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Compter correctement les colonies

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J'utilise la gélose au rose bengale cloramfenicol pour la recherche de levures et de moisissures à inclure dans le pétri plat. Quelle est la méthode correcte pour le comptage ? Je ne sais pas si je compte tout ou seulement le plus gros ?


oui il faut compter chaque individu colonie.

Cependant, dans la pratique, la question est plus de savoir ce qui est considéré comme une assiette comptable et quelle est son importance. Dans de nombreux laboratoires, vous constaterez que les techniciens et les scientifiques ne prendront pas la peine de compter chaque colonie sur la plaque si vous avez un nombre visiblement élevé de colonies. Ils diront par exemple simplement (avec un peu d'expérience), le compte pour cette assiette est supérieur à 300 (écrivez>300).

Néanmoins, vous aurez bien sûr toujours besoin d'un décompte, il est donc courant d'effectuer l'une des opérations suivantes :

  • Divisez votre assiette en secteurs de taille égale (vous pouvez tracer des lignes au bas de l'assiette), comptez toutes les colonies dans un secteur, puis multipliez ce nombre par le nombre de secteurs que vous avez divisés. Ainsi, disons, vous avez divisé votre plaque en 4 secteurs (quadrants) en dessinant une grande croix dessus, vous compteriez les colonies dans un quadrant puis multiplieriez par 4. C'est évidemment une extrapolation.
  • L'autre option consiste à diluer votre échantillon jusqu'à ce que vous l'obteniez dans une plage dénombrable. Vous pouvez donc faire une dilution en série, la mettre sur des plaques, puis une fois que vos organismes se sont développés, vous pouvez compter la plaque entière et ensuite multiplier par le facteur de dilution. Donc, disons, par exemple que vous avez votre échantillon dans un bouillon d'enrichissement et faites deux dilutions au 1/10 (1/100) puis étalez 0,1 ml (compte pour 1/10), vous avez un facteur de dilution final de 1000. Donc vous auriez besoin de multiplier le nombre que vous obtenez sur cette plaque imaginaire par 1000.

Dans votre échantillon, vous avez évidemment une variété d'organismes différents. Il est probablement conseillé de vérifier les méthodes officielles pour ce qu'elles recommandent. Voici un extrait de la méthode officielle BAM pour les Levures, Moisissures et Mycotoxines :

Compter les plaques après 5 jours d'incubation. S'il n'y a pas de croissance à 5 jours, réincuber pendant encore 48 h. Ne comptez pas les colonies avant la fin de la période d'incubation car la manipulation des plaques pourrait entraîner une croissance secondaire à partir de spores délogées, rendant les comptes finaux invalides. Compter les plaques contenant 10-150 colonies. Si principalement des levures sont présentes, les plaques avec 150 colonies sont généralement dénombrables. Cependant, si des quantités substantielles de moisissures sont présentes, selon le type de moisissures, la limite supérieure de dénombrement peut devoir être abaissée à la discrétion de l'analyste. Rapporter les résultats en unités formant colonie (CFU)/g ou CFU/ml sur la base du nombre moyen d'ensembles en triple. Arrondir compte à deux chiffres significatifs. Si le troisième chiffre est égal ou supérieur à 6, arrondissez au chiffre supérieur (par exemple, 456 = 460) ; si 4 ou moins, arrondir au chiffre ci-dessous (par exemple, 454 = 450). Si le troisième chiffre est 5, arrondissez au chiffre ci-dessous si les 2 premiers chiffres sont un nombre pair (par exemple, 445 = 440) ; arrondir au chiffre ci-dessus si les 2 premiers chiffres sont un nombre impair (par exemple, 455 = 460). Lorsque les plaques de toutes les dilutions n'ont pas de colonies, signalez le nombre de moisissures et de levures (MYC) comme inférieur à 1 fois la dilution la plus faible utilisée. Isoler les colonies individuelles sur PDA ou MA, si une analyse plus approfondie et l'identification des espèces est nécessaire.

Veuillez voir le lien ici.


Thérapie par cellules souches chez les nouveau-nés : le temps est (presque) venu

Autres cellules souches pour la dysplasie bronchopulmonaire

Cellules progénitrices endothéliales et cellules formant des colonies endothéliales

Les ECFC et ECFC-CdM ont tous deux amélioré efficacement les lésions pulmonaires hyperoxiques et l'hypertension pulmonaire chez les animaux immunodéprimés. 15 Dans le modèle de bléomycine de DBP, ECFC-CdM n'a eu aucun effet sur la structure pulmonaire mais a empêché l'hypertension pulmonaire. 57 Cela pourrait limiter le potentiel thérapeutique de l'ECFC-CdM. Les ECFC ont amélioré à la fois l'alvéolarisation et l'hypertension pulmonaire. Fait intéressant, les ECFC avant terme mais pas à terme ont perdu leur effet thérapeutique après une exposition hyperoxique, ce qui indique que les produits cellulaires peuvent être influencés de manière significative par des changements dans les conditions de culture.

Cellules épithéliales amniotiques humaines

Dans la DBP induite par la bléomycine, l'administration IV de hAEC a réduit l'inflammation et la fibrose pulmonaires. 58 In vitro, les hAEC ont pu être différenciées en cellules alvéolaires de type II productrices de surfactant. Après administration in vivo, les hAEC ont migré dans le poumon endommagé et semblaient se différencier en cellules alvéolaires de type II. 58 Une différenciation similaire en pneumocytes de type I et de type II a été observée après l'administration d'hAEC à des fœtus de mouton présentant une lésion pulmonaire induite par la ventilation. 59 Des effets proangiogéniques ont été observés pour les hAEC à terme mais pas avant terme dans le modèle de bléomycine. 28 La comparaison directe des hAEC et des CSM dérivées de la membrane amniotique après une lésion pulmonaire induite par la bléomycine a révélé un effet supérieur des CSM sur la fibrose pulmonaire, mais des effets anti-inflammatoires similaires pour les deux thérapies cellulaires. 60

Plus de données sur le dosage optimal, le moment et la voie d'administration sont nécessaires avant que les hAEC et les MSC puissent être comparés de manière plus concluante.


Virginie

La première colonie anglaise dans le nouveau monde était en Virginie, avec la première colonie permanente établie en 1607, dirigée par des marchands londoniens, qui envoyèrent une colonie de cinq navires s'installer sur l'île de Roanoke. Les tempêtes les ont forcés à entrer dans la baie de Chesapeake. Ils remontèrent la rivière Powhatan, débarquèrent et formèrent la colonie de Jamestown. La rivière a été nommée James River en l'honneur de leur roi. Après diverses difficultés, la colonie prospéra et, en 1619, la première assemblée représentative de Virginie se tint à Jamestown. Cette assemblée a formé la base de ce qui allait devenir l'État de Virginie.


Aperçu des procédures et des utilisations des techniques aseptiques

Le programme du laboratoire consistait à étudier les techniques aseptiques. Ces techniques aseptiques sont essentielles dans un laboratoire car elles aident à maintenir le laboratoire stérile, et la stérilité est vitale dans un laboratoire car elle permet au scientifique d'étudier et d'augmenter avec précision les bactéries dont ils ont besoin. La stérilité est également importante pour éviter que les bactéries qui ne sont pas nécessaires à la réplication et à la croissance sur le milieu de progression stérile ou la plaque de gélose.

Il y avait quelques techniques aseptiques que nous devions suivre tout en traitant des bactéries et du milieu d'expansion stérile. Pour éviter que le milieu de développement ne soit pollué par des bactéries de l'air et d'autres sujets flottant librement, un bec Bunsen a été créé à proximité de l'endroit où en fait le milieu de progression et les échantillons de bactéries devaient être utilisés. Le bec Bunsen a créé un courant de convection qui a éliminé et détruit la plupart des bactéries présentes dans l'environnement et d'autres matières flottantes à proximité du lieu de travail. Cela a réduit le risque de contamination du milieu de croissance et des exemples de bactéries.

Le bec Bunsen a également été configuré pour permettre l'utilisation d'une autre stratégie appelée flambage. Cette technique consiste à transférer à travers la flamme du brûleur tout ce qui est entré directement en contact avec des bactéries ou tout ce qui va entrer directement en contact avec l'échantillon de bactéries. Les choses qui sont flambées sont des équipements de laboratoire tels que des boucles bactériologiques, une pipette en verre et des cols de récipient ou de flacon. Les choses doivent atteindre une température de plus de 100 oC pour que cela soit stérilisé.

Une autre stratégie aseptique est appelée manipulation. Dans cette technique, le plus petit doigt est utilisé pour retirer le couvercle de la bouteille contenant les bactéries, ce qui permet à tous ces autres doigts d'obtenir tout ce qui est nécessaire. Cette technique permet également d'éviter que le couvercle du conteneur ne descende sur la paillasse où il est susceptible de se contaminer et donc de contaminer la culture de bactéries dans le conteneur.

L'approche aseptique précédente mais la plus cruciale est de savoir qui quelqu'un empêche les bactéries de contaminer elles-mêmes le laboratoire et l'équipement. Chaque personne porte une quantité importante de bactéries à l'intérieur et à l'extérieur de son corps. Chaque fois que nous utilisions des bactéries dans un laboratoire, nous devions porter un revêtement de laboratoire, ce qui empêchait les bactéries de nos vêtements et de nos systèmes de se propager dans le laboratoire. Nous devons également faire attention à ce que les gens ne toussent pas ou n'éternuent pas sur le support de progression, car cela entraînerait la progression des bactéries libérées par votre corps. De plus, après avoir effectué l'expérience, il était essentiel que les mains soient lavées avec du savon antibactérien pour aider à prévenir les contaminants croisés. Si les mains ne sont pas lavées correctement et si des bactéries restent encore sur les mains, elles pourraient se multiplier à un rythme exponentiel et provoquer des infections bactériennes.

La première partie de l'expérience consistait à observer différents écarts et quantités de bactéries sur les mains avant le rinçage et après le lavage. Cela se fait en plaçant les mains dans une boîte de Pétri avec de la gélose nutritive. La gélose nutritive est un milieu de progrès microbiologique couramment utilisé pour la culture foreuse de bactéries. Le plat a été séparé en deux et a été étiqueté avec une partie du plat ayant des empreintes de mains pré-lavées et l'autre partie après rinçage. Le plat a ensuite été placé en incubation à 37 degrés car c'est la température optimale où les bactéries ont la capacité de se multiplier à un taux exponentiel en fonction de certains facteurs, par exemple la quantité de nourriture disponible ou l'espace.

La prochaine partie de l'expérience consiste à faire une plaque à stries. Cela a été fait en utilisant la bactérie Staphylococcus aureus. Un petit test de la bactérie SA a été utilisé et mis sur une anse stérile et striée d'un milieu gélosé. Un exemple de plat de strie qui a été réalisé est montré sur le schéma ci-dessous :

Diagramme montrant la méthode de placage par stries

1. Flammer la boucle et la ligne et rayer une boucle de bouillon comme en A sur le schéma.

2. Reflammez la boucle et refroidissez-la.

3. Strie comme en B pour propager les bactéries d'origine sur une plus grande partie de la gélose.

4. Reflammez la boucle et refroidissez-la.

5. Série comme en C, D E et F en suivant la même procédure après chaque série comme indiqué ci-dessus.

6. Étiquetez la plaque et incubez-la à l'envers.

