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12.5 : BCL-2 - Biologie

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BCL-2 est un proto-oncogène humain situé sur le chromosome 18. Son produit est une protéine membranaire intégrale (appelée Bcl-2) située dans les membranes du réticulum endoplasmique (RE), l'enveloppe nucléaire et dans les membranes externes des mitochondries. Le gène a été découvert en tant que locus transloqué dans un B-caune jeeukémie (d'où le nom). Cette translocation se retrouve également dans certains lymphomes à cellules B.

Dans les cellules B cancéreuses, la partie du chromosome 18 contenant le BCL-2 locus a subi une translocation réciproque avec la partie du chromosome 14 contenant le locus de la chaîne lourde de l'anticorps. Cette translocation t(14;18) place le BCL-2 gène proche de l'amplificateur du gène de la chaîne lourde. Cet activateur est très actif dans les cellules B (dont le travail consiste à synthétiser de grandes quantités d'anticorps). Il n'est donc pas surprenant de constater que la protéine Bcl-2 est exprimée à des niveaux élevés dans ces cellules t(14;18).

Ce qui rend BCL-2 un proto-oncogène ?

Les lymphocytes B, comme tous les lymphocytes activés, meurent quelques jours après avoir eu la chance de faire leur travail. Cela garantit qu'ils ne s'attardent pas une fois que la menace a été traitée et ne tournent leur attaque contre les composants du soi. Les cellules B vieillissantes se tuent en apoptose. Cependant, des niveaux élevés de la protéine Bcl-2 protègent les cellules d'une mort précoce par apoptose. La protéine Bcl-2 supprime l'apoptose en empêchant l'activation des caspases qui effectuent le processus. Ainsi, des gènes codant pour des inhibiteurs de l'apoptose doivent être ajoutés à la liste des gènes pouvant agir comme oncogènes. Dans ce cas, l'effet n'est pas obtenu en augmentant le taux de prolifération cellulaire mais en réduisant le taux de mort cellulaire.

Bien que la translocation t (14:18) se trouve dans les lymphomes et les leucémies à cellules B, quelque chose d'autre doit contribuer à la création du cancer car plus de 50% d'entre nous ont un petit nombre de cellules B avec cette translocation qui ne progresse jamais en cancer. Les loci du gène des anticorps sont des endroits dangereux pour les proto-oncogènes pour s'installer. Translocation du proto-oncogène c-myc proche de l'amplificateur des gènes de la chaîne lourde de l'anticorps produit également des cellules B cancéreuses entraînant le lymphome de Burkitt. La translocation de la BCL-2 locus n'est qu'une des nombreuses mutations qui peuvent donner naissance à un clone malin de cellules B. Toutes les leucémies résultantes sont désignées la leucémie lymphocytaire chronique ou LLC.


L'origan démontre des effets suppresseurs de tumeur distincts dans le modèle de carcinome du sein

But: L'identification d'aliments végétaux naturels a suscité un intérêt considérable pour le développement d'agents efficaces contre le cancer. Ainsi, les effets antitumoraux de l'origan dans le modèle de cancer du sein in vivo et in vitro ont été évalués.

Méthodes : L'origan lyophilisé (ORE) a été administré à deux concentrations de 0,3 et 3 % par l'alimentation. L'expérience a pris fin 14 semaines après l'administration du cancérogène. À l'autopsie, les tumeurs mammaires ont été prélevées et préparées pour une analyse histopathologique et immunohistochimique. De plus, une évaluation in vitro dans des cellules MCF-7 a été réalisée.

Résultats: L'ORE à faible dose a supprimé la fréquence tumorale de 55,5 %, l'incidence tumorale de 44 % et le volume tumoral de 44,5 % par rapport aux animaux témoins. L'analyse des cellules tumorales de rat a montré une diminution de l'expression de Ki67, VEGFR-2, CD24 et EpCAM et une augmentation de l'expression de la caspase-3 après un traitement ORE à faible dose. De plus, l'ORE à haute dose a allongé la latence tumorale de 12,5 jours, une diminution de l'expression de Bcl-2, VEGFR-2, CD24 et EpCAM et une augmentation de l'expression de la caspase-3 dans les cellules de carcinome ont été observées. L'analyse histopathologique a révélé une diminution du rapport des carcinomes de haut/bas grade dans les deux groupes traités. Des études in vitro ont montré que l'ORE diminuait la survie et la prolifération des cellules MCF-7. Dans les cellules MCF-7 traitées à l'ORE, une augmentation des cellules exprimant le sous-G 0/G 1 La teneur en ADN et une augmentation du pourcentage de cellules MCF-7 positives à l'annexine V/PI ont été observées. In vitro, des voies apoptotiques à la fois dépendantes de la caspase et non dépendantes de la caspase ont été trouvées. La désactivation de l'activité anti-apoptotique de Bcl-2, une diminution du potentiel membranaire mitochondrial et l'activation de la voie de l'apoptose mitochondriale ont été observées dans les cellules MCF-7 traitées par ORE.

Conclusion : Nos résultats démontrent, pour la première fois, un effet suppresseur de tumeur distinct de l'origan dans le modèle de cancer du sein.

Mots clés: Angiogenèse Apoptose Cellules souches cancéreuses Prolifération cellulaire Cellules MCF-7 Cancérogenèse mammaire Origan Rat.


Rôle de l'activation de l'autophagie dans l'atténuation de la neurotoxicité de l'alcool

Protéine de la famille Bcl-2

Les protéines de la famille Bcl-2 sont des cibles connues de l'exposition à l'alcool dans le cerveau ( Heaton et al., 2015 ). Ils sont bien connus pour leur régulation de la mort/survie cellulaire. Des études récentes indiquent que les protéines de la famille Bcl-2 jouent un double rôle dans la régulation de l'autophagie en plus de leur rôle dans la survie cellulaire ( Decuypere et al, 2012 Hardwick et Soane, 2013 ). Les protéines antiapoptotiques de la famille Bcl-2, telles que Bcl-2, Bcl-xL et Mcl-1, peuvent supprimer l'autophagie en se liant directement à Beclin1. Il semble que seule la protéine Bcl-2 ER-résidée supprime l'autophagie ( Pattingre et al., 2005 Chang et al., 2010 ). En plus de se lier à Beclin1, Bcl-2 et Bcl-xL peuvent également réguler négativement la réponse autophagique en contrôlant l'homéostasie calcique du RE qui joue un rôle important dans l'initiation de l'autophagie ( Brady et al., 2007 Høyer-Hansen et al ., 2007 ). Contrairement aux protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, les protéines pro-apoptotiques uniquement BH3, telles que Bnip3, Bnip3L/Nix, Bad, Bik, Noxa, Puma et Bim, induisent généralement l'autophagie par leur liaison à Bcl-2 et le déplacement ultérieur de la inhibiteur Bcl-2 du complexe Beclin1. Cependant, le rôle des protéines pro-apoptotiques Bax et Bak dans l'autophagie est controversé. Des régulations positives et négatives de l'autophagie par Bax et Bak ont ​​été rapportées ( Ding et al., 2011 ).

