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Besoin d'un filtre à air approprié pour bioréacteur?

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Je vais construire un bioréacteur simple pour la croissance des microalgues.

J'ai déjà des filtres à fluide taille de pores : 0,2 um, diamètre : 25 mm https://nl.vwr.com/app/catalog/Product?article_number=514-4039

Je me demande si je peux les utiliser pour la filtration de l'air afin d'éviter les bactéries lors du pompage dans l'air. Ou ai-je nécessairement besoin de filtres à air ?


Eh bien, vous devez vous procurer un filtre spécifique pour la filtration de l'air. Je recommande le filtre à membrane en polytétrafluoréthylène PTFE. Maintenant, les seuls problèmes sont la taille et « la stérilité ».

Il existe de nombreux fournisseurs qui les proposent. Si votre institution a un accord avec VWR, ils en ont certainement. Sinon, j'ai utilisé Sartorius dans le passé, mais je n'ai pas de fidélité particulière à leur marque.

Faites-moi savoir si vous avez besoin de plus d'aide.


Décharges de bioréacteurs

Une décharge de bioréacteur est une décharge municipale de déchets solides (MSWLF) dans laquelle des liquides sont ajoutés pour aider les bactéries à décomposer les déchets. L'augmentation de la dégradation et de la stabilisation des déchets est réalisée par l'ajout de liquide et d'air pour améliorer les processus microbiens. Ce concept de bioréacteur diffère de l'approche traditionnelle des décharges municipales de « tombe sèche ».

Types de décharges de bioréacteurs

    - Dans une décharge de bioréacteur aérobie, le lixiviat est retiré de la couche inférieure, acheminé vers des réservoirs de stockage de liquides et recirculé dans la décharge de manière contrôlée. De l'air est injecté dans la masse de déchets à l'aide de puits verticaux ou horizontaux pour favoriser l'activité aérobie et accélérer la stabilisation des déchets.

Exploitation d'un bioréacteur de paillasse

Les fermenteurs sont utilisés pour augmenter le rendement de la culture et la productivité des cellules issues de la bio-ingénierie. Après avoir sélectionné plusieurs candidats à la culture de cellules microbiennes ou animales dans des flacons à agitation, la prochaine étape logique consiste à augmenter la biomasse de la culture sélectionnée avec le fermenteur. Cette vidéo montre la configuration et le fonctionnement d'un système de bioréacteur de paillasse typique.

Résumé

Les systèmes de fermentation sont utilisés pour fournir un environnement de croissance optimal pour de nombreux types de cultures cellulaires. La capacité offerte par les fermenteurs à contrôler soigneusement la température, le pH et les concentrations d'oxygène dissous en particulier les rend essentiels à une croissance et à une expression efficaces à grande échelle des produits de fermentation. Cette vidéo décrira brièvement les avantages du fermenteur par rapport au flacon secoué. Il identifiera également les composants clés d'un système de fermentation de paillasse typique et donnera des instructions de base sur la configuration du récipient et l'étalonnage de ses sondes. Le spectateur sera familiarisé avec le processus de stérilisation et montrera comment ensemencer le milieu de croissance dans le récipient avec la culture. Les concepts de base de l'exploitation, de l'échantillonnage et de la récolte seront également démontrés. L'analyse simple des données et le nettoyage du système seront également abordés.

Introduction

La technologie de fermentation de base est une extension de la technique simple du flacon agité pour les cultures en croissance. Il est né du désir de contrôler les environnements de croissance des cultures vivantes de manière plus complète et quantitative. Les flacons d'agitation de culture en lots sont généralement limités par un contrôle imprécis de la température. L'uniformité de la température dans un agitateur incubé ou une pièce chaude est très variable, s'écartant parfois de 5 °C ou plus du point de consigne prévu. Etant donné que le flacon agité est normalement agité à une vitesse fixe, l'absorption d'oxygène et les échanges gazeux sont limités. Une fois que l'oxygène ambiant disponible est épuisé, la plupart des cultures ne parviennent pas à prospérer. Il n'y a pas de contrôle du pH dans les flacons agitateurs. Dans de nombreux cas, si la culture n'est pas limitée par la matière première, elle devient acide au point de nuire à la culture et la respiration ralentit considérablement. La plupart des cultures en flacons agités sont également gérées en 'batch', ce qui signifie qu'elles ne sont nourries qu'une seule fois au début ou près du début de l'inoculation des cultures. Une fois cette source de carbone initiale consommée, la culture cesse de croître. Dans certains cas, son métabolisme peut changer et commencer à consommer d'autres métabolites dans le bouillon de culture, modifiant parfois les caractéristiques de la biomasse ou de la protéine résultante. Les flacons à agiter sont également généralement sujets à une perte par évaporation du milieu dans des environnements de culture plus chauds, généralement de 10 % du volume par 24 heures à 37 ° °C. Cette perte modifie la densité de la culture et interdit le fonctionnement à plus long terme du système. Enfin, l'utilisateur peut rencontrer un moussage du média après agitation. L'apparition de mousse dans l'espace libre au-dessus de la culture limitera les échanges gazeux et étouffera davantage la croissance.

Le système de fermentation de base est conçu pour répondre à toutes ces limitations. Un contrôle minutieux de la température est obtenu dans les cuves de fermentation grâce à l'utilisation d'une agitation par turbine et d'une chemise chauffante. Un capteur inséré dans le récipient et le contrôle de rétroaction du chauffage et du refroidissement de cette veste entraînent généralement un contrôle de la température ۪.1 °C autour du point de consigne. Les fermenteurs de paillasse permettent généralement de contrôler le pH via l'ajout de réactif liquide via une pompe. La valeur du pH est surveillée en permanence dans le but de maintenir l'environnement optimal pour la croissance cellulaire. Une bonne aération est maintenue par la turbine de mélange susmentionnée ou par l'infusion d'air ou de gaz additionné d'oxygène directement dans la culture. Avec les cultures sensibles au cisaillement, le gaz enrichi en oxygène est le principal mécanisme de maintien du niveau d'oxygène dans la culture. La mesure de l'oxygène en solution est généralement réalisée par une sonde polarographique qui n'est normalement pas disponible pour une utilisation dans des flacons agités. Il est également possible d'ajouter en continu ou périodiquement de l'alimentation au récipient pour maintenir la croissance de manière linéaire ou exponentielle. Le condenseur de gaz de sortie fournit une surface froide pour que la vapeur dans le flux de gaz d'échappement se condense, préservant ainsi le volume et la densité de la culture. L'ajout périodique de tensioactif antimousse est actionné par une sonde de conductivité dans la culture, réduisant la mousse en surface et permettant les échanges gazeux.

Le récipient, avec toutes les sondes, raccords, turbines, tuyaux de récolte et tubes, est assemblé et stérilisé dans un autoclave standard. Après les étalonnages finaux de la sonde et la stabilisation dans l'environnement d'exploitation, la culture est ajoutée au récipient. Le système peut ensuite être utilisé pour caractériser la culture d'une manière plus quantitative et précise qu'avec une méthode en flacon agité. Un contrôle strict de la température, du pH, de la teneur en oxygène, de la consommation d'aliments, de l'évaporation des liquides et des niveaux de mousse contribuent tous à une biomasse beaucoup plus élevée et à un meilleur rendement en protéines.

