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Mutation dynamique et huntington

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J'ai lu que la maladie de Huntington est un trouble causé par des mutations dynamiques de l'ADN, ce qui signifie qu'une séquence triplet d'ADN change de génération en génération. Disons que nous avons la séquence ATGATGATGATG. L'enfant de cette personne a ATTATGATGATG et le petit-enfant aura ATTATTATGATG etc. Cela signifie que Huntington sera pire (début plus tôt) plus la génération durera.

Mes questions sont : ma compréhension de la mutation dynamique est-elle correcte ? N'y a-t-il pas d'âge MINIMUM où Huntington fera ses débuts ? En d'autres termes, si une génération est très longue et a la maladie de Huntington, un bébé peut-il présenter des symptômes à la naissance ?


À l'heure actuelle, le plus jeune cas diagnostiqué de Huntington avait 2 ans. Cet article semble discuter non seulement de l'apparition de ce garçon, mais aussi du diagnostic des symptômes de la maladie à début précoce.

Ici, ils recherchent un lien entre l'âge d'apparition et la durée des répétitions.

Le fait est que ces répétitions ne s'allongeront pas constamment. Il y a un "glissement" pendant la réplication, ce qui allonge les répétitions, mais les raccourcit également. Il est possible que le mauvais chromosome de maman ait été hérité, mais à cause du glissement, il ne produit plus les symptômes de Huntington.

Cette image ne montre pas la mécanique réelle de ce qui se passe, mais elle montre comment les répétitions peuvent être ajoutées et soustraites.

Il s'avère que Kayser et. al a décidé d'examiner les chimpanzés et les humains pour découvrir lequel des deux mécanismes proposés est le plus probable. Leurs résultats suggèrent que le glissement est le plus proche du "modèle d'instabilité hétérozygote".

Le modèle suggère :

les loci hétérozygotes pourraient avoir un taux de mutation plus élevé en raison d'événements de réparation des mésappariements qui se produisent pendant la synapsie


Pour répondre brièvement à ta question :

Il semble que "l'âge minimum" soit jusqu'à présent de 2 ans, cependant, cela ne signifie pas qu'il ne s'est pas produit plus tôt. La maladie de Huntington se caractérise par un changement dans les habiletés motrices, et si le changement se produit avant la naissance, il pourrait ne pas être remarqué. En théorie, il est possible que les symptômes de Huntington puissent commencer avant la naissance.


Mutation dynamique

L'une des caractéristiques paradoxales des loci de mutation dynamique est qu'ils présentent un taux de mutation apparemment élevé et pourtant il existe des preuves d'effets fondateurs - que certains chromosomes sont prédisposés à cette forme de mutation. La base de ceci réside dans le fait que la composition de la séquence répétée a un rôle à jouer dans la détermination de son instabilité. En 1990, Weber a noté que dans le cas des répétitions dinucléotidiques AC, les plus longues qui n'avaient pas de bases d'interruption dans le tractus répété étaient plus polymorphes que celles avec des interruptions répétées. Cette même règle semble s'appliquer aussi bien pour les répétitions trinucléotidiques que pour des répétitions beaucoup plus longues (jusqu'à 42 nucléotides) qui donnent naissance à certains sites chromosomiques fragiles. Par exemple, tous les allèles expansés du SCA1 locus sont des répétitions parfaites, alors que 98% des allèles normaux (qui ne se développent pas) ont une interruption de répétition. De plus, les allèles expansés peuvent être vus comme ayant leur origine dans le pool de 2% d'allèles répétés parfaits de la population normale. Il s'agit d'un thème commun à chaque locus de mutation dynamique où les données ont été collectées, ce qui suggère qu'il s'agit d'une propriété commune à toutes les mutations dynamiques.


Informations connexes

Une brochure d'information sur la maladie de Huntington compilée par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS).

Une brochure d'information sur la maladie de Huntington compilée par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS).

La maladie de Huntington (MH) est une maladie héréditaire qui provoque la mort de cellules cérébrales, appelées neurones, dans diverses zones du cerveau, y compris celles qui aident à contrôler les mouvements volontaires (intentionnels). Les symptômes de la maladie, qui s'aggravent progressivement, comprennent des mouvements incontrôlés (appelés chorée), des postures corporelles anormales et des changements de comportement, d'émotion, de jugement et de cognition. Les personnes atteintes de MH développent également une coordination altérée, des troubles de l'élocution et des difficultés à s'alimenter et à avaler. La MH commence généralement entre 30 et 50 ans. Une forme d'apparition précoce appelée MH juvénile survient avant l'âge de 20 ans. Ses symptômes diffèrent quelque peu de ceux de l'adulte et comprennent la rigidité, la lenteur, des difficultés à l'école, des secousses musculaires involontaires rapides appelées myoclonies et des convulsions. Plus de 30 000 Américains ont la HD.

La maladie de Huntington est causée par une mutation du gène d'une protéine appelée huntingtine. Le défaut provoque la répétition des éléments constitutifs de la cytosine, de l'adénine et de la guanine (CAG) de l'ADN beaucoup plus de fois que la normale. Chaque enfant d'un parent atteint de MH a 50-50 chances d'hériter du gène MH. Un enfant qui n'hérite pas du gène MH ne développera pas la maladie et ne pourra généralement pas la transmettre aux générations suivantes. Une personne qui hérite du gène MH finira par développer la maladie. La MH est généralement diagnostiquée sur la base d'un test génétique, d'antécédents médicaux, d'une imagerie cérébrale et de tests neurologiques et de laboratoire.

Il n'existe aucun traitement qui puisse arrêter ou inverser l'évolution de la MH. La tétrabénazine et la deutérabénazine peuvent traiter la chorée associée à la MH. Les médicaments antipsychotiques peuvent soulager la chorée et aider à contrôler les hallucinations, les délires et les accès de violence. Des médicaments peuvent être prescrits pour traiter la dépression et l'anxiété. Les effets secondaires des médicaments utilisés pour traiter les symptômes de la MH peuvent inclure fatigue, sédation, diminution de la concentration, agitation ou hyperexcitabilité, et ne doivent être utilisés que lorsque les symptômes créent des problèmes pour l'individu.

La maladie de Huntington provoque un handicap qui s'aggrave avec le temps. Actuellement, aucun traitement n'est disponible pour ralentir, arrêter ou inverser l'évolution de la MH. Les personnes atteintes de MH meurent généralement dans les 10 à 30 ans suivant l'apparition des symptômes, le plus souvent d'infections (le plus souvent de pneumonie) et de blessures liées à des chutes.

Un axe majeur de la recherche sur la MH est de comprendre la toxicité de la protéine huntingtine mutante pour les cellules cérébrales et de développer des médicaments potentiels pour la contrer. La découverte du gène MH, que la recherche financée par NINDS a aidé à identifier, permet aux scientifiques de recruter des individus porteurs du gène MH dans des études cliniques avant qu'ils ne tombent malades. Les chercheurs espèrent comprendre comment le gène défectueux affecte diverses structures du cerveau ainsi que la chimie et le métabolisme du corps. Certains des symptômes cliniques des maladies neurodégénératives peuvent être causés par le dysfonctionnement ultime des circuits neuronaux. Les scientifiques utilisent des méthodes de pointe telles que l'optogénétique (où les neurones sont activés ou réduits au silence dans le cerveau d'animaux vivants à l'aide de faisceaux lumineux) pour étudier de tels défauts de circuit dans la MH. Les scientifiques utilisent également des cellules souches pour étudier les mécanismes de la maladie et tester des médicaments thérapeutiques potentiels.

L'étude PREDICT-HD financée par le NINDS vise à identifier des biomarqueurs (changements biologiques pouvant être utilisés pour prédire, diagnostiquer ou surveiller une maladie) de la MH. Une vaste étude soutenue par le NINDS vise à identifier des facteurs génétiques supplémentaires chez les personnes qui influencent l'évolution de la maladie. D'autres recherches espèrent identifier des variations dans les génomes des personnes atteintes de MH qui pourraient indiquer de nouvelles cibles pour l'intervention et le traitement de la maladie.

Informations provenant de MedlinePlus de la National Library of Medicine
La maladie de Huntington


Fonctions potentielles^

Les analyses de la séquence et de la structure de la huntingtine ont fourni des indications sur les fonctions des protéines dans le corps humain. Ces résultats sont étayés par diverses études expérimentales qui ont directement testé la fonction de la huntingtine et déterminé que la huntingtine est impliquée dans un certain nombre de processus importants à la fois au niveau cellulaire et au niveau de l'organisme. Ces processus incluent le transport de molécules à l'intérieur d'une cellule (transport intracellulaire), la régulation de la transcription, l'inhibition de la mort cellulaire programmée (apoptose) et le développement embryonnaire. Ces fonctions seront discutées en détail ci-dessous.

Transport intracellulaire^

De nombreux rôles de la huntingtine dans le transport intracellulaire ont été bien documentés dans la recherche scientifique (intra = &ldquowithin» donc intracellulaire signifie littéralement &ldquowithin cells&rdquo). Les expériences ont constamment observé que la huntingtine est impliquée dans le trafic intracellulaire des vésicules, des conteneurs sphériques constitués de lipides qui transportent des molécules autour de la cellule. Un mécanisme de cette action semble être l'interaction de la huntingtine avec les microtubules, les composants en forme de bâtonnets du cytosquelette qui aident au transport des vésicules. Les microtubules sont constitués d'empilements de protéines appelées tubuline, qui s'ajoutent et tombent constamment aux extrémités de ces empilements pour allonger ou contracter la longueur de ces structures selon les besoins. Cette croissance et cette dispersion dynamiques sont nécessaires pour de nombreux processus cellulaires importants, tels que la séparation des chromosomes pendant la mitose (Pour plus d'informations sur le rôle des microtubules dans la division des cellules, cliquez ici). Les microtubules fournissent également l'échafaudage pour les molécules spécialisées connues sous le nom de protéines motrices des microtubules pour se déplacer à travers le cytoplasme. Ces protéines motrices peuvent être considérées comme des livreurs cellulaires, se déplaçant le long des autoroutes des microtubules pour transporter leur cargaison de vésicules d'un endroit de la cellule à un autre.