Il a été montré que l'éthanol module la protéine de la famille Bcl-2 dans les neurones in vitro et in vivo ( Ge et al., 2004 Liu et al., 2009 Heaton et al., 2011, 2015 Ali Shah et al., 2013 ). Généralement, l'alcool diminue l'expression des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 mais augmente l'expression des protéines anti-apoptotiques, ce qui peut activer l'autophagie.


Résultats

Protéine Bcl-2 recombinante avec la séquence transmembranaire (TM) C-terminale remplacée par une His6-tag (Son6-Bcl-2ΔTM) a été préparé. Le liposome a été fabriqué avec les lipides caractéristiques de MOM et un analogue lipidique chélatant Ni 2+ qui se lie au His6-tag à l'extrémité C-terminale du Bcl-2 recombinant, générant ainsi un Bcl-2 attaché à la membrane imitant le Bcl-2 lié à MOM natif. Le liposome a également été chargé avec un colorant fluorescent, Cascade Blue (CB, Mr 𢏀,5 kDa), ou des dextranes marqués au CB (Mr 𢏃 ou 10 kDa). La formation de pores par le Bcl-2 libérerait les molécules fluorescentes du liposome, qui seraient liées par l'anticorps anti-CB à l'extérieur du liposome, provoquant une réduction (extinction) de la fluorescence CB. L'étendue et la cinétique de l'extinction de la fluorescence indiquent l'étendue et la cinétique de la libération de colorant du liposome, qui sont directement en corrélation avec l'étendue et la cinétique de la formation de pores Bcl-2 dans la membrane.

Corrélation directe entre la concentration et la taille des pores de Bcl-2

En utilisant l'approche ci-dessus, nous avons examiné l'étendue de la libération des trois molécules fluorescentes de tailles différentes par différentes concentrations de Bcl-2 après interaction avec tBid. Comme le montre la figure 1A, une libération significative de 0,5 kDa CB a commencé à une concentration de Bcl-2 inférieure (25 nM) à celle de 3-kDa CB-dextran (50 nM). La libération de 10 kDa de CB-dextrane n'a pas été détectée même à la concentration de Bcl-2 la plus élevée (100 nM). Si les pores de Bcl-2 ne sont formés que par des monomères, ces pores doivent avoir une taille uniforme qui sera indépendante de la concentration de Bcl-2. Puisque les résultats montrent que la taille des pores de Bcl-2 dépend positivement de la concentration de Bcl-2, cela suggère que l'oligomérisation de Bcl-2 est impliquée dans la formation des pores, au moins les plus grands.

UNE, étendue de la libération de colorants CB de 0,5 kDa (barre noire), 3 (barre étirée) ou 10 kDa (barre blanche) CB-dextrans à partir de liposomes chélateurs de Ni 2+ 12,5 μM par diverses concentrations de His6-La protéine Bcl-2ΔTM en présence ou en l'absence de 10 nM tBid a été déterminée par le degré d'extinction de la fluorescence (Bcl-2ΔTM/㥏Triton) après une incubation de 3 heures à pH 7,4. Les données présentées sont des moyennes de trois expériences indépendantes avec écart type (S.D., barre d'erreur). B, cinétique de libération du colorant CB et des CB-dextrans de 12,5 μM Ni 2+ -liposome par 100 nM His6-Bcl-2ΔTM et 10 nM tBid à pH 7,4 ont été mesurés en surveillant en continu l'étendue de l'extinction de la fluorescence pendant 3 heures. Les données présentées sont des moyennes de trois expériences indépendantes avec S.D. (barres d'erreur). (□) 0,5-kDa CB (●) 3-kDa CB-dextran (○) 10-kDa CB-dextran (■) le contrôle négatif, liposome chargé de 0,5-kDa CB incubé avec un tampon protéique .

Corrélation inverse entre la cinétique de libération du colorant par Bcl-2 et la taille du colorant

Pour tester davantage le modèle de formation de pores Bcl-2, la cinétique de libération de colorants de différentes tailles a été examinée. Comme le montre la figure 1B, même si 0,5 kDa CB et 3-kDa CB-dextran ont été libérés du liposome par 100 nM de Bcl-2 après interaction avec tBid, le petit colorant a été libéré à un taux plus élevé que le grand. Le temps pour la moitié de la libération maximale (t1/2) pour le CB et le CB-dextrane était de 𢏃 et 30 min, respectivement. Le CB-dextran de 10 kDa n'a pas été libéré même après des heures d'incubation, écartant la possibilité qu'une exposition prolongée des liposomes à Bcl-2 et tBid puisse causer des dommages non spécifiques à la membrane. Si les pores de Bcl-2 ne sont formés que par des monomères, les colorants de différentes tailles doivent être libérés du liposome au même taux que celui dicté par le taux de conversion de Bcl-2 de la conformation membranaire à la conformation des pores, un constante à une concentration protéique donnée. En revanche, si l'oligomérisation est impliquée dans la formation des pores, la vitesse de libération du petit colorant doit être supérieure à celle du gros colorant puisque la vitesse de formation des petits pores oligomères doit être supérieure à celle des gros pores oligomères. Par conséquent, les données cinétiques ci-dessus fournissent un soutien supplémentaire au modèle selon lequel les protéines Bcl-2 forment des pores via l'oligomérisation.

Amélioration de la formation de pores par oligomérisation Bcl-2

Pour déterminer l'effet de l'oligomérisation de Bcl-2 sur la formation de pores, nous avons utilisé des protéines Bcl-2 dans différents états oligomères ou de différentes puissances d'oligomérisation. Pendant la purification de son6-Bcl-2ΔTM, nous avons observé que la protéine était éluée de la colonne de filtration sur gel Superdex 200 principalement dans les fractions monomères et oligomères, à en juger par leur co-élution avec les normes protéiques de 25 et 200 kDa, respectivement (Fig. 2A ). La protéine dans les deux fractions est pure à 90 % selon l'analyse SDS-PAGE suivie d'une coloration au bleu de Coomassie (figure 2B). L'identité de la protéine a été confirmée par immunotransfert en utilisant un anticorps spécifique de Bcl-2 (figure 2C). La masse molaire moyenne en poids de la protéine monomère est de 24 540 ± 982 g/mol telle que déterminée par l'analyse de diffusion de la lumière multi-angles (Fig. 2D), proche de la valeur calculée pour His monomère6-Bcl-2ΔTM, 24 795 g/mol, confirmant que la protéine monomère est la Bcl-2 monomère. Il est concevable que la protéine oligomère soit un oligomère Bcl-2 puisqu'elle s'élue plus tôt que la protéine monomère de la colonne de filtration sur gel. Le monomère et l'oligomère Bcl-2 purifiés sont assez stables puisqu'ils ont été élués dans la fraction correspondante après une seconde chromatographie de filtration sur gel (figure 2E). Cela nous a permis de tester quelle forme de protéine Bcl-2 est la plus efficace dans la formation de pores. Comme le montre la figure 2F, les protéines Bcl-2 tant monomères qu'oligomères ont libéré la même quantité de CB-dextranes de 3 kDa des liposomes après une incubation de 3 heures. Cependant, la cinétique de libération du colorant par les deux formes de Bcl- est différente. Le taux de libération induit par l'oligomère Bcl-2 est beaucoup plus élevé que celui par le monomère depuis t1/2 pour le premier est 𢏃,3 min et le dernier � min. Ces résultats démontrent que, bien que l'oligomère et le monomère de Bcl-2 soient tous deux compétents pour la formation de pores, l'oligomère est beaucoup plus efficace dans la formation de pores que le monomère, indiquant que l'oligomérisation de Bcl-2 est une étape intermédiaire pendant la formation de pores. réaction de formation.