Protocole

  1. Commencez l'opération avec la configuration du navire. Un fermenteur conventionnel a les composants suivants qui doivent être installés (Figure 1):
    1. Sonde de pH - pour la mesure du pH dans la culture vivante. Calibrer la sonde avant l'installation et stériliser avec le récipient. Installez la sonde dans la plaque frontale.
    2. pO2 sonde - pour la mesure de la teneur en oxygène dissous à l'intérieur du récipient pendant la fermentation. Installer dans la plaque de tête.
    3. Pipe de récolte pour l'échantillonnage de la culture. Installez ce composant à hauteur réglable dans la plaque de tête.
    4. Sparger de gaz - réside au fond du récipient et fournit une infusion de gaz à la culture. Accrochez le sparger à la source de gaz sur le fermenteur et montez-le dans la plaque de tête.
    5. Arbre de turbine et turbine - la turbine agite la culture et est essentielle pour maintenir l'uniformité de la culture dans le récipient.
    6. Condenseur de gaz d'échappement - pour réduire les pertes par évaporation dans le récipient en refroidissant le chemin des gaz d'échappement.
    7. Lignes de pompe à réactif pour le contrôle du pH ou l'ajout d'alimentation.
    1. Rassemblez 2 tampons de référence dans de petits béchers, une bouteille de lavage et un bécher de lavage de rechange.
    2. Accrochez la sonde de pH au fermenteur et allumez le fermenteur.
    3. Faites défiler jusqu'au paramètre pH et à l'aide du bouton de menu, faites défiler jusqu'à l'option 'Cal' et appuyez sur 'Enter'.
    4. Sélectionnez ƈ' pour un étalonnage en 2 points.
    5. Laver la pointe de la sonde et plonger dans le tampon de référence basse. La valeur sur le fermenteur se stabilisera. A l'aide des touches + et -, ajustez la valeur affichée pour qu'elle corresponde à la valeur du tampon pH de référence. Une fois qu'il cesse de clignoter, appuyez sur 'Enter'.
    6. Laver la sonde et l'insérer dans le deuxième tampon de référence. Laissez la valeur se stabiliser, puis utilisez le clavier pour que la valeur affichée corresponde à la valeur tampon de référence élevée. Appuyez sur 'Entrée' pour confirmer.
    7. Lavez la pointe de la sonde et déconnectez-la du fermenteur. Mettez le capuchon de protection sur la connexion et installez-le dans la plaque de tête.

    Résultats représentatifs

    Le bioréacteur peut fonctionner avec ou sans le logiciel IRIS. Cependant, pour capturer des données, il est préférable d'utiliser le logiciel. Avant l'ajout de bactéries, les capteurs de pH et d'oxygène doivent être calibrés, la vitesse de la turbine réglée et la température réglée. Dans Figure 2, les données de sortie d'un cycle de bioréacteur sont présentées. La température a été réglée à 30 °C, la vitesse de la turbine à 200 tr/min. Les paramètres peuvent être différents pour chaque expérience, mais avant l'ajout de bactéries, le système doit être à l'état d'équilibre. Dans figure 3, le changement de concentration en oxygène avec l'ajout de la culture bactérienne est montré. Les points de consigne pour cette expérience sont 37 °C, agitateur à 200 tr/min, O2 à 70%. A 19h20, la pompe d'alimentation délivre la culture de semences bactériennes à une DO de 0,1 provoquant une chute immédiate de la O2 niveau. Le bioréacteur répond à l'évolution de l'O2 niveau avec une augmentation du débit d'air et de la vitesse de la turbine. Les consignes des augmentations sont fixées en cascade (étape 35). Le pH du réacteur a été suivi en temps réel, le pH diminuant puis augmentant comme le montre la fluctuation de la ligne de pH au cours du temps (Figure 4). L'ensemble du cycle peut être analysé et les paramètres ajustés pour les expériences ultérieures.


    Figure 1. Bioréacteur de paillasse avec toutes les pièces étiquetées et connectées. Cette figure montre le réacteur à cuve agitée au début d'un essai. Les pièces du réacteur sont étiquetées et comprennent les capteurs, la turbine, la jauge de température, les bouteilles d'échantillonnage d'alimentation &, l'orifice d'échappement, le manomètre d'air, la chemise chauffante, la tour de condenseur et le panneau de commande.


    Figure 2. Image d'écran du logiciel du bioréacteur au début de l'exécution. Au début d'un essai en cuve agitée, la température a été réglée à 30 °C (ligne jaune), la vitesse de la turbine à 200 tr/min (ligne rouge), le pH à 6,5 (ligne verte) et pO2 à 57,2 % (ligne bleue). Cliquez ici pour voir la figure plus grande.


    Figure 3. Image d'écran du logiciel du bioréacteur pendant l'analyse à mesure que l'oxygène diminue. Lorsque la culture est en phase de croissance active, elle consomme de l'oxygène et la quantité d'oxygène dans le réacteur est diminuée (ligne bleue). En augmentant la vitesse de la turbine, plus d'oxygène peut être ajouté à la culture (ligne rouge). Cliquez ici pour voir la figure plus grande.


    Figure 4. Image d'écran du logiciel du bioréacteur montrant le changement de pH au fil du temps. Le pH de la culture est surveillé en continu et au fil du temps, il diminue à mesure que l'acide lactique est produit, puis augmente à mesure que la base est ajoutée au bioréacteur (ligne bleue). Cliquez ici pour voir la figure plus grande.

    Discussion

    Les bioréacteurs à cuve agitée sont la norme dans l'industrie de la biotechnologie et sont utilisés depuis plus de 40 ans 1 . Le petit réservoir d'agitation a été important pour la mise à l'échelle, la réduction, l'optimisation des contraintes, la caractérisation et le développement de processus. Elle peut également jouer un rôle important dans le développement de la médecine individualisée 2 . Le bioréacteur à petite échelle est le plus similaire à in situ conditions de croissance cellulaire, car elle peut être surveillée et optimisée tout au long d'une analyse. Le plus souvent, les expériences initiales sont effectuées à l'aide de flacons agités, mais les conditions dans le bioréacteur à petite échelle diffèrent considérablement de celles du flacon agité. Dans une expérience, nous avons constaté que les conditions d'une croissance optimale de E. coli et la production de protéine fluorescente verte (GFP) dans le flacon agité ne s'est pas traduite dans le réservoir agité (données non publiées).

    D'autres méthodes de culture de cellules à grande échelle comprennent les bouteilles roulantes, les bioréacteurs à plateforme basculante à usage unique 3 et les bioréacteurs à usage unique plus grands avec des volumes de travail de 50 à 5 000 L. Chaque méthode présente des défis pour la mise à l'échelle, mais a trouvé une place dans la production. Le bioréacteur à plate-forme basculante à usage unique est similaire au réservoir agité et fournit un environnement régulé. Il diffère du réservoir agité en ce que le mélange se produit en raison d'un mouvement de bascule pour générer des vagues pour empêcher la sédimentation des cellules et fournir une oxygénation. L'hydrodynamique de cette méthode est différente de celle du réservoir agité et le volume maximum est limité à 1 000 L. Les différences peuvent affecter la croissance cellulaire et la production de produits. D'autres systèmes à usage unique combinent le réservoir agité avec le réacteur jetable pour fournir une plate-forme avec un minimum d'infrastructure et de frais généraux associés, et la capacité de biotraitement à haut débit 4 .

    Les nouveaux utilisateurs de bioréacteurs de paillasse peuvent avoir des difficultés à déterminer les points de consigne initiaux pour le pH, pO2 et la température cependant, les recherches publiées peuvent être référencées pour cette information 5, 6, 7, 8, 9 . Pour les cultures bactériennes en particulier, il est recommandé de démarrer l'agitation à la même vitesse que le flacon agitateur et la température à la même consigne. Le pH de la culture des précédentes séries de flacons d'agitation peut également être utilisé comme point de départ. Réglage de la pO2 la valeur est plus difficile et est généralement déterminée de manière empirique. Cependant, à partir de 50 % de pO2 est un point de départ recommandé.

    Divulgations

    L'auteur A. Magno est un employé d'ATR Biotech qui produit les réactifs et les instruments utilisés dans cet article.

