic interpolation. For each of the models, features were extracted from specific blocks, particularly the layer after a max-pooling layer. The extracted features were put through a global average pooling layer and then concatenated to form a feature vector which was fed into an MLP (multilayer perceptron) set with 256 neurons for final classification. Of these models, the modified Xception network trained with Reinhard stain-normalized images performed the best, with a reported accuracy score of 94%. Overall, the Xception architecture performed the best for both of the stain normalization methods, and the Reinhard [22] technique produced higher accuracies than Macenko [19]. The other architectures ranked in the following order: Inception-v3, Inception-ResNet-v2, VGG16, and VGG19. Interestingly, the approximate parameters for these architectures are 23 million, 54 million, 138 million, and 143 million, respectively. One could hypothesize that an increase in parameter count translates to a decrease in accuracy of this dataset. This indicates that the bigger architectures may have more difficulty extracting critical features from training images, even if measures are taken to enlarge the dataset being used. The results of this study also emphasize the benefit of incorporating stain normalization into preprocessing and how choosing the correct method improves accuracy significantly. Table 1 shows a comparison summary of related deep learning techniques in the literature.


Histopathology-driven artificial intelligence predicts TMB-H colorectal cancer

IMAGE: A representative microscopic image of the hematoxylin and eosin (H&E) stained tumor mutational burden-high colorectal cancer tumor. Digital information from such this neoplastic and also non-neoplastic images is transformed and. Voir plus

Credit: Niigata University

Niigata, Japan - Biomarkers are important determinants of appropriate and effective therapeutic approaches for various diseases including cancer. There is ample evidence pointing toward the significance of immune check point inhibitors (ICI) against cancer, and they showed promising clinical benefits to a specific group of patients with colorectal cancer (CRC). Several reports demonstrated the efficacy of biomarkers such as programmed death-1 protein ligand (PD-L1), density of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), and tumor mutational burden (TMB), to determine the patient responsiveness for the efficient use of ICIs as therapeutics against cancer.

A high level of TMB (TMB-H), which reflects elevated total number of non-synonymous somatic mutations per coding area of a tumor genome and normally derived from gene panel testing, is recognized as a promising biomarker for the ICI therapies of various solid cancers. However, in clinical practice, it is not feasible to perform gene panel testing for all cancer patients.

In addition, the studies of Dr. Shimada group also provided means to predict TMB-H CRC only by using the TIL information from the H&E slides from the patients' tumor tissues. However, considering that the patients in the studied cohort were not treated with any ICIs, no conclusions could be drawn regarding their ICI responsiveness following the TMB-H diagnosis and it was suggested that future clinical trials need to be conducted to address whether TIL alone can be useful as a predictive biomarker for the efficacy of ICIs. Dr. Shimada says about the present study: "We have developed artificial intelligence to predict genetic alterations in colorectal cancer by deep learning using hematoxylin and eosin slides. This artificial intelligence is important in solving the cost problems associated with genetic analysis and facilitating personalized medicine in colorectal cancer."

Overall, the studies by Dr. Shimada and associates provide a cost and time effective and reliable method to inform the clinicians if the CRC patient they are managing can benefit from Immune Checkpoint Inhibitor (including inhibitors of the PD-1 protein and its ligand, PD-L1) therapy, without implicating the use of gene panel.

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HER2 Molecular Marker Scoring Using Transfer Learning and Decision Level Fusion

In prognostic evaluation of breast cancer, immunohistochemical (IHC) marker human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) is used for prognostic evaluation. Accurate assessment of HER2-stained tissue sample is essential in therapeutic decision making for the patients. In regular clinical settings, expert pathologists assess the HER2-stained tissue slide under microscope for manual scoring based on prior experience. Manual scoring is time consuming, tedious, and often prone to inter-observer variation among group of pathologists. With the recent advancement in the area of computer vision and deep learning, medical image analysis has got significant attention. A number of deep learning architectures have been proposed for classification of different image groups. These networks are also used for transfer learning to classify other image classes. In the presented study, a number of transfer learning architectures are used for HER2 scoring. Five pre-trained architectures viz. VGG16, VGG19, ResNet50, MobileNetV2, et NASNetMobile with decimating the fully connected layers to get 3-class classification have been used for the comparative assessment of the networks as well as further scoring of stained tissue sample image based on statistical voting using mode operator. HER2 Challenge dataset from Warwick University is used in this study. A total of 2130 image patches were extracted to generate the training dataset from 300 training images corresponding to 30 training cases. The output model is then tested on 800 new test image patches from 100 test images acquired from 10 test cases (different from training cases) to report the outcome results. The transfer learning models have shown significant accuracy with VGG19 showing the best accuracy for the test images. The accuracy is found to be 93%, which increases to 98% on the image-based scoring using statistical voting mechanism. The output shows a capable quantification pipeline in automated HER2 score generation.


Discussion

One limitation of percutaneous image-guided ablation when compared with surgery is the lack of pathologic evidence that the target lesion was completely ablated with sufficient tumor-negative margins. Most studies indicate that positive surgical margins have been associated with a higher risk of local recurrence and shorter overall survival (28,29), a conclusion that has been verified in recent studies performed in the context of modern preoperative chemotherapy (30,31).