UNE, oligomérisation de His6-Bcl-2ΔTM a été examiné par chromatographie de filtration sur gel. Le A280 a été contrôlée pour chaque fraction éluée et tracée. Les positions d'élution pour les standards de protéines sont indiquées en haut du graphique avec le M correspondantr. B, pureté à la fois du monomère (piste 1) et de l'oligomère (piste 2) His6-Les protéines Bcl-2ΔTM éluées de la colonne de filtration sur gel ci-dessus ont été analysées par SDS-PAGE et coloration de Coomassie. Mr des standards de protéines est indiqué sur la gauche du gel. C, identité du monomère (piste 1) et oligomère (piste 2) His6-Les protéines Bcl-2ΔTM ont été déterminées par immunoblot en utilisant un anticorps spécifique de Bcl-2. , masse molaire moyenne en poids de His6-Le monomère Bcl-2ΔTM élué de la colonne de filtration sur gel a été déterminé par analyse de diffusion de la lumière multi-angle. E, stabilité de His sauvage6-L'oligomère Bcl-2ΔTM (top plot, ●) et le monomère (bottom plot, ■), ou le monomère mutant G154A/G155A (bottom plot, ○) en solution a été testé en injectant les fractions correspondantes de la première colonne de filtration sur gel dans la seconde chromatographie. F, cinétique de libération de 3-kDa CB-dextran de 12,5 μM Ni 2+ -liposome par 100 nM His6-Bcl-2ΔTM monomère ou oligomère et 10 nM tBid à pH 7,4 ont été contrôlés comme ci-dessus. Les données présentées sont des moyennes avec S.D. (barres d'erreur) de trois expériences indépendantes utilisant l'oligomère Bcl-2 (▲), le monomère (○) ou le tampon protéique (●).

Dans une étude précédente, nous avons généré un mutant Bcl-2 dans lequel les deux résidus glycine aux positions 154 et 155 ont été changés en alanine. Ce mutant a montré une activité de formation de pores plus élevée dans les liposomes (14). En mesurant l'augmentation dépendante de la concentration de l'anisotropie du tryptophane, nous avons constaté que la protéine mutante a une affinité d'homo-association 6,5 fois plus élevée que la protéine de type sauvage (figure 3A). Par rapport à la protéine de type sauvage monomère, la protéine mutante monomère (figure 3B) avait une plus grande étendue de formation du pore qui libère un colorant de 3 kDa après une incubation de 3 heures. De plus, la cinétique de formation de pores était beaucoup plus rapide avec le mutant, avec un t1/2 de � min, ce qui est 3 fois plus court que le t1/2 pour le type sauvage (Fig. 3B). Ces données soutiennent en outre le modèle selon lequel l'oligomérisation des protéines Bcl-2 facilite la formation de pores.

UNE, homo-association de His sauvage6-Bcl-2ΔTM ou le mutant G154A/G155A a été examiné en mesurant l'anisotropie de fluorescence après titrage de la protéine correspondante dans le tampon D. Les données présentées sont des moyennes de trois titrages indépendants avec S.D. (barres d'erreur) et (■) pour le type sauvage et (●) pour le mutant. K pour la liaison de type sauvage ou le mutant est de 196 ± 43 ou 30 ± 5 nM, respectivement. B, la cinétique de libération de 3-kDa CB-dextran à partir de 12,5 μM Ni 2+ -liposome a été surveillée en présence de 100 nM de His de type sauvage monomère6-Bcl-2ΔTM ou le mutant G154A/G155A et 10 nM tBid à pH 7,4 comme ci-dessus. Les données présentées sont des moyennes avec S.D. (barres d'erreur) à partir de trois expériences indépendantes utilisant le tampon de type sauvage (○), mutant (●) ou protéique (□).

Oligomérisation de Bcl-2 dans une membrane détectée par réticulation chimique et chromatographie de filtration sur gel

Pour déterminer si l'oligomérisation de Bcl-2 se produit dans la membrane liposomale, un agent de reticulation BMH homobifonctionnel réactif au sulfhydryle a été utilisé. Le sien6La protéine -Bcl-2ΔTM ne contient qu'une seule cystéine à la position 158. Par conséquent, seul le produit d'addition dimère peut être généré (Fig. 4A), même si certains Bcl-2 sont sous forme oligomérique comme le montre la chromatographie par filtration sur gel (Fig. 2A). La spécificité de la réaction BMH a été démontrée par le fait qu'aucun produit d'addition dimère n'a été observé même en présence de BMH lorsqu'un mutant Bcl-2 sans cystéine était utilisé (figure 4A).

UNE, homo-association de His6-Bcl-2ΔTM en solution (pH 7,4) a été détecté par réticulation avec BMH. Les données présentées sont un gel SDS-PAGE coloré au Coomassie représentatif de trois expériences indépendantes. (●), flèche du monomère Bcl-2, dimère Bcl-2 réticulé. B, homo-association de His6-Bcl-2ΔTM dans la membrane liposomale a été surveillée par réticulation BMH après incubation de la protéine avec le liposome à pH 5,0, et la protéine liée à la membrane a été purifiée en utilisant une centrifugation flottante de saccharose. Les données présentées sont représentatives de deux expériences indépendantes. C, oligomérisation de His 50 ou 800 nM6-Bcl-2ΔTM dans la membrane a été déterminé par chromatographie de filtration sur gel après incubation de la protéine à pH 7,4 avec 12,5 μM Ni 2+ -liposome en l'absence ou en présence de 5 nM de tBid. Les protéines dans les fractions éluées ont été analysées par SDS-PAGE et immunoblot avec un anticorps spécifique de Bcl-2. Les positions d'élution des standards de protéines sont indiquées en haut du graphique avec Mr. , l'oligomérisation de 200 nM de Bax dans la membrane en l'absence ou en présence de 20 nM de tBid a été déterminée de manière similaire, sauf qu'un anticorps spécifique de Bax a été utilisé dans l'immunotransfert.