Il a été démontré que la huntingtine interagit avec une variété de composants différents impliqués dans l'action des microtubules, y compris la tubuline et la dynéine, une protéine motrice des microtubules qui se déplace généralement vers le centre des cellules. Des études de cartographie qui ont examiné la séquence de la huntingtine ont trouvé un site de liaison pour la dynéine, suggérant que les deux protéines peuvent interagir au sein des cellules. Cette découverte a été corroborée par des preuves que la huntingtine forme des complexes avec la dynéine dans des extraits cellulaires de neurones de souris. En plus de l'action directe de la huntingtine, ses partenaires de liaison ont également été proposés pour affecter la dynamique des microtubules. La protéine 1 associée à la Huntingtine (HAP1) est l'un de ces partenaires qui interagit avec la dynactine, une protéine essentielle à la fonction de la dynéine, et la kinésine, une protéine motrice des microtubules qui se déplace généralement vers la périphérie cellulaire (la direction opposée de la dynéine le long des microtubules). En effet, la huntingtine et HAP1 sont toutes deux transportées dans les axones à une vitesse compatible avec l'hypothèse selon laquelle elles se déplacent le long des microtubules avec les protéines motrices des microtubules. De plus, la huntingtine et HAP1 sont capables de se déplacer à la fois vers le noyau cellulaire et la périphérie, comme on pourrait s'y attendre si ces protéines s'associent à la dynéine et à la kinésine. La direction dans laquelle la huntingtine se déplace dépend des signaux qu'elle reçoit d'autres protéines en interaction. Sur la base d'observations telles que celles-ci, les scientifiques ont suggéré que la huntingtine agit comme un échafaudage moléculaire, permettant à différentes protéines de se réunir et d'interagir.

Les interactions de la huntingtine avec les microtubules, la dynéine et d'autres éléments du transport intracellulaire peuvent aider à expliquer son effet sur le trafic des vésicules. Par exemple, la huntingtine semble jouer un rôle important dans le transport intracellulaire du facteur neuronal dérivé du cerveau (BDNF), un facteur neurotrophique important pour le développement et la survie des cellules striatales (pour plus d'informations sur la relation entre la MH et le BDNF, cliquez ici). Le BDNF est initialement produit par les neurones du cortex et de la substance noire, puis déplacé vers le striatum, le site majeur de la neurodégénérescence dans la MH. Comme toutes les protéines sécrétées, le BDNF doit d'abord être synthétisé dans les cellules avant d'être libéré. Une fois le BDNF traduit à partir de son ARN messager, il est traité et conditionné dans des vésicules qui sont transportées vers la membrane cellulaire le long des microtubules et des autoroutes. Lorsque ces vésicules contenant du BDNF atteignent la membrane, elles s'accumulent dans des compartiments spécialisés jusqu'à ce qu'elles reçoivent le signal de être libéré. La huntingtine semble être cruciale dans le transport du BDNF de son site de production à la membrane cellulaire. Des expériences in vitro dans lesquelles des niveaux anormalement élevés de huntingtine ont été exprimés dans des lignées cellulaires neuronales ont révélé que cette protéine augmentait la vitesse à laquelle les vésicules contenant du BDNF se déplaçaient le long des microtubules. Inversement, l'abaissement des niveaux de huntingtine a réduit la vitesse des vésicules. Fait intéressant, l'expression de la huntingtine mutante a également réduit le transport du BDNF, réduisant ainsi la capacité des neurones à libérer ce facteur essentiel à la survie des autres neurones. Ces résultats fournissent un modèle convaincant pour comprendre une façon dont la MH pourrait provoquer une neurodégénérescence dans le cerveau.

Bien que le transport du BDNF soit un exemple bien étudié, il a été démontré que la huntingtine affecte un large éventail de la machinerie cellulaire impliquée dans le trafic intracellulaire. Par exemple, une étude a révélé que la suppression de la huntingtine chez le poisson zèbre, un organisme modèle populaire dans les expérimentations scientifiques, les a rendus carencés en fer. Bien que les embryons de poisson zèbre avec des niveaux réduits de huntingtine puissent absorber du fer, leurs cellules étaient incapables de transporter le fer là où il était nécessaire. Les futures études sur le rôle de la huntingtine dans le trafic et le transport intracellulaires seront probablement importantes pour comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la MH.

Régulation transcriptionnelle^

La huntingtine semble aider à réguler la transcription en agissant dans le cadre d'un interrupteur marche/arrêt qui indique aux cellules quand commencer à exprimer certains gènes. Un mécanisme par lequel la huntingtine régule la transcription est la liaison à des facteurs de transcription, des protéines qui régulent la transcription de l'ADN pour produire de l'ARN messager. Cette interaction directe semble être un mécanisme par lequel la huntingtine contrôle l'expression du BDNF. Le gène qui code pour le BDNF est précédé d'une région régulatrice sur l'ADN appelée élément répresseur 1/élément de silençage neurone restrictif (RE1/NRSE). Cette région peut être reconnue et liée par un facteur de transcription appelé élément répresseur-1/facteur de transcription de silençage restrictif neuronal (REST/NSRF). La liaison de REST/NSRF à RE1/NSRE désactive l'expression du gène qui vient après cette région régulatrice, qui dans ce cas est le BDNF. Il a été démontré que la huntingtine se lie directement à REST/NSRF, l'empêchant d'entrer dans le noyau et de se lier à RE1/NRSE. En conséquence, le gène BDNF peut être exprimé. Dans la MH, la huntingtine mutante permet à REST/NSRF d'entrer dans le noyau et de bloquer la transcription du BDNF, entraînant un déficit de ce facteur neurotrophique critique. Fait intéressant, la séquence RE1/NRSE régule non seulement le gène BDNF, mais se trouve également avant d'autres gènes impliqués dans le développement et la fonction neuronale. Des analyses informatiques ont suggéré que le génome humain contient près de 1 900 séquences RE1/NSRE, suggérant que la huntingtine pourrait jouer un rôle dans la régulation transcriptionnelle de nombreux autres gènes.

Le rôle de la huntingtine dans la régulation de la transcription est cohérent avec sa capacité à faire la navette entre le noyau et le cytoplasme. Bien que l'on pensait autrefois que la huntingtine n'était présente que dans le cytoplasme des neurones, la protéine complète et ses fragments ont été détectés dans le noyau. La huntingtine étant présente dans le noyau, elle doit pouvoir traverser l'enveloppe nucléaire qui sépare le noyau du cytoplasme. La plupart des grosses protéines qui pénètrent dans le noyau ont un signal de localisation nucléaire (NLS), qui a la fonction opposée à celle du NES et permet aux protéines d'entrer dans le noyau (voir la section ci-dessus pour une explication). Cependant, les analyses de la structure de la huntingtine ont révélé qu'elle ne contient pas de SNL classique, suggérant que la protéine a un moyen alternatif de traverser l'enveloppe nucléaire. La capacité de la huntingtine à entrer et à sortir du noyau a conduit les chercheurs à suggérer que la huntingtine est impliquée dans un complexe de protéines qui transportent les molécules entre le noyau et le cytoplasme. Les scientifiques émettent l'hypothèse que cette navette pourrait être impliquée dans la régulation des facteurs de transcription autorisés à pénétrer dans le noyau à certains moments. Cependant, comme la plupart des études se sont concentrées sur les effets de la huntingtine mutante sur la transcription, ce rôle de la huntingtine de type sauvage reste spéculatif.

Inhiber l'apoptose^

Un rôle de la huntingtine dans la neuroprotection a été suggéré par la découverte que la désactivation du gène de la huntingtine chez les souris adultes les a amenés à développer une neurodégénérescence sévère. Les souris déficientes en huntingtine présentaient un phénotype similaire à celui observé dans un modèle de souris MH. À l'inverse, la surexpression de la huntingtine chez la souris protégeait les neurones de certains types de dommages neuronaux, des niveaux plus élevés de huntingtine conférant plus de neuroprotection. Les qualités protectrices de la huntingtine ont été attribuées à sa capacité à inhiber l'apoptose, ou la mort cellulaire programmée. Les chercheurs ont observé que l'apoptose dans les neurones des vertébrés dépend de l'action des caspases, les enzymes qui clivent d'autres protéines en fragments plus petits. La huntingtine a été observée in vitro pour bloquer la formation d'un complexe protéique qui active les caspases pour démarrer le processus apoptotique. Des preuves similaires d'apoptose ont été observées dans le cerveau de souris adultes et de poisson zèbre dont le gène huntingtin était désactivé.

Développement embryonnaire ^

Alors que la huntingtine&rsquos diverses fonctions cellulaires sont généralement attribuées à ses actions dans les neurones, la protéine semble également être essentielle pour le développement des embryons. Des études qui ont éliminé le gène de la huntingtine chez la souris ont révélé que leurs embryons meurent dans les sept ou huit jours suivant la fécondation. De plus, il ne suffit pas que la huntingtine soit simplement présente dans l'embryon en développement, mais elle doit être présente en quantité suffisante. Les souris qui ont 50 % ou moins des niveaux normaux de huntingtine survivent après le huitième jour après la fécondation, mais présentent des défauts importants dans le développement de leur système nerveux. Ces souris sont généralement capables d'atteindre l'âge adulte, mais présentent des anomalies comportementales, des défauts cognitifs et une neurodégénérescence dans certaines zones de leur cerveau. Fait intéressant, l'ajout de copies de la huntingtine avec la mutation d'expansion (même celles avec jusqu'à 128 répétitions CAG) peut sauver des souris knock-out d'une mort précoce, suggérant que le rôle de la huntingtine dans le développement de l'embryon est différent de ses actions plus tard dans la vie adulte. Cette hypothèse est étayée par des preuves que les humains qui sont homozygotes pour le gène mutant qui cause la MH (c'est-à-dire qu'ils n'ont pas de copies "normales" du gène) n'ont pas de malformations congénitales apparentes.


VOIES PATHOGÈNES

Perte de fonction/haploinsuffisance

L'extinction ou l'interférence avec la transcription est un moyen par lequel les répétitions étendues provoquent la perte de la fonction des gènes. Exemples : syndrome de l'X fragile, dans lequel l'expansion répétée entraîne la méthylation du FMR1 région promotrice ( 33) épilepsie myoclonique (EPM1) ( 34), dans laquelle l'expansion répétée sépare physiquement les facteurs de transcription dans le promoteur de la cystatine B et l'ataxie de Friedreich, dans laquelle la séquence répétée intronique expansée adopte une structure d'ADN « collante » qui interfère avec la transcription du gène de la frataxine ( 35). Bien que ces maladies résultantes présentent une transmission récessive (ou liée à l'X), il existe un potentiel de transmission dominante où la réduction du niveau ou de l'activité d'un produit génique limitant la vitesse peut apparaître comme une haploinsuffisance. Cela semble être le cas pour le SIX5 gène dans la dystrophie myotonique ( 36, 37), car la répétition CTG étendue est située dans le SIX5 promoteur. La réduction du « dosage » efficace de la SIX5 On pense que le produit génique provoqué par l'extinction d'un allèle contribue à certains aspects de la pathologie (voir ci-dessous).