    Remerciements

    Ce projet a été soutenu en partie par l'Université Johns Hopkins, le Bureau du prévôt à travers le Initiative scientifique de la passerelle.


    Récipients de bioréacteur Cellbag avec film Bioclear 11

    Les conteneurs de bioréacteur Cellbag avec film Bioclear 11 sont recommandés pour les lignées cellulaires CHO et autres avec une sensibilité antioxydante spécifique.

    Sélectionnez le modèle

    Récipients de bioréacteur Cellbag avec film Bioclear 11, une formulation à faible teneur en antioxydants avec une construction similaire au film Bioclear 10. Le film Bioclear 11 est recommandé pour les lignées cellulaires qui se sont révélées sensibles à certains antioxydants.

    • Les conteneurs de bioréacteur Cellbag sont des chambres jetables préstérilisées pour le mélange non invasif de fluides à l'aide d'un système de bioréacteur WAVE.
    • Le film Bioclear 11 est une version à faible teneur en antioxydants de Bioclear 10 à utiliser avec les cellules CHO et d'autres lignées cellulaires qui ont une sensibilité antioxydante Irgafos™.

    Les conteneurs de bioréacteur Cellbag avec film Bioclear 11 sont conçus pour être utilisés avec les systèmes de bioréacteur WAVE. Les conteneurs de bioréacteur Cellbag avec Bioclear 11 sont formulés pour la culture de cellules de mammifères lorsque les produits de dégradation de l'Irgafos 168 peuvent interférer avec la croissance de lignées cellulaires sensibles telles que les cellules CHO. Les composants du bioréacteur Cellbag sont similaires à ceux utilisés pour les sacs de stockage biologique et répondent aux spécifications USP Classe VI pour les plastiques. Un guide d'aide à la validation réglementaire est disponible pour démontrer la biocompatibilité.

    Les conteneurs de bioréacteur Cellbag sont disponibles dans de nombreuses configurations. Les volumes vont de 2 à 200 L pour une utilisation avec les systèmes de bioréacteurs à bascule WAVE. Les conteneurs de bioréacteur Cellbag comprennent des filtres d'entrée et de sortie d'air, un port d'échantillonnage sans aiguille et un port de remplissage/récolte. De plus, chaque conteneur de bioréacteur Cellbag peut être personnalisé avec des raccords en option tels que des connecteurs aseptiques ReadyMate, des tubes plongeurs, un capteur de pH optique intégré dans le sac, des ports à bouchon à vis, des ports de température, des filtres de perfusion et des ports de tubes spéciaux.


    Des cultures statiques aux processus intensifiés

    Malgré le contrôle strict nécessaire pour une fabrication efficace d'ACT, les cellules immunitaires sont encore fréquemment développées dans des systèmes statiques dotés d'une capacité de surveillance limitée [10, 19, 23]. Ces plates-formes (plaques, flacons et sacs) dépendent d'incubateurs et sont limitées à un mode batch-and-split qui divise périodiquement et remplit la culture de milieu pour faire face à l'activité métabolique et aux besoins de stimulation des cellules, donc ces cultures sont très sensibles à la contamination car plusieurs récipients ouverts sont nécessaires pour créer un seul produit [33]. De plus, les cycles de renouvellement moyens provoquent des fluctuations fréquentes des nutriments et des métabolites qui peuvent déclencher une forte variabilité phénotypique [19]. En conséquence, les cellules ACT sont toujours fabriquées selon des procédés et des méthodes qui ont été caractérisés comme « archaïques, à peine contrôlés et incomparables » [34]. En raison de leur simplicité, les entreprises de thérapie cellulaire peuvent lancer des essais cliniques en utilisant des systèmes statiques, nécessitant une évaluation plus approfondie car des différences clés dans des paramètres tels que la contrainte de cisaillement, les conditions de culture et les interactions de cellule à cellule peuvent entraîner un profil biologique divergent lorsque les cellules sont déplacées. à une configuration dynamique à plus grande échelle [35].

    Les tests de qualité, qui comprennent des tests de fonctionnalité complexes, doivent être effectués en temps opportun, car les produits ACT sont généralement utilisés ou conservés brièvement après la production, ce qui augmente le risque d'incertitude et d'erreurs thérapeutiques [36]. Cela implique que la technologie d'analyse de processus (PAT) à elle seule n'est pas en mesure de fournir des informations solides pour répondre à la plupart des questions de qualité. Pour cette raison, la caractérisation discrète en cours de processus de l'état des cellules pendant la fabrication est généralement déphasée avec des propriétés surveillées en continu à l'aide d'outils PAT, qui sont de nature inférentielle (par exemple, OD, pH, consommation de glucose ou densité cellulaire) [37]. Cependant, notre compréhension de l'état cellulaire, y compris la métabolomique, la clonogénicité et la régulation du cycle cellulaire s'améliore considérablement [38].

    La plupart des bioréacteurs utilisés pour la culture de cellules thérapeutiques proviennent de vaisseaux et de technologies créés pour l'amont de bactéries ou de levures [14]. Cependant, il est important de noter que ces systèmes ne se concentrent pas sur l'intégrité et la fonctionnalité des cellules mais sur la maximisation du rendement, nécessitant ainsi un réaménagement pour relever le défi de générer un produit cellulaire sain et fonctionnel [38]. Les bioréacteurs permettent une mise à l'échelle du processus avec une standardisation et une reproductibilité élevées, tout en permettant l'évaluation de l'influence des paramètres du processus sur les performances de la culture [39]. De la même manière, l'intensification des processus par la mise en œuvre d'outils de modélisation mécaniste et de PAT, associée à l'utilisation de techniques de culture automatisées, permet d'atteindre un meilleur contrôle de l'expansion cellulaire [14] (Fig. 2).

    Principales caractéristiques des cuves de culture statiques et dynamiques et leur influence sur la variabilité du processus. Tendances typiques de la densité des cellules viables (ligne rouge), de la concentration en nutriments (ligne verte) et de l'oxygène dissous (ligne bleue) pour chaque type de récipient de culture

    La capacité d'un bioréacteur à surveiller et à contrôler les paramètres de processus critiques est une caractéristique très précieuse qui doit encore être explorée de manière optimale avec des cultures de lymphocytes. Pour profiter de ces capacités, plusieurs conceptions de bioréacteurs ont déjà été testées pour la culture de lymphocytes. Ces différentes configurations de bioréacteurs (Fig. 2) sont généralement adaptées à un domaine spécifique d'ACT (applications allogéniques ou autologues). Cependant, comme les cellules cultivées ont en principe les mêmes besoins, un ensemble général d'exigences visant à maximiser les capacités des bioréacteurs peut être formulé, guidant la transition de cultures statiques vers des processus intensifiés.


    Détermination de la croissance cellulaire

    La mesure de la croissance cellulaire est généralement effectuée en prélevant des échantillons à différents moments :

    1. Comptage cellulaire par coloration (microscope), dans le cas de cellules de mammifères
    2. Densité cellulaire totale (mortes et vivantes) par DO 600-650nm dans un spectrophotomètre pour bactéries/levures ou densité cellulaire totale (mortes et vivantes) par comptage dans une chambre de comptage de cellules Neubauer sous le microscope
    3. Cellules vivantes par dilution de l'échantillon, incubation de 0,1 ml sur plaque de gélose ou incubation de 1 ml dans une plaque de gélose pendant 1-3 jours à température de croissance en incubateur, utilisé dans le cas de bactéries/levures
    4. Par une cellule "compteur de socs" ou un système de comptage de particules

    Mesures in situ

    LAMBDA ouvre une nouvelle possibilité d'accéder à la cinétique de croissance cellulaire en mesurant et en enregistrant les quantités d'acide ou de base nécessaires pour maintenir le pH de la culture constant.