La protéine Bcl-2 a été incubée avec le liposome à pH 5 pendant 3 heures, une condition connue pour favoriser la formation de pores (14). Après centrifugation flottante de densité de saccharose, la fraction supérieure contenant des liposomes a été collectée et soumise à une réticulation BMH. Un adduit BMH-dépendant a été détecté avec un Mr � kDa, le M préditr de dimère His6-Bcl-2ΔTM (figure 4B). Étant donné que BMH contient deux groupes maléimide espacés par un lieur de 16 Å et que la molécule Bcl-2 a des dimensions de 50흅휵 (Å) selon la structure RMN(3), le produit de réticulation est très probablement formé par deux molécules Bcl-2 qui sont liées l'une à l'autre dans la membrane. Les données démontrent donc qu'au moins certaines protéines Bcl-2 forment un dimère dans la membrane dans la condition de formation de pores.

Pour déterminer l'état oligomère de Bcl-2 lié à la membrane après interaction avec tBid, une autre condition dans laquelle Bcl-2 forme des pores (Fig. 1), nous avons d'abord isolé les liposomes après incubation avec Bcl-2 et/ou tBid en utilisant CL- Chromatographie par filtration sur gel 2B. Les protéines liées à la membrane ont été solubilisées par CHAPS, un détergent zwitter-ionique qui ne modifie pas l'état oligomère des protéines de la famille Bcl-2 (25, 26), puis soumises à une chromatographie de filtration sur gel Superdex 200. Comme le montre la figure 4C, Bcl-2 lié à la membrane a été facilement détecté après incubation avec des liposomes en présence de tBid. La forme principale du Bcl-2 est le dimère et le trimère, à en juger par leur co-élution avec les standards protéiques de 43 et 67 kDa, respectivement. En l'absence de tBid, seules les protéines Bcl-2 résiduelles sont détectées dans ces fractions, suggérant qu'une petite fraction de la protéine Bcl-2 liée à la membrane est dans les états dimère et trimère même en l'absence de tBid. L'interaction tBid augmente considérablement la quantité de protéines Bcl-2 liées à la membrane, dimères et trimères. Des oligomères Bcl-2 plus gros avec un M apparentr supérieur à 67 kDa a été détecté lorsqu'une concentration plus élevée de Bcl-2 a été utilisée. Étant donné que la taille des pores de Bcl-2 est directement corrélée à sa concentration (Fig. 1A), ce résultat suggère que les oligomères de Bcl-2 plus gros forment les pores de Bcl-2 plus gros.

Dans notre étude précédente, Bax a également formé des pores dans la membrane liposomale après interaction avec tBid (14). Le pore Bax est plus grand que le pore Bcl-2, libérant du CB-dextran de 10 kDa. Il est concevable que le pore de Bax soit formé par un oligomère plus gros. En effet, de gros oligomères de Bax ont été détectés dans les fractions membranaires en utilisant le même test de filtration sur gel que celui de Bcl-2. En présence de tBid, les oligomères de Bax avec Mr de 67 à 200 kDa et plus ont été détectés (Fig. 4D, graphique du bas). En comparaison, les oligomères Bcl-2 sont tous inférieurs à 200 kDa même à une concentration 4 fois supérieure à celle de Bax (figure 4C). Aucun Bax n'a été détecté dans la fraction membranaire en l'absence de tBid (Fig. 4D, graphique du haut), ce qui est cohérent avec le fait que Bax est une protéine soluble avant l'interaction avec tBid. Pris ensemble, ces résultats ont démontré que Bcl-2 et Bax forment des oligomères dans la membrane après interaction avec tBid, mais la taille des oligomères Bcl-2 est plus petite que celle des oligomères Bax, ce qui est directement corrélé à la taille de leurs pores.


Biologie familiale BCL-2

La voie apoptotique intrinsèque est régulée par la famille BCL-2 et se compose de 2 grands groupes de protéines : (1) les protéines de survie avec son membre fondateur BCL-2, 3,4 MCL-1, 9 BCL-xL, 15 B- lymphome cellulaire-w (BCL-w), 19 et le gène lié au BCL-2 exprimé dans le foie fœtal-1 (BFL-1), 20 qui inhibent tous la mort cellulaire et (2) les protéines pro-apoptotiques, qui peuvent être subdivisées en (a) protéines uniquement BH3 : BCL-2-interacting mediator of cell death (BIM), 21 modulateur de l'apoptose régulé à la hausse par p53 (PUMA BBC2), 22,23 NOXA (phorbol-12 myristate-13-acetate-induit protein 1 PMAIP1), 24 promoteur de mort associé à BCL-2 (BAD), domaine interagissant avec BH3 (BID), 25 tueur interagissant avec BCL-2 (BIK), 26 facteur modificateur BCL-2 (BMF), 27 Harakiri (HRK ) 28 et (b) les protéines de type BCL-2-associated X protein (BAX) 29 / BCL-2 homologues antagonist killer (BOK) 30 (y compris le tueur ovarien lié à BCL-2 [BOK]). 31 Toutes les protéines de la famille BCL-2 partagent les domaines communs d'homologie BCL-2 (BH) en fonction de leur similarité de séquence. 32 Prosurvival et les protéines de type BAX/BAK contiennent respectivement 4 et 3 domaines BH, tandis que les protéines BH3 uniquement partagent le domaine BH3 avec la famille plus large (Figure 1).

Les membres de la famille BCL-2 et leur activation. La famille de protéines BCL-2 contient des domaines BH fonctionnellement conservés et peut être subdivisée en protéines effectrices pro-survie, pro-apoptotique BH3 uniquement et pro-apoptotique. TM, transmembranaire.

Les membres de la famille BCL-2 et leur activation. La famille de protéines BCL-2 contient des domaines BH fonctionnellement conservés et peut être subdivisée en protéines effectrices pro-survie, pro-apoptotique BH3 uniquement et pro-apoptotique. TM, transmembranaire.

