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5: Interactions Moléculaires, Thermodynamique & Couplage Réaction Amp - Biologie

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Alors que la diversité des organismes et les propriétés uniques de chaque organisme individuel sont le produit de processus évolutifs, initiés il y a des milliards d'années, il est tout aussi important de reconnaître que tous les systèmes et processus biologiques, de la croissance et de la division cellulaire aux pensées et sentiments, obéissent les règles de la chimie et de la physique, et en particulier les lois de la thermodynamique.


5: Interactions Moléculaires, Thermodynamique & Couplage Réaction Amp - Biologie

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L'avènement de la génomique fonctionnelle a permis aux biosciences moléculaires de faire un long chemin vers la caractérisation des constituants moléculaires de la vie. Pourtant, le défi pour la biologie dans son ensemble est de comprendre comment les organismes fonctionnent. En découvrant comment la fonction apparaît dans les interactions dynamiques, la biologie des systèmes aborde les chaînons manquants entre les molécules et la physiologie. La biologie des systèmes descendante identifie les réseaux d'interaction moléculaire sur la base du comportement moléculaire corrélé observé dans les études « omiques » à l'échelle du génome. La biologie des systèmes ascendante examine les mécanismes par lesquels les propriétés fonctionnelles apparaissent dans les interactions de composants connus. Ici, nous décrivons les défis rencontrés par la biologie des systèmes et discutons des limites des approches descendantes et ascendantes, qui, malgré ces limitations, ont déjà conduit à la découverte de mécanismes et de principes qui sous-tendent la fonction cellulaire.

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Résumé

La réorganisation des solvants peut contribuer de manière significative à l'énergétique des interactions protéine-protéine. Cependant, notre connaissance de l'ampleur de la contribution énergétique est limitée, en partie, par un manque de mesures expérimentales quantitatives. Le répresseur de biotine forme un homodimère comme condition préalable à la liaison à l'ADN pour réprimer l'initiation de la transcription. A 20 °C, la réaction de dimérisation, couplée thermodynamiquement à la liaison d'un petit ligand, le bio-5′-AMP, est caractérisée par une énergie libre de Gibbs de -7 kcal/mol. Cette énergie libre de dimérisation nette modeste reflète des forces motrices enthalpiques et entropiques opposées sous-jacentes très importantes de 41 ± 3 et -48 ± 3 kcal/mol, respectivement. La thermodynamique a été interprétée comme indiquant le couplage de la libération de solvant à la dimérisation. Dans ce travail, cette interprétation a été étudiée en mesurant l'effet du remplacement de H2O avec D2O sur la thermodynamique de dimérisation. Les mesures d'équilibre de sédimentation effectuées à 20 °C révèlent un effet isotopique du solvant de -1,5 kcal/mol sur l'énergie libre de dimérisation de Gibbs. Analyse de la dépendance en température de la réaction dans D2O indique des contributions enthalpiques et entropiques de 28 et -37 kcal/mol, respectivement, considérablement plus petites que les valeurs mesurées dans H2O. Ces grandes perturbations isotopiques du solvant à la thermodynamique sont compatibles avec une contribution significative de la libération de solvant à la réaction de dimérisation.


Thermodynamique des réactions anticorps-antigène. 1. La liaison d'haptènes simples à deux classes d'anticorps fractionnés selon l'affinité

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Résultats et discussion

Nous avons entrepris de tester l'hypothèse selon laquelle l'entropie-mètre est universellement applicable [c'est-à-dire que la mise à l'échelle (s) entre les changements de mouvement interne rapide et les changements d'entropie conformationnelle est constant]. Il existe maintenant environ deux douzaines d'études publiées sur le changement de la dynamique des chaînes latérales méthyliques qui sont suffisamment complètes pour être utilisées pour tester cette idée (Annexe SI, tableau S1). Les critères de sélection de ces complexes comprenaient la disponibilité d'affectations complètes et de données de relaxation dans les états protéiques libres et complexés, ainsi qu'une interface en grande partie sèche dans le complexe. Nous avons augmenté bon nombre de ces études de relaxation RMN en mesurant la thermodynamique de liaison à l'aide d'une calorimétrie de titrage isotherme (ITC) dans des conditions de solution RMN correspondantes (c'est-à-dire, tampon, pH, température). Des exemples entièrement nouveaux ont également été examinés. L'ensemble de données organisé est résumé dans Annexe SI, tableaux S1 à S4.