    La croissance de la culture est globalement considérée comme un grand complexe de réactions biochimiques ou chimiques, qui utilisent des substrats et donnent des produits sous la forme du produit souhaité ou/et de la masse cellulaire.

    La croissance cellulaire produit toujours du CO2 qui est acide et pour maintenir le pH constant, cet acide (qui s'échappe partiellement) doit être compensé par l'ajout d'un autre acide par un contrôleur de pH avec pompe à acide. (La formation d'acides et de bases métaboliques autres que le CO2 sont bien entendu également pris en compte par cette mesure globalement). En croissance régulière équilibrée la production de CO2 et le besoin d'acide correcteur de pH est proportionnel à la croissance (comme la somme de tous les processus métaboliques dans la cellule). Par conséquent, la quantité de solution de correction de pH ajoutée (acide ou base) est une indication précise de l'étendue de la croissance de la culture. L'ajout contrôlé d'acide équivaut en principe à un titrage analytique et est donc très précis.

    La méthode LAMBDA utilisant l'INTÉGRATEUR est strictement liée à l'activité métabolique réelle

    L'INTÉGRATEUR LAMBDA PUMP-FLOW transforme les impulsions entraînant le moteur de la pompe en une tension qui peut être enregistrée soit sur un enregistreur, soit visualisée sur un écran par un PC à l'aide du logiciel de fermentation (FNet ou SIAM).

    La quantification du signal INTEGRATOR peut être facilement obtenue en utilisant des acides de concentration connue et en étalonnant le débit de la pompe. Cela se fait facilement. Ensuite, cette valeur est corrélée à l'étendue de croissance mesurée par une autre méthode de taux de croissance appropriée. Ensuite, le simple signal du PUMP-FLOW INTEGRATOR permet une véritable cinétique de croissance précise et très peu coûteuse. Ce n'est pas le cas pour de nombreuses méthodes très coûteuses de mesure du taux de croissance, par ex. la mesure de la densité optique (DO) de la culture. Une telle mesure n'est pas précise car les cellules mortes, les bulles d'air, les précipités et toute autre formation de couleur ou de turbidité apparaissent comme une augmentation de la concentration cellulaire.

    La trace obtenue par l'INTÉGRATEUR donne également des indications sur les problèmes de croissance, la contamination et l'étendue de la biotransformation. C'est un paramètre important lorsqu'il s'agit de comparer des séries de cultures. Il serait dommage pour tout scientifique de ne pas utiliser ce système simple et précis pour le suivi de la croissance cellulaire que ce soit dans des cultures eucaryotes ou procaryotes.

    La trace de pH obtenue par la majorité des bioréacteurs concurrents n'est presque toujours qu'une ligne droite qui ne dit rien sur la culture. Cependant, si la quantité d'acide ou de base requise pour maintenir le pH constant pendant toute la croissance de la culture est visualisée par l'INTÉGRATEUR, cela ouvre une nouvelle dimension pleine d'informations précieuses pour le scientifique.

    Ci-dessous, un exemple de trace d'une activité de pompe à acide transformée par l'INTÉGRATEUR au cours d'une culture de biotransformation (trace rouge avec deux réinitialisations). La trace rouge est la seule qui soit clairement exponentielle, comme il se doit. En totalisant la consommation d'acide, l'étendue de la transformation et l'état immédiat de la culture peuvent être déduits. Inutile de dire à quel point de telles informations peuvent être importantes pour le contrôle et la reproductibilité des différentes cultures.

    Les clients de LAMBDA sont tellement convaincus de l'utilité de l'INTÉGRATEUR, qu'ils mettent des INTÉGRATEURS sur presque tous les paramètres contrôlés. Pas étonnant, les cellules sont si compliquées que toute information supplémentaire ne peut être que bénéfique.

    LAMBDA ne fournit pas de sondes de DO ou de biomasse pour les raisons évoquées précédemment. Cependant, l'utilisateur peut ajouter lui-même de telles sondes ultérieurement. Leur sortie peut être connectée au canal « X » ou, en variante, elle peut être visualisée par le logiciel SIAM. Le récipient MINIFOR a 6-8 cols latéraux et il y a donc de la place pour mettre des sondes supplémentaires. Cependant, il faut garder à l'esprit que de telles méthodes de mesure (les sondes et les contrôleurs correspondants) sont généralement très coûteuses.

    Bioréacteur MINIFOR en bref

    Bioréacteur avec un nouveau concept innovant pour tous types de cultures cellulaires à l'échelle du laboratoire de 35 ml à 6 l de volumes de culture.

    La construction extrêmement compacte permet d'économiser une surface de paillasse de laboratoire coûteuse.

    Deux douzaines de nouvelles idées et innovations permettent une haute qualité de mesure et de contrôle de six paramètres essentiels pour une bonne reproductibilité des analyses.

    Veuillez faire un voyage avec notre guide Innovations - il vous guidera à travers les améliorations, qui font de notre bioréacteur LAMBDA MINIFOR le meilleur choix pour votre laboratoire !

    Vous avez besoin d'un devis, du prix de nos produits, d'un conseil technique ou de plus d'informations ? Avez-vous des commentaires, des recommandations ou des questions?


    Conclusion

    Cette revue a rassemblé la littérature de tous les domaines du génie biochimique et du génie tissulaire, en mettant l'accent sur le bioréacteur de prolifération, pour mettre en évidence les considérations de conception qui doivent être respectées pour un bioprocédé capable de commercialiser un produit carné cultivé. Il reconnaît que si des leçons peuvent être tirées d'autres industries biotechnologiques, il manque des données clés requises pour la conception de bioprocédés. Ceux-ci ont été identifiés et discutés dans l'espoir que les lecteurs pourront les aborder et contribuer à une meilleure conception et progression du domaine naissant.


    Comment ça fonctionne

    La nature regorge d'exemples de processus intelligents et efficaces, et nous nous sommes inspirés d'un certain nombre d'entre eux lors de la conception de nos modules MBR. Cela a été un grand succès, résultant en de faibles coûts énergétiques, un nettoyage minimal et une qualité d'eau élevée. Nous développons progressivement nos systèmes de modules MBR pour les améliorer encore plus, toujours avec le même principe directeur : l'efficacité naturelle.

    LowResist™

    La conception LowResist unique d'Alfa Laval confère à notre module à membrane une chute de pression extrêmement faible. C'est grâce à la pression transmembranaire ultra-faible (TMP) que les membranes MBR Alfa Laval nécessitent beaucoup moins de nettoyage et d'entretien que les autres MBR du marché. Le faible TMP signifie qu'il n'y a pas d'encrassement des pores, juste un encrassement de surface facilement éliminé.

    C'est également la raison pour laquelle les filtres Alfa Laval MBR peuvent fonctionner par gravité avec seulement 1 m d'eau au-dessus du module, ce qui permet de maximiser la capacité d'un réservoir sans avoir à utiliser de pompes.

    Dans notre nouveau modèle, nous avons amélioré la technologie LowResist pour réduire encore plus la pression transmembranaire. Les nouvelles membranes ont des côtés ouverts, permettant à l'eau de s'écouler librement dans les boîtes de perméat. Cela conduit à une répartition plus uniforme de la pression sur la membrane, ce qui améliore la capacité et réduit les besoins de nettoyage.

    S Aerator™

    Notre dernier modèle MBR est équipé du système d'aération S Aerator. Ce nouveau système amélioré minimise la consommation d'air pendant le processus de filtration des eaux usées.

    Le nouvel aérateur S d'Alfa Laval utilise une conception à une seule ligne, combinée à une ligne affleurante.

    La conception facilite l'activation et la désactivation de l'air pendant le fonctionnement et vous permet de faire fonctionner vos modules à membrane MBR avec une aération alternée. Cela signifie que dans les systèmes avec plus d'un module membranaire, le décapage à l'air est appliqué de manière alternative et non continue. Ceci est possible sans que l'encrassement ne devienne un problème grâce au TMP extrêmement faible. Le gros avantage réside dans les économies d'énergie, d'investissement et de maintenance.