Activation de la voie apoptotique

L'apoptose est composée de 3 phases distinctes : (1) l'initiation, (2) l'engagement et (3) l'exécution. Ce processus est induit par des stimuli de stress tels que la privation de nutriments ou des dommages à l'ADN (Figure 2). Les protéines BH3 uniquement sont activées en tant que stimulus de mort d'une manière temporelle et spécifique au type de cellule, et déplacent/activent les protéines de type BAX/BAK lors de l'étape d'initiation. 33 Au cours de la phase d'engagement, BAX et BAK forment des homodimères et des hétérodimères, qui s'assemblent ensuite en structures semblables à des pores dans la membrane mitochondriale externe et provoquent la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale (MOMP). 34-38 Cela conduit ensuite à la perte du potentiel transmembranaire mitochondrial et de la phosphorylation oxydative, et à la libération du cytochrome C de l'espace intermembranaire mitochondrial dans le cytoplasme. 39 Dans l'étape d'exécution, le cytochrome C avec APAF-1 et la procaspase-9 forment l'apotosome, qui médie le clivage de la procaspase-9 en sa forme active caspase-9 et par conséquent favorise l'activation des effecteurs caspases-3, 6 et 7 , qui induisent les DNases à cliver l'ADN en fragments. Il est important de noter que le « point de non-retour » se produit généralement au niveau de l'activation BAX/BAK, 37 auquel la cellule s'engage à subir une mort cellulaire programmée. En raison de différences structurelles, les protéines uniquement BH3 ont des affinités variables pour des protéines de survie particulières (figure 3). 40 Certaines protéines uniquement BH3 telles que BIM et PUMA se lient de manière proche à toutes les protéines de survie. 41,42 D'autres protéines uniquement BH3 se lient de manière plus sélective, telles que BAD, qui se lie à BCL-2, BCL-xL et BCL-W, et NOXA, qui se lie principalement à MCL-1. 40

La voie intrinsèque de l'apoptose.

La voie intrinsèque de l'apoptose.

Profil de liaison des protéines pro-apoptotiques uniquement BH3 et effectrices aux protéines de survie et comment les protéines de survie sont ciblées par les inhibiteurs de protéines de la famille BCL-2.

Profil de liaison des protéines pro-apoptotiques uniquement BH3 et effectrices aux protéines de survie et comment les protéines de survie sont ciblées par les inhibiteurs de protéines de la famille BCL-2.

Deux formes principales d'induction de l'apoptose ont été proposées. (1) Dans le modèle d'activation directe, les protéines BH3 uniquement agissent soit comme activateurs (par exemple, BIM, Bid/tBid, PUMA) soit comme sensibilisateurs (par exemple, BAD, NOXA). Les activateurs se lient à la fois aux protéines de survie et de type BAX/BAK, conduisant à l'intégration dans la membrane mitochondriale externe. Les protéines de survie telles que BCL-xL peuvent séquestrer les protéines BH3 uniquement et ainsi empêcher l'activation de BAX. Les sensibilisateurs se lient directement à la protéine de survie et interviennent dans la libération d'activateurs. (2) Le modèle indirect (déplacement) suppose que BAX et BAK sont constitutivement actifs mais sont liés à des protéines de survie pour empêcher l'apoptose. Les protéines BH3 uniquement déplacent BAX et BAK lors d'un stimulus de mort. Étant donné que les protéines uniquement BH3 ont des affinités de liaison différentes pour chaque protéine de survie, l'initiation de l'apoptose nécessite l'activation de plusieurs protéines uniquement BH3 pour déplacer des quantités suffisantes de BAX et BAK pour provoquer la MOMP. Au cours de la dernière décennie, il est devenu évident que ces 2 modèles coexistent probablement et fonctionnent de manière spécifique au contexte, conduisant à un modèle unifié dans lequel les protéines de survie séquestrent à la fois les protéines BH3 uniquement et ont également activé BAX et BAK (Figure 2). 38 Le fait que les protéines uniquement BH3 aient des modalités de liaison différentes pour chaque protéine de prosurvie offre une opportunité de cibler les protéines de prosurvie avec des inhibiteurs pharmacologiquement sélectifs ayant un grand potentiel thérapeutique dans les hémopathies malignes. 40


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Le silençage de l'ARN décrit plusieurs voies liées mécaniquement qui sont impliquées dans le contrôle et la régulation de l'expression des gènes. [4] [5] [6] Les voies de silençage de l'ARN sont associées à l'activité régulatrice de petits ARN non codants (environ 20 à 30 nucléotides de long) qui fonctionnent comme des facteurs impliqués dans l'inactivation des séquences homologues, la promotion de l'activité des endonucléases, l'arrêt de la traduction, et/ou modification chromatique ou d'ADN. [7] [8] [9] Dans le contexte dans lequel le phénomène a été étudié pour la première fois, le petit ARN s'est avéré jouer un rôle important dans la défense des plantes contre les virus. Par exemple, ces études ont démontré que les enzymes détectent l'ARN double brin (ARNdb) ne se trouve pas normalement dans les cellules et le digère en petits morceaux qui ne peuvent pas causer de maladie. [10] [11] [12] [13] [2]

Alors que certaines fonctions du silençage de l'ARN et de sa machinerie sont comprises, beaucoup ne le sont pas. Par exemple, le silençage de l'ARN s'est avéré important dans la régulation du développement et dans le contrôle des événements de transposition. [14] Il a été démontré que le silençage de l'ARN joue un rôle dans la protection antivirale des plantes et des insectes. [15] Également chez la levure, il a été démontré que le silençage de l'ARN maintient la structure de l'hétérochromatine. [16] Cependant, le rôle varié et nuancé du silençage de l'ARN dans la régulation de l'expression des gènes reste une enquête scientifique en cours. Une gamme de fonctions diverses a été proposée pour un nombre croissant de petites séquences d'ARN caractérisées, par exemple, la régulation du développement, le destin des cellules neuronales, la mort cellulaire, la prolifération, le stockage des graisses, le destin des cellules hématopoïétiques, la sécrétion d'insuline. [17]

L'ARN silencing fonctionne en réprimant la traduction ou en clivant l'ARN messager (ARNm), en fonction du degré de complémentarité de l'appariement des bases. L'ARN a été largement étudié dans le cadre de son rôle d'intermédiaire dans la traduction des gènes en protéines. [18] Les fonctions de régulation plus actives, cependant, n'ont commencé à être abordées par les chercheurs qu'à partir de la fin des années 1990. [19] L'étude marquante fournissant une compréhension du premier mécanisme identifié a été publiée en 1998 par Fire et al., [1] démontrant que l'ARN double brin pourrait agir comme un déclencheur pour le silençage génique. [19] Depuis lors, diverses autres classes de RNA silencing ont été identifiées et caractérisées. [4] Actuellement, le potentiel thérapeutique de ces découvertes est exploré, par exemple, dans le cadre de la thérapie génique ciblée. [20] [21]

Alors que le silençage de l'ARN est une classe de mécanismes en évolution, un thème commun est la relation fondamentale entre les petits ARN et l'expression des gènes. [8] Il a également été observé que les principales voies d'extinction de l'ARN actuellement identifiées ont des mécanismes d'action qui peuvent impliquer à la fois l'extinction post-transcriptionnelle des gènes (PTGS) [22] ainsi que les voies de l'extinction génique dépendante de la chromatine (CDGS). [4] Le CDGS implique l'assemblage de petits complexes d'ARN sur des transcrits naissants et est considéré comme englobant des mécanismes d'action qui impliquent des événements de silençage génique transcriptionnel (TGS) et de co-transcriptional gene silencing (CTGS). [23] Ceci est significatif au moins parce que les preuves suggèrent que les petits ARN jouent un rôle dans la modulation de la structure de la chromatine et du TGS. [24] [25]