La partie suivante de la première période consistait à faire des dilutions en série. Cela vous permet de rechercher le nombre de cellules de la peau dans une culture bactérienne. Étant donné que les statistiques sur les cellules bactériennes sont généralement élevées dans le test initial, l'étalement de ce test de manière non diluée conduirait simplement à la création de l'arrière-cour bactérienne (un frottis de plusieurs colonies de bactéries individuelles qui se développent à côté ou au-dessus de chaque autre).

Les statistiques sur les cellules bactériennes doivent être réduites, ce qui est réalisé en diluant systématiquement la quantité de bactéries dans le test. Une petite quantité d'échantillon de bactéries est mélangée à une solution diluante (comme un bouillon stérile), puis des dilutions successives sont effectuées. Une petite quantité de chacun des échantillons de bactéries diluées est ensuite multipliée sur une plaque de gélose. Les quantités de colonies de bactéries qui se développent sur chaque plaque sont comptées. En travaillant à rebours en multipliant avec le "facteur de dilution" (le nombre de fois que vous avez dilué le test bactérien avec la solution diluante), nous avons pu faire une dédicace des nombres de bactéries dans l'échantillon initial. Après la création des dilutions, 100 l de chaque dilution ont été transférés dans une plaque de gélose à l'aide d'une pipette, puis passés à travers la plaque de gélose avec un étaleur. Ces six plaques de gélose ont ensuite été mises en incubation à 37°C tous les jours et nuits. Lors de la distribution de l'arrière-cour bactérienne, la plaque avec le niveau de dilution 10-5 a été réalisée en premier, puis les autres 10-4, 10-3, 10-2. c'est parce que l'épandeur qui a été utilisé était en plastique, donc la bactérie la moins concentrée a été transmise en premier car l'épandeur en plastique transparent ne pouvait pas être enflammé pour détruire les bactéries. Si cette stratégie aseptique n'avait pas été utilisée et que la meilleure concentration de bactéries avait été utilisée en premier, cela aurait signifié que les repas bactériens auraient pu être pollués et qu'une colonie de bactéries n'aurait pas été gagnée. Si un épandeur de gobelets était utilisé, cela pourrait le faire dans l'ordre croissant car un verre pourrait être flambé en mettant de l'éthanol sur la surface, tuant les bactéries sur l'épandeur en verre avant de faire une autre partie de la dilution en série.

Le dernier domaine des premières classes de laboratoire était de préparer des frottis de bactéries pour la coloration de Gram. La coloration de Gram est une technique couramment utilisée pour différencier deux grands groupes de bactéries en fonction de leurs différents constituants de la structure de la paroi cellulaire. Le processus de coloration de Gram fait la distinction entre les groupes Gram positif et Gram négatif en colorant ces cellules de la peau en rose ou en violet. Les bactéries à Gram positif se colorent en violet en raison de la présence d'une couche épaisse de peptidoglycane à la surface de leurs parois cellulaires, qui retient le cristal violet avec lequel ces cellules sont colorées. De plus, les bactéries à Gram négatif se colorent en rose, ce qui est attribué à une structure de paroi de peptidoglycane plus maigre, qui ne retiendra pas le cristal violet pendant le processus de décoloration.

La coloration de Gram implique trois techniques : la coloration avec un colorant soluble dans l'eau appelé cristal violet, la décoloration et la contre-coloration, généralement avec de la safanine. En raison des différences dans la largeur d'un revêtement de peptidoglycane dans la membrane cellulaire entre les bactéries Gram positives et Gram négatives, les bactéries Gram positives (avec un niveau de peptidoglycane plus épais) préservent la coloration cristal violet par le processus de décoloration, tandis que les bactéries Gram négatives perdent la coloration cristal violet et sont à la place colorés par la safranine dans le processus de coloration ultime. Le processus comprend trois étapes :

1. Les cellules sont colorées avec un colorant cristal violet. Ensuite, une solution d'iode de Gram (iode et iodure de potassium) est ajoutée pour former un composé organique entre votre cristal violet et l'iode. Ce complexe est une molécule plus grosse que le colorant cristal violet original et l'iode et est insoluble dans l'eau.

2. Un décolorant tel que les boissons alcoolisées éthyliques ou l'acétone est mis dans le test, qui déshydrate le revêtement de peptidoglycane, le rétrécit et le tend. Le grand cristal violet-iode organique n'est pas capable de pénétrer cette enveloppe de peptidoglycane resserrée, et il est donc capturé dans la cellule chez les bactéries Gram positives. Inversement, la membrane externe des bactéries à Gram négatif est dégradée et la couche de peptidoglycane plus mince des cellules à Gram négatif a du mal à retenir le complexe cristal violet-iode et la couleur est perdue.

3. Un contre-colorant, comme la safranine hydrosoluble faiblement normale, est ajouté au test, le colorant en vert. Comme la safranine est plus claire que le cristal violet, elle ne perturbe pas la coloration pourpre des cellules cutanées à Gram positif. Cependant, les cellules Gram négatives décolorées sont colorées en rouge.

(Les méthodes descriptives sont indiquées dans le manuel pour toutes les expériences.)


Méthode plus simple pour mesurer les infections virales chez les abeilles

Il peut être difficile d'évaluer la gravité d'une infection virale dans une colonie d'abeilles. Un nouvel outil du Département d'Agroécologie facilite la tâche. Crédit : Colourbox

Des scientifiques de l'Université d'Aarhus ont développé un modèle qui permet aux apiculteurs d'évaluer plus facilement la gravité des infections virales chez leurs abeilles mellifères.

Avez-vous besoin de sonner l'alarme s'il y a 100 000 particules virales dans les ruches - ou n'y a-t-il pas de quoi s'inquiéter jusqu'à ce qu'il y en ait 10 millions ? Il peut être difficile pour la plupart des gens de jongler avec un si grand nombre, mais maintenant les scientifiques de l'Université d'Aarhus ont permis aux apiculteurs de conclure plus facilement sur la gravité de la pression des infections virales dans leurs colonies d'abeilles.

Sur la base d'observations dans des colonies d'abeilles danoises, les scientifiques ont regroupé l'incidence des infections virales en quatre catégories. Cela signifie qu'au lieu d'utiliser une échelle mobile de nombres avec beaucoup de zéros derrière, vous pouvez simplement vous référer aux quatre catégories. Cela facilite la tâche des apiculteurs, lorsque, par exemple, ils doivent décider s'ils doivent prendre des mesures préventives ou non et si une colonie d'abeilles peut être utilisée pour une reproduction ultérieure. C'est aussi un outil important pour les scientifiques.

"Lorsque vous devez lutter contre des épidémies, il est important de connaître l'étendue de la maladie et sa cause. Cela s'applique également à la prévalence des virus chez les abeilles mellifères. Avec notre méthode, il est plus simple d'évaluer cette prévalence", explique le scientifique principal Per Kryger du Département d'agroécologie de l'Université d'Aarhus.

Les abeilles mellifères sont des acteurs importants de notre chaîne alimentaire. Ils contribuent à assurer la pollinisation des cultures afin que les fleurs se transforment en fruits. Ces dernières années, les abeilles mellifères ont connu des problèmes à l'échelle mondiale : des colonies d'abeilles se sont effondrées pour des raisons inconnues. Depuis 2006, environ 30 pour cent des colonies d'abeilles mellifères sont perdues chaque année aux États-Unis. Alors que la situation au Danemark n'est pas aussi grave, c'est toujours un problème que les colonies s'effondrent sans en connaître la cause exacte.

Plusieurs facteurs peuvent être à blâmer, seuls ou à l'unisson, dont les virus, les parasites et diverses formes de stress. Des abeilles résistantes à l'acarien varroa et au parasite microscopique ressemblant à une éponge Nosema apis ont été élevées avec succès. Peut-être que la même chose pourrait être faite dans la lutte contre les virus.

Des études antérieures ont montré que le virus est répandu dans de nombreuses colonies d'abeilles et que très peu de colonies d'abeilles mellifères sont complètement exemptes de virus. Cela s'applique également aux colonies apparemment saines, donc une sorte de tolérance doit s'être développée qui signifie que les abeilles ne tombent pas malades même lorsqu'elles sont infectées.

Ce fait implique qu'il peut être possible de développer des colonies résistantes. La reproduction sélective nécessite cependant que vous puissiez compter le nombre de particules virales afin que les bonnes colonies puissent être sélectionnées pour produire la prochaine génération.

Colonies d'abeilles au microscope

Pour avoir une idée du niveau d'infection actuel au Danemark, les scientifiques ont examiné des colonies d'abeilles mellifères danoises saines pour sept virus différents. Ils ont également examiné des colonies de ruchers avec une forte incidence de varroa ou un taux de mortalité élevé en hiver.

"Nous avons examiné le niveau d'infection des abeilles danoises en nous concentrant sur les colonies d'abeilles saines. Les résultats peuvent constituer le niveau de référence pour les évaluations de la santé d'une colonie d'abeilles", explique Esmaeil Amiri, qui a réalisé ce projet dans le cadre de son doctorat. études à l'Université d'Aarhus avec l'aide de nombreux apiculteurs danois qui ont envoyé des abeilles en bonne santé à l'étude.

Il s'est avéré qu'il y avait une grande différence dans l'apparition du virus dans les colonies malades et saines. Parmi les colonies saines, 36 pour cent ne contenaient aucun virus. Dans les colonies malades, il y avait au moins un type de virus dans chaque colonie. Il y avait aussi une grande variation dans le nombre de particules virales dans les deux groupes, et il était courant de voir plusieurs types de virus simultanément dans la même colonie. Le virus le plus courant était le virus de Sacbrook (SBV), le virus des cellules de la reine noire (BQCV) et le virus de l'aile déformée (DWV).

Sur la base de leurs observations, les scientifiques ont établi quatre catégories de niveau d'infection :

  • Gratuit (0 particules virales)
  • Faible (plus de 0 mais moins de 1 000 particules virales)
  • Intermédiaire (supérieur ou égal à 1 000 mais inférieur à 10 000 000 particules virales)
  • Élevé (supérieur ou égal à 10 000 000 de particules virales)

La classification du nombre viral en quatre catégories a permis aux scientifiques de comparer statistiquement les niveaux de virus dans les colonies d'abeilles malades et saines. Cette classification ne profite pas qu'aux scientifiques.

"Lorsque les apiculteurs peuvent travailler avec quatre catégories de nombres de virus au lieu d'une échelle mobile, cela leur permet de prendre plus facilement des décisions stratégiques afin d'empêcher la propagation de la maladie ou dans le travail de sélection", explique Per Kryger et poursuit :

"Il est important que les connaissances que nous générons puissent être comprises par les profanes. Nous pensons que cet ensemble de données simplifié est un moyen d'atteindre cet objectif."


Que sont les colonies de moisissures ?

Question: J'ai fait tester des échantillons de moisissures dans un laboratoire ici aux États-Unis. Les résultats retournés montrant Aspergillus 19 colonies pour le premier échantillon. Les résultats du deuxième échantillon ont été Aspergillus 3 colonies, Géotrichum 1 colonie, et Pénicillium 1 colonie. Que sont les colonies et à quoi correspond leur nombre ? Il y a un grave problème dans notre maison et aucun d'entre nous n'est en bonne santé. Toute information que vous pourriez me donner serait très appréciée.