    QuickSwap™

    Les membranes MBR sont faciles à installer et à remplacer grâce à la technologie unique QuickSwap&trade d'Alfa Laval. La technologie QuickSwap&trade unique d'Alfa Laval signifie que chaque paquet peut être retiré individuellement, minimisant la hauteur de levage requise au-dessus du module à membrane. Cela signifie que les modules à membrane Alfa Laval&rsquos MBR sont particulièrement adaptés aux installations intérieures ou souterraines où une hauteur de levage supplémentaire signifie un coût d'investissement plus élevé.

    Les membranes se remplacent facilement grâce à la technologie QuickSwap&trade. Avec toutes les membranes d'un module montées en packs, un pack entier peut être remplacé en une seule opération, au lieu d'avoir à remplacer chaque élément membranaire individuellement.

    Pour remplacer un pack, il suffit de baisser le niveau du réservoir, de sortir l'ancien pack et d'en mettre un nouveau. Il n'est pas nécessaire de sortir le module entier du réservoir ou de passer du temps à s'assurer que chaque élément membranaire est en place après le remplacement des membranes.

    Membranes MBR optimisées pour une capacité élevée

    Les nouveaux modules à membrane Alfa Laval MBR ne nécessitent que deux côtés libres pendant le fonctionnement et peuvent donc être installés côte à côte en rangées, augmentant ainsi considérablement la densité de la membrane installée.

    La gamme de différentes tailles de modules, combinée à la faible profondeur d'eau requise pour le fonctionnement par gravité, permet d'optimiser l'utilisation des réservoirs existants et de maximiser la surface de membrane installée. Avec la solution d'Alfa Laval, vous obtenez la plus grande surface de membrane par volume de réservoir.

    La haute résistance à l'encrassement et l'absence d'encrassement des pores d'une membrane MBR Alfa Laval permettent de faire fonctionner le bioréacteur avec des concentrations de solides en suspension jusqu'à 50 % plus élevées que les filtres d'autres fabricants.

    La combinaison de ces facteurs signifie que vous obtenez une capacité maximale par volume de réservoir avec les membranes Alfa Laval MBR.

    MBR Membranes ─ conçues pour les applications de filtration des eaux usées

    Les membranes sont un élément clé d'une station d'épuration des eaux usées MBR et dans le traitement des eaux usées industrielles. Nous développons et fabriquons nous-mêmes toutes les membranes utilisées dans nos modules MBR pour garantir la plus haute qualité et la meilleure durabilité. Les membranes sont fabriquées en PVDF résistant au chlore et ont été spécialement optimisées pour une utilisation dans les applications de traitement des eaux usées.

    Les membranes constituent une barrière absolue contre les bactéries, les microplastiques et plusieurs autres polluants, et l'eau traitée est garantie pour répondre aux exigences de réutilisation de l'eau ou de rejet respectueux de l'environnement.

    Entièrement automatisé pour de faibles besoins en personnel

    Les membranes Alfa Laval MBR sont faciles à utiliser et peuvent être entièrement automatisées. Tous les aspects importants, tels que le décapage à l'air, les durées de cycle et le NEP peuvent être initiés, contrôlés et surveillés à distance. Le seul travail manuel requis pendant le traitement de l'eau MBR avec nos modules est de s'assurer que les réservoirs de produits chimiques de nettoyage sont remplis.

    Les besoins en personnel qui en résultent sont donc très faibles, normalement environ 1/4 équivalent temps plein d'opérateur par usine.

    Nettoyage

    La pression transmembranaire ultra-faible et l'absence d'encrassement des pores signifient que très peu de nettoyage est nécessaire. En fonctionnement normal, il suffit d'une période de relaxation de 2 minutes toutes les 10 minutes pour que l'air de récurage élimine l'encrassement de la surface.

    Il n'y a pas besoin de rinçage à contre-courant fréquent ou de lavage à contre-courant amélioré chimiquement - seulement un nettoyage CIP d'une à deux heures tous les deux ou trois mois. Les gains de temps par rapport aux autres systèmes MBR sont très importants.

    Les longs cycles de nettoyage CIP offrent également l'avantage de minimiser l'usure des membranes et l'utilisation de produits chimiques.


    Étape 8 : Obtention des cylindres en verre

    J'ai acheté le verre pour mon projet auprès d'Adams & Chittenden, un atelier de soufflage de verre scientifique à Berkeley, en Californie. Ils créent principalement des pièces de verre soufflé sur mesure utilisées pour les entreprises chimiques et biotechnologiques, y compris les bioréacteurs en verre. Découvrez la galerie sur leur site web : http://www.adamschittenden.com/

    Ma commande était assez simple - deux cylindres en verre de 450 mm de deux diamètres différents : 200 mm (les grands morceaux de verre extérieurs) et 60 mm (le morceau de verre intérieur). Les tubes en verre sont disponibles dans des tailles standard avec des tolérances spécifiques. Pour ma pièce les tolérances étaient :

    450 mm de long, 200 OD, 7 mm d'épaisseur :

    OD max : 202,6 mm // OD min : 197,4 mm

    ID max : 190,2 mm // ID min : 181,8 mm

    450 mm de long, 60 mm de diamètre extérieur, 2,4 mm d'épaisseur :

    OD max : 61,1 mm, OD min : 58,9 mm

    Max ID: 56.9mm, Min ID: 53.5 mm

    The tolerance for the tubing length was +/- 1mm, although I gave them special guidance to try to make them as equal as possible. (For example, it would be much better if they were both 449 or 451 rather than having one 450.5 and another 449.5. )

    I incorporated all of these tolerances into the design of the aluminum canisters.


    Requirements of bioreactors for lymphocyte culture

    Although every cell therapy process has unique elements, it is not practical to design specialized devices for each specific product. Instead, ACT products should be grouped on shared process characteristics, defining strategies and technologies that fit better for each category as a whole [40]. In that regard, ACT can be performed using two general principles: autologous and allogenic. In the autologous setting, a batch is individually produced from a patient’s biopsy, isolating and culturing the cell population of interest. In the allogenic workflow, cell source is a universal donor platform with highly expandable cells that have similar scale requirements as the manufacturing of cell derived proteins and the cell product may target multiple patients [25]. Process-wise, increasing vessel scale and ensuring culture performance (scale-up) is related to allogeneic approaches, while parallelizing several independent units (scale-out) is generally the goal in optimizing autologous therapy [22]. An autologous batch size is not expected to exceed more than a few liters volume, because of the limited amount of starting material and the time sensitivity of the cells to retain their functionality. Thus, scaling up autologous is not useful and scaling out for multiple batches still requires a thorough assessment of technical capacities [35]. This delicate setting for autologous cell therapy drives bioprocess development towards automation [11, 25], as the ideal autologous platform should compensate for the effects of varying culture conditions on CQA’s performance [40]. The allogenic set up, on the other hand, requires appropriate inoculation levels with minimal seed adaptation to maximize the expansion outcome. Therefore, the possibility of having a set of vessels geometrically and dynamically comparable is highly relevant [41]. In the same way, achieving consistent process reproducibility is necessary for a standardized and safe allogenic platform, thus, allogenic bioprocess development is mostly driven towards process control than workflow automation. To harness a bioreactor’s full potential, its design and application should be fitted to the challenges of cultivating lymphocytes and the supplements necessary for their growth. These are, in the view of the authors, and based on previous frameworks of requirements [14, 19, 25, 34, 35, 42], the main standards to be fulfilled by a culturing platform for ACT.