Auparavant, les coefficients déterminés empiriquement reliant les changements de surface polaire et apolaire accessible aux entropies de solvatation de ces deux types de surface devaient être dérivés sous réserve de diverses hypothèses sur la nature de l'entropie conformationnelle (12). La quantité sans précédent de données dynamiques utilisées ici nous permet maintenant de déterminer directement les coefficients de surface. Les données sur les 28 protéines utilisées ici ont été obtenues à des températures quelque peu différentes (298-308 K). Des changements significatifs de capacité calorifique accompagnent l'hydratation des groupes apolaires et polaires. Heureusement, la variation de température correspondante de l'entropie de désolvatation est bien décrite expérimentalement par les relations ΔSapolaire =Cpapolaireln(T/385K)⋅ΔCOMME UNapolaire (27) etSpolaire =Cppolaireln(T/176K)⋅ΔCOMME UNpolaire (28), oùCpapolaire etCppolaire sont les changements dans les capacités thermiques d'hydratation par unité de surface d'apolaire (ΔCOMME UNapolaire) et polaire (ΔCOMME UNpolaire) de surface, respectivement, et 385 K et 176 K sont des températures de référence auxquelles les entropies de solvatation apolaire et polaire s'extrapolent à 0 (27, 28). L'interception de l'équation. 2 contient la perte d'entropie rotationnelle-translationnelle lors de la formation du complexe. Nous reformulons donc l'équation. 2 comme : Δ S total = sd [ ( N χ protéine Δ 〈 O axe 2 〉 protéine ) + ( N χ ligand Δ 〈 O axe 2 〉 ligand ) ] + [ Δ C papolaire ⁡ ln ( T / 385 K ) Δ ASA apolaire + Δ C ppolaire ⁡ ln ( T / 176 K ) Δ ASA polaire ] + [ Δ S r − t + Δ S autre ] , [3] où les termes de capacité calorifique sont évalués à la température expérimentale de chaque complexe. Lorsqu'elle est combinée avec les changements connus de la surface accessible apolaire et polaire, cette formulation donne les contributions à l'entropie du solvant. Les entropies sont données ici par rapport à un état standard de 1 M.

Si des contributions non comptabilisées à l'entropie de liaison (c'est-à-dire, ΔSautre) être insignifiant, alors ΔSr-t dominera l'interception ordonnée. Les violations des quelques hypothèses utilisées pour construire la ligne d'étalonnage du compteur d'entropie entraîneront un écart par rapport à la linéarité. On suppose que les groupes méthyle sont suffisamment nombreux, bien répartis et correctement couplés aux acides aminés non méthyliques de telle sorte que leurs mouvements fournissent une couverture complète du mouvement interne de la protéine. Ces hypothèses sont fortement étayées par la simulation (21).