Réponse: En biologie, une colonie (du latin colonia) désigne plusieurs organismes individuels de la même espèce vivant en étroite collaboration. En cas de moisissure, les colonies se réfèrent à des croissances individuelles (voir photo). Le nombre de colonies est un décompte de ces croissances individuelles (colonies) et elles peuvent appartenir à différents types de moisissures ou au même type. Par exemple, dans votre cas, le premier échantillon n'avait que Aspergillus (19 colonies) et le deuxième échantillon présentait 3 types de moisissures différents. C'est Aspergile (3 colonies), Géotrichum (1 colonie) et Pénicillium (1 colonie). L'image de droite montre des colonies de 2 types de moisissures différents. Les colonies bleu-vert appartiennent à Pénicillium et le reste (avec des centres verdâtres) sont Stachybotrys colonies.

Le nombre de colonies signalé pour les 2 échantillons ne semble pas être élevé, mais cela ne signifie pas que vous n'avez pas de problème de moisissure. Vous voudrez peut-être demander l'aide d'un consultant en environnement local qualifié qui pourra évaluer l'étendue de la croissance de moisissures dans votre maison et vous conseiller sur la marche à suivre.

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À propos de Jackson Kung'u

Le Dr Jackson Kung'u travaille pour MBL, un laboratoire spécialisé dans l'identification et le dénombrement des moisissures et des bactéries couramment détectées dans l'air, les fluides et les échantillons en vrac prélevés dans les maisons, les écoles, les bureaux, les hôpitaux, les environnements industriels, agricoles et autres. Jackson propose également un cours de formation unique sur les moisissures sur la façon de reconnaître les moisissures intérieures, de développer des stratégies d'échantillonnage efficaces, d'interpréter les résultats de laboratoire et de contrôler la croissance des moisissures.


Introduction

La croissance bactérienne est un indicateur essentiel dans de nombreuses études sur les micro-organismes. La sélection d'antibiotiques (Van Doorn et al., 2000), les tests toxicologiques (Chen et al., 2004) et l'évaluation de la sécurité sanitaire des aliments et des médicaments (Itoh et al., 1998) nécessitent la détermination des taux de survie des microorganismes pour vérifier réalisations de la recherche. Cela implique généralement de compter le nombre de bactéries dans une unité de volume de bouillon bactérien à l'aide de diverses méthodes, notamment la cytométrie en flux, la spectrophotométrie, la filtration sur membrane et la méthode sur plaque de gélose. La cytométrie en flux (Macey, 2007) combine l'utilisation de propriétés bactériennes avec diverses substances fluorescentes. Les bactéries sont placées dans un cytomètre en flux, dans lequel les substances fluorescentes qu'elles transportent sont excitées par des lasers réglés à des fréquences particulières pour la génération de signaux optiques. Des filtres de différentes longueurs d'onde convertissent ces signaux en signaux électroniques pour permettre le comptage des bactéries. La spectrophotométrie (Schmidt et Schmidt, 2004) est une mesure quantitative de la transmission optique d'une suspension bactérienne en fonction de la longueur d'onde. La quantité de lumière qui traverse la suspension est indicative de la concentration de certaines bactéries qui ne laissent pas passer la lumière. La méthode du filtre à membrane (Inatomi, 2003) consiste à faire passer des échantillons convenablement dilués à travers un filtre à membrane dont le diamètre des pores est inférieur à celui des micro-organismes. Les micro-organismes restent sur la membrane, qui est ensuite placée sur un milieu de culture. Le nombre total de bactéries dans l'échantillon d'origine peut alors être calculé en fonction du nombre de colonies qui se forment sur la membrane filtrante. La méthode sur plaque de gélose (Barbosa, 1995) consiste à étaler la suspension bactérienne diluée sur un milieu de culture approprié. Étant donné que seuls les microbes survivants se développent et forment des colonies sur la plaque, en comptant le nombre de colonies, le nombre de bactéries viables peut être obtenu. Parmi ces méthodes, la méthode sur plaque de gélose est couramment utilisée pour doser le taux de survie des microbes.

Cependant, le comptage manuel des colonies est long et imprécis. Pour gagner du temps et éviter les incohérences, un certain nombre de logiciels de traitement d'images, comme ImageJ, ont été développés. ImageJ est un programme d'analyse d'images gratuit qui peut être utilisé pour de nombreux traitements et analyses d'images. Cependant, pour les utilisateurs qui n'ont pas une connaissance approfondie du traitement d'images, plus d'efforts et de familiarité avec la langue sont nécessaires pour obtenir des résultats satisfaisants. De plus, Clarke et al. (2010) ont proposé un système de comptage de colonies à faible coût et à haut débit composé d'un logiciel de comptage de colonies et d'un appareil photo numérique grand public ou d'un scanner de documents. Le logiciel, appelé "NICE" (NIST's Integrated Colony Enumerator), lit les formats d'image standard et peut donc être utilisé avec de nombreux systèmes d'imagerie. Le programme (OpenCFU) créé par Geissmann (2013) qui permet de contrôler les paramètres de traitement peut également être utilisé pour compter les colonies cellulaires et autres objets circulaires. Niyazi et al. (2007) ont développé Clono-Counter, qui utilise trois paramètres, à savoir les niveaux de gris, la taille maximale d'une colonie et la distribution des niveaux de gris au sein de la colonie, pour le comptage des colonies. Les utilisateurs doivent avoir une certaine expérience pour trouver les paramètres appropriés, mais certaines directives sont fournies pour accélérer le processus. Zhang et Chen (2007) ont proposé un compteur de colonies automatique pour le dénombrement des colonies bactériennes sans aucune intervention humaine, qui s'est avéré plus précis que Clono-Counter. Bien qu'il ait une grande précision dans les images avec des supports colorés, il a des problèmes avec celles avec des supports transparents. Chen et Zhang (2009) ont proposé une méthode pour éliminer les différences de couleur résultant de la culture dans divers environnements de culture, lui permettant d'être appliquée aux boîtes de Pétri de divers milieux. Des performances raisonnables pour les images avec des supports colorés et clairs ont été démontrées. Hommes et al. (2008) ont éliminé les bords des boîtes de Pétri en supposant que ce sont des cercles parfaits malgré l'adhérence des colonies sur les bords. À travers un certain nombre d'itérations, ils ont identifié des valeurs seuils capables d'isoler les colonies de l'arrière-plan, ont utilisé la transformation de distance et un algorithme de bassin versant pour diviser les colonies, puis ont utilisé le rapport de compacité pour éliminer le bruit avant le comptage. Hong (2008) a proposé une méthode basée sur une machine à vecteurs de support (SVM) pour l'identification des colonies. Leur approche a utilisé six paramètres, à savoir la zone, le périmètre, le diamètre équivalent, le facteur de forme, la longueur et la largeur, pour identifier les colonies, avec des taux de reconnaissance de plus de 96%. Ates et Gerek (2009) ont proposé une méthode qui obligeait les utilisateurs à sélectionner d'abord trois points. Utilisant le fait que trois points peuvent définir un cercle, ils ont ensuite identifié semi-automatiquement les bords des boîtes de Pétri et ont utilisé le rapport de compacité pour déterminer l'existence de colonies groupées qui nécessitent une division. Brugger et al. (2012) ont utilisé un CCD pour capturer des images de colonies. La limite du plat était considérée comme un cercle parfait. Les colonies qui touchent la frontière ont été supprimées. Les résultats étaient fortement corrélés avec ceux obtenus à partir du comptage manuel. Dahlé et al. (2004) utilise un scanner à plat pour compter les colonies dans 12 boîtes de Pétri à la fois. Après coloration, les boîtes de Pétri ont été placées sur des supports spécialement conçus pour fixer les boîtes dans la même position d'une expérience à l'autre et réduire l'ombrage. Bae et al. (2009) ont proposé un instrument microbiologique intégrant un localisateur de colonies, un diffusiomètre avant et un contrôleur de mouvement 2D qui non seulement compte et localise les colonies bactériennes, mais mesure également automatiquement la signature de diffusion avant pour identifier l'espèce de la colonie bactérienne à l'étude. Ogawa et al. (2012) ont proposé une analyse d'images d'ombres en accéléré (TSIA), qui consiste à capturer une image de la boîte de Pétri chaque heure, puis à analyser les différences en fonction des ombres. Cette technique permet aux observateurs d'identifier les emplacements des colonies. D'autres nouvelles techniques telles que la transformée de distance (Mukherjee et al., 1995), la transformée de Hough (Barber et al., 2001) et la logique floue (Marotz et al., 2001) ont également été appliquées pour faciliter le comptage automatisé.

Plusieurs auteurs (Men et al., 2008, Ates et Gerek, 2009, Brugger et al., 2012) ont noté des problèmes liés à la détection des colonies autour de la périphérie de la boîte Peri, et excluent ainsi cette zone du traitement. Cependant, étant donné que les colonies étaient réparties sur toute la surface d'une plaque, l'exclusion des colonies autour de la périphérie de la plaque peut réduire la précision statistique. De plus, certains algorithmes (Niyazi et al., 2007, Ates et Gerek, 2009) obligent les utilisateurs à fournir manuellement des paramètres avant le processus automatisé. Pour surmonter ces problèmes, cette étude propose un système entièrement automatique efficace pour compter les colonies. Les colonies à la fois autour de la zone centrale et des bords d'une boîte de Pétri sont prises en compte. Les performances du système proposé sont comparées à des comptages manuels vérifiés. Une interface utilisateur graphique (GUI) conviviale est également développée.

La section suivante présente les procédures de culture de colonies bactériennes et de capture d'images. Les méthodes de traitement d'images, comprenant la segmentation d'images, le comptage des colonies dans la zone centrale et le comptage des colonies dans la zone du bord sont introduites dans la section 3 suivies des résultats expérimentaux et des discussions. Un résumé et des conclusions sont donnés dans la section 5.


Compter correctement les colonies - Biologie

La technique stérile est toujours une affaire relative. Les précautions requises dépendent de la situation expérimentale, y compris les milieux de croissance utilisés, les capacités compétitives de l'organisme expérimental, la durée de l'expérience et l'utilisation prévue de la culture. Pour ces expériences, le problème de contamination le plus grave est la moisissure. De nombreuses moisissures courantes se développent bien sur les supports de levure et rivalisent efficacement, faisant grossir les plaques et obscurcissant les levures qui réussissent à se développer. Les bactéries sont moins problématiques car la plupart d'entre elles ne poussent pas bien sur ces milieux et, avec un peu d'expérience, on peut facilement les distinguer des levures. D'autres souches de levure peuvent être des contaminants désastreux si elles ne sont pas détectées. En particulier, une levure rouge qui apparaît parfois peut être très déroutante, mais se distingue de notre levure rouge car elle ne nécessite pas d'adénine.