Gain de fonction : l'hypothèse de la polyglutamine toxique — vieilles inquiétudes face à un nouveau dogme

De nombreuses séquences répétées expansées sont situées dans des régions codantes où elles se traduisent en segments polyglutamine expansés dans les allèles de la maladie (tableau 2). Ceci, associé à un ensemble substantiel de données démontrant la toxicité de la polyglutamine dans les cellules, a conduit à penser que la polyglutamine expansée est un composant commun et crucial dans la pathogenèse de ces maladies. À l'appui de ce point de vue, un anticorps, 1C2, dirigé contre le tractus polyglutamine de longueur normale de la protéine de liaison de la boîte TATA (TBP), s'est avéré reconnaître spécifiquement la polyglutamine expansée dans plusieurs des maladies à répétition expansée, par ex. huntingtine, ataxine 1 et autres (38). Cela a été pris comme preuve que la polyglutamine expansée a adopté une conformation différente qui a contribué d'une certaine manière à sa toxicité. Le contexte dans lequel la séquence répétée était située a été proposé pour expliquer pourquoi une telle conformation par ailleurs toxique ne posait pas de problèmes lorsqu'elle était située dans le TBP. Cette théorie est maintenant quelque peu erronée, car le tractus polyglutamine expansé dans certains allèles (m >50) de TBP a récemment été associée à une maladie neurodégénérative (39, 40). Il est possible qu'encore une autre conformation du tractus polyglutamine expansé soit adoptée une fois que la séquence répétée dépasse un seuil encore plus élevé.

Des inclusions nucléaires ont été trouvées dans les neurones affectés de modèles de souris transgéniques HD et SCA1 et de patients HD (41), ce qui incite à affirmer que ces inclusions nucléaires élargies contenant de la polyglutamine provoquent un dysfonctionnement neuronal. Klemment et al. (42) ont supprimé la région d'auto-association SCA1 chez les souris transgéniques et ont constaté que ces souris présentaient toujours une ataxie et une pathologie cellulaire de Purkinje, cependant, aucune preuve d'agrégats nucléaires n'a été trouvée. D'autres études sur le cerveau d'individus atteints de la maladie de Huntington (43, 44) ont révélé que les agrégats nucléaires étaient plus fréquemment trouvés dans les neurones non affectés que dans les neurones épineux striataux vulnérables. Par conséquent, il a maintenant été proposé qu'au lieu d'être pathogènes, les inclusions nucléaires puissent même protéger contre les effets toxiques de la polyglutamine expansée (45).

Une autre preuve contradictoire d'un rôle commun de la polyglutamine dans la pathogenèse est que les allèles de la maladie de la répétition CAG dans l'ataxie spinocérébelleuse 6 sont bien dans la plage normale pour d'autres « maladies polyglutamines ». Dosages fonctionnels sur les allèles CAG expansés du gène associé à SCA6, CACNA1A, démontrent une augmentation du transport du Ca 2+ ( 46) et rendent ainsi probable que ce gain de fonction est une cause spécifique et unique de pathogenèse pour ce trouble. Prises ensemble, ces exceptions suggèrent que la notion d'une seule voie pathogène commune impliquant la polyglutamine est peu probable.

Comme si les contradictions avec les gènes codant pour la polyglutamine ne suffisaient pas, une liste croissante d'ataxies associées à des répétitions ne code même pas pour la polyglutamine (tableau 2). Dans SCA12, la répétition CAG étendue est située dans la région 5'-non traduite (5'-UTR) du gène PPP2R2B ( 47, 48), tandis que dans SCA8 un CUG élargi est situé dans le 3′-UTR d'un transcrit (bien qu'il existe une controverse quant à savoir si cette expansion est à l'origine d'une maladie neurodégénérative) (49–51). De plus, une répétition intronique expansée de 5 pb s'est récemment avérée être associée à SCA10 ( 15).

Il faut donc se demander si la polyglutamine expansée est une condition nécessaire et suffisante pour les maladies dans lesquelles elle a été identifiée comme l'agent pathogène. Si c'est le cas, alors comment la spécificité cellulaire de cette toxicité est-elle expliquée alors qu'au moins certaines de ces protéines sont largement exprimées (voir 52) ? Une explication possible de cette énigme vient des découvertes de Kennedy et Shelbourne (26), qui révèlent une amplification spécifique à la cellule affectée de la répétition CAG instable dans un modèle murin de la maladie de Huntington. Il a également été constaté que les personnes atteintes de la maladie de Huntington présentaient une instabilité somatique, qui était la plus prononcée dans les zones affectées du cerveau (53, 54). Cela suggère que la mutation somatique en cours peut contribuer aux maladies causées par des répétitions étendues. Cette expansion peut également expliquer la relation entre le nombre de copies répétées de la lignée germinale et l'âge au début de ces maladies (7). Le temps nécessaire pour que la maladie se manifeste pourrait représenter le temps qu'il faut à l'allèle associé à la maladie pour atteindre un seuil critique de nombre de copies plus élevé dans la population cellulaire affectée (Fig. 2).

Quelle est alors la preuve que la polyglutamine a un rôle ? Les principales données proviennent d'études sur des modèles animaux transgéniques, en particulier celles de SCA1 souris transgéniques. La mutation du signal de localisation nucléaire de l'ataxine-1 diminue fortement la toxicité, alors que l'abolition des séquences nécessaires à l'agrégation ne le fait pas (42). Traversée de SCA1 les souris avec une souris transgénique déficiente en ubiquitine ligase entraînent une pathologie plus grave (55). Pour SCA2 et SCA6, la localisation nucléaire ne semble pas nécessaire, suggérant des voies différentes de celles de SCA1 (et HD) (56, 57).

Dans un modèle de souris transgénique MH où la transcription du transgène pouvait être activée ou désactivée artificiellement, il a été démontré avec élégance que l'expression du gène contenant CAG expansé était nécessaire pour une pathologie de type MH (58). Ce modèle animal fournit la première indication que la MH (et, espérons-le, d'autres maladies à répétition CAG étendue) est potentiellement traitable, étant donné que, chez les patients à risque, le gène responsable de la maladie peut être soit désactivé, soit le produit du gène toxique peut être éliminé de les neurones sensibles.

Vraisemblablement, d'autres facteurs, tels que la modification du tractus polyglutamine et/ou du contexte protéique dans lequel se trouve la polyglutamine, contribuent à la spécificité cellulaire de la toxicité. Des exemples où cela est apparemment ( 59) ou n'est pas ( 60) le cas ont été rapportés. La contribution relative de divers facteurs intrinsèques et extrinsèques est donc susceptible de différer entre les différents gènes de la maladie (et les systèmes modèles expérimentaux). Dépistage génétique des facteurs qui modifient la pathologie générée par la polyglutamine chez Drosophile ont produit un grand nombre et une grande variété de candidats ( 61, 62), et il sera très intéressant de voir lequel (le cas échéant) d'entre eux a un rôle dans la maladie humaine à polyglutamine.

Le biais de détermination a été invoqué par Penrose pour expliquer (et discréditer) l'observation de l'anticipation observée par les généticiens cliniques dans les familles de dystrophie myotonique (63). Alors que les répétitions d'ADN expansées donnent maintenant une base moléculaire (et une validation) pour le phénomène d'anticipation, la facilité relative avec laquelle les répétitions CAG expansées peuvent être dépistées comme cause de maladie neurodégénérative pourrait bien avoir conduit à une suraccentuation de l'importance relative de cette forme de mutation et a peut-être contribué à l'idée que les répétitions CAG expansées ont nécessairement une voie pathogène commune (via leurs polyglutamines expansées codées). Bien qu'il existe de nombreuses preuves à l'appui du rôle de la polyglutamine dans certaines maladies à expansion répétée, il existe une liste croissante d'exceptions et d'incohérences qui suggèrent (au moins) qu'il ne s'agit pas nécessairement d'une voie pathogène commune à toutes les maladies neurodégénératives. dans lequel une répétition étendue (sans parler d'un CAG étendu) est la mutation causant la maladie.

Des preuves supplémentaires pour des voies alternatives - effets de gènes multiples

Dans la dystrophie myotonique, il existe de bonnes preuves pour soutenir non seulement le rôle de plusieurs gènes, mais également de multiples voies dans la médiation des effets pathogènes de l'expansion répétée (pour la revue, voir 10). Trois gènes (DMPK, SIX5 et DMWD) sont tous situés à proximité immédiate de la répétition CTG expansée DM. On pense qu'au moins trois voies pathogènes distinctes contribuent à la DM. (i) La répétition expansée affecte l'épissage du gène DMPK dans lequel elle se trouve (64). (ii) Le transcrit d'ARN contenant la répétition expansée est à la fois compartimenté de manière inappropriée et titre une protéine cruciale (muscleblind) (65). L'expression de la répétition CTG dans un autre transcrit spécifique du muscle est capable de provoquer au moins une partie du phénotype DM (myotonie et myopathie) (66). (iii) La répétition DM CTG est également située dans la région promotrice du SIX5 gène et son expansion interfère également avec l'expression de ce gène. Les SIX5 gène code pour un facteur de transcription dont la concentration est critique pour le développement des yeux, des muscles et des testicules (67). Suppression hétérozygote de Six5 est suffisant pour provoquer des cataractes oculaires chez les souris transgéniques (36, 37), et donc la SIX5 l'haploinsuffisance provoquée par l'expansion de la répétition DM CTG est susceptible de contribuer au phénotype DM.

Les FRAXE Le site fragile chromosomique est associé à une forme légère de retard mental (68). La répétition CCG élargie a d'abord été localisée dans la 5'-UTR d'un gène, appelée FMR2. L'expression de FMR2 est éteint par expansion répétée et méthylation subséquente de la région du promoteur de l'îlot CpG (69), d'une manière analogue à l'extinction de la FMR1 gène au FRAXA locus dans le syndrome du X fragile (33). On a donc pensé que la perte de FMR2 était responsable du phénotype associé à FRAXE. Cependant, un gène supplémentaire, FMR3, a maintenant été identifié qui partage le même îlot CpG méthylé (70). Expression de FMR3 est également réduit au silence par FRAXE mutation complète et donc ce gène peut également contribuer au phénotype.


Quantification de la protéine huntingtine mutante dans le liquide céphalo-rachidien de patients atteints de la maladie de Huntington

1 University College London (UCL) Institute of Neurology, National Hospital for Neurology and Neurosurgery, Londres, Royaume-Uni.

2 IRBM Promidis SRL, Pomezia, Italie.

3 Carver College of Medicine, Université de l'Iowa, Iowa City, États-Unis.

4 Institut de neurosciences et de physiologie, Département de psychiatrie et de neurochimie, Académie Sahlgrenska de l'Université de Göteborg, Mölndal, Suède.

5 Centre de médecine moléculaire et thérapeutique, Département de génétique médicale, Université de la Colombie-Britannique, Vancouver, Colombie-Britannique, Canada.

6 CHDI Management/CHDI Foundation, Los Angeles, Californie, États-Unis.

Adressez la correspondance à : Douglas Macdonald, CHDI Management/CHDI Foundation, 6080 Center Dr., Suite 100, Los Angeles, Californie 90045, États-Unis. Téléphone : 310.342.5508 Courriel : [email protected]

Note d'auteur : Edward J. Wild et Roberto Boggio ont contribué à parts égales à ce travail.

1 University College London (UCL) Institute of Neurology, National Hospital for Neurology and Neurosurgery, Londres, Royaume-Uni.