Malgré l'attention précoce dans la littérature sur l'interférence ARN (ARNi) en tant que mécanisme central qui se produit au niveau de la traduction de l'ARN messager, d'autres ont depuis été identifiés dans la famille plus large des voies conservées de silençage de l'ARN agissant au niveau de l'ADN et de la chromatine. [26] Le silençage de l'ARN fait référence à l'activité de silençage d'une gamme de petits ARN et est généralement considéré comme une catégorie plus large que l'ARNi. Bien que les termes aient parfois été utilisés de manière interchangeable dans la littérature, l'ARNi est généralement considéré comme une branche du RNA silencing. Dans la mesure où il est utile de faire une distinction entre ces concepts connexes, le silençage de l'ARN peut être considéré comme faisant référence au schéma plus large des contrôles liés aux petits ARN impliqués dans l'expression des gènes et la protection du génome contre les séquences d'ADN répétitives mobiles, les rétroéléments, et les transposons dans la mesure où ceux-ci peuvent induire des mutations. [27] Les mécanismes moléculaires pour le silençage de l'ARN ont été initialement étudiés chez les plantes [12] mais se sont depuis élargis pour couvrir une variété de sujets, des champignons aux mammifères, fournissant des preuves solides que ces voies sont hautement conservées. [28]

Au moins trois classes primaires de petits ARN ont actuellement été identifiées, à savoir : les petits ARN interférents (siARN), microARN (miARN) et l'ARN interagissant avec piwi (piARN).

Petit ARN interférent (siARN) Modifier

Les siARN agissent dans le noyau et le cytoplasme et sont impliqués dans l'ARNi ainsi que dans le CDGS. [4] Les siRNA proviennent de longs précurseurs d'ARNdb dérivés d'une variété de précurseurs d'ARN simple brin (ssRNA), tels que les ARN sens et antisens. Les siARN proviennent également d'ARN en épingle à cheveux dérivés de la transcription de régions répétées inversées. Les siARN peuvent également provenir enzymatiquement de précurseurs d'ARN non codants. [29] Le volume de la littérature sur les siRNA dans le cadre de l'ARNi est important.

MicroARN (miARN) Modifier

The majority of miRNAs act in the cytoplasm and mediate mRNA degradation or translational arrest. [30] However, some plant miRNAs have been shown to act directly to promote DNA methylation. [31] miRNAs come from hairpin precursors generated by the RNaseIII enzymes Drosha and Dicer. [32] Both miRNA and siRNA form either the RNA-induced silencing complex (RISC) or the nuclear form of RISC known as RNA-induced transcriptional silencing complex (RITS). [33] The volume of literature on miRNA within the framework of RNAi is extensive.

Trois régions et microARN non traduits principaux Modifier

Three prime untranslated regions (3'UTRs) of messenger RNAs (mRNAs) often contain regulatory sequences that post-transcriptionally cause RNA interference. Such 3'-UTRs often contain both binding sites for microRNAs (miRNAs) as well as for regulatory proteins. By binding to specific sites within the 3'-UTR, miRNAs can decrease gene expression of various mRNAs by either inhibiting translation or directly causing degradation of the transcript. The 3'-UTR also may have silencer regions that bind repressor proteins that inhibit the expression of a mRNA.

The 3'-UTR often contains microRNA response elements (MREs). Les MRE sont des séquences auxquelles les miARN se lient. These are prevalent motifs within 3'-UTRs. Among all regulatory motifs within the 3'-UTRs (e.g. including silencer regions), MREs make up about half of the motifs.

As of 2014, the miRBase web site, [34] an archive of miRNA sequences and annotations, listed 28,645 entries in 233 biologic species. Parmi ceux-ci, 1 881 miARN se trouvaient dans des loci de miARN humains annotés. Les miARN devaient avoir en moyenne environ quatre cents ARNm cibles (affectant l'expression de plusieurs centaines de gènes). [35] Freidman et al. [35] estimate that >45,000 miRNA target sites within human mRNA 3'UTRs are conserved above background levels, and >60% of human protein-coding genes have been under selective pressure to maintain pairing to miRNAs.

Des expériences directes montrent qu'un seul miARN peut réduire la stabilité de centaines d'ARNm uniques. [36] Other experiments show that a single miRNA may repress the production of hundreds of proteins, but that this repression often is relatively mild (less than 2-fold). [37] [38]

Les effets de la dérégulation de l'expression des gènes par les miARN semblent être importants dans le cancer. [39] For instance, in gastrointestinal cancers, nine miRNAs have been identified as epigenetically altered and effective in down regulating DNA repair enzymes. [40]

The effects of miRNA dysregulation of gene expression also seem to be important in neuropsychiatric disorders, such as schizophrenia, bipolar disorder, major depression, Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorders. [41] [42] [43]

Piwi-interacting RNA (piRNA) Edit

piRNAs represent the largest class of small non-coding RNA molecules expressed in animal cells, deriving from a large variety of sources, including repetitive DNA and transposons. [44] However, the biogenesis of piRNAs is also the least well understood. [45] piRNAs appear to act both at the post-transcriptional and chromatin levels. They are distinct from miRNA due to at least an increase in terms of size and complexity. Repeat associated small interfering RNA (rasiRNAs) are considered to be a subspecies of piRNA. [3]

The most basic mechanistic flow for RNA Silencing is as follows: (For a more detailed explanation of the mechanism, refer to the RNAi:Cellular mechanism article.)

1: RNA with inverted repeats hairpin/panhandle constructs --> 2: dsRNA --> 3: miRNAs/siRNAs --> 4: RISC --> 5: Destruction of target mRNA

  1. It has been discovered that the best precursor to good RNA silencing is to have single stranded antisense RNA with inverted repeats which, in turn, build small hairpin RNA and panhandle constructs. [6] The hairpin or panhandle constructs exist so that the RNA can remain independent and not anneal with other RNA strands.
  2. These small hairpin RNAs and/or panhandles then get transported from the nucleus to the cytosol through the nuclear export receptor called exportin-5, and then get transformed into a dsRNA, a double stranded RNA, which, like DNA, is a double stranded series of nucleotides. If the mechanism didn't use dsRNAs, but only single strands, there would be a higher chance for it to hybridize to other "good" mRNAs. As a double strand, it can be kept on call for when it is needed.
  3. The dsRNA then gets cut up by a Dicer into small (21-28 nt = nucleotides long) strands of miRNAs (microRNAs) or siRNAs (short interfering RNAs.) A Dicer is an endoribonucleaseRNase, which is a complex of a protein mixed with strand(s) of RNA.
  4. Lastly, the double stranded miRNAs/siRNAs separate into single strands the antisense RNA strand of the two will combine with another endoribonuclease enzyme complex called RISC (RNA-induced silencing complex), which includes the catalytic component Argonaute, and will guide the RISC to break up the "perfectly complementary" target mRNA or viral genomic RNA so that it can be destroyed. [2][6]
  5. It means that based on a short sequence specific area, a corresponding mRNA will be cut. To make sure, it will be cut in many other places as well. (If the mechanism only worked with a long stretch, then there would be higher chance that it would not have time to match to its complementary long mRNA.) It has also been shown that the repeated-associated short interference RNAs (rasiRNA) have a role in guiding chromatin modification. [2]

For an animated explanation of the mechanism of RNAi by Nature Reviews, see the External Links section below.