Contrairement aux expériences à court terme, cependant, les milieux de stérilisation doivent être assez rigoureux car le stockage laisse suffisamment de temps pour que même les contaminants à croissance lente se développent. Nous avons conclu par expérience que le stockage des médias dans le froid est en fait contre-productif. Il n'empêche pas la contamination, mais ralentit sa croissance. Par conséquent, la contamination peut passer inaperçue jusqu'à ce que les cultures soient incubées. Il est bien préférable de stocker le milieu à température ambiante et de détecter la contamination avant d'utiliser le milieu.

(1) Stérilisation à la chaleur humide

La chaleur humide fournie par un autoclave ou un autocuiseur est un moyen efficace de stériliser la plupart des matériaux. À une pression de 15 psi au-dessus de la pression atmosphérique, l'eau atteint une température d'environ 121O C avant de bouillir. La plupart des matériaux sont efficacement stérilisés par une exposition de 15 minutes à cette température. Si un autoclave n'est pas disponible, un autocuiseur domestique ordinaire stérilisera efficacement les fournitures de médias en petits lots.

(2) Stérilisation à la chaleur sèche

Les matériaux secs tels que le verre et le métal peuvent être stérilisés dans un four, mais cela nécessite une température plus élevée (160°C) et un temps plus long (au moins 2 heures) qu'un autoclave. Ceci est plus pratique pour la verrerie lorsqu'un four contrôlé par une minuterie automatique est disponible afin que la stérilisation et le refroidissement puissent se produire pendant la nuit. L'utilisation de vaisselle en plastique jetable et pré-stérilisée rend le four moins important.

La flamme d'un brûleur à gaz stérilise efficacement les petits objets en verre ou en métal, comme les anses d'ensemencement, mais il faut éviter de "faire frire" la levure par contact avec des objets chauffés dans une flamme. Trempez les épandeurs de verre dans de l'alcool, puis utilisez la flamme pour enflammer l'alcool. Placez des outils métalliques tels que des boucles dans la flamme jusqu'à ce qu'ils soient rouges. Refroidir les outils chauds en les touchant à la gélose ou à l'intérieur d'un tube de verre stérile. Cependant, comme les flammes sont dangereuses, cette méthode peut et doit être évitée autant que possible. Nous avons découvert que le flambage n'est vraiment nécessaire que pour stériliser les anses d'inoculation et les petits instruments. Nous n'avons pas été en mesure de démontrer l'utilité de flamber les ouvertures des tubes, des bouteilles ou des flacons dans ces expériences.

(4) Stérilisation à l'alcool

Dans de nombreuses procédures expérimentales, le moyen le plus efficace de stériliser des objets est l'éthanol. 95% ou 70% fonctionnera. Ce dernier est en fait plus efficace, mais le premier est souvent plus pratique. Bien entendu, l'alcool doit pouvoir s'évaporer ou être brûlé avant que l'objet ne soit utilisé en contact avec la levure. Utilisez une flamme pour brûler l'alcool, une bougie est généralement moins chère et plus sûre qu'un brûleur à gaz. L'alcool, plus que la chaleur, effectue la stérilisation, il suffit donc d'"allumer" l'alcool pour minimiser le chauffage et accélérer le processus. Essuyez également le banc avec de l'alcool avant de commencer une expérience pour éliminer la poussière chargée de moisissures, la source de contamination la plus courante. Si votre peau n'est pas particulièrement sensible, essuyez-vous également les mains avec une petite quantité d'alcool.

(5) Garder les choses stériles stériles

Les sources de contamination les plus courantes au cours d'une expérience sont la poussière, provenant de la paillasse, de l'air et des personnes. Cela dicte plusieurs principes évidents :
1) Gardez les choses couvertes autant que possible.
2) Ne touchez rien qui entrera en contact avec la culture et si vous la touchez, stérilisez-la à nouveau avant de l'utiliser.
3) Essuyez la surface autour de l'expérience avec de l'alcool et minimisez les turbulences de l'air.
4) Évitez de parler, de chanter, de siffler, de tousser ou d'éternuer en direction de choses qui devraient être stériles. Les cheveux longs, s'ils ne sont pas attachés, peuvent être une source de contamination.
5) Maintenir une zone appropriée pour la préparation, le stockage et l'utilisation de milieux stériles. Malheureusement, les plantes d'intérieur, les animaux et d'autres matériaux tels que les milieux de Drosophila, que l'on trouve couramment dans les salles de cours de biologie, sont des sources abondantes de moisissure et doivent être éloignés de la zone utilisée pour les procédures stériles.

(6) Étudiez votre contamination pour l'éviter la prochaine fois

Si certaines de vos plaques de gélose sont contaminées, vous pouvez souvent dire en examinant la plaque comment la contamination a eu lieu. Si les contaminants sont incrustés dans la gélose, le contaminant a probablement été versé avec le milieu. Si la contamination se trouve sous la gélose, elle aurait pu se trouver dans la boîte avant qu'elle ne soit versée ou entrer lors de l'ouverture du couvercle pour verser. Si la contamination est sur le dessus, elle peut être entrée avant la fermeture du couvercle après le versement, lors de l'ouverture du couvercle pour essuyer la condensation ou pendant l'ensemencement de la plaque.

(7) Adaptez vos techniques à vos besoins

Une technique stérile appropriée est essentielle pour des expériences microbiologiques réussies, mais des précautions excessives peuvent être de sérieuses distractions. Les levures et les bactéries nécessitent des méthodes différentes de la culture tissulaire. La levure pousse vigoureusement, dépassant la plupart des choses, à l'exception de quelques champignons filamenteux (flous) et de certaines bactéries. Les expériences peuvent être contaminées et ne pas être perdues lorsque les élèves utilisent de la levure parce que la levure poussera assez bien, malgré la contamination, pour que les résultats d'une expérience puissent être lus à travers la croissance incriminée. Par conséquent, faites preuve de la plus grande prudence lors de la fabrication et du versement des médias.

La plupart des expériences de ce manuel utilisent un ou deux des types de supports suivants :
1) un milieu nutritionnellement complet contenant une quantité sous-optimale d'adénine (YED),
2) un milieu nutritionnellement complet contenant un excès d'adénine (YEAD),
3) un milieu chimiquement défini dépourvu d'adénine (MV),
4) un milieu chimiquement défini avec de l'adénine (MV + Ade),
5) un milieu de sporulation (YEKAC),
6) un milieu utilisé pour identifier les petits mutants (PETITE) et
7) un milieu riche utilisé pour stocker les souches de levures (YEPAD).

Nous utilisons des milieux préparés à partir d'ingrédients disponibles dans le commerce. La petite dépense supplémentaire de ces ingrédients est plus que compensée par leur uniformité et leur fiabilité. Les économies qui peuvent être réalisées en utilisant des ingrédients « faits maison » sont plus faibles que prévu car nous n'avons pas encore trouvé de substitut à l'ingrédient le plus cher, la gélose. Bien que des sources courantes, telles que divers types de jus de légumes, puissent fournir la plupart des autres ingrédients, nous avons constaté que le sacrifice de la reproductibilité était injustifié.

Le milieu YED (extrait de levure + dextrose) sera notre milieu de croissance standard. On l'appelle un milieu « complexe » car il est fabriqué à partir d'ingrédients naturels (levure) et sa composition chimique exacte n'est pas connue. Il contient tout ce qui se trouve dans la levure - y compris l'adénine, bien sûr - c'est donc aussi un milieu "complet". Les mutants rouges nécessitant de l'adénine se développent bien sur ce milieu et développent le pigment rouge caractéristique.

Le milieu YEAD (extrait de levure + adénine + dextrose) contient les mêmes ingrédients que YED, mais un excès d'adénine est ajouté. Les mutants rouges nécessitant de l'adénine se développent bien sur ce milieu et Ne fera pas développer le pigment rouge caractéristique.

Le milieu YEPAD (extrait de levure + peptone + adénine + dextrose) contient les mêmes ingrédients que YEAD mais a de la peptone ajoutée. C'est un milieu très riche utilisé pour le stockage des souches de levure.

Le milieu MV (Minimal plus Vitamines) est un milieu chimiquement défini, ce qui signifie qu'il est composé du minimum d'ingrédients chimiques purs nécessaires pour soutenir la croissance de la levure de type sauvage. Nous utiliserons MV lorsque nous aurons besoin d'un milieu qui ne contient pas d'adénine.

Le milieu MV + Ade (Minimal plus Vitamines + adénine) contient les mêmes ingrédients que le MV mais un excès d'adénine est ajouté.

YEKAC (extrait de levure plus acétate de potassium) induit diploïde levure à sporuler et subir méiose. Il est nutritionnellement déséquilibré, donc très peu de croissance se produira.

Le milieu PETITE contient du glycérol comme source de carbone et est utilisé pour identifier les petites colonies mutantes. Les petites cellules ne se développeront pas sur ce milieu.

Recettes pour milieux de croissance gélosés

Si vous utilisez un mélange préemballé, suivez les instructions sur l'emballage. Si vous pesez des ingrédients secs, utilisez les recettes suivantes. Les recettes sont données pour la préparation de 100 millilitres. Si vous voulez en faire plus, multipliez simplement les quantités pour obtenir le volume que vous souhaitez. Exemple : pour faire 500 millilitres, multipliez chaque ingrédient par 5. Ne mettez pas plus de 600 millilitres dans un flacon de 1000 millilitres. Si vous remplissez trop les récipients, ils peuvent déborder pendant le processus de stérilisation.Il faut environ 25 millilitres de médium pour verser une plaque standard de 100 x 15 mm. (Les milieux liquides peuvent être fabriqués à partir de ces recettes en omettant la gélose.)

Milieu de dextrose extrait de levure (YED) :

1 gramme d'extrait de levure
2 grammes de dextrose anhydre (glucose)
2 grammes d'agar (agar-agar gum agar)
100 ml d'eau

Milieu de dextrose d'adénine extrait de levure (YEAD) :

1 gramme d'extrait de levure
2 grammes de dextrose anhydre (glucose)
2 grammes d'agar (agar-agar gum agar)
8 ml de solution mère d'adénine
92 ml d'eau

Milieu Peptone Adénine Dextrose Extrait de Levure (YEPAD) :

1 gramme d'extrait de levure
2 grammes de peptone
2 grammes de dextrose anhydre (glucose)
2 grammes d'agar (agar-agar gum agar)
8 ml de solution mère d'adénine
92 ml d'eau

1 gramme d'extrait de levure
0,025 gramme de dextrose anhydre (glucose)
2,4 ml de glycérol
2 grammes d'agar (agar-agar gum agar)
98 ml d'eau

0,15 grammes de base d'azote de levure sans acides aminés et sulfate d'ammonium
0,52 grammes de sulfate d'ammonium
2 grammes de dextrose anhydre (glucose)
2 grammes d'agar (agar-agar gum agar)
100 ml d'eau

Médias minimaux plus Adénine (MV + ade) :

0,15 gramme de base d'azote de levure sans acides aminés et sulfate d'ammonium
0,52 gramme de sulfate d'ammonium
2,0 grammes de dextrose anhydre (glucose)
Agar de 2,0 grammes (agar-agar gomme agar)
8,0 ml de solution mère d'adénine
92 ml d'eau

1 gramme d'acétate de potassium
0,25 gramme d'extrait de levure
2 grammes d'agar (agar-agar gum agar)
100 ml d'eau

400 mg d'adénine dans 400 ml d'eau (1 mg/ml)
Ranger à température ambiante.
Utiliser 2 ml de solution mère pour 100 ml de milieu réduire de 2 ml l'eau ajoutée au milieu.