    Suitable vessel size and scalability

    Cell-based therapies often require the application of vast quantities of cells (10 8 � 10 ) to patients therefore the space required for their growth is a practical limitation. Assuming a culture density of 10 6 to 10 7 cells/mL (a high value for ACT), it would demand a volume starting from few milliliters up to tens of liters during culture [43]. The available bioreactor scale must be flexible enough to fully accommodate the range of cell growth across all feasible batches, and to compensate for the expected potential growth variability from the source [25]. To achieve this, ultra-high cell density cultures or an industrial scale production that is able to maintain uniform culture conditions are required [39]. Some current expansion processes include a preliminary stage where cells are activated and rapidly multiplied in static systems, generating enough cells for bioreactor inoculation. However, enough bioreactor space for the actual expansion is still necessary.

    GMP compliance

    To avoid cross contamination (between different batches or patients) and microbiological contamination, closed systems (bags, expansion sets, flasks), incubators and hoods should be used [36]. Bioreactors should guarantee sterility by keeping a closed system [19]. Each manipulation step (e.g. inoculation, activation, transduction, media changes, stimulation, sampling, washing) creates a risk for error and contamination that may lead to a failed run [36]. For that purpose, single-use, closed, disposable cell production “kits” may represent a desired design strategy for patient-specific cell therapy manufacturing protocols [44], particularly if such kits can be designed for simplicity [43].

    Process control

    Once the specific requirements for the cells being expanded have been defined, process parameters such as temperature, shear stress, dissolved oxygen (DO) and CO2 and environmental variables like osmolality and pH must be kept at optimal values [14]. .Extensive, online process monitoring and integrated control is required for adaptation to process changes [45]. DO and pH of the medium are typically held constant to provide a consistent environment supporting optimal cell expansion. DO and pH signals, are valuable for assessing the status of the expansion medium and cell proliferation, triggering a proportional feeding strategy [41], although this is a fairly limited approach. Some technologies that should be considered for ACT process monitoring and control are included in Table  1 . The final goal of process monitoring should be to find descriptors that can give information about the influence of batch-to-batch or donor-to-donor variability on the expansion process [58]. The best approach for process control development would be to use PAT data to facilitate process related decisions in real-time, or even predictively. This can include decision points for transduction, perfusion initiation, harvest point, or even quality control release based on minimum viability or endotoxin level. Ideally, such technologies would evolve to measure surface markers expression of key phenotypic markers.

    Tableau 1

    Advanced process monitoring tools for ACT

    ToolApplicationTaperRef.
    Raman spectroscopyMetabolite monitoring (glucose, lactate, amino acids).On-line[46]
    Total Cell Concentration.On-line[46]
    Cell identity determination (phenotype & activation).At-line[47, 48]
    Sequential injection capillary electrophoresisMetabolite monitoring (glucose, lactate, amino acids).At-line[49]
    Cell concentration.At-line[49]
    FT-IR spectroscopyGlucose monitoring.On-line[50]
    Electrical impedanceCell-mediated cytotoxicity and cell adhesion.At-line[51�]
    Biosensors for acidification measurementMetabolite monitoring (lactate).On-line[54]
    Biosensors – opticalCytokine quantification.Potentiel[55, 56]
    Gas chromatography-mass spectrometryVolatile organic compound (VOC) emissions profiling – metabolic monitoring.On-line[57]

    Handling of shear stress

    Ex vivo expansion of all immune cell types should avoid mechanical stress by chaotic, inhomogeneous medium dynamics [19]. It has been long established that animal cells are sensitive to shear, which, above certain levels, compromises their viability. Besides the direct effect that mechanical forces can exert on a cell membrane’s integrity, animal cells are adapted to the environment of each tissue, evolving sensitive mechanisms for detecting shear changes. To develop an acceptable understanding of how these forces influence cell behavior, it is necessary to recreate similar level of shear forces than found in the body within a bioreactor, allowing for a detailed characterization and control of the mechanotransduction process [59] and the direct effects of shear on the cells. Importantly, agitation must be designed to manage not only shear exposure of cells, but also the efficiency of mass transfer, suspension of cells and avoidance of heterogeneities that may cause cell inconsistencies [25].

    Representative sampling

    The designed bioreactor process should stay out of any artificial deleterious influences on cell integrity by passaging and reseeding the cells, as it may decrease total yield [19]. Sampling and harvesting of cells, medium, or both should be also designed with simplicity in mind. Taking samples has certain drawbacks that need to be mitigated [35]: to get a representative bioreactor sample, a significant volume should be drawn, which can impact on yield, especially if multiple small scale vessels are used for the cell expansion. Repeated sampling can also increase the risk of contaminating the bioreactor. Issues that need to be resolved in such cell therapy process development platforms include deciding on the amount of cells needed to reflect heterogeneity and the usage of live cell-based image analysis and “lab-on-chip” strategies [43].

    Stimulation and supplementation

    Media changes in bioreactors are usually done by nutrient addition, or by total or partial media replacement, or by perfusion. If a cell culture produces non-damaging levels of waste products, concentrated levels of nutrients can be added over time to feed the growing culture. Inevitably, waste metabolites such as lactate and ammonia start to accumulate, and either media replacement or perfusion is required. Perfusion, in which fresh media is gradually fed and old media is removed while the cells are retained, is the ideal way to intervene and still maintain a stable environment for cell therapy [35]. It also should be noted that cell exhaustion can be induced by current activation methods, which generally also demand careful operator attention [32]. Because of that, precise optimization of the feeding of nutrients and cell activators/stimulants is needed, being able to precisely supply them into the culturing medium, allowing for different feeding profiles.

    Gas transfer

    Gas transfer happens passively in static systems, which limits oxygen availability in high volume vessels, as the diffusive flux of a gas is inversely proportional to the thickness of the liquid that needs to be permeated, according to Fick’s law and the McMurtrey model of oxygen diffusion [60]. Oxygen transfer may be limited in non-perfused bioreactors because low agitation rates are required to minimize shear stress on the lymphocytes and headspace aeration is also generally preferred for the same reasons. This, on the long run, may hinder the final expansion output of the system [41]. .Oxygen can be supplied to a bioreactor either via the headspace or via a sparger which disperses gas into the medium, however, sparging has been shown to be possibly detrimental for immune cell growth [61]. The physiological oxygen concentration is usually lower than the atmospheric. Because of that, establishing culturing protocols that resembles in vivo oxygenation conditions may improve expansion yield and cell functionality [22]. Similarly, the use of CO2 levels representative of the biological fluctuation threshold could also be beneficial of the process outcome. It must be noted that reduced oxygen tension results in reduced human T cell proliferation, increased intracellular oxidative damage and susceptibility to apoptosis upon activation, highlighting the importance of controlling oxygen levels in culture [62].

    Physiological congruency

    There is no ideal bioreactor that suits all purposes for all cells, but it should be able to replicate in vitro many of the conditions experienced in vivo, therefore it should allow for experimental testing, mechanical conditioning and monitoring of living cells in dynamic conditions [59]. In a close physiological remembrance, immune cells cultured in bioreactors often require APCs for stimulation, three-dimensional culturing, controlled cell-cell contact and undisturbed local microenvironments [25]. These needs should be taken into consideration during the design of suitable devices, starting from the fact that hematopoietic cells do not require a surface to grow, being anchorage independent [63]. It is true that cells can be adapted to a specific bioreactor design as a replacement to engineering the bioreactor itself, but it must be noted that this approach may not be available to most cell therapies, as cells may become senescent after a certain amount of doublings [25]. It should also be noted that some cells may need to be in extensive contact with each other, such as TILs [64] and T cells [65, 66], some of them also tend to form aggregates that must be controlled for optimal growth [67], usually by mechanical disruption of the clusters.

    Different reactor configurations may fulfill these requirements to a varying extent. Given this framework, in the next chapter we explore the currently available options and highlight the most relevant characteristics that stand out from comparison.