L'ajustement de l'équation. 3 aux données dynamiques indique une forte corrélation linéaire (R de -0,85, R 2 = 0.72, P < 10 -7 ) (Fig. 1). Pour vérifier la stabilité de l'ajustement, nous avons effectué une analyse de type jackknife, où les membres individuels de l'ensemble de données ont été échantillonnés au hasard. Un minimum de cinq points seulement est requis pour définir s avec une précision raisonnable, qui converge en douceur à mesure que des points supplémentaires sont ajoutés (Annexe SI, fig. S1). Les valeurs déterminées de s,Sr-t,Cpapolaire, etCppolaire sont énumérées dans le tableau 1, et d'autres statistiques sont résumées dans Annexe SI, fig. 2 et tableau S5. Le paramètre d'intérêt central (s) est bien déterminé et fournit un moyen robuste et apparemment général pour obtenir expérimentalement le changement d'entropie conformationnelle lors de l'association protéine-ligand. Il est un peu plus petit que le paramètre obtenu en utilisant uniquement les deux systèmes protéiques, protéine activatrice de catabolite et calmoduline, utilisés précédemment pour l'étalonnage (21) (Fig. 1, cercles verts et bleus, respectivement). Bien qu'il soit probable que s variera en détail entre différentes protéines, la précision capturée par la figure 1 indique que cette variabilité est limitée.

Calibrage du proxy dynamique pour l'entropie conformationnelle des protéines. Ajustement de l'éq. 3 aux données fournies par 28 associations protéine-ligand (cercles bleu, vert et magenta) est montré. La différence entre l'entropie de liaison totale mesurée et l'entropie de solvant calculée est tracée en fonction du changement du proxy dynamique lors de la liaison du ligand. L'approximation dynamique est la différence des paramètres d'ordre généralisé au carré moyen de Lipari-Szabo des axes de symétrie du groupe méthyle (Δ<O 2 axe>) mis à l'échelle par le nombre total d'angles de torsion (Non) dans la protéine. Les barres d'erreur horizontales incluent la SD de <O 2 axe>, ce qui est inférieur à ±0,01 pour nos données. Pour les complexes impliquant de petits peptides ou oligonucléotides, l'incertitude du ligand contribue aux barres d'erreur d'abscisse (Annexe SI). Les barres d'erreur d'ordonnée proviennent des erreurs de quadrature propagées du expérimentalSle total et la précision des coefficients ajustés utilisés pour déterminerSsolvant, etSr-t. Dans de nombreux cas, l'erreur d'ordonnée est inférieure à la taille du symbole. La pente aménagée (s) de -0,0048 ± 0,0005 kJ⋅mol -1 ⋅K -1 permet la conversion des changements mesurés dans le mouvement de la chaîne latérale méthyle et la contribution associée à l'entropie conformationnelle totale. D'autres paramètres déterminés pour l'Eq. 3 sont résumées dans le tableau 1. Sont également présentées les valeurs pour le complexe barnase/dCGAC sans ajout d'une contribution nette de l'eau à vie longue avec la protéine (losange rouge) et avec une contribution nette de l'eau associée de manière rigide uniquement dans le complexe ajouté ( diamant gris). Cette dernière est calculée en utilisant l'entropie de fusion pour l'immobilisation de neuf molécules d'eau dans le complexe uniquement (9 × -22 J⋅mol -1 ⋅K -1 ). De plus amples détails sont fournis dans le texte principal. Le carré orange représente le complexe binaire HBP(D24R)-histamine se liant à la sérotonine. Les sous-ensembles de données CaM et CAP sont indiqués en vert et en bleu, respectivement.

Calibrage de l'entropie-mètre

Dans ce traitement, nous avons ignoré la contribution à l'entropie de liaison du squelette de la protéine. Des simulations récentes suggèrent que la liaison de ligands par des protéines structurées impliquera peu de contribution du squelette de la chaîne polypeptidique (25). Malheureusement, seuls six des complexes utilisés ont une dynamique suffisamment caractérisée pour permettre d'inclure pleinement le mouvement du squelette dans notre analyse. Cependant, lorsqu'il est analysé de manière similaire, ce sous-ensemble indique que la contribution du squelette à l'entropie de liaison est en effet faible (<5%). En utilisant la valeur déterminée de s, nous pouvons maintenant établir quantitativement que la contribution de l'entropie conformationnelle à la reconnaissance moléculaire par les protéines est assez variable. L'entropie conformationnelle peut fortement défavoriser, n'avoir aucun effet sur ou favoriser fortement l'association, et c'est souvent un déterminant important de la thermodynamique de la liaison (Fig. 2). En effet, pour environ un quart des complexes utilisés dans la calibration de l'entropie, l'absence de contribution de l'entropie conformationnelle à la thermodynamique de liaison se traduirait par des affinités biologiquement inefficaces.