Disques de papier buvard adénine

1,25 grammes d'adénine
150 ml d'eau distillée
disques de papier buvard d'art
Ajouter de l'adénine à l'eau distillée dans un bécher suffisamment grand pour que la solution ne déborde pas. Faire bouillir cinq minutes. Ajouter les disques de papier buvard et faire bouillir cinq minutes de plus. Retirez les disques avec des pinces stériles dans un récipient couvert stérile tel qu'une boîte de Pétri. Placez-les en une seule couche et laissez-les sécher pendant plusieurs jours.

Pour de nombreuses expériences à court terme, il est possible de "stériliser" l'eau en la faisant bouillir.
1) placez l'eau dans un récipient non couvert,
2) placer le récipient dans une casserole d'eau bouillante pendant 15 minutes,
3) après refroidissement, serrez le couvercle sur le réservoir d'eau.

Une meilleure façon de préparer de l'eau stérile est probablement de placer les récipients d'eau légèrement couverts dans un autoclave ou un autocuiseur, puis de stériliser l'eau dans les mêmes conditions que celles utilisées pour les milieux de croissance.

F. Température d'incubation et taux de croissance

La température de croissance optimale pour ces souches est d'environ 30 °C, mais elles pousseront de manière tout à fait satisfaisante sur une plage beaucoup plus large. Toutes ces expériences peuvent être effectuées à une température ambiante confortable, mais la levure tolère presque toutes les températures possibles. Cependant, la température affectera le taux de croissance. À des températures plus basses, les cellules croîtront plus lentement et la vitesse doit être déterminée expérimentalement. Les temps d'incubation estimés dans ces expériences sont basés sur une incubation à des températures comprises entre un degré ou deux de 30 °C.

On peut, en fait, ralentir la levure en les refroidissant pour que les expériences s'intègrent dans les horaires de classe. Réfrigérez simplement ou refroidissez simplement les assiettes à différents stades pour ralentir la croissance. Gardez à l'esprit, cependant, qu'une fois qu'une culture a été réfrigérée, il peut y avoir une période de latence de plusieurs heures avant qu'elle ne recommence à pousser. Bien sûr, s'il a atteint la phase stationnaire, il ne poussera plus à aucune température.

Les souches de levure peuvent en fait être conservées pendant de longues périodes au réfrigérateur à des températures juste au-dessus du point de congélation. Certaines variétés continueront de croître, bien que très lentement, à ces températures, mais la plupart resteront viables pendant des semaines ou des mois, et certaines pendant des années.

Les températures supérieures à 30O C doivent être évitées. Bien que les cellules se développent à des températures plus élevées, elles accumulent de petites mutations indésirables et la sporulation est fortement inhibée. Le pigment rouge des mutants d'adénine est également inhibé à des températures plus élevées. Il est plus sûr d'incuber les cultures en cours de sporulation à une température ambiante confortable.

Incuber les cultures dans l'obscurité ou à la lumière réduite autant que possible. Bien qu'elle ne soit pas critique, une exposition prolongée à la lumière ambiante normale ou à une lumière plus vive réduira la viabilité des cellules contenant le pigment rouge. La souche G948-1C/U sensible aux UV ne doit pas être exposée de façon prolongée à des sources lumineuses.

Pour une croissance optimale et pour que le pigment rouge se développe, les plaques doivent être aérobies. Nous incubons les assiettes dans des sacs plastiques ouverts pour la conservation des aliments. Assez d'oxygène est disponible avec les sacs ouverts pour soutenir la respiration aérobie. Les sacs en plastique empêchent les assiettes de sécher trop vite, les protègent de la contamination et les rendent plus faciles à transporter sans renverser.

G. Utiliser des cure-dents et des boucles d'inoculation

Dans la plupart des cas, le moyen le plus simple de déplacer la levure d'un endroit à un autre sur un milieu gélosé est d'utiliser un cure-dent stérile. Le cure-dent de style plat est plus facile à utiliser que le style rond. L'extrémité pointue est utile pour prélever des échantillons de colonies individuelles ou pour faire de petites taches ou stries. L'extrémité plate est bonne pour étaler la levure, pour l'étaler pour isoler des colonies simples et pour mélanger. Les cure-dents sont stériles directement à partir de la boîte tant que la boîte n'a pas été contaminée. Il suffit de couper un coin pour faire un petit trou (environ 1/4 à 1/2 pouce de diamètre) et la boîte servira de distributeur. Les cure-dents dans une boîte pointent dans les deux sens, mais vous pouvez facilement sélectionner l'extrémité que vous préférez pour n'importe quelle tâche. Bien entendu, il faut veiller à ne manipuler chaque cure-dent que par l'extrémité qui ne touchera ni la levure ni le milieu.

Le cure-dent est une alternative à l'anse d'inoculation traditionnelle, disponible dans le commerce, même en platine. Nous fabriquons nos propres boucles d'inoculation à partir d'un morceau de tige de laiton de 6 à 8 pouces (comme utilisé pour le brasage) et de fil de nichrome. Percez un petit trou près de l'extrémité de la tige pour ancrer le fil, insérez l'extrémité du fil dans le trou, enroulez plusieurs tours autour de la tige et laissez un pouce ou deux de fil droit. À l'extrémité de la partie droite, formez une boucle avec une paire de pinces à bec effilé. Faites flamber le fil dans un bec Bunsen jusqu'à ce qu'il devienne rouge pour le stériliser avant chaque utilisation, et bien sûr, laissez-le refroidir avant de toucher (ou de faire frire) la levure. Le toucher à l'agar le refroidit immédiatement.

Il existe plusieurs façons de propager les cellules. Ils utilisent divers types d'équipement de pipetage et diverses méthodes pour déplacer les cellules à la surface de la gélose.
Méthode quantitative de placage par coulée
Cette méthode nécessite la préparation d'un tube de dilution finale séparé pour chaque plaque, puis tout le contenu du tube est versé sur la surface de la gélose. Cette méthode a l'avantage de ne pas nécessiter l'utilisation d'une flamme. Il a l'inconvénient de ne pas être aussi reproductible.

1. Faire une série de dilutions de 1 à 10 de suspensions de cellules de levure.
2. Pipeter 0,1 ml de la suspension appropriée dans un tube stérile contenant 0,9 ml d'eau stérile. Agiter le tube pour suspendre les cellules, puis verser tout le contenu du tube sur la surface du milieu gélosé. Inclinez et faites pivoter la plaque pour répartir uniformément la suspension sur la surface de la gélose.
3. S'il y a des taches qui ne sont pas couvertes, utilisez un cure-dent stérile pour étaler la suspension sur les zones non couvertes.

La suspension doit être laisser tremper dans la gélose avant que les plaques ne soient exposées au traitement expérimental. Pour accélérer le processus, préparez les plaques de gélose plusieurs jours à l'avance et laissez-les sécher un peu avant de verser la suspension de levure.

La section vidéo Serial Dilution & Viable Cell Counts illustre la méthode de placage par coulée.

Méthode d'épandage quantitative
Lorsque vous souhaitez des données précises, il est préférable d'utiliser une méthode de placage alternative. La suspension cellulaire est pipetée avec précision sur la surface de la gélose puis étalée avec un étaleur stérile. Il existe deux types d'épandeurs :

Écarteur de trombone sans flamme
Vous pouvez facilement fabriquer un épandeur réutilisable peu coûteux en redressant deux coudes dans un grand trombone, en laissant une extrémité en épingle à cheveux pour l'épandage et une poignée droite à angle droit. Vous pouvez stériliser plusieurs épandeurs ensemble dans des béchers couverts ou enveloppés dans du papier aluminium ou du papier.
Épandeur de verre flammé
Si vous avez l'équipement et les compétences nécessaires pour travailler avec une tige de verre, vous pouvez fabriquer un simple épandeur de verre en chauffant et en pliant une section d'un pouce à l'extrémité d'un court morceau de tige de verre. Ces épandeurs peuvent également être achetés.

1. Faire une série de dilutions de 1 à 10 de suspensions de cellules de levure.
2. Utilisez une pointe de pipette neuve pour pipeter 0,1 ml de la suspension appropriée sur la surface de la gélose. Frappez le tube avant de prélever l'échantillon. Si vous faites plusieurs plaques, vous pouvez pipeter des cellules dans chaque plaque en utilisant la même pointe de pipette, puis les étaler sans enflammer l'épandeur entre chaque plaque.
3. Stérilisez l'épandeur dans de l'éthanol à 95 %, puis passez l'épandeur à travers une flamme pour enflammer l'alcool. Tenez l'épandeur avec précaution jusqu'à ce que tout l'alcool sur l'épandeur brûle complètement. L'utilisation de flammes à alcool est une étape dangereuse et nécessite des soins et une surveillance étroite de la part de l'enseignant.
4. Refroidissez l'épandeur en le touchant à la gélose . Utilisez le côté plat pour étaler la suspension sur la surface puis utilisez la partie incurvée de l'épandeur pour faire des coups qui se chevauchent. Tournez la plaque de 90 degrés et répétez le processus pour faire des traits qui se chevauchent. Le couvercle peut être maintenu sur la plaque pour minimiser la contamination. Évitez d'étaler la suspension jusqu'au bord où elle peut couler entre la gélose et le côté de la boîte de Pétri.

La section vidéo Utilisation de levure pour mesurer les UV solaires illustre une méthode de placage par épandage de verre flammé.

Méthode qualitative de placage par coulée pour produire des pelouses de cellules
Cette méthode produit une croissance épaisse et uniforme de cellules (pelouse) sur la surface de la plaque de gélose. Il s'agit d'une méthode rapide et utile pour une variété d'expériences qualitatives.

1. Préparez une suspension trouble de cellules de levure.
2. Pipeter 1,0 ml de la suspension à la surface du milieu gélosé. Inclinez et faites pivoter la plaque pour répartir uniformément la suspension sur la surface de la gélose.
3. S'il y a des taches qui ne sont pas couvertes, utilisez un cure-dent stérile pour étaler la suspension sur les zones non couvertes.

Comme dans la méthode quantitative de placage par coulée, la suspension doit être laisser tremper dans la gélose avant que les plaques ne soient exposées au traitement expérimental. Si vous préparez les plaques de gélose plusieurs jours à l'avance et que vous les laissez sécher un peu avant de verser la suspension de levure, vous accélérerez le processus.

Rubrique vidéo Effet des UV solaires sur les cellules illustre la méthode de coulée de placage pour une pelouse.