2 IRBM Promidis SRL, Pomezia, Italie.

3 Carver College of Medicine, Université de l'Iowa, Iowa City, États-Unis.

4 Institut de neurosciences et de physiologie, Département de psychiatrie et de neurochimie, Académie Sahlgrenska de l'Université de Göteborg, Mölndal, Suède.

5 Centre de médecine moléculaire et thérapeutique, Département de génétique médicale, Université de la Colombie-Britannique, Vancouver, Colombie-Britannique, Canada.

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Note d'auteur : Edward J. Wild et Roberto Boggio ont contribué à parts égales à ce travail.

1 University College London (UCL) Institute of Neurology, National Hospital for Neurology and Neurosurgery, Londres, Royaume-Uni.

2 IRBM Promidis SRL, Pomezia, Italie.

3 Carver College of Medicine, Université de l'Iowa, Iowa City, États-Unis.

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1 University College London (UCL) Institute of Neurology, National Hospital for Neurology and Neurosurgery, Londres, Royaume-Uni.

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6 CHDI Management/CHDI Foundation, Los Angeles, Californie, États-Unis.

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Note d'auteur : Edward J. Wild et Roberto Boggio ont contribué à parts égales à ce travail.

CONTEXTE: La quantification des protéines associées à la maladie dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) a été essentielle pour l'étude et le traitement de plusieurs troubles neurodégénératifs. Le LCR et, à notre connaissance, n'a jamais été mesuré auparavant.

MÉTHODES: Nous avons développé un immunoessai mHTT ultrasensible par comptage de molécules uniques (SMC) qui a été utilisé pour quantifier les niveaux de mHTT dans des échantillons de LCR provenant d'individus porteurs de la mutation HD et d'individus témoins dans 2 cohortes indépendantes.

RÉSULTATS: Ce dosage immunologique SMC mHTT a démontré une spécificité élevée pour le mHTT, une sensibilité élevée avec un seuil de détection femtomolaire et une large plage dynamique. L'analyse des échantillons de LCR a montré que mHTT était indétectable dans le LCR de tous les témoins mais quantifiable dans presque tous les porteurs de mutation. La concentration de mHTT dans le LCR était environ 3 fois plus élevée chez les patients atteints de MH manifeste que chez les porteurs de mutations prémanifestes. De plus, les taux de mHTT augmentaient à mesure que la maladie progressait et étaient associés à une probabilité d'apparition à 5 ans. La concentration mHTT a prédit de manière indépendante un dysfonctionnement cognitif et moteur. De plus, le niveau de mHTT était associé aux concentrations de tau et de chaîne légère des neurofilaments dans le LCR, suggérant une origine neuronale pour le mHTT détecté.

CONCLUSIONS: Nous avons démontré que la mHTT peut être quantifiée dans le LCR de patients MH en utilisant le test immunologique SMC mHTT décrit. De plus, le niveau de mHTT détecté est associé à la proximité de l'apparition de la maladie et à une diminution des fonctions cognitives et motrices. La capacité de quantifier la mHTT du LCR facilitera l'étude de la MH, et la quantification de la mHTT pourrait potentiellement servir de biomarqueur pour le développement et le test de thérapies expérimentales de réduction de la mHTT pour la MH.

ENREGISTREMENT D'ESSAI: N'est pas applicable.

LE FINANCEMENT: Fondation CHDI Inc. Medical Research Council (MRC) Instituts nationaux britanniques pour la recherche en santé (NIHR) Rosetrees Trust Swedish Research Council et Fondation Knut et Alice Wallenberg.

Contrairement à d'autres maladies neurodégénératives courantes comme la maladie d'Alzheimer (MA) et la maladie de Parkinson (MP), qui se caractérisent par un mauvais repliement et une agrégation des protéines, la cause de la maladie de Huntington (MH) est connue avec certitude : une expansion répétée CAG dans le HTT gène codant pour la protéine huntingtine (HTT) (1). La huntingtine mutante (mHTT) contient un tractus polyglutamine étendu et provoque un dysfonctionnement neuronal et la mort, produisant la combinaison progressive et finalement fatale de symptômes comportementaux, cognitifs et moteurs qui caractérisent la MH (2, 3). Il n'existe actuellement aucun traitement qui modifie la progression de la MH, mais de nombreuses approches entrent maintenant en clinique, y compris des stratégies pour diminuer la production ou améliorer la clairance de la mHTT (4).

En raison de sa pénétrance complète, un test génétique peut identifier de manière fiable les individus destinés à développer la MH. Cependant, malgré une association entre la durée de la répétition CAG et l'âge d'apparition, l'évolution clinique de la MH peut être variable et imprévisible et est en partie déterminée par des facteurs génétiques et environnementaux inconnus (5). Certains d'entre eux sont probablement liés aux propriétés structurelles ou fonctionnelles de mHTT ou de ses espèces clivées et modifiées post-traductionnellement (3). La mHTT a été largement étudiée dans des systèmes modèles, mais chez l'homme son étude se limite à des méthodes indirectes telles que la mesure de l'atrophie cérébrale ou l'examen des tissus post-mortem.

La quantification des protéines associées à la maladie dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) humain est de plus en plus précieuse pour le diagnostic, le suivi de la progression de la maladie et l'évaluation de la réponse au traitement dans les maladies neurodégénératives, notamment la MA, la MP et la sclérose latérale amyotrophique (SLA) (6-9). Malgré son expression omniprésente, la mHTT n'a jamais été détectée dans le LCR humain, très probablement en raison de sa localisation principalement intracellulaire, ce qui entraîne de très faibles concentrations dans le LCR. Néanmoins, puisque mHTT est la cause connue de la neuropathologie MH, son étude dans un compartiment accessible du SNC, tel que le LCR, sera très informative. La capacité de quantifier la mHTT dans le LCR aurait un potentiel immédiat en tant que biomarqueur pharmacodynamique dans les essais thérapeutiques de traitements anti-HTT et, s'il était indépendamment capable de prédire les caractéristiques phénotypiques, le LCR mHTT pourrait servir de biomarqueur utile de la progression de la MH.

Nous avons précédemment décrit un test qui quantifie le mHTT soluble dans les leucocytes du sang périphérique et a montré que les niveaux de concentration de mHTT étaient associés à la progression de la maladie et aux taux d'atrophie cérébrale, mais ce test était insuffisamment sensible pour détecter la protéine dans le plasma du patient ou le LCR (10). Nous rapportons ici ce que nous pensons être un nouveau dosage immunologique de comptage de molécules uniques (SMC) sensible aux femtomolaires pour la mHTT soluble et son utilisation pour quantifier la mHTT dans le LCR à partir de 2 cohortes de volontaires témoins et de porteurs de mutations HD.

Le dosage immunologique SMC quantifie mHTT de manière sensible, spécifique et reproductible. Tout d'abord, nous avons utilisé le test immunologique SMC pour détecter des protéines HTT N548 humaines recombinantes purifiées avec des longueurs de polyglutamine dans les gammes mutantes (46Q) et WT (19Q). Nous avons trouvé une sélectivité marquée pour le mutant HTT par rapport au WT HTT (Figure 1, A et B). Cette spécificité est conférée par l'anticorps anti-HTT polyQ MW1, comme précédemment démontré dans d'autres plates-formes de dosage (11, 12). L'anticorps 2B7, quant à lui, se lie aux 17 acides aminés N-terminaux du mutant et du WT HTT (13). Un seuil de détection femtomolaire bas et une large plage dynamique ont été montrés avec le mHTT N548 46Q recombinant (figure 1C). La sélectivité élevée du dosage pour HTT par rapport à d'autres protéines a été démontrée par une baisse d'environ 80 % du signal après immunodéplétion par l'anticorps anti-HTT 4C9 (matériel supplémentaire de la figure 1B disponible en ligne avec cet article doi:10.1172/JCI80743DS1).

Le dosage immunologique mHTT SMC est spécifique et sensible. (UNE) Schéma de mHTT (pas à l'échelle) indiquant les épitopes liés par les anticorps 2B7 et MW1 utilisés pour le dosage. 2B7 se lie aux résidus 1-17 de l'extrémité N (11), tandis que MW1 transmet la spécificité de la protéine mutante en se liant préférentiellement au tractus polyglutamine expansé (13). (B) La détection de protéines HTT recombinantes purifiées avec le dosage immunologique SMC montre une spécificité pour le mutant (mHTT) par rapport à la protéine HTT humaine WT. (C) La détermination de la LLoQ et de l'ULoQ du test montre un seuil de détection femtomolaire bas et une large plage dynamique.

En utilisant le LCR artificiel et humain provenant de participants témoins et de porteurs de mutations MH enrichis de protéines HTT recombinantes, nous avons trouvé de bons taux de récupération du signal mHTT (91 % à 114 %) sur toute la plage quantifiable du test. Cela indique la capacité du test à quantifier avec précision des quantités connues d'analyte de référence dans des échantillons réels et que les conditions expérimentales contrôlent de manière satisfaisante tout effet potentiel sur la matrice du LCR (généralement causé par des anticorps hétérophiles, une activité protéolytique ou une liaison d'anticorps non spécifique Figure supplémentaire 1, C et D).

La mHTT est détectée chez le porteur de mutation, mais pas chez le participant témoin, le LCR. Ensuite, nous avons utilisé le test pour quantifier la mHTT dans le LCR et le plasma de 2 cohortes indépendantes (Londres, m = 12 et Vancouver, m = 40 Tableau 1). La cohorte de Vancouver couvrait un éventail plus large de participants que la cohorte de Londres, y compris ceux dont la maladie était avancée. Il n'y avait pas de différences significatives d'âge, de sexe ou de longueur de répétition CAG entre les cohortes.

Caractéristiques démographiques et cliniques des participants des cohortes de London et de Vancouver

Nous avons pu détecter la protéine mHTT dans les échantillons de LCR : la mHTT était présente dans le LCR de presque tous les porteurs de mutation HTT, mais pas dans celui des volontaires témoins (Figure 2). Dans la cohorte de Londres, nous avons pu détecter mHTT dans le LCR des 9 porteurs de mutations (moyenne ± SD 182,5 ± 106,3 fM P = 0,00455), mais pas dans le LCR de l'un des 3 contrôles (figure 2A). L'odds ratio (OR) pour la présence de mHTT chez les porteurs de mutation par rapport aux témoins était incalculablement élevé, avec une limite de confiance inférieure à 95 % de 33,1. Dans la cohorte de Vancouver, nous avons détecté du LCR mHTT chez 26 des 28 porteurs de mutation HTT (289,1 ± 194,6 fM, P = 7,79 × 10 –8 Figure 2B), mais dans aucun des 10 contrôles, l'OR pour la détection de mHTT chez les porteurs de mutations était à nouveau incalculablement élevé (limite de confiance inférieure à 95 % de 14,8).

mHTT est détectable dans le LCR à partir de HTT porteurs de mutations mais pas de participants témoins dans 2 populations. (UNE) Population de Londres (m = 12) et (B) Population de Vancouver (m = 30). La concentration de mHTT dans le LCR était significativement élevée chez les sujets MH manifeste par rapport à celle des sujets MH prémanifeste dans les deux populations. Les barres horizontales indiquent les moyennes du groupe. Les données ont été calculées par ANOVA des moindres carrés pondérés.