Contribution de l'entropie conformationnelle des protéines à l'énergie libre de liaison du ligand aux protéines. La large gamme de contributions disponibles aux protéines pour la liaison de haute affinité des ligands est illustrée par les complexes protéine-ligand utilisés pour calibrer les paramètres de l'Eq. 3. Les 28 complexes protéine-ligand sont classés par ordre décroissant de la contribution de l'entropie conformationnelle (barres rouges) à l'énergie libre totale de liaison (barres bleues). L'entropie conformationnelle contribuée par la réponse des chaînes latérales d'acides aminés à la liaison d'un ligand peut varier de très défavorable, à négligeable, à très favorable. Dans certains cas, l'entropie conformationnelle est essentielle pour la liaison de haute affinité. Les origines structurelles de l'utilisation variable de l'entropie conformationnelle dans la reconnaissance moléculaire sont inconnues. Dans la plupart des cas, le changement d'entropie du solvant reste une contribution dominante. Notez que −TΔSr-t,Sligand, etSsolvant ne sont pas représentés ici. La thermodynamique de chaque complexe est résumée dans Annexe SI, tableaux S2 et S4.

L'entropie-mètre calibré permet de déterminer la contribution de l'entropie conformationnelle à un processus de liaison en utilisant uniquement l'information dynamique qui est, pour un hétérodimère (AB) : Δ S conf = sd [ ( N χ A Δ 〈 O axe 2 〉 A ) + ( N B Δ 〈 O axe 2 B ) ] sd = − ( 4,8 ± 0,5 ) × 10 − 3 kJ mol − 1 K − 1 . [4]

Il est important de noter que d'autres contributions entropiques aux associations protéine-ligand sont également rendues accessibles par l'approche résumée dans la figure 1 et l'équation. 3. Éq. 3 permet d'autres sources inconnues d'entropie. Ces sources peuvent inclure, par exemple, la (dé)protonation ou la (dé)solvatation de charge associée à la liaison (29). Clairement, si ΔSautre est à la fois significative et varie entre les complexes, alors la linéarité de l'Eq. 3 sera dégradé. La corrélation linéaire observée suggère fortement que tel n'est pas le cas. Ainsi, siSautre est petit par rapport àSconf etSsolvant, alors l'ordonnée à l'origine représente la perte d'entropie rotationnelle-translationnelle lors de la formation de complexes de haute affinité. ??Sr-t a fait l'objet d'un vaste débat théorique mais, comme l'entropie conformationnelle, a résisté à la définition expérimentale. L'apparentSr-t est de −0,10 ± 0,01 kJ⋅mol −1 ⋅K −1 (état standard de 1 M), ce qui se compare raisonnablement bien avec la apparenteSr-t obtenu par des simulations de dynamique moléculaire (30).