    Need for proper air filter for bioreactor? - La biologie

    Methane fermentation is a versatile biotechnology capable of converting almost all types of polymeric materials to methane and carbon dioxide under anaerobic conditions. This is achieved as a result of the consecutive biochemical breakdown of polymers to methane and carbon dioxide in an environment in which a variety of microorganisms which include fermentative microbes (acidogens) hydrogen-producing, acetate-forming microbes (acetogens) and methane-producing microbes (methanogens) harmoniously grow and produce reduced end-products. Anaerobes play important roles in establishing a stable environment at various stages of methane fermentation.

    Methane fermentation offers an effective means of pollution reduction, superior to that achieved via conventional aerobic processes. Although practiced for decades, interest in anaerobic fermentation has only recently focused on its use in the economic recovery of fuel gas from industrial and agricultural surpluses.

    The biochemistry and microbiology of the anaerobic breakdown of polymeric materials to methane and the roles of the various microorganisms involved, are discussed here. Recent progress in the molecular biology of methanogens is reviewed, new digesters are described and improvements in the operation of various types of bioreactors are also discussed.

    Methane fermentation is the consequence of a series of metabolic interactions among various groups of microorganisms. A description of microorganisms involved in methane fermentation, based on an analysis of bacteria isolated from sewage sludge digesters and from the rumen of some animals, is summarized in Fig. 4-1. The first group of microorganisms secrete enzymes which hydrolyze polymeric materials to monomers such as glucose and amino acids, which are subsequently converted to higher volatile fatty acids, H 2 and acetic acid (Fig. 4-1 stage 1). In the second stage, hydrogen-producing acetogenic bacteria convert the higher volatile fatty acids e.g., propionic and butyric acids, produced, to H 2 , CO 2 , and acetic acid. Finally, the third group, methanogenic bacteria convert H 2 , CO 2 , and acetate, to CH 4 and CO 2 .

    Polymeric materials such as lipids, proteins, and carbohydrates are primarily hydrolyzed by extracellular, hydrolases, excreted by microbes present in Stage 1 (Fig. 4-1). Hydrolytic enzymes, (lipases, proteases, cellulases, amylases, etc.) hydrolyze their respective polymers into smaller molecules, primarily monomeric units, which are then consumed by microbes. In methane fermentation of waste waters containing high concentrations of organic polymers, the hydrolytic activity relevant to each polymer is of paramount significance, in that polymer hydrolysis may become a rate-limiting step for the production of simpler bacterial substrates to be used in subsequent degradation steps.

    Lipases convert lipids to long-chain fatty acids. A population density of 10 4 - 10 5 lipolytic bacteria per ml of digester fluid has been reported. Clostridia and the micrococci appear to be responsible for most of the extracellular lipase producers. The long-chain fatty acids produced are further degraded by p-oxidation to produce acetyl CoA.

    Proteins are generally hydrolyzed to amino acids by proteases, secreted by Bacteroides, Butyrivibrio, Clostridium, Fusobacterium, Selenomonas, and Streptococcus. The amino acids produced are then degraded to fatty acids such as acetate, propionate, and butyrate, and to ammonia as found in Clostridium, Peptococcus, Selenomonas, Campylobacter, and Bacteroides.

    Polysaccharides such as cellulose, starch, and pectin are hydrolyzed by cellulases, amylases, and pectinases. The majority of microbial cellulases are composed of three species: (a) endo-(3-l,4-glucanases (b) exo-p-l,4-glucanases (c) cellobiase or p-glucosidase. These three enzymes act synergistically on cellulose effectively hydrolyzing its crystal structure, to produce glucose. Microbial hydrolysis of raw starch to glucose requires amylolytic activity, which consist of 5 amylase species: (a) a-amylases that endocleave a ±1-4 bonds (b) p-amylases that exocleave a ±1-4 bonds (c) amyloglucosidases that exocleave a ±l-4 and a ±l-6 bonds (d) debranching enzymes that act on a ±l-6 bonds (e) maltase that acts on maltose liberating glucose. Pectins are degraded by pectinases, including pectinesterases and depolymerases. Xylans are degraded with a ²-endo-xylanase and a ²-xylosidase to produce xylose.

    Hexoses and pentoses are generally converted to C 2 and C 3 intermediates and to reduced electron carriers (e.g., NADH) via common pathways. Most anaerobic bacteria undergo hexose metabolism via the Emden-Meyerhof-Parnas pathway (EMP) which produces pyruvate as an intermediate along with NADH. The pyruvate and NADH thus generated, are transformed into fermentation endo-products such as lactate, propionate, acetate, and ethanol by other enzymatic activities which vary tremendously with microbial species.

    Thus, in hydrolysis and acidogenesis (Fig. 4-1 Stage 1), sugars, amino acids, and fatty acids produced by microbial degradation of biopolymers are successively metabolised by fermentation endo-products such as lactate, propionate, acetate, and ethanol by other enzymatic activities which vary tremendously with microbial species.

    Thus, in hydrolysis and acidogenesis (Fig. 4-1 Stage 1), sugars, ammo acids, and fatty acids produced by microbial degradation of biopolymers are successively metabolised by groups of bacteria and are primarily fermented to acetate, propionate, butyrate, lactate, ethanol, carbon dioxide, and hydrogen (2).

    Although some acetate (20%) and H 2 (4%) are directly produced by acidogenic fermentation of sugars, and amino acids, both products are primarily derived from the acetogenesis and dehydrogenation of higher volatile fatty acids (Fig. 4-1 Stage 2).

    Obligate H 2 -producing acetogenic bacteria are capable of producing acetate and H 2 from higher fatty acids. Only Syntrophobacter wolinii, a propionate decomposer (3) and Sytrophomonos wolfei, a butyrate decomposer (4) have thus far been isolated due to technical difficulties involved in the isolation of pure strains, since H 2 produced, severely inhibits the growth of these strains. The use of co-culture techniques incorporating H 2 consumers such as methanogens and sulfate-reducing bacteria may therefore facilitate elucidation of the biochemical breakdown of fatty acids.

    Overall breakdown reactions for long-chain fatty acids are presented in Tables 4-1 and 4-2. H 2 production by acetogens is generally energetically unfavorable due to high free energy requirements ( a ”G o, > 0 Table 4-1 and 4-2). However, with a combination of H 2 -consuming bacteria (Table 4-2, 4-3), co-culture systems provide favorable conditions for the decomposition of fatty acids to acetate and CH 4 or H 2 S ( a ”G o, < 0). In addition to the decomposition of long-chain fatty acids, ethanol and lactate are also converted to acetate and H 2 by an acetogen and Clostridium formicoaceticum, respectively.

    The effect of the partial pressure of H 2 on the free energy associated with the conversion of ethanol, propionate, acetate, and H 2 /CO 2 during methane fermentation is shown in Fig. 4-2. An extremely low partial pressure of H 2 (10 -5 atm) appears to be a significant factor in propionate degradation to CH 4 . Such a low partial pressure can be achieved in a co-culture with H 2 -consuming bacteria as previously described (Table 4-2,4-3).

    Methanogens are physiologically united as methane producers in anaerobic digestion (Fig. 4-1 Stage 3). Although acetate and H 2 /CO 2 are the main substrates available in the natural environment, formate, methanol, methylamines, and CO are also converted to CH 4 (Table 4-3).