Il n'y avait aucun effet statistiquement significatif de l'âge ou du sexe sur les concentrations de mHTT dans le LCR dans les deux cohortes. Les concentrations de mHTT étaient un peu plus élevées dans la cohorte de Vancouver (216,9 ± 33,3 fM) que dans la cohorte de Londres (136,8 ± 35,4 fM), mais ce n'était pas statistiquement significatif (P = 0,217). La cohorte de Vancouver contenait des sujets avec une maladie plus avancée que la cohorte de Londres. Il n'y avait pas de différence significative dans les concentrations moyennes d'hémoglobine dans le LCR entre les cohortes de London et de Vancouver (P = 0,63), ce qui suggère qu'il n'y a pas de différences majeures dans la qualité du LCR.

La concentration de mHTT dans le LCR est plus élevée dans le manifeste que chez les participants MH prémanifestés. Les concentrations de mHTT dans le LCR étaient significativement plus élevées chez les participants présentant une MH manifeste (239,2 ± 166,8 fM) que chez les porteurs de mutation prémanifeste (69,0 ± 4,6 fM) dans la cohorte de Londres (P = 0,0035 Figure 2A). Ceci a été reproduit dans la cohorte de Vancouver, dans laquelle la concentration moyenne de HTT était de 365,0 ± 177,6 fM chez les participants MH manifeste, comparativement à 137,4 ± 130,4 fM chez les participants MH prémanifeste (P = 0,0006 Figure 2B).

La concentration de mHTT dans le LCR est plus élevée aux stades avancés de la maladie. Pour évaluer si les niveaux de mHTT changent au cours de la MH, nous avons examiné son association avec le score de charge de morbidité pathologique, une fonction de l'âge et de la longueur de répétition CAG qui prédit de nombreuses caractéristiques de l'apparition et de la progression de la MH (14, 15). Les concentrations de mHTT dans le LCR étaient significativement positivement associées au score de charge de morbidité chez les HTT porteurs de mutations dans la cohorte de Londres (R = 0.909, P = 0,0007 Figure 3A). Cela a été reproduit dans la cohorte de Vancouver, mais avec un coefficient de corrélation plus faible (R = 0.695, P = 0,0001 Figure 3B).

La concentration de mHTT dans le LCR est en corrélation significative avec le stade de la maladie. La concentration mHTT était positivement associée au score de charge de morbidité dans les deux cas (UNE) Londres (m = 9) et (B) Vancouver (m = 30) cohortes. Des associations positives significatives ont également été observées avec (C) Probabilité d'apparition conditionnelle à 5 ans chez les participants avant le manifeste (m = 13) et () dans les scores moteurs UHDRS (m = 39). Les données ont été calculées par analyse de régression linéaire.

Pour déterminer si le niveau de mHTT augmente à mesure que l'apparition de la maladie approche chez les porteurs de mutation prémanifeste, nous avons examiné son association avec la probabilité d'apparition conditionnelle à 5 ans - une estimation basée sur l'âge et le CAG de la proximité d'un individu prémanifesté par rapport à l'apparition clinique (16) - et trouvé une association positive significative (R = 0.661, P = 0,0139 Figure 3C). Notamment, les 2 participants MH avec des niveaux de mHTT dans le LCR inférieurs à la limite de détection étaient parmi les porteurs de mutations prémanifestes les plus éloignés de l'apparition prévue (probabilité d'apparition à 5 ans de 0,003 et 0,04).

La concentration de mHTT dans le LCR prédit indépendamment les caractéristiques cliniques de la MH. Ensuite, nous avons examiné si les niveaux de mHTT dans le LCR avaient la capacité de prédire les paramètres cliniques de la MH, au-delà du pouvoir prédictif connu de la longueur et de l'âge des répétitions CAG. Nous avons trouvé une association positive statistiquement significative entre la concentration de mHTT dans le LCR et le score moteur de l'échelle d'évaluation de la maladie de Huntington (UHDRS) (R = 0.629, P < 0,0001 Figure 3D). Cette association est restée significative après contrôle du score de charge de morbidité (R = 0.516, P = 0.0167).

Notamment, des associations négatives significatives ont également été trouvées entre la concentration de mHTT dans le LCR et la performance dans 4 des 4 tâches cognitives évaluées chez les participants de Vancouver : test de modalité symbole-chiffre (R = –0.565, P = 0,0062) Correspondance des couleurs Stroop (R = –0.620, P = 0,0012) Correspondance de mots Stroop (R = –0.612, P = 0,0015) et les interférences de Stroop (R = –0.505, P = 0,012 Tableau supplémentaire 1). Tous, à l'exception du score d'interférence de Stroop, sont restés statistiquement significatifs après contrôle du score de la charge de morbidité. Valeurs FDR (q valeurs), calculées pour tenir compte des comparaisons multiples, étaient inférieures à 0,05 pour toutes les associations brutes entre les scores mHTT et cognitifs, ainsi que pour les associations contrôlées par le fardeau de la maladie de mHTT avec la correspondance des couleurs et des mots de Stroop.

Ces résultats indiquent que la concentration de mHTT dans le LCR a une valeur prédictive indépendante pour ces caractéristiques cliniques de la MH, au-delà de la capacité prédictive connue de l'âge et de la longueur de répétition CAG.

Les concentrations de mHTT dans le LCR sont associées à celles des marqueurs neuronaux. Pour explorer l'origine et la signification du mHTT détecté dans le LCR, nous avons examiné les concentrations dans le LCR des protéines neuronales tau et de la chaîne légère des neurofilaments (NFL) dans les mêmes échantillons. Nous avons trouvé une association linéaire positive significative entre la concentration de mHTT dans le LCR et la concentration de tau dans le LCR (R = 0.791, P = 0,0111 Figure 4A) dans la cohorte de Londres. Ceci a été reproduit dans la cohorte de Vancouver (R = 0.577, P = 0,0008 Figure 4B).

Les concentrations dans le LCR de mHTT et des protéines neuronales tau et NFL sont significativement associées. Des associations linéaires positives significatives ont été observées entre les concentrations dans le LCR de mHTT et de tau dans (UNE) Londres (m = 9) et (B) Vancouver (m = 30) cohortes. Une association étonnamment étroite a été observée entre la concentration de mHTT dans le LCR et la concentration de NFL dans le (C) Londres (m = 9) et () Vancouver (m = 20) cohortes. Les données ont été calculées par analyse de régression linéaire.

Une association significative entre les concentrations de mHTT et de NFL dans le LCR a également été observée dans la cohorte de Londres (R = 0.886, P = 0,0015 Figure 4C) ceci a été reproduit avec une haute signification dans la cohorte de Vancouver (R = 0.919, P < 0,0001 Figure 4D).

Contrairement à la concentration mHTT, les concentrations tau et NFL n'étaient pas significativement associées aux scores cognitifs après contrôle de la charge de morbidité (tableau supplémentaire 1), à l'exception de la correspondance des couleurs NFL et Stroop (R = –0.626, P = 0,022), une association qui n'a pas survécu à la correction FDR. Nous notons, cependant, que d'autres estimations de corrélations cognitives de la NFL étaient d'une magnitude similaire à celle des corrélations mHTT, bien que l'échantillon disponible de mesures de la NFL soit plus petit.

Il n'y avait pas d'association positive ou négative significative entre les concentrations de mHTT et d'hémoglobine dans le LCR dans les deux cohortes (P = 0,125 pour Londres P = 0,945 pour la figure 2A supplémentaire de Vancouver), ni entre celles de mHTT et de protéines totales (P = 0,835 pour Londres P = 0,844 pour la figure supplémentaire 2B de Vancouver).

La mHTT a été détectée dans le plasma de tous les porteurs de mutation (Figure 2C supplémentaire). Cependant, il n'y avait pas d'association significative entre le LCR et les concentrations plasmatiques appariées de mHTT dans l'ensemble des données (r = 0,454, IC bootstrap à 95 % -0,145 à 0,740, P ≈ 0,14) ou après le retrait de 2 participants avec des valeurs extrêmes pour les deux mesures (r = –0.074, P = 0,670 Figure supplémentaire 2D).

Nous rapportons ici, pour la première fois à notre connaissance, la première quantification réussie de mHTT dans le LCR humain, obtenue à partir de 2 cohortes indépendantes. .De plus, nous rapportons ce que nous pensons être la première preuve directe qu'une charge mHTT plus élevée est associée à une fonction cognitive plus faible et à un dysfonctionnement moteur plus sévère chez les patients. Le fait que ces associations cliniques restent présentes après contrôle du score de charge de morbidité suggère que la mHTT du LCR pourrait avoir une valeur indépendante supplémentaire substantielle en tant que biomarqueur de la MH. À notre connaissance, c'est la première fois qu'un marqueur biochimique a montré la capacité de prédire indépendamment de telles caractéristiques phénotypiques de la MH.

De plus, la concentration de mHTT dans le LCR a d'autres associations potentiellement pertinentes sur le plan clinique : elle est significativement associée à la probabilité d'apparition dans la MH prémanifeste et au score de fardeau de la maladie chez tous les porteurs de mutations, et la concentration moyenne de mHTT est environ 3 fois plus élevée dans la MH manifeste que dans la MH prémanifeste. . Étant donné que la mHTT provoque la MH, sa quantification dans le LCR pourrait potentiellement être un biomarqueur moléculaire de la progression de la maladie, avec une valeur possible pour la conception et la conduite d'essais cliniques, et une fenêtre sur l'histoire naturelle de la maladie.

Les taux de mHTT dans le LCR n'étaient pas associés à l'âge, au sexe, à la concentration d'hémoglobine ou de protéines totales dans le LCR ou à la concentration plasmatique de mHTT, ce qui implique que nos résultats ne sont pas des artefacts démographiques, de contamination sanguine ou de transfert de mHTT du sang périphérique dans le LCR. Le fait que le LCR mHTT n'était pas associé à la concentration totale en protéines suggère qu'une augmentation générale des protéines dans la HD n'explique pas nos résultats dans le LCR mHTT.

Les concentrations de mHTT dans le LCR observées dans la cohorte de Vancouver étaient un peu plus élevées que dans la cohorte de London, mais cette différence n'était pas statistiquement significative. La cohorte de Vancouver contenait des sujets atteints d'une maladie avancée (qui présentaient également des concentrations de mHTT plus élevées), ainsi que davantage de sujets prémanifestés plus proches de l'apparition prévue de la maladie. De plus, contrairement aux échantillons de London, les échantillons de LCR de Vancouver n'étaient pas non plus standardisés pour le régime alimentaire ou l'heure de la journée. Les effets possibles du régime alimentaire, de l'heure de la journée, de la manipulation des échantillons et d'autres facteurs sur la concentration de mHTT dans le LCR sont actuellement à l'étude et pourraient être minimisés à l'avenir par la normalisation des procédures de collecte et de traitement.