Immunity against viruses or transposons Edit

RNA silencing is the mechanism that our cells (and cells from all kingdoms) use to fight RNA viruses and transposons (which originate from our own cells as well as from other vehicles). [2] In the case of RNA viruses, these get destroyed immediately by the mechanism cited above. In the case of transposons, it's a little more indirect. Since transposons are located in different parts of the genome, the different transcriptions from the different promoters produce complementary mRNAs that can hybridize with each other. When this happens, the RNAi machinery goes into action, debilitating the mRNAs of the proteins that would be required to move the transposons themselves. [46]

Down-regulation of genes Edit

For a detailed explanation of the down-regulation of genes, see RNAi:downregulation of genes

Up-regulation of genes Edit

For a detailed explanation of the up-regulation of genes, see RNAi:upregulation of genes

RNA silencing also gets regulated Edit

The same way that RNA silencing regulates downstream target mRNAs, RNA silencing itself is regulated. For example, silencing signals get spread between cells by a group of enzymes called RdRPs (RNA-dependent RNA polymerases) or RDRs. [2]

Growing understanding of small RNA gene-silencing mechanisms involving dsRNA-mediated sequence-specific mRNA degradation has directly impacted the fields of functional genomics, biomedicine, and experimental biology. The following section describes various applications involving the effects of RNA silencing. These include uses in biotechnology, therapeutics, and laboratory research. Bioinformatics techniques are also being applied to identify and characterize large numbers of small RNAs and their targets.

Biotechnology Edit

Artificial introduction of long dsRNAs or siRNAs has been adopted as a tool to inactivate gene expression, both in cultured cells and in living organisms. [2] Structural and functional resolution of small RNAs as the effectors of RNA silencing has had a direct impact on experimental biology. For example, dsRNA may be synthesized to have a specific sequence complementary to a gene of interest. Once introduced into a cell or biological system, it is recognized as exogenous genetic material and activates the corresponding RNA silencing pathway. This mechanism can be used to effect decreases in gene expression with respect to the target, useful for investigating loss of function for genes relative to a phenotype. That is, studying the phenotypic and/or physiologic effects of expression decreases can reveal the role of a gene product. The observable effects can be nuanced, such that some methods can distinguish between “knockdown” (decrease expression) and “knockout” (eliminate expression) of a gene. [47] RNA interference technologies have been noted recently as one of the most widely utilized techniques in functional genomics. [48] Screens developed using small RNAs have been used to identify genes involved in fundamental processes such as cell division, apoptosis and fat regulation.

Biomedicine Edit

Since at least the mid-2000s, there has been intensifying interest in developing short interfering RNAs for biomedical and therapeutic applications. [49] Bolstering this interest is a growing number of experiments which have successfully demonstrated the clinical potential and safety of small RNAs for combatting diseases ranging from viral infections to cancer as well as neurodegenerative disorders. [50] In 2004, the first Investigational New Drug applications for siRNA were filed in the United States with the Food and Drug Administration it was intended as a therapy for age-related macular degeneration. [48] RNA silencing in vitro and in vivo has been accomplished by creating triggers (nucleic acids that induce RNAi) either via expression in viruses or synthesis of oligonucleotides. [51] Optimistically many studies indicate that small RNA-based therapies may offer novel and potent weapons against pathogens and diseases where small molecule/pharmacologic and vaccine/biologic treatments have failed or proved less effective in the past. [49] However, it is also warned that the design and delivery of small RNA effector molecules should be carefully considered in order to ensure safety and efficacy.

The role of RNA silencing in therapeutics, clinical medicine, and diagnostics is a fast developing area and it is expected that in the next few years some of the compounds using this technology will reach market approval. A report has been summarized below to highlight the many clinical domains in which RNA silencing is playing an increasingly important role, chief among them are ocular and retinal disorders, cancer, kidney disorders, LDL lowering, and antiviral. [51] The following table displays a listing of RNAi based therapy currently in various phases of clinical trials. The status of these trials can be monitored on the ClinicalTrials.gov website, a service of the National Institutes of Health (NIH). [52] Of note are treatments in development for ocular and retinal disorders, that were among the first compounds to reach clinical development. AGN211745 (sirna027) (Allergan) and bevasiranib (Cand5) (Opko) underwent clinical development for the treatment of age-related macular degeneration, but trials were terminated before the compounds reached the market. Other compounds in development for ocular conditions include SYL040012 (Sylentis) and QPI-007 (Quark). SYL040012 (bamosinan) is a drug candidate under clinical development for glaucoma, a progressive optic neurdegeneration frequently associated to increased intraocular pressure QPI-007 is a candidate for the treatment of angle-closure glaucoma and Non-arteritic anterior ischaemic optic neuropathy both compounds are currently undergoing phase II clinical trials. Several compounds are also under development for conditions such as cancer and rare diseases.

Clinical domain Médicament Indication Cible
Ocular and retinal disorders TD101 Pachyonychia congenita Keratin 6A N171K mutant
Ocular and retinal disorders QPI-1007 Non-arteritic anterior ischaemic optic neuropathy Caspase 2
Ocular and retinal disorders AGN211745 Age-related macular degeneration, choroidal neovascularization VEGFR1
Ocular and retinal disorders PF-655 Diabetic macular oedema, age-related macular degeneration RTP801
Ocular and retinal disorders SYL040012 Glaucome β2 adrenergic receptor
Ocular and retinal disorders Bevasiranib Diabetic macular oedema VEGF
Ocular and retinal disorders Bevasiranib Macular degeneration VEGF
Cancer CEQ508 Polypose adénomateuse familiale β-catenin
Cancer ALN-PLK1 Tumeur du foie PLK1
Cancer FANG Solid tumor Furin
Cancer CALAA-01 Solid tumor RRM2
Cancer SPC2996 la leucémie lymphocytaire chronique BCL-2
Cancer ALN-VSP02 Solid tumor VEGF, kinesin spindle protein
Cancer NCT00672542 Metastatic melanoma LMP2, LMP7, and MECL1
Cancer Atu027 Solid malignancies PKN3
Kidney disorders QPI-1002/I5NP Acute kidney injury p53
Kidney disorders QPI-1002/I5NP Graft dysfunction kidney transplant p53
Kidney disorders QPI-1002/I5NP Kidney injury acute renal failure p53
LDL lowering TKM-ApoB Hypercholesterolaemia APOB
LDL lowering PRO-040,201 Hypercholesterolaemia APOB
Antiviral miravirsen Virus de l'hépatite C miR-122
Antiviral pHIV7-shI-TAR-CCR5RZ VIH HIV Tat protein, HIV TAR RNA, human CCR5
Antiviral ALN-RSV01 VRS RSV nucleocapsid
Antiviral ALN-RSV01 RSV in lung transplant patients RSV nucleocapsid