Similarly, after RF ablation, the minimal ablation margin is a factor associated with local tumor control (23,32–35). Treatment effectiveness is routinely assessed with postprocedural imaging (US, CT, or MR imaging) to evaluate if the intended ablation margin has been reached, and if it has not, to direct further treatment (23,36,37). Several methods have been proposed for precise calculation of the ablation margin, including fusion imaging (32) and use of anatomic intrahepatic landmarks (23). All of these methods suffer from differences when comparing images from scans performed at different times. Despite progress in fusion and registration software, limitations of these techniques still present a challenge when attempting accurate calculation of the margin of the ablation zone around a previously treated tumor (23,32). Despite the use of these imaging modalities, incomplete tumor treatment and LTP remain common after RF ablation (7–10).

The sole use of imaging in the assessment of ablation margins presumes that the entire depicted ablation zone contains necrotic or nonviable cells however, few studies have validated image findings with tissue characteristics after ablation. In the early radiologic-pathologic correlation study performed by Goldberg et al (38), imaging failed to depict peripheral residual untreated tumor foci, even in four of five cases in which initial tumor and ablation zone sizes were identical. Par ailleurs, (une) prior studies performed to evaluate tissue collected from the electrodes used for ablation and (b) our study, in which we preformed direct assessment of the ablation zone with biopsy, show that viable tumor cells may be present within the ablation zone, even when postprocedural imaging displays sufficient ablation margins and findings compatible with radiographic technical success (12,13,16). It appears that these incompletely treated viable tumor cells within the ablation zone “escape” the spatial resolution of available anatomic and functional imaging modalities. In addition, the assessment of tissue examinations in the ablation zone introduces an objective tool with which to assess ablation effectiveness. This assessment is less vulnerable to operator variability and technical limitations, such as those described in the assessment and calculation of the ablation margin (23), and it may be easier to reproduce. Nevertheless, biopsies and sampling errors can also occur, and residual tumor may not be detected in some cases. This can explain the few recurrences seen in our study even after negative biopsy results and sufficient margins were obtained.

Histopathologic examination of tumors excised immediately after RF ablation has shown regions of altered cellular morphology within the treated volume that do not correspond to coagulative necrosis or classic tumor cell appearance (38). These areas may represent either (une) cells in the early stages of irreversible apoptosis or coagulative necrosis or (b) viable cells maintaining their proliferative potential, allowing them to replicate once the cellular insult is removed (21,22). Thus, it is prudent to further interrogate such cells with available immunohistochemical staining for cytosolic and mitochondrial enzyme activity, especially in the immediate postprocedural setting. Days after RF ablation, the evolution of intracellular cascades leads to more pronounced cellular changes in the direction of irreversible apoptosis or necrosis that can be evaluated with standard hematoxylin-eosin staining (38,39). However, immunohistochemical staining has been considered superior to hematoxylin-eosin staining in the diagnosis of irreversible cellular damage up to 24 weeks after RF ablation, as noted in an earlier study by Morimoto et al (39).

An interesting and unique finding of our study is that immunohistochemistry did not alter the initial classification based on the interpretation of the morphologic (hematoxylin-eosin) stain. All 16 ablation zones containing tumor cells were also positive for Ki-67, OXP, or both. This observation differs from observations in previous studies in which ablated tissue was assessed and in which immunohistochemistry was considered necessary to determine viability and changed specimen classification in two (13%) of 15 cases (12,13). It is possible that this finding represents the acquired experience of study pathologists at our institution in the evaluation of ablated tissue, and it potentially justifies the future investigation of the utility of immediate postablation frozen sections and morphologic assessment to document complete tumor cell necrosis.

Viability of tissue adherent to electrodes was analyzed in a study by Snoeren et al (16), who used the autofluorescence method and glucose-6-phosphate diaphorase staining. They concluded that viable tissue was an independent risk factor for LTP . Despite the different methods used to document viability, the incidence of viable tissue in the Snoeren et al study (29.2%) was slightly greater than that in our study (24%) and in the prior studies by Sofocleous et al (19.1%) (12,13). This observation, in combination with the fact that viability in all studies was an independent predictor of LTP , may indicate that both methods of tissue evaluation possess similar efficacy.

Our study had several limitations. The most important factor limiting the weight of our conclusions was the relatively small number of enrolled patients (m = 47). In addition, pathologic evaluation with biopsies from the center and the margin of the ablation zone does not yield information about necrosis within the entire treated lesion volume, as opposed to the evaluation of resected tumors and their surgical margins. Moreover, specimens were classified as Ki-67 positive even if the evaluated tissue was only slightly positive at immunostaining. Estimation of the labeling percentage of the target CLM was not performed, thereby precluding investigation of any potential correlation between the level and grade of proliferation (Ki-67 positivity) and time to LTP . Another limitation of our study was that the minimal margin analyzed as a predictor for time to LTP was evaluated by using 4–8-week postablation CT images, while the presumed minimal margin targeted with biopsy was estimated by using CT images obtained immediately after ablation. That was a rough estimate suited to the time limitations of the procedure however, for this study, accurate estimation and recording of the minimal margin (using CT landmarks) was performed by using CT images obtained 4–8 weeks after RF ablation, as previously described in detail (23). Software capabilities with fusion of the preablation tumor with the ablation zone are currently under development and are evolving. This will enable accurate calculation of the margin during or immediately after ablation and at subsequent time points. As indicated in our work, a positive viable tumor biopsy had a strong and significant prognostic value, as it was an early biomarker of local tumor recurrence and ablation failure. The addition of biopsy of the ablation zone introduces a more objective and reproducible significant predictive assessment of the ablation zone rather than relying on the imaging findings and margin assessment alone.

Avancées des connaissances

■ Ablated tumors with posttreatment biopsies containing tumor cells positive for Ki-67 or OxPhos antibodies are 3.4 times more likely to recur (P = .008).


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