Plusieurs résultats indiquent que le SNC est à l'origine de la protéine mHTT détectée par ce test dans le LCR des participants. Nous avons trouvé de très fortes corrélations linéaires entre la concentration de CSF mHTT et les concentrations de tau et de NFL, qui sont toutes deux exprimées presque exclusivement dans les neurones et sont associées à diverses formes de neurodégénérescence (6, 8, 9).

Notre immunoessai SMC utilise une combinaison d'anticorps optimisée avec une spécificité élevée pour le HTT expansé à la polyglutamine, alliée à une plate-forme qui améliore le rapport signal/bruit grâce à une incubation avec des microparticules paramagnétiques recouvertes d'anticorps, suivie d'une interrogation laser dans une cellule à flux capillaire pour détecter molécules d'analyte individuelles. Les immunoessais SMC ont une sensibilité élevée et des plages dynamiques qui sont des ordres de grandeur supérieurs à ceux des immunoessais conventionnels (17).

Comme souligné ci-dessus, l'association entre la concentration mHTT du LCR et les scores moteurs et cognitifs a survécu à la correction statistique du score de charge de morbidité. Il n'en va pas de même pour la protéine tau, ce qui implique la spécificité de la mHTT parmi les marqueurs protéiques du LCR de la neuropathologie en tant que biomarqueur ayant une capacité indépendante à prédire les caractéristiques cliniquement pertinentes de la maladie. Ceci, bien sûr, est en accord avec le rôle étiologique connu de la protéine. Nos résultats de la NFL dans un sous-ensemble d'échantillons relativement petit identifient cette protéine comme un biomarqueur potentiel de la MH, et nous continuons à étudier cette possibilité (18).

Le mécanisme sous-jacent à l'augmentation des concentrations de mHTT mérite une étude plus approfondie. De manière cruciale, les anticorps 2B7 et MW1 se lient à des domaines distincts de l'extrémité N terminale de mHTT (figure 1A), qui contient l'expansion de polyglutamine considérée comme essentielle à la neurodégénérescence de la MH (19, 20). Notre immunoessai SMC détectera donc toute espèce mHTT soluble contenant les épitopes 2B7 et MW1, à savoir les résidus 1-17 et la répétition polyglutamine. Ainsi, il détectera la protéine mHTT pleine longueur, les fragments d'exon 1, ainsi que d'autres fragments de mHTT qui contiennent l'extrémité N-terminale, mais il ne détectera aucune espèce dépourvue de l'extrémité N-terminale ou d'un tractus polyglutamine expansé. Nous ne pouvons exclure la possibilité d'une contribution d'autres espèces mHTT telles que les oligomères ou les agrégats mHTT. Néanmoins, notre test représente la première opportunité d'étudier la biologie des protéines mHTT in vivo dans le SNC du patient et permettra à de futures études de caractériser les espèces mHTT dans le LCR et leur rôle dans la pathobiologie de la MH. Nous développons des tests CSF complémentaires pour le HTT total et ses fragments clivés afin de comprendre quelles espèces de HTT sont associées à la neurodégénérescence ou à la neuroprotection.

Nous avons observé que la concentration de mHTT dans le LCR augmente avec la progression de la maladie. Nous avons précédemment signalé un phénomène similaire dans les leucocytes périphériques et démontré la présence de fragments mHTT N-terminaux dans ces cellules, suggérant que l'accumulation progressive de fragments mHTT N-terminaux pourrait être à l'origine de l'augmentation (10). Les fragments N-terminaux sont connus pour s'accumuler dans les neurones dans le cadre de la neuropathologie dans les modèles animaux (21), et il se pourrait que cette accumulation entraîne une augmentation de la mort cellulaire, augmentant la concentration de mHTT dans le LCR à mesure que la maladie progresse. Les associations linéaires avec les concentrations de tau et de NFL suggèrent que mHTT peut être un indicateur de dysfonctionnement global et/ou de mort des cellules contenant mHTT.

La spécificité de notre test pour la protéine mutante sur WT HTT provient de l'épitope d'anticorps MW1 liant la polyglutamine. Par définition, cela introduit une certaine tendance pour les faisceaux de polyglutamine plus longs à générer un signal plus élevé. Cependant, nous avons précédemment démontré l'utilisation d'une série allélique de protéines mHTT purifiées (10) et montrons à nouveau ici (Figure 1) que la concentration de mHTT, plutôt que la longueur de polyglutamine, est le principal contributeur à la liaison de cet anticorps dans la gamme de polyglutamine observée. chez 93% des patients (16).

Mosaïque somatique pour le HTT La longueur de répétition CAG a été observée dans le cerveau post-mortem humain, bien qu'il ne soit pas clair si une telle expansion est un moteur de la mort neuronale sélective de région, ou même lorsqu'elle survient au cours de la maladie (22-24). On pourrait émettre l'hypothèse qu'un nombre croissant de polyglutamines peut contribuer à l'augmentation du signal mHTT avec la progression de la maladie. Cependant, la dépendance primaire du dosage mentionnée ci-dessus sur la concentration de mHTT plutôt que sur le nombre de polyglutamines suggère qu'une concentration de mHTT croissante est probablement le principal moteur de l'augmentation du signal observé. Néanmoins, la possibilité d'une contribution de l'instabilité somatique mérite une étude plus approfondie.

Le présent travail démontre la relation entre le LCR mHTT et la progression de la maladie, tel qu'évalué par un examen transversal des participants à travers le spectre de la maladie. Pour établir si le LCR mHTT est un biomarqueur utile de l'apparition et de la progression de la MH, la prochaine étape cruciale sera d'exploiter ce test pour étudier le LCR mHTT et sa relation avec la progression clinique de manière longitudinale chez les patients.

Dans d'autres affections neurodégénératives, la quantification dans le LCR des protéines du SNC associées à la maladie a désormais une utilité clinique directe pour guider la prise de décision clinique autour du diagnostic. Les tests SMC ont également été utilisés pour détecter des espèces protéiques d'intérêt à faible abondance dans la MA (25 - 27). Alors qu'un test génétique peut prédire qui développera la MH, le diagnostic d'apparition motrice est actuellement clinique. Une fois mieux compris, les niveaux de mHTT dans le LCR pourraient jouer un rôle, aux côtés d'autres biomarqueurs, dans le soutien à la prise de décision clinique dans la MH, en particulier si des agents thérapeutiques modificateurs de la maladie deviennent disponibles.

Enfin, des approches thérapeutiques pour la MH qui visent à réduire la production de protéines mHTT au niveau de l'ADN/ARN ou à améliorer la clairance mHTT des cellules sont actuellement testées dans des essais cliniques (4). La capacité de quantifier la mHTT soluble directement dans un tissu accessible du SNC sera très probablement d'une valeur considérable en tant que biomarqueur pharmacodynamique dans de tels essais. Le test que nous décrivons ici a le potentiel de soutenir le développement clinique de ces agents thérapeutiques et d'autres pour la MH.

Recrutement des participants. HTT les porteurs de mutations ont été identifiés par des tests génétiques et le stade clinique déterminé à l'aide de l'UHDRS, comme décrit précédemment (28).

Collecte et traitement des échantillons. Une collecte dédiée de LCR auprès de 12 participants (cohorte de Londres) a été réalisée en utilisant des procédures conçues pour optimiser la détection de mHTT. Les échantillons ont été prélevés entre 9h00 et 10h00 après un jeûne à partir de minuit (l'eau était autorisée). Après injection de jusqu'à 5 ml de lidocaïne à 2 % (Mercury Pharmaceuticals Inc.), 15 à 20 ml de LCR ont été prélevés par ponction lombaire à l'aide d'aiguilles atraumatiques (catalogue 5181.27 Vygon) et placés immédiatement sur de la glace au chevet du patient. Les récipients de collecte et les articles en plastique tout au long de la chaîne de traitement étaient en polypropylène pour minimiser l'adsorption des protéines (29). Tout le traitement a été effectué sans délai et sur glace. Le LCR a été centrifugé à 2000 g pendant 10 minutes pour éliminer les cellules, divisées en aliquotes, congelées immédiatement à -80°C et analysées dans les 4 mois.

Un deuxième ensemble d'échantillons de LCR (cohorte de Vancouver), utilisé pour la réplication, a été collecté entre 2004 et 2009. Le LCR a été obtenu auprès de 40 participants en utilisant des méthodes similaires (30), mais le temps d'échantillonnage et les articles en plastique n'étaient pas standardisés et les échantillons ont été traités à température ambiante. . Ces échantillons ont été divisés en aliquotes et conservés à –80°C.

Des échantillons de sang ont été obtenus dans les 30 minutes suivant le prélèvement du LCR dans des tubes de préparation de cellules d'héparine de sodium à Londres (catalogue 362753 BD) ou des tubes EDTA à Vancouver (catalogue 367863 BD), et le plasma a été isolé par centrifugation conformément aux instructions du fabricant.

Anticorps. L'anticorps MW1 spécifiquement contre le domaine polyglutamine de HTT a été développé par Paul Patterson (13). L'anticorps anti-HTT 2B7 reconnaît les 17 premiers acides aminés de la protéine HTT humaine, et sa génération et sa caractérisation ont été décrites précédemment (11). Le marquage des anticorps destinés à être appliqués dans le test de détection du LCR a été effectué avec les kits Singulex Capture and Detection Labeling (catalogues 03-0077 et 03-0076 Singulex) conformément aux instructions du fabricant.

Protéine HTT purifiée recombinante. Des protéines humaines recombinantes contenant la séquence N-terminale de HTT avec 548 acides aminés (N548) et des répétitions polyglutamine de différentes longueurs ont été générées comme décrit précédemment (31). En bref, les protéines GST-HTT humaines recombinantes ont été exprimées dans E. coli BL-21 (catalogue C2530H New England BioLabs) et enrichi en Glutathione Sepharose 4B Beads (catalogue 17-0756-01 GE Healthcare). Les protéines HTT ont ensuite été clivées et purifiées à partir des marqueurs GST en utilisant PreScission Protease (catalogue 27-0843-01 GE Healthcare). Les protéines HTT ont été stockées dans du PBS à pH 7,2 avec 1 % de Tween-20 à -80°C jusqu'à utilisation ultérieure. La pureté a été évaluée par le gel de page SDS bleu de Coomassie (catalogues 20278 et NW04120BOX Life Technologies) (Figure supplémentaire 1A).