Main challenge Edit

As with conventional manufactured drugs, the main challenge in developing successful offshoots of the RNAi-based drugs is the precise delivery of the RNAi triggers to where they are needed in the body. The reason that the ocular macular degeneration antidote was successful sooner than the antidote with other diseases is that the eyeball is almost a closed system, and the serum can be injected with a needle exactly where it needs to be. The future successful drugs will be the ones who are able to land where needed, probably with the help of nanobots. Below is a rendition of a table [51] that shows the existing means of delivery of the RNAi triggers.

Laboratory Edit

The scientific community has been quick to harness RNA silencing as a research tool. The strategic targeting of mRNA can provide a large amount of information about gene function and its ability to be turned on and off. Induced RNA silencing can serve as a controlled method for suppressing gene expression. Since the machinery is conserved across most eukaryotes, these experiments scale well to a range of model organisms. [53] In practice, expressing synthetic short hairpin RNAs can be used to reach stable knock-down. [54] If promoters can be made to express these designer short hairpin RNAs, the result is often potent, stable, and controlled gene knock-down in both in vitro and in vivo contexts. [55] Short hairpin RNA vector systems can be seen as roughly analogous in scope to using cDNA overexpression systems. [56] Overall, synthetic and natural small RNAs have proven to be an important tool for studying gene function in cells as well as animals. [57]

Bioinformatics approaches to identify small RNAs and their targets have returned several hundred, if not thousands of, small RNA candidates predicted to affect gene expression in plants, C. elegans, D. melanogaster, zebrafish, mouse, rat, and human. [58] These methods are largely directed to identifying small RNA candidates for knock-out experiments but may have broader applications. One bioinformatics approach evaluated sequence conservation criteria by filtering seed complementary target-binding sites. The cited study predicted that approximately one third of mammalian genes were to be regulated by, in this case, miRNAs. [59]

Ethics & Risk-Benefit Analysis Edit

One aspect of RNA silencing to consider is its possible off-target affects, toxicity, and delivery methods. If RNA silencing is to become a conventional drug, it must first pass the typical ethical issues of biomedicine. [60] Using risk-benefit analysis, researchers can determine whether RNA silencing conforms to ethical ideologies such as nonmaleficence, beneficence, and autonomy. [61]

There is a risk of creating infection-competent viruses that could infect non-consenting people. [62] There is also a risk of affecting future generations based on these treatments. These two scenarios, in respect to autonomy, is possible unethical. At this moment, unsafe delivery methods and unintended aspects of vector viruses add to the argument against RNA silencing. [61]

In terms of off-target effects, siRNA can induce innate interferon responses, inhibit endogenous miRNAs through saturation, and may have complementary sequences to other non-target mRNAs. These off-targets could also have target up-regulations such as oncogenes and antiapoptotic genes. The toxicity of RNA silencing is still under review as there are conflicting reports. [61] [62] [63]

RNA silencing is quickly developing, because of that, the ethical issues need to be discussed further. With the knowledge of general ethical principles, we must continuously perform risk-benefit analysis. [61]


Conclusion

The method reported here, EMIRGE, reconstructs full-length SSU sequences from metagenomic data from a microbial community of interest, accurate to the species level. In addition, the method also provides accurate SSU sequence abundance estimates. EMIRGE is robust to errors and omissions in the reference database, and is broadly applicable to any dataset produced with short read sequencing technology. An open-source implementation of the algorithm is freely available [41]. We expect that application of the method, especially with very deep sequencing, will provide new insights into fine details of changing microbial community structure.


Original articles

Lovell, J. F. et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cellule 135, 1074–1084 (2008)

Edlich, F. et al. Bcl-x(L) retrotranslocates Bax from the mitochondria into the cytosol. Cellule 145, 104–116 (2011)

Czabotar et al. Bax crystal structures reveal how BH3 domains activate Bax and nucleate its oligomerization to induce apoptosis. Cellule 152, 519–531 (2013)

Ichim et al. Limited mitochondrial permeabilization causes DNA damage and genomic instability in the absence of cell death. Mol. Cellule 57, 860–872 (2015)

McArthur, K. et al. BAK/BAX macropores facilitate mitochondrial herniation and mtDNA efflux during apoptosis. Science 23, eaao6047 (2018)


Informations sur l'auteur

Jonathan B Baell, Sanji Kulasegaram, John P Parisot & Brian J Smith

Present address: Present addresses: Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Parkville, Victoria, Australia (J.B.B.) Chemistry Department, Monash University, Clayton, Victoria, Australia (S.K.) Peter McCallum Cancer Centre, East Melbourne, Victoria, Australia (J.P.P.) Department of Chemistry, La Trobe Institute of Molecular Sciences, La Trobe University, Bundoora, Victoria, Australia (B.J.S.).,

Peter E Czabotar and Brad E Sleebs: These authors contributed equally to this work.

Affiliations

Chemical Biology Division, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Parkville, Victoria, Australia

Guillaume Lessene, Brad E Sleebs, Kym N Lowes, Jonathan B Baell, Wilhelmus J A Kersten, Sanji Kulasegaram, Rebecca M Moss, John P Parisot, Brian J Smith, Ian P Street, Hong Yang, David C S Huang & Keith G Watson

Department of Medical Biology, University of Melbourne, Parkville, Victoria, Australia

Guillaume Lessene, Peter E Czabotar, Brad E Sleebs, Kym N Lowes, Jerry M Adams, Jonathan B Baell, Peter M Colman, Wilhelmus J A Kersten, Sanji Kulasegaram, Rebecca M Moss, John P Parisot, Brian J Smith, Ian P Street, Hong Yang, David C S Huang & Keith G Watson

Structural Biology Division, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Parkville, Victoria, Australia

Peter E Czabotar & Peter M Colman

Department of Early Discovery Biochemistry, Genentech, Inc., San Francisco, California, USA

Kerry Zobel, Kurt Deshayes & Wayne J Fairbrother

Molecular Genetics of Cancer Division, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Parkville, Victoria, Australia

Department of Discovery Chemistry, Genentech, Inc., San Francisco, California, USA


Voir la vidéo: CLL Whiteboard #3: Mechanisms of Action of Anti-Apoptotic BCL2 Inhibitors (Février 2023).