    Table 4-1 Proposed Reactions Involved in Fatty Acid Catabolism by Syntrophomonas wolfei

    + 2 H 2 O 2 CH 3 COO - + 2H 2 + H +

    CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 COO -

    + 4 H 2 O 3 CH 3 COO - + 4H 2 + 2H +

    CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 COO -

    + 6 H 2 O 4 CH 3 COO - + 6H 2 + 3H +

    +1 H 2 O CH 3 CH 2 COO - + CH 3 COO - +2 H 2 + H +

    CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 COO -

    + 4 H 2 O CH 3 CH 2 COO - + 2 CH 3 COO - +4 H 2 + 2H +

    CH 3 CHCH 2 CH 2 CH 2 COO -
    |
    CH 3

    + 2 H 2 O CH 3 CHCH 2 COO - + CH 3 COO - + 2H 2 + H +
    |
    CH 3

    Table 4-2 Free-Energy Changes for Reactions Involving Anaerobic Oxidation in Pure Cultures or in Co-Cultures with H 2 -Utilizing Methanogens or Desulfovibrio spp.

    1. Proton-reducing (H 2 -producing) acetogenic bacteria

    A. CH 3 CH 2 CH 2 COO - + 2H 2 O 2 CH 3 COO - + 2H 2 + H +

    B. CH 3 CH 2 COO - + 3H 2 O CH 3 COO - + HCO 3 - + H + + 3H 2

    2. H 2 -using methanogens and desulfovibrios

    C. 4H 2 + HCO 3 - + H + CH 4 + 3 H 2 O

    D. 4H 2 + S0 4 2- + H + HS - + 4 H 2 O

    A + C 2 CH 3 CH 2 CH 2 COO - + HCO 3 - + H 2 O 4 CH 3 COO - + H + + CH 4

    A + D 2 CH 3 CH 2 CH 2 COO - + S0 4 2- 4 CH 3 COO - + H + + HS -

    B + C 4 CH 3 CH 2 COO - + 12H 2 4 CH 3 COO - + HCO 3 - + H + + 3 CH 4

    B + D 4 CH 3 CH 2 COO - + 3 S0 4 2 " 4 CH 3 COO - + 4 HCO 3 - + H + + 3 HS -

    Table 4-3 Energy-Yielding Reactions of Methanogens

    CO 2 + 4 H 2 ® CH 4 + 2H 2 O

    HCO 3 - + 4 H 2 + H + ® CH 4 + 3 H 2 O

    CH 3 COO - + H 2 O ® CH 4 + HCO 3 -

    HCOO - + H + ® 0.25 CH 4 + 0.75 CO 2 + 0.5 H 2 O

    CO + 0.5 H 2 O ® 0.25 CH 4 + 0.75 CO 2

    CH 3 OH ® 0.75 CH 4 + 0.25 CO 2 + 0.5 H 2 O

    CH 3 NH 3 + + 0.5 H 2 O ® 0.75 CH 4 + 0.25 CO 2 + NH 4 +

    (CH 3 ) 2 NH 2 + + H 2 O ® 1.5 CH 4 + 0.5 CO 2 + NH 4 +

    (CH 3 ) 2 NCH 2 CH 3 H + + H 2 O ® 1.5 CH 4 + 0.5 CO 2 + + H 3 NCH 2 CH 3

    (CH 3 ) 3 NH+ 1.5H 2 O ® 2.25 CH 4 + 0.75 CO 2 + NH 4 +

    Since methanogens, as obligate anaerobes, require a redox potential of less than -300 mV for growth, their isolation and cultivation was somewhat elusive due to technical difficulties encountered in handling them under completely O 2 -free conditions. However, as a result of a greatly improved methanogen isolation techniques developed by Hungate (6), more than 40 strains of pure methanogens have now been isolated. Methanogens can be divided into two groups: H 2 /CO 2 - and acetate-consumers. Although some of the H 2 /CO 2 -consumers are capable of utilizing formate, acetate is consumed by a limited number of strains, such as Methanosarcina spp. and Methanothrix spp. (now, Methanosaeta), which are incapable of using formate. Since a large quantity of acetate is produced in the natural environment (Fig. 4-1), Methanosarcina and Methanothrix play an important role in completion of anaerobic digestion and in accumulating H 2 , which inhibits acetogens and methanogens. H 2 -consuming methanogens are also important in maintaining low levels of atmospheric H 2 .

    H 2 /CO 2 -consuming methanogens reduce CO 2 as an electron acceptor via the formyl, methenyl, and methyl levels through association with unusual coenzymes, to finally produce CH 4 (7) (Fig. 4-3). The overall acetoclastic reaction can be expressed as:

    Since a small part of the CO 2 is also formed from carbon derived from the methyl group, it is suspected that the reduced potential produced from the methyl group may reduce CO 2 to CH 4 (8).

    On the basis of homologous sequence analysis of 16S rRNAs, methanogens have been classified into one of the three primary kingdoms of living organisms: the Archaea (Archaebacteria). The Archaea also include major groups of organisms such as thermophiles and halophiles. Although Archaea possess a prokaryotic cell structure and organization, they share common feature with eukaryotes: homologous sequences in rRNA and tRNA, the presence of inn-ones in their genomes, similar RNA polymerase subunit organization, immunological homologies, and translation systems.

    Recombinant DNA technology is one of the most powerful techniques for characterizing the biochemical and genetic regulation of methanogenesis. This necessitates the selection of genetic markers, an efficient genetic transformation system, and a vector system for genetic recombination as prerequisites.

    Genetically marked strains are prerequisites for genetic studies: these strains can be employed to develop a genetic-exchange system in methanogens based on an efficient selection system. Since growth of M. thermoautotrophicum is inhibited by fluorouracil, analogue-resistant strains were isolated by spontaneous mutation. Other mutants resistant to DL-ethionine or 2-bromoethane sulfonate (coenzyme M analogue), in addition to autotrophic mutants, were obtained by mutagenic treatment. Several autotrophic strains were also obtained for the acetoclastic methanogen, M. voltae. These mutant strains are listed in Table 4-4.

    Although some methanogen genes such as amino acid and purine biosysnthetic genes, transcription and translation machinery genes, and structural protein genes, have been cloned, genes encoding enzymes involved in methanogenesis were chosen as "methane genes" here.

    Methyl CoM reductase (MR Fig. 4-3) constitutes approximately 10% of the total protein in methanogenic cultures. The importance and abundance of MR inevitably focused initial attention on elucidating its structure and the mechanisms directing its synthesis and regulation. MR- encoding genes have been cloned and sequenced from Methanococcus vanielli, M. voltae, Methanosarcina barkeri, Methanobacterium thermoautotrophicum and M. fervidus.

    Formylmethanofuran transferase (FTR) catalyzes the transfer of a formyl group from formylmethanofuran (MFR) to tetrahydromethanopterin (H 4 MPT) (Fig. 4-3, 4-2). The FTR-encoding gene from M. thermoautotrophicum has been cloned, sequenced, and functionally expressed in E. coli. Formate dehydrogenase (FDH) may sometimes account for 2 to 3% of the total soluble proteins in methanogenic cultures. The two genes encoding the a ± and a ² subunits of FDH have been cloned and sequenced from M formicicum. In addition, the genes encoding F 420 -reducing hydrogenase (Fig. 4-3), ferredoxin, and ATPase have also been cloned.

    Table 4-4 Auxotrophic and Drug-Resistant Mutants Applicable To Gene Transfer Experiments


    Voir la vidéo: FILTRE A AIR FAIT MAISON. DellOrto SHA 1515 Tuto (Mai 2022).


Commentaires:

  1. Attewell

    Et où la logique?

  2. Gilleasbuig

    Cette brillante idée doit être délibérément

  3. Arashim

    La réponse exacte

  4. Arashizil

    Il y a quelque chose dans ce domaine. Je saurai, merci beaucoup pour l'information.

  5. Drust

    Je me suis abonné au flux RSS, mais pour une raison quelconque, les messages sont sous la forme de hiéroglyphes :( Comment résoudre ce problème ?

  6. Loman

    Je suis désolé, mais à mon avis, vous vous trompez. Je suis en mesure de le prouver.



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