Dosage immunologique SMC pour la quantification de la protéine HTT mutante dans le LCR et le plasma. Tampon de dilution (50 l/puits) contenant 6 % de BSA, 0,8 % de Triton X-100, 750 mM de NaCl et un inhibiteur de protéase complet (catalogue 04693116001 Roche) 15 l par puits de LCR artificiel (complété de 10 % de Tween-20 et de protéase complète inhibiteur) et 135 l/puits d'échantillon humain (plasma LCR natif prédilué 1:3 dans du tampon de dilution) ont été ajoutés à une plaque de dosage 96 conique (catalogue P-96-450V-C Axygen). Anticorps 2B7 (100 µl/puits) dilué au 1:400 avec Erenna Assay Buffer (catalogue 02-0474-00 Singulex) couplé à des particules magnétiques (catalog 03-0077-02 Singulex) à raison de 25 µg d'anticorps par milligramme de particules magnétiques a été ajouté, et la plaque a été scellée et incubée sous agitation (600 tr/min Heidolph Titramax 1000 Microplate Shaker) à température ambiante pendant 1 heure. La plaque a été placée sur un rack magnétique et lavée 4 fois avec 200 µl de tampon de lavage 1X (catalogue 02-0111-00 Singulex). Le tampon de lavage a été retiré et 20 µl/puits de 0,5 ng/µl d'anticorps de détection MW1 dilué marqué avec le fluorophore de détection (catalogue 03-0076-02 Singulex) à un rapport de 15,7 pmol de fluorophore par microgramme de MW1 ont été ajoutés à la plaque. La plaque a été scellée et incubée sous agitation (750 tr/min) à température ambiante pendant 1 heure. Les plaques ont été lavées et le complexe anticorps-antigène a été transféré dans une nouvelle plaque d'essai à 96 cônes pour éliminer les événements de liaison non spécifiques au plastique. Après 4 lavages avec 200 l de tampon de lavage 1X et aspiration, du tampon d'élution (solution de glycine acide, 0,1 M, pH 2,7) a été ajouté à la plaque, et la plaque a été incubée sous agitation (1000 rpm) pendant 5 minutes. L'anticorps de détection élué a été transféré dans une plaque d'analyse Nunc 384 puits (catalogue 264573 Sigma-Aldrich) et neutralisé avec du tampon de neutralisation (Tris, 1 M, pH 9). La plaque d'analyse a été centrifugée pour éliminer la formation de mousse et de bulles, scellée et ensuite analysée avec le système d'immunoessai Erenna (Singulex).

Tous les tests ont été effectués par des opérateurs qui ne connaissaient pas l'état clinique du participant.

Quantification d'autres protéines. La quantification de l'hémoglobine a été réalisée avec le kit ELISA Human Hemoglobin (catalogue E88-135 Bethyl Laboratories) selon les instructions du fabricant. La quantification de Tau a été réalisée avec le kit V-PLEX Plus Human Total Tau (catalogue K151LAE Meso Scale Diagnostics) selon les instructions du fabricant. La quantification des protéines totales a été réalisée avec le Pierce BCA Protein Assay Kit (catalogue 23225 Life Technologies) selon les instructions du fabricant. La NFL a été quantifiée à l'aide d'un kit ELISA (UmanDiagnostics) selon les instructions du fabricant. Les concentrations femtomolaires ont été estimées à l'aide des masses molaires canoniques obtenues à partir de la base de données UniProt (32, 33).

Statistiques. L'analyse a été effectuée avec SAS, version 9.4 (SAS Inc.), StatXact, version 8 et R, version 3.1.1 (démarrage de la bibliothèque). La signification statistique a été définie par un P valeur inférieure à 0,05. Les limites supérieure et inférieure de quantification (ULoQ et LLoQ, respectivement) ont été définies comme les concentrations les plus faibles et les plus élevées de l'analyte dans le LCR qui pouvaient être déterminées quantitativement avec une précision et une exactitude acceptables. La pertinence de la distribution des données pour l'analyse statistique paramétrique a été vérifiée à l'aide de graphiques Q-Q. Des variables démographiques potentiellement confusionnelles (âge, sexe) ont été examinées dans des analyses préliminaires. Sauf indication contraire, ces facteurs de confusion n'étaient pas significatifs et ont été exclus des analyses finales. Les différences entre les sites ont été examinées à l'aide de la méthode bilatérale de Student. t test avec des variances égales ou inégales déterminées par un P = 0,15 seuil sur les tests F pliés. La détection de mHTT chez les porteurs de mutation par rapport aux témoins a été examinée à l'aide du test exact de Fischer. Les différences dans les niveaux de mHTT entre les groupes de porteurs de mutations ont été examinées à l'aide de l'ANOVA pondérée des moindres carrés (via PROC MIXED), avec une pondération basée sur différentes variances résiduelles spécifiques au groupe. La régression linéaire a été utilisée pour examiner la relation entre le mHTT et la charge de morbidité, la probabilité d'apparition, la NFL, le tau et les scores cliniques. Il y avait une non-normalité dans les distributions des mesures plasmatiques d'hémoglobine mHTT et LCR. Les comparaisons de groupe de ces variables ont donc été basées sur le test de Wilcoxon. Pour les corrélations mHTT plasmatiques, nous rapportons la corrélation de Pearson avec les IC bootstrap BCA. Pour l'hémoglobine du LCR, certaines mesures étaient en dehors de la plage quantifiable, et d'autres étaient détectables mais en dehors de la plage linéaire. Nous avons donc testé les corrélations d'hémoglobine dans le LCR à l'aide du test de rang de Spearman. Des comparaisons multiples ont été traitées via des FDR au sein de groupes conceptuellement liés (34).

Approbation de l'étude. Tous les travaux impliquant des volontaires humains ont été effectués conformément à la Déclaration d'Helsinki et approuvés par le Comité d'éthique de la recherche du centre de Londres et le Comité d'éthique de la recherche clinique de l'Université de la Colombie-Britannique. Tous les participants ont fourni un consentement éclairé écrit.

Nous remercions Robert Pacifici, Ignacio Muñoz-Sanjuan, Beth Borowsky et Simon Noble pour leurs discussions utiles et leur contribution scientifique Ulrike Träger pour ses conseils techniques et son soutien à Peter McColgan pour son soutien à la collecte d'échantillons Cristina Cariulo, Lara Petricca et Maria Carolina Spiezia pour leurs contributions techniques et feu Paul Patterson pour la fourniture d'anticorps MW1. Ce travail a été principalement financé par la CHDI Foundation Inc., une organisation de recherche biomédicale privée à but non lucratif exclusivement dédiée à la découverte et au développement de thérapies qui ralentissent la progression de la MH. E.J. Les travaux de Wild sont financés par le Medical Research Council UK (MR/M008592/1), le NIHR, l'Académie des sciences médicales, le Réseau européen de la maladie de Huntington (EHDN/SF/0478), la Fondation CHDI et GSK Inc. S.J. Tabrizi reçoit une subvention de l'EU FP7 Health Call the Medical Research Council UK (MR/L012936/1 et MR/J003832/1) la Fondation CHDI the Wellcome Trust the UK Huntington's Disease Association the Dementia and Neurodegenerative Disease Network UK the European Huntington's Disease Mettre en réseau le Centre de Recherche Biomédicale UCL/UCLH et le Conseil de Recherche en Biotechnologie et Sciences Biologiques (BBSRC). J.R.C. Miller est financé conjointement par la MRC et Rosetrees Trust. H. Zetterberg a reçu un financement du Conseil suédois de la recherche et de la Fondation Knut et Alice Wallenberg. Ce travail a été soutenu en partie par le NIHR UCL Hospitals Biomedical Research Center et le UCL Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.

L'adresse actuelle de Roberto Boggio est : Merck Serono chez RBM S.p.A. Istituto di Ricerche Biomediche A. Marxer, Via Ribes 1, 10010 Colleretto Giacosa (TO), Italie.

L'adresse actuelle de Rainer Kuhn et Andreas Weiss est : Evotec AG, Manfred Eigen Campus, Hambourg, Allemagne.

Conflit d'intérêt: D. Macdonald est employé par CHDI Management Inc., qui fournit des services-conseils à la Fondation CHDI. E.J. Wild a fait partie des conseils consultatifs ou a été consultant pour Shire Pharmaceuticals et Isis Pharmaceuticals Inc. S.J. Tabrizi a fait partie de conseils consultatifs ou a été consulté pour Siena Biotech, Simon-Kucher & Partners, Roche, Takeda Pharmaceuticals International, Novartis, Sanofi-Aventis, The Wellcome Trust, Isis Pharmaceuticals Inc., GSK Inc., Shire et TEVA Pharmaceutical Industries . R. Kuhn est un employé d'Evotec International. Il a siégé aux conseils consultatifs ou consulté pour CHDI Management Inc., IRBM Promidis SRL, Novartis Venture Fund, Satter Investment Management, Piqur Therapeutics AG et la Fondation NCL.

Informations de référence: J Clin Invest. 2015125(5) :1979–1986. doi:10.1172/JCI80743.


Une étude donne des indices sur l'origine de la maladie de Huntington et une nouvelle façon de trouver des médicaments

Les maladies du développement peuvent désormais être étudiées grâce à une nouvelle technologie impliquant de minuscules modèles de cerveau appelés neuruloïdes, présentés ici.

Les premiers signes de la maladie de Huntington, une maladie héréditaire qui détériore lentement le corps et l'esprit, n'apparaissent généralement qu'à l'âge mûr. Mais de nouvelles découvertes suggèrent que quelque chose ne va pas dans le cerveau bien avant que les symptômes n'apparaissent, et plus tôt que jamais. À l'aide d'une nouvelle technologie, les scientifiques de Rockefeller ont pu retracer les causes de la maladie jusqu'aux premiers stades du développement, alors que le cerveau ne faisait que commencer à se former.

Développé dans le laboratoire d'Ali Brivanlou, le professeur Robert et Harriet Heilbrunn, le système utilise des neuroloïdes, de minuscules cultures de tissus en trois dimensions qui servent de modèles pour des organes entiers. Les chercheurs créent ces amas cellulaires à partir de cellules souches embryonnaires humaines et les manipulent en laboratoire pour étudier comment surviennent les maladies du développement.

Des travaux antérieurs dans le laboratoire de Brivanlou ont trouvé des preuves que la maladie survient dans les jeunes neurones, mais cette dernière étude ramène encore plus loin la période de développement, à l'étape du développement du cerveau lorsque l'uniformité cellulaire cède la place à l'émergence de structures particulières, un processus appelé neurulation . Lorsque les chercheurs ont introduit dans les neuroloïdes une mutation connue pour causer la maladie de Huntington, elle a constamment provoqué des effets dramatiques avec des structures tissulaires de forme anormale. « Quelque chose s'est effondré », dit Brivanlou.

Les chercheurs ont commencé à utiliser la technologie pour rechercher des médicaments qui préviennent ces anomalies, une approche qui, espèrent-ils, fournira une alternative puissante aux travaux similaires effectués sur des modèles animaux.

«Cette technologie ouvre vraiment la porte à l'identification des mécanismes qui régissent le développement du cerveau, à la compréhension de la façon dont ils tournent mal dans la maladie et au test de médicaments qui remettent ces mécanismes sur la bonne voie», explique Brivanlou.