I. Micropipettes automatiques, pipettes sérologiques et pipettes jetables à bulbe

Les pipettes automatiques sont les chevaux de bataille de la biologie moléculaire et de la microbiologie modernes. Ils sont rapides et précis, et permettent d'économiser beaucoup de temps et de frustration. Les expériences de ce manuel nécessitent souvent l'utilisation d'une pipette de 0,1 ml. Bien qu'ils soient relativement chers, ils rendent le travail si rapide que l'on peut facilement être partagé par plusieurs étudiants ou groupes de laboratoire. Vous l'utiliserez pour faire des dilutions en série et pour plaquer des cellules sur gélose. Les embouts stériles sont conditionnés dans des distributeurs en plastique réutilisables. Entraînez-vous à utiliser la pipette avec de l'eau jusqu'à ce que vous vous sentiez à l'aise avec. (Si les micropipettes automatiques ne sont pas disponibles, il est possible de remplacer les pipettes à bulbe jetables, les pipettes sérologiques ou les tubes capillaires gradués)

1. Appuyez fermement sur la petite extrémité de la pipette dans l'extrémité ouverte d'une pointe pendant que la pointe est encore dans le distributeur.
2. Pour le remplir, appuyez lentement sur le piston jusqu'à ce que vous sentiez une résistance, mais pas aussi loin que possible. Plongez l'embout dans la solution puis relâchez lentement le piston. Si des gouttes adhèrent à la pointe, essuyez-les sur le bord du récipient.
3. Placez l'embout dans le liquide du tube dans lequel vous pipetez et appuyez lentement sur le piston. Cette fois, appuyez aussi loin que possible pour expulser tout l'échantillon. Retirez l'embout de la pipette de la solution, relâchez le piston et jetez l'embout.

Des pipettes sérologiques et des pompes à pipettes peuvent être utilisées à la place des pipettes automatiques. Ces pipettes donneront des mesures de volume très précises. Il est possible d'acheter des pipettes sérologiques préstérilisées en plusieurs tailles. Vous devez disposer d'un jeu de pompes à pipettes que les élèves peuvent utiliser avec ces pipettes. N'oubliez pas que ce n'est jamais une bonne pratique d'utiliser votre bouche pour aspirer du liquide dans une pipette. Même pas d'eau stérile !

Les pipettes à bulbe jetables sont également acceptables pour la plupart des expériences de ce manuel. Trois gouttes d'une pipette à bulbe d'un millilitre sont approximativement égales à 0,1 ml. Les mesures de volume ne sont pas aussi précises mais ces pipettes sont bon marché et ne nécessitent pas l'utilisation de pompes à pipettes. Ces pipettes peuvent également être achetées préstérilisées et emballées individuellement. Les emballages des pipettes préstérilisées fournissent un support stérile pratique pour la pipette pendant la procédure expérimentale.

J. Faire une sous-culture de levure

Les nutriments de levure peuvent être apportés par un milieu solide ou liquide. Lorsque les souches de levure proviennent d'un fournisseur, elles poussent généralement sur des pentes de gélose. Si vous gardez ces pentes bien fermées et réfrigérées, vous pouvez les conserver jusqu'à un an. Les inclinaisons plus petites vous permettent d'utiliser des cure-dents pour déplacer la levure. Il est préférable d'avoir des cultures fraîches pour vos expériences. Ainsi, la veille de l'utilisation de la levure, transférez un petit nombre de cellules de la culture mère vers un milieu frais (généralement YED). Vous pouvez utiliser une boucle flammée pour transférer les cellules, mais un cure-dent stérile est généralement plus facile. Touchez le cure-dent sur les cellules de l'inclinaison, vous n'avez pas besoin de transférer de nombreuses cellules. Faites une traînée de cellules à la surface de la gélose en essayant de ne pas creuser la surface de la gélose. Cette procédure de culture de levure fraîche est appelée sous-culture. Vous devez repiquer au moins 12 heures avant d'utiliser la levure.

Parfois, les cultures seront envoyées des centres de stockage de levure sur des papiers au lait. Pour faire une nouvelle sous-culture : Ouvrez le papier d'aluminium stérilement et à l'aide de pinces stériles, placez le petit carré de papier de lait sur une plaque de gélose YED stérile. Si vous essuyez plusieurs fois le papier sur la gélose, vous devriez utiliser des colonies uniques et une grande tache de cellules se développera là où le papier est placé. Il faudra de 3 à 5 jours pour que de nombreuses souches cultivées de cette manière atteignent une taille appropriée. Les cultures envoyées de cette façon sont moins vulnérables aux intempéries et aux longs trajets.

K. Isoler des colonies uniques

De nombreuses expériences nécessitent la croissance de colonies à partir de cellules individuelles isolées. Ceci est facilement accompli en étalant les cultures sur une plaque de gélose avec l'extrémité plate d'un cure-dent. Le but de la technique est de diluer les cellules à la surface de la gélose en stries successives qui se chevauchent, jusqu'à ce que les cellules individuelles soient séparées ou distribuées pour former des colonies isolées. La figure ci-dessous illustre la technique, que vous devez pratiquer jusqu'à ce que vous soyez compétent.

La première étape consiste à faire une seule bande courte de cellules (environ 2 cm de long) près du bord de la gélose dans une boîte de Pétri. Avec un cure-dent frais, faites une deuxième série qui se chevauche, à un angle d'environ 15 degrés par rapport à la première, en faisant glisser les cellules de la première série sur la gélose fraîche. Faites plusieurs autres stries parallèles avec le même cure-dent. Ensuite, prenez un nouveau cure-dent et répétez le processus en commençant à la fin de la dernière série. Répétez cette séquence jusqu'à ce que toute la plaque soit couverte. Étant donné que la population de cellules produite à partir d'une seule cellule mère est un clone, il s'agit d'un processus de clonage de levure. Si une culture n'est pas pure, pour une raison quelconque, cela fournit une méthode pour isoler des clones purs. Le même résultat peut être obtenu en utilisant une boucle flammée et refroidie à chaque étape où un cure-dent frais est utilisé. Cette approche est plus lente et risque de faire frire les cellules.

Dans certaines expériences, nous transférons de nombreuses cultures d'un type de milieu à un ou plusieurs autres types, afin de déterminer les besoins de croissance des cultures. Cela peut être fait à l'aide de cure-dents ou de boucles, mais s'il y a de très nombreuses souches à transférer, cela devient laborieux. Une méthode simple et rapide - le placage de répliques - a joué un rôle majeur dans le développement de la génétique microbienne et est l'une des grandes économies de main-d'œuvre de tous les temps. Les expériences décrites ci-dessous peuvent être réalisées sans cette technique, mais elle est fascinante à faire et vaut la peine de la mettre en place. Même avec des expériences modestes, l'effort est un bon investissement à long terme.

Le principe du placage réplique est celui d'un tampon en caoutchouc.

Un tampon en velours de coton est utilisé pour tamponner une réplique du motif de cellules poussant sur une plaque sur une ou plusieurs autres plaques. L'appareil se compose d'un support cylindrique pour le velours qui est juste de la bonne taille pour s'adapter à l'intérieur du fond d'une plaque de Pétri, et d'un anneau quelconque pour maintenir le velours en place. Pour les assiettes en plastique standard de 10 cm, le diamètre approprié est d'environ 3,3 pouces. Le support peut être un cylindre de bois, de métal, de plastique ou de tout autre matériau que vous pouvez fabriquer. Il peut même s'agir d'une boîte de conserve d'une livre ou d'un autre récipient cylindrique lourd si le fond est plat. (Un cercle découpé dans un plateau de viande en mousse fait une bonne surface plane pour mettre sur une boîte de conserve) L'anneau pour tenir le velours peut être un gros collier de serrage, un autre objet trouvé ou même un gros élastique.

Le velours, bien sûr, doit être stérilisé, et le velours de coton nouvellement coupé doit généralement être délinté avec un morceau de ruban adhésif avant d'être stérilisé. Autoclavez-le et séchez-le soigneusement. Nous utilisons des carrés de six pouces, que nous empilons et enveloppons dans du papier, autoclaves, puis séchons sous vide. Si un autoclave n'est pas disponible, séchez-les dans un four chaud ou laissez-les simplement reposer sur le comptoir jusqu'à ce qu'ils sèchent. Pour réutiliser les carrés de velours, les rincer à l'eau claire et restériliser. D'autres tissus tels que plusieurs couches de gaze de coton peuvent être utilisés à la place du velours de coton.

Pour répliquer la plaque, retournez la plaque maîtresse, celle avec la levure dessus, sur le velours du support et appuyez fermement la plaque contre la surface du tissu stérile. Ensuite, décollez lentement la plaque en laissant une réplique ou une empreinte du motif cellulaire sur le velours. Transférez la réplique sur le velours sur une ou une série de plaques stériles en appuyant doucement chaque plaque sur le velours et en la faisant sauter. Il est possible de faire jusqu'à 20 répliques à partir d'une seule plaque maîtresse si nécessaire. La procédure est illustrée à la figure 13.

La manière dont vous retirez la plaque du velours contrôle la quantité de levure transférée du velours à la plaque ou de la plaque au velours. Si vous retirez la plaque principale du velours avec un mouvement lent et roulant, plus de levure restera sur le velours que si vous la retirez avec un mouvement vertical rapide. Il est souhaitable de transférer le moins de cellules possible et de toujours pouvoir voir l'empreinte des cellules sur la plaque de réplique.

M. Estimation du nombre de cellules de levure dans une culture

Il existe de nombreuses manières de compter directement les cellules, la plus courante utilisant des chambres de comptage pour le microscope ou des compteurs électroniques de particules. Ceux-ci ont peu de valeur instructive en génétique et ne conviennent pas à une utilisation générale en classe.Par conséquent, nous avons conçu des expériences qui ne dépendent pas de comptages de particules précis. Lorsque des comptages cellulaires sont nécessaires, nous les déterminons à partir du nombre de colonies sur les plaques (voir Procédures de dilution et de placage).

De nombreuses expériences, cependant, nécessitent de faire des estimations approximatives du nombre de cellules dans une suspension liquide afin d'obtenir un nombre raisonnable de colonies plaquées. Pour cela, vous utiliserez l'un des instruments optiques les plus sophistiqués et les plus sensibles qui existent : l'œil humain. Avec étonnamment peu de pratique, vous pouvez apprendre à estimer le nombre de cellules dans une suspension en la regardant simplement.

L'estimation visuelle de la densité cellulaire est basée sur le seuil assez élevé de l'œil pour observer la turbidité. Lorsqu'elles sont visualisées dans un tube standard de 13 x 100 mm, les suspensions de levure de moins d'environ 1 million de cellules par ml ne sont pas visiblement troubles. Au-dessus de ce seuil de densité, elles sont visiblement nuageuses. En ajustant le nombre de cellules dans une suspension jusqu'à ce qu'elles soient à peine visibles, vous pouvez obtenir une suspension de densité connue (environ 1 x 106 cellules/ml) puis utiliser des dilutions en série pour obtenir d'autres concentrations. (Voir aussi l'expérience Dilutions en série et comptages de cellules viables)

  • Tubes de culture stériles bouchés 13 x 100 ml
  • Eau stérile
  • Pipettes stériles de 1 ml (pipettes à bulbe jetables ou pipettes sérologiques et pompe à pipette)
  • Micropipette et embouts stériles (facultatif)

Procédure:
une. Placer 1 à 2 ml d'eau stérile dans un tube.
b. Utilisez une anse d'inoculation refroidie et flambée ou un cure-dent stérile pour suspendre une petite quantité de levure, de la taille d'une tête d'épingle, dans l'eau.
c. Mélangez soigneusement la suspension en tenant le tube sans serrer près de son sommet entre le pouce et l'index, et en le frappant près du fond avec la paume d'un ou plusieurs doigts de l'autre main, en lui donnant un mouvement tourbillonnant. (Le mouvement sourd se rapproche du geste que l'on ferait pour faire signe à quelqu'un de venir ici.)
Cette suspension doit contenir environ 1 x 107 cellules/ml, mais cette densité est difficile à juger, nous allons donc la diluer avant de juger de sa densité.
ré. Pipeter 0,9 ml d'eau stérile dans un tube avec une pipette stérile de 1,0 ml.
e. Diluer 0,1 ml de votre suspension cellulaire dans ce tube et le battre. Comparez-le avec un tube contenant de l'eau stérile. Si le tube avec les cellules est à peine trouble, alors il contient à peu près 1 x 106 cellules/ml.
F. Si le tube n'est pas visiblement trouble, ajoutez des volumes supplémentaires de 0,1 ml de la suspension d'origine jusqu'à ce qu'il le soit. Si vous pensez qu'il est plus trouble que la limite de visibilité, ajoutez plus d'eau stérile. Ajustez les volumes d'eau et de cellules jusqu'à ce que vous soyez convaincu. Gardez une trace des volumes que vous ajoutez afin de connaître la dilution finale que vous avez effectuée.