Recherche sur la maladie de Huntington (MH)

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative progressive, héréditaire, caractérisée par des mouvements anormaux involontaires et divers degrés de difficultés cognitives, telles que des problèmes de mémoire ou des difficultés à prendre des décisions ou à organiser leur vie, et des problèmes émotionnels, tels que l'anxiété et la dépression. La MH est causée par des mutations du gène Huntington (HTT), qui produit une protéine mutante. La maladie est génétiquement dominante, c'est-à-dire qu'un seul de nos deux gènes HTT doit être muté pour produire la MH, et chaque enfant d'une personne atteinte de MH a 50 % de chances de recevoir le gène mutant.

Les cerveaux MH sont examinés depuis des décennies par des neuropathologistes. Il y a une perte sévère de neurones dans le striatum, une zone de la partie centrale du cerveau qui joue un rôle important dans la régulation des mouvements fluides. Des zones du cortex cérébral présentent également une perte neuronale. Il y a perte de myéline, la gaine graisseuse qui entoure et isole les axones, les processus neuronaux par lesquels les neurones communiquent entre eux. D'autres cellules du cerveau, notamment les astrocytes, les cellules gliales qui soutiennent la fonction et la santé neuronales et la microglie, les cellules immunitaires du cerveau, sont également affectées.

Mécanismes moléculaires à l'origine de la MH

Bien que la neuropathologie nous ait donné des indices essentiels sur les changements structurels dans les cerveaux MH, elle ne nous a pas permis de comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine de la maladie. Ces dernières années, les chercheurs ont pu produire la mutation HTT chez des souris et des cellules cultivées dans des cultures tissulaires. Ces études ont commencé à révéler des mécanismes importants par lesquels la mutation produit cette pathologie remarquable. De nouvelles technologies sont également apparues pour nous permettre d'étudier les changements moléculaires dans le cerveau humain. L'un d'eux est le séquençage d'ARN à noyau unique (snRNAseq).

Ces coupes à travers le cerveau d'un patient normal et d'un patient MH révèlent que le cerveau MH est plus petit (atrophique), en particulier dans le striatum (flèches).

Avec cette approche, nous isolons les noyaux cellulaires de différentes zones du cerveau MH, en utilisant des tissus cérébraux frais congelés prélevés lors de l'autopsie et stockés à très basse température dans la New York Brain Bank du Columbia University Medical Center. Les noyaux cellulaires contiennent l'ADN de la cellule ainsi que l'ARN fabriqué à partir des gènes codés dans l'ADN. L'ARN est ensuite transporté du noyau vers le cytoplasme cellulaire, où il est « lu » et traduit en protéines cellulaires. Notez que tous les gènes ne sont pas exprimés dans tous les types de cellules, donc, par exemple, l'expression des gènes dans les cellules hépatiques est différente de celle exprimée dans les cellules musculaires.

De plus, les gènes exprimés dans les cellules normales doivent être significativement différents de ceux exprimés par les mêmes cellules dans une maladie. La technologie snRNAseq nous permet de capturer les ARN dans les noyaux puis de déterminer exactement quels ARN sont présents dans les noyaux individuels. Ainsi, nous obtenons une liste de gènes exprimés dans tous les différents types de cellules et comparons ceux du cerveau MH à ceux du cerveau des personnes sans maladie neurologique. Nous pouvons même comparer ces profils d'expression génique aux mêmes types de cellules dans d'autres maladies neurologiques, telles que les maladies d'Alzheimer et de Parkinson. Notez que dans les modèles murins de maladie, on peut isoler des cellules, pas seulement des noyaux, à partir de cerveaux fraîchement prélevés, mais cela est impossible dans des tissus congelés. Il est possible de le faire dans une certaine mesure à partir d'un nouveau cerveau humain, mais plus difficile, et on ne peut pas utiliser du matériel déjà mis en banque.

Une autre caractéristique de snRNAseq est que nous pouvons examiner différentes régions du cerveau. Par exemple, dans la MH et la zone de la partie centrale du cerveau, le striatum, est plus touchée que d'autres zones telles que le cortex cérébral. C'est-à-dire plus tôt dans la maladie lorsqu'il y a une perte beaucoup plus importante de neurones dans le striatum que dans d'autres régions. Nous pouvons maintenant comparer les profils d'expression génique de différents types cellulaires dans différents domaines, en discriminant ces différences.

Comment les études unicellulaires peuvent-elles nous aider à mieux comprendre la MH ?

Dans le cerveau des patients atteints de maladies neurodégénératives, toutes les cellules ne présentent pas simultanément des changements pathologiques. Ces maladies évoluent au fil des années et parfois des décennies. Ainsi, en examinant des cellules individuelles, nous trouvons un mélange de celles qui sont gravement modifiées et de celles qui sont beaucoup plus modérément modifiées. Les cellules le long de ce spectre ont des modèles d'expression génique différents, et en examinant ces modèles, nous pouvons déduire certains des premiers changements de la maladie. Ceci est important parce que les thérapies seraient plus efficaces si elles étaient proposées tôt au cours d'une maladie évolutive, avant même l'apparition des signes et des symptômes. À titre d'exemple, nous avons découvert que les astrocytes du cerveau MH peuvent être regroupés par leurs modèles d'expression génique dans ceux que nous pensons être plus avancés dans un spectre pathologique que d'autres.

De plus, les modifications de l'expression des gènes dans les astrocytes du striatum sont différentes de celles du cortex des cerveaux MH. Nous constatons que les réponses précoces des astrocytes impliquent l'augmentation de l'expression de gènes qui offrent une protection contre les métaux lourds, tels que le fer et le cuivre, des métaux lourds qui sont augmentés dans le cerveau MH, alors que les stades ultérieurs de la pathologie des astrocytes ont perdu ces gènes protecteurs. . Les études neuropathologiques soulignent que même au sein d'une même zone, comme le striatum ou le cortex, il existe une hétérogénéité en pathologie. Ainsi, la pathologie du striatum se déroule selon un gradient dorsal (supérieur) à ventral (inférieur). L'examen des cellules de différentes régions striatales peut également nous donner un aperçu des changements dans l'expression des gènes à mesure que la MH progresse.

Les technologies modernes ajoutent plus à snRNAseq. Nous pouvons maintenant choisir une série d'ARN qui sont augmentés ou diminués dans le cerveau MH et appliquer des sondes pour ces ARN à des sections tissulaires du cerveau pour demander si les cellules avec les expressions génétiques modifiées sont réparties de manière aléatoire sur le tissu ou si certaines zones de le striatum ou le cortex sont touchés. Nous sommes certains qu'il n'y a pas de distribution aléatoire. Encore une fois, cette visualisation peut nous donner un aperçu de l'emplacement des premiers changements dans le cerveau.

La découverte de changements dans l'expression des gènes dans la MH et d'autres maladies donne à la communauté scientifique des informations nouvelles et importantes sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces troubles. En particulier, la découverte de changements précoces dans l'expression des gènes pourrait bien nous conduire à de meilleures thérapies.


La maladie de Huntington est une maladie héréditaire qui affecte les cellules nerveuses du cerveau. Elle est causée par une mutation autosomique d'un gène situé sur le chromosome 4. Elle est causée par un gène dominant donc un seul allèle est nécessaire pour donner la maladie. Elle touche environ 1 personne sur 10 000.

La maladie de Huntington s'aggrave progressivement avec le temps. Elle provoque la détérioration des cellules cérébrales et la perte progressive du contrôle des muscles volontaires par les nerfs moteurs. La maladie de Huntington était à l'origine appelée chorée de Huntington (&ldquochorea&rdquo est le mot grec pour danser) en raison des mouvements incontrôlables de tremblement et de danse associés à la maladie. Cependant, le terme &ldquodisease&rdquo est maintenant utilisé parce que la condition implique beaucoup plus que des mouvements incontrôlables. La perte de capacité intellectuelle, les troubles de l'élocution, les hallucinations, les sautes d'humeur et de personnalité et la perte de mémoire sont associées à des degrés divers à cette condition.

Le gène responsable de la maladie de Huntington est situé sur le chromosome 4. Il est responsable de la production d'une protéine appelée Huntington. La fonction de cette protéine est actuellement inconnue. Dans la maladie de Huntington, le gène muté produit une forme anormale de la protéine. Les cellules dans certaines parties du cerveau sont particulièrement sensibles aux effets de la protéine de Huntington anormale et, par conséquent, fonctionnent mal et finissent par mourir.

Une difficulté particulière avec la maladie de Huntington est que les symptômes n'apparaissent généralement pas avant l'âge mûr. À ce stade, les personnes atteintes ont peut-être déjà transmis la maladie à leurs enfants. La maladie de Huntington est causée par un gène dominant et un seul allèle est nécessaire pour donner la maladie. Ainsi, toutes les personnes hétérogènes sont atteintes. En moyenne, 50 % des enfants en souffriront si l'un des parents est touché.

Si nous désignons l'allèle récessif par &ldquoh&rdquo et l'allèle dominant par &ldquoH&rdquo, alors une personne hétérozygote &ldquoHh&rdquo aura la maladie il ne peut y avoir de porteurs.

Par exemple, si un père en souffre, le tableau ci-dessous montre qu'il y a 1 chance sur 2 que l'enfant soit atteint de la maladie de Huntington.

Il n'existe actuellement aucun remède pour guérir la maladie de Huntington et sa progression ne peut être inversée ou ralentie. Des médicaments peuvent être utilisés pour gérer certains des symptômes tels que les mouvements excessifs. La thérapie de la parole et de la communication est également donnée pour aider les patients dans leur vie de tous les jours. Les tests ADN prédictifs sont disponibles pour les familles à haut risque de contracter la maladie. Cela comprend le conseil à la personne avant et après le test.


Mutation dynamique et huntington's - Biologie

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Les articles de fond représentent la recherche la plus avancée avec un potentiel important d'impact élevé dans le domaine. Les articles de fond sont soumis sur invitation individuelle ou sur recommandation des éditeurs scientifiques et font l'objet d'un examen par les pairs avant leur publication.

L'article de fond peut être soit un article de recherche original, une nouvelle étude de recherche substantielle qui implique souvent plusieurs techniques ou approches, ou un article de synthèse complet avec des mises à jour concises et précises sur les derniers progrès dans le domaine qui passe systématiquement en revue les avancées les plus passionnantes dans le domaine scientifique. Littérature. Ce type d'article donne un aperçu des orientations futures de la recherche ou des applications possibles.

Les articles du Choix de l'éditeur sont basés sur les recommandations des éditeurs scientifiques des revues MDPI du monde entier. Les rédacteurs en chef sélectionnent un petit nombre d'articles récemment publiés dans la revue qui, selon eux, seront particulièrement intéressants pour les auteurs ou importants dans ce domaine. L'objectif est de fournir un aperçu de certains des travaux les plus passionnants publiés dans les différents domaines de recherche de la revue.


Voir la vidéo: #Types#de#mutation# types de mutation (Août 2022).