N. Procédures de dilution et de placage

Dans de nombreuses expériences, il faut étaler un nombre approximativement connu de cellules sur une plaque pour former des colonies. Nous utilisons des dilutions en série, en faisant plusieurs petites dilutions, l'une après l'autre, au lieu de faire une grande dilution. La méthode économise de la matière et évite l'utilisation de gros volumes difficiles à mesurer et à stériliser.

  • Tubes de culture stériles bouchés 13 x 100 ml
  • Eau stérile
  • Pipettes stériles de 1 ml (pipettes à bulbe jetables ou pipettes sérologiques et pompe à pipette)
  • Micropipette et embouts stériles (facultatif)
  • Trombone ou épandeur en verre : Les cellules sont réparties sur la surface de la gélose avec des épandeurs.

Faire des dilutions en série :
La procédure suivante donne une série de dilutions qui varient par des facteurs de dix. Vous pourrez utiliser cette procédure pour la plupart des expériences qui nécessitent des dilutions en série (Figure 12).

une. Préparer une suspension contenant environ 1 x 106 cellules/ml dans de l'eau stérile en suivant la procédure décrite dans Estimation du nombre de cellules de levure dans une culture.
b. Pipeter 0,9 ml d'eau stérile dans chacun des trois tubes et les étiqueter. Nous vous recommandons de faire un schéma dans votre cahier montrant la procédure et la signification de vos étiquettes.
c. Remettre en suspension les cellules dans la suspension d'origine. Prélevez 0,1 ml avec la micropipette et un embout neuf et transférez-le dans l'un des tubes d'eau. Frappez ensuite le tube pour suspendre les cellules.
ré. Répétez la procédure en série, en utilisant une nouvelle pipette ou un embout de pipette pour chacun des tubes restants, de sorte que chaque tube contienne 1/10e du nombre de cellules que le précédent. La troisième dilution doit contenir environ 1 x 103 cellules/ml.

Placage des dilutions :
Si vous vous attendez à ce que toutes les cellules se développent, vous n'étalerez que la dilution finale, car les autres tubes seraient trop concentrés et les plaques fabriquées à partir d'eux contiendraient trop de colonies à compter. Cependant, dans les expériences d'irradiation, vous utiliserez les dilutions contenant plus de cellules pour compenser le nombre réduit de cellules qui survivent à l'irradiation. De cette façon, vous obtiendrez un nombre optimal de colonies à compter sur chaque plaque, même lorsque la plupart des cellules sont mortes.

e. Vous aurez de meilleures données si vous faites tous les placages en double ou en triple. Étiquetez d'abord les plaques à l'aide d'un marqueur (un Pilot SC-UF ou un Sharpie). (Vous utiliserez également ce même type de stylo pour marquer les colonies lorsque vous les compterez.) Nous vous recommandons d'identifier chaque plaque avec le numéro de la souche, la dose (pour les expériences de rayonnement), la plaque de dilution et vos initiales, mais vous préférerez peut-être pour coder cette information dans vos notes et mettre les lettres ou chiffres du code sur la plaque. Écrivez uniquement sur le couvercle ou en minuscules sur le bord du fond, en laissant le fond dégagé pour marquer les colonies lorsque vous les comptez.

F. Remettre en suspension les cellules dans chaque tube en le frappant avant de prélever un échantillon, puis pipeter 0,1 ml au centre de chacune des plaques en double. Si vous utilisez des épandeurs de trombones, prenez un épandeur stérile de l'enveloppe. Si vous utilisez un épandeur en verre, retirez-le de l'alcool, allumez-le dans une flamme et, une fois la flamme éteinte, touchez-le à la gélose de l'une des plaques loin des cellules. Répartir les cellules sur la surface avec l'un ou l'autre épandeur, en prenant soin de garder les cellules à au moins 0,5 cm du bord de la gélose. (Si vous utilisez la méthode d'étalement par coulée, pipetez 0,1 ml de la suspension dans 0,9 ml d'eau stérile. Mélangez les cellules dans l'eau. Versez tout le mélange sur la surface de la gélose, puis inclinez et faites pivoter la plaque jusqu'à ce que le mélange soit uniformément réparti sur la surface de la gélose.)

O. Examen microscopique de la levure

La façon la plus simple d'examiner les levures au microscope est de les regarder directement sur la plaque. Cela ne fonctionne qu'avec des objectifs de faible puissance (10x) car les objectifs de puissance plus élevée se rapprochent trop de la gélose et s'embuent. Pour voir plus de détails, faites une diapositive à montage humide. Mettez une goutte d'eau sur une lame de microscope. Transférez une petite quantité de levure dans l'eau avec un cure-dent stérile et remuez un peu. Ensuite, placez une lamelle sur la suspension de levure sur la lame. Si les préparations doivent être vues par un certain nombre d'étudiants, scellez la lamelle sur la lame avec du vernis à ongles et la lame sera visible pendant plusieurs heures. L'immersion dans l'huile ne devrait pas être nécessaire et pour simplement observer les formes des cellules, il n'est pas nécessaire de les colorer. Avec des méthodes de coloration appropriées, le noyau peut être vu, mais la levure chromosomes sont trop petits pour être vus avec la plupart des microscopes optiques.

Pour les démonstrations en classe, vous pouvez utiliser un microscope vidéo. Il existe un certain nombre de très bons microscopes vidéo disponibles sur le marché. Si vous n'en avez pas, il est possible d'obtenir plusieurs des mêmes résultats avec un microscope de classe et une caméra vidéo domestique. Lorsque nous regardons au microscope, nos yeux sont focalisés à l'infini. Si nous plaçons une caméra vidéo près de l'oculaire du microscope et réglons la mise au point de la caméra à l'infini, elle « verra » la même chose que nos yeux. Il aide à couper la lumière entrant par le côté en enveloppant l'objectif de la caméra et l'oculaire du microscope avec un morceau de tissu sombre ou de papier d'aluminium.

Les expériences utilisent les souches suivantes :

Q. Irradier la levure avec un rayonnement ultraviolet

Les lampes UV-C germicides standard, qui sont des tubes à décharge de vapeur de mercure à basse pression, constituent une source UV idéale pour irradier la levure de type sauvage avec des enzymes de réparation de l'ADN normales. Les lampes solaires ou à quartz halogènes sont de bonnes sources d'UV pour irradier des souches mutantes de levure déficientes en enzymes normales de réparation de l'ADN.

Les lampes UV-C germicides standard sont des tubes fluorescents courants sans revêtement fluorescent et avec une enveloppe transparente aux ultraviolets. Le spectre du mercure à basse pression est un spectre de raies dont la raie la plus proéminente a une longueur d'onde de 253,7 nanomètres. C'est fortuitement proche des 260 nanomètres qui est optimal pour l'absorption par ADN.

La conception de l'U.V. La chambre de rayonnement est dictée par plusieurs considérations, la plus importante étant la sécurité. (Voir Instructions pour la construction d'une chambre de rayonnement UV) Le rayonnement émis par les lampes germicides provoquera des brûlures douloureuses et dangereuses aux yeux et à la peau, ils doivent donc être protégés efficacement. L'exposition aux cellules ne peut pas être contrôlée en allumant et en éteignant la lampe car l'intensité de sortie de la lampe dépend fortement de la température. Par conséquent, il doit être enfermé dans une boîte blindée avec un mécanisme d'obturation afin qu'il puisse se réchauffer à une température constante avant d'être utilisé. La porte et le volet doivent être verrouillés afin qu'ils ne puissent pas être ouverts tous les deux en même temps.

Mode opératoire pour chambre à rayonnement UV :

1. Branchez la lampe et allumez-la. Vous pouvez savoir en toute sécurité quand la lampe est allumée en voyant le voyant lumineux.
2. Laissez la lampe se réchauffer pendant 30 minutes, si possible.
3. Centrez la boîte de Pétri à exposer sur la marque au fond de la boîte, retirez le couvercle de la plaque, abaissez doucement la porte et ouvrez le volet. Mesurez le temps d'exposition à partir du moment où l'obturateur s'est ouvert. Lorsque le temps est écoulé, fermez le volet, soulevez doucement la porte, mettez le couvercle sur la boîte de Pétri et retirez-la. Un déplacement trop rapide de la porte provoque des turbulences d'air susceptibles d'entraîner une contamination des plaques de gélose. Si le boîtier est équipé d'une ampoule UV-B, la même procédure peut être suivie.

Procédure d'exposition à l'aide du soleil ou des lampes de jardin halogènes à quartz :

1. Couvrez le plat avec du papier foncé et pendant qu'il reste couvert, placez le plat à un angle de 90 degrés par rapport à la source lumineuse. Si vous utilisez une lampe halogène à quartz, retirez le couvercle en verre de la lampe. Bien que le soleil et la lampe de jardin produisent moins de rayonnement UV que le tube germicide, il faut tout de même prendre des précautions raisonnables. Ne regardez pas directement la source et évitez toute exposition directe à long terme à la peau.

ATTENTION : Une ampoule halogène à quartz devient très chaude. L'utilisation de cette lampe doit être sous la supervision directe de l'enseignant.

2. Retirez le couvercle sombre de la plaque et commencez à mesurer le temps d'exposition. Lorsque le temps s'est écoulé, couvrir le plat et le déplacer vers l'incubateur. Il n'est généralement pas nécessaire de retirer le couvercle des boîtes de Pétri en plastique lorsque vous utilisez le soleil ou les lampes de jardin halogènes à quartz comme source UV. La plupart des boîtes de Pétri en plastique sont transparentes aux longueurs d'onde des UV produites par ces sources. Vous voudrez peut-être effectuer une expérience d'essai sur chaque nouveau lot de boîtes de Pétri. Si vous obtenez des taux de survie plus élevés que prévu, vous souhaiterez peut-être retirer les couvercles pendant l'exposition aux UV. Si la contamination devient un problème, vous pouvez recouvrir la vaisselle d'une fine pellicule de plastique ou d'un sac à sandwich. Ces films plastiques minces n'absorberont pas des quantités importantes d'UV.


Colonisation et autonomie gouvernementale précoce

L'ouverture du 17ème siècle a trouvé trois pays - la France, l'Espagne et l'Angleterre - en lice pour la domination en Amérique du Nord. Parmi ceux-ci, l'Angleterre, la plus tardive sur la scène, a finalement pris le contrôle des débuts de ce qui est maintenant les États-Unis. Les Français, troublés par les guerres étrangères et les querelles religieuses internes, ont longtemps manqué de réaliser les grandes possibilités du nouveau continent, et leurs établissements dans la vallée du Saint-Laurent ont diminué. Les Espagnols étaient préoccupés par l'Amérique du Sud et les terres baignées par les Caraïbes et le golfe du Mexique. Mais les Anglais, après les échecs initiaux sous Sir Humphrey Gilbert et Sir Walter Raleigh, ont implanté des établissements solides tout le long du Maine à la Géorgie, les ont nourris d'un flux constant de personnes et de capitaux, et ont rapidement absorbé la plus petite entreprise de colonisation des Hollandais dans le Hudson Valley et le petit effort suédois sur la rivière Delaware. En un siècle et demi, les Britanniques avaient 13 colonies florissantes sur la côte atlantique : Massachusetts, New Hampshire, Rhode Island, Connecticut, New York, Pennsylvanie, Delaware, New Jersey, Maryland, Virginie, Caroline du Nord, Caroline du Sud et Géorgie.

En peu de temps, les colons ont poussé de la bande de Tidewater vers les Appalaches et ont finalement traversé les montagnes par le Cumberland Gap et la rivière Ohio. Décennie après décennie, ils sont devenus moins européens dans leurs habitudes et leurs perspectives et plus américains, la frontière en particulier leur marquant. Leur liberté de la plupart des héritages féodaux de l'Europe occidentale et l'autonomie qu'ils ont nécessairement acquise en soumettant la nature les ont rendus hautement individualistes.


Vecteurs d'expression : 5 choses à savoir | Clonage

C'est souvent le produit du gène cloné, plutôt que le gène lui-même, qui présente un intérêt primordial, en particulier lorsque la protéine a une valeur commerciale, thérapeutique ou de recherche.

Grâce à une meilleure compréhension des principes fondamentaux du métabolisme de l'ADN, de l'ARN et des protéines et de leur régulation, les chercheurs peuvent désormais manipuler les cellules pour exprimer des gènes clonés afin d'étudier leurs produits protéiques.

Les vecteurs d'expression sont conçus pour que tout insert cloné puisse être transcrit en ARN et, dans de nombreux cas, même traduit en protéine. Des bibliothèques d'expression d'ADNc peuvent être construites dans des vecteurs spécialement conçus dérivés de plasmides ou de bactériophage l.

Les protéines codées par les divers clones d'ADNc dans de telles bibliothèques d'expression peuvent être synthétisées dans les cellules hôtes, et si des dosages appropriés sont disponibles pour identifier une protéine particulière, son clone d'ADNc correspondant peut être identifié et isolé. Des vecteurs d'expression conçus pour l'expression d'ARN ou l'expression de protéines, ou les deux, sont disponibles.

Chose # I. Expression de l'ARN:

Un vecteur pour l'expression in vitro d'inserts d'ADN en tant que transcrits d'ARN peut être construit en plaçant un promoteur hautement efficace adjacent à un site de clonage polyvalent. La figure 4.14 représente un tel vecteur d'expression. L'ADN vecteur recombinant linéarisé est transcrit in vitro en utilisant l'ARN polymérase SP6. De grandes quantités de produit d'ARN peuvent être obtenues de cette manière si des ribonucléotides radioactifs sont utilisés comme substrats, des molécules d'ARN marquées utiles comme sondes sont fabriquées.

Chose # II. Expression des protéines:

Étant donné que les ADNc sont des copies d'ADN d'ARNm, les ADNc sont des copies ininterrompues des exons de gènes exprimés. Parce que les ADNc manquent d'introns, il est possible d'exprimer ces versions d'ADNc de gènes eucaryotes dans des hôtes procaryotes qui ne peuvent pas traiter les transcrits primaires complexes de gènes eucaryotes. Pour exprimer une protéine eucaryote dans E. coli, l'ADNc eucaryote doit être cloné dans un vecteur d'expression qui contient des signaux régulateurs à la fois pour la transcription et la traduction.

En conséquence, un promoteur où l'ARN polymérase initie la transcription ainsi qu'un site de liaison au ribosome pour faciliter la traduction sont manipulés dans le vecteur juste en amont du site de restriction pour insérer l'ADN étranger. Le codon d'initiation AUG qui spécifie le premier acide aminé dans la protéine (le site de démarrage de la traduction) est apporté par l'insert (Fig. 4.15).

Des promoteurs puissants ont été construits qui conduisent la synthèse de protéines étrangères à des niveaux égaux à 30 % ou plus de la protéine cellulaire totale d'E. coli. Un exemple est le promoteur hybride, ptac, qui a été créé en fusionnant une partie du promoteur des gènes d'E. coli codant pour les enzymes du métabolisme du lactose (le promoteur lac) avec une partie du promoteur des gènes codant pour les enzymes de la biosynthèse du tryptophane ( le promoteur trp) (Fig. 4.16).

Dans les cellules portant des vecteurs d'expression ptac, le promoteur ptac n'est pas induit pour conduire la transcription de l'insert étranger jusqu'à ce que les cellules soient exposées à des inducteurs qui conduisent à son activation. Les analogues du lactose (un -galactoside) tels que l'isopropyl-β-thiogalactoside, ou IPTG, sont d'excellents inducteurs de ptac. Ainsi, l'expression de la protéine étrangère est facilement contrôlée. La production bactérienne de protéines eucaryotes précieuses représente l'une des utilisations les plus importantes de la technologie de l'ADN recombinant.

Par exemple, l'insuline humaine pour le traitement clinique du diabète est maintenant produite dans des bactéries. Des systèmes analogues pour l'expression de gènes étrangers dans des cellules eucaryotes comprennent des vecteurs portant des éléments promoteurs dérivés de virus de mammifères, tels que le virus simien 40 (SV40), le virus d'Epstein-Barr et le cytomégalovirus humain (CMV).

Un système d'expression de haut niveau de gènes étrangers utilise des cellules d'insectes infectées par le vecteur d'expression baculovirus. Les baculovirus infectent les insectes lépidoptères (papillons et mites). Dans les vecteurs baculovirus modifiés, le gène étranger est cloné en aval du promoteur de la polyédrine, une protéine structurale virale majeure codée, et le vecteur recombinant est incorporé peut conduire à une accumulation du produit du gène étranger à des niveaux aussi élevés que 500 mg/l.

Chose # III. Criblage de bibliothèques d'expressions d'ADNc avec des anticorps:

Des anticorps qui réagissent spécifiquement de manière croisée avec une protéine d'intérêt particulière sont souvent disponibles. Si tel est le cas, ces anticorps peuvent être utilisés pour cribler une bibliothèque d'expression d'ADNc afin d'identifier et d'isoler des clones d'ADNc codant pour la protéine. La banque d'ADNc est introduite dans des bactéries hôtes, qui sont étalées et cultivées pendant une nuit, comme dans le schéma d'hybridation de colonies décrit précédemment.

Des membranes de nylon liant l'ADN sont placées sur les plaques pour obtenir une réplique des colonies bactériennes. La membrane de nylon est ensuite incubée dans des conditions qui induisent la synthèse des protéines à partir des inserts d'ADNc clonés, et les cellules sont traitées pour libérer la protéine synthétisée.

La protéine synthétisée se lie étroitement à la membrane en nylon, qui peut ensuite être incubée avec l'anticorps spécifique. La liaison de l'anticorps à son produit protéique cible révèle la position de tout clone d'ADNc exprimant la protéine, et ces clones peuvent être récupérés à partir de la plaque d'origine. Comme d'autres bibliothèques, les bibliothèques d'expression peuvent également être criblées avec des sondes oligonucléotidiques.

Chose # IV. Expression de la protéine de fusion:

Certains vecteurs d'expression portent des inserts d'ADNc clonés directement dans la séquence codante d'un gène codant pour une protéine porté par le vecteur (Fig. 4.17). La traduction de la séquence recombinante conduit à la synthèse d'une protéine hybride ou d'une protéine de fusion. La région N-terminale de la protéine fusionnée représente les séquences d'acides aminés codées dans le vecteur, tandis que le reste de la protéine est codé par l'insert étranger.

Gardez à l'esprit que la séquence de codon triplet dans l'insert cloné doit être en phase avec les codons apportés par les séquences vectorielles pour fabriquer la bonne protéine. La séquence protéique N-terminale apportée par le vecteur peut être choisie en fonction des objectifs. De plus, l'ajout d'une séquence signal N-terminale qui cible la protéine hybride pour la sécrétion à partir de la cellule simplifie la récupération de la protéine de fusion.

Divers systèmes de fusion de gènes ont été développés pour faciliter l'isolement d'une protéine spécifique codée par un insert cloné. Les procédures d'isolement sont basées sur la purification par chromatographie d'affinité de la protéine de fusion grâce à l'exploitation des propriétés uniques de liaison et de liaison de la protéine codée par le vecteur (tableau 4.2).

Chose # V. 1 -β-galactosidase et sélection bleue ou blanche:

Une version de ces vecteurs d'expression de protéine de fusion place le site de clonage à la fin de la région codante de la protéine β-galactosidase, de sorte qu'entre autres la protéine de fusion est attachée à la β-galactosidase et peut être récupérée en purifiant la -galactosidase activité.

Alternativement, placer le site de clonage dans la région codant pour la -galactosidase signifie que les inserts clonés perturbent la séquence d'acides aminés de la β-galactosidase, inactivant son activité enzymatique. Cette propriété a été exploitée pour développer un protocole de criblage visuel qui distingue les clones de la bibliothèque qui portent des inserts de ceux qui en sont dépourvus.

Les cellules qui ont été transformées avec une bibliothèque d'ADNc d'expression de -galactosidase à base de plasmide (ou infectées avec une bibliothèque similaire construite dans un vecteur de fusion de -galactosidase à base de bactériophage ) sont étalées sur des milieux contenant du 5-bromo-4-chloro-3 -indolyl-β-D-galactopyranoside, ou X-gal (Fig. 4.18).

Le X-gal est un substrat chromogène, une substance incolore qui, lors d'une réaction enzymatique, donne un produit coloré. Après induction à l'IPTG, les colonies bactériennes (ou plaques) abritant des vecteurs dans lesquels le gène de la -galactosidase est intact (les vecteurs dépourvus d'inserts) expriment une β-galactosidase active qui clive X-gal, libérant le 5-bromo-4-chloro-indoxy , qui se dimérise pour former un produit bleu indigo.

Ces colonies bleues (ou plages) représentent des clones dépourvus d'inserts. Le gène de la P-galactosidase est inactivé dans les clones avec inserts, de sorte que les colonies (ou plaques) qui restent « blanches » (en fait, incolores) sont des clones recombinants.


Voir la vidéo: ..Вставай, поднимайся рабочий народ! Федерация Независимых Профсоюзов России (Mai 2022).


Commentaires:

  1. Faejas

    Votre idée est très bonne

  2. Kehn

    Excellente idée et période



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