La contribution de l'entropie du solvant aux processus impliquant des protéines est généralement dérivée des modifications de la surface accessible au solvant. Avant ce travail, de telles approches ont nécessité de fortes hypothèses concernant l'entropie conformationnelle (12), qui ne sont pas requises ici car les quatre paramètres des termes d'entropie de l'Eq. 3 peut être déterminé directement. Nous constatons que l'enfouissement des surfaces apolaires et polaires lors de la liaison produit un changement positif (favorable) d'entropie. Ce changement positif se produit parce que l'hydratation des groupes polaires, comme l'hydratation des groupes apolaires, a une entropie d'hydratation négative, en accord avec un large éventail de données thermodynamiques sur l'hydratation des solutés, des ions et des protéines (28, 31, 32). Nous avons déterminé les coefficients de surface pour apolaire (uneapolaire) et polaire (unepolaire) l'entropie de désolvatation à 298 K est de −0,096 ± 0,029 J⋅mol −1 ⋅K −1 ⋅Å −2 et −0,027 ± 0,005 J⋅K −1 ⋅Å −2 , respectivement (tableau 1). Les coefficients de capacité thermique d'hydratation correspondants sont également répertoriés dans le tableau 1. L'enfouissement de la zone hydrophobe stabilise le complexe par effet hydrophobe. Parallèlement, l'enfouissement de la zone polaire stabilise également le complexe via la libération de son eau hydratante dans l'état volumineux et moins ordonné (31). Les coefficients sont plus petits que ceux obtenus précédemment (12, 33) et, en partie, reflètent l'impact d'une évaluation inadéquate de la contribution de l'entropie des chaînes latérales résiduelles dans l'état replié des protéines dans des travaux antérieurs. Il est également intéressant de noter que la plus petite amplitude provient probablement d'une différence dans la nature de la solvatation. Les entropies de solvatation antérieures ont été estimées à partir des transferts de groupe entre l'eau et les solvants organiques ou le déploiement global des protéines globulaires (par exemple, réf. 12, 27, 28, 33 ⇓ -36), ce qui implique une solvatation complète des chaînes latérales. En revanche, les études ici se concentrent sur la (dé) solvatation de surfaces de protéines plus étendues et peuvent refléter des différences d'échelle de longueur, de géométrie détaillée et de dynamique inhérente des surfaces de protéines (par exemple, réf. 37 ⇓ -39). Cette question reste à approfondir.

Plusieurs propriétés fondamentales des molécules de protéines en solution sont liées à leur capacité thermique, qui, à son tour, est liée à l'entropie sous-jacente. La définition la plus pertinente de Cp voici la dérivée de l'entropie par rapport au logarithme népérien de la température. Ainsi, le déterminé s paramètre de l'entropie-mètre, ainsi que des données appropriées de dépendance de la température, permet la contribution conformationnelle de la protéine à Cp changements à déterminer. L'importance relative des contributions de conformation et de solvatation à ΔCp de liaison, comme pour ΔS, a fait l'objet de nombreux débats (40), car, auparavant, il n'existait pas de moyen expérimental pour isoler les différentes contributions. La dépendance à la température du mouvement rapide des chaînes latérales porteuses de méthyle n'a été examinée que pour quelques protéines : par exemple, les domaines drkN (41) et α-spectrine (42) SH3, l'ubiquitine (43, 44) et une calmoduline– complexe peptidique (45). Les premières études RMN ont suggéré que le squelette contribuait moins à la capacité thermique des protéines repliées que les chaînes latérales (41). En utilisant l'entropie-mètre, nous constatons que les chaînes latérales d'acides aminés ne contribuent qu'une petite fraction (∼5–6%) à la capacité calorifique totale mesurée par calorimétrie différentielle à balayage de ces deux dernières protéines (Annexe SI, tableau S6). Cette découverte renforce la proposition selon laquelle la plus grande partie de la capacité calorifique provient des interactions solvant-protéine (10, 40, 46).

En plus d'explorer le rôle de l'entropie conformationnelle dans la fonction des protéines, l'entropie-mètre peut être utilisé pour éclairer d'autres manifestations importantes de l'entropie. Par exemple, les complexes utilisés pour l'étalonnage de l'entropie-mètre ont en grande partie des interfaces sèches. La présence d'eau « structurale » retenue à la surface enterrée constituant l'interface affecterait l'entropie du solvant mais serait masquée par la méthode classique de calcul en fonction de la surface accessible. Après calibration (Fig. 1), l'entropie associée à l'organisation de l'eau au sein d'un complexe protéique peut être explorée. Pour illustrer ce point de vue, nous avons examiné le complexe entre la ribonucléase extracellulaire barnase de Bacillus amyloliquefaciens et un substrat modèle oligonucléotidique dCGAC. La barnase est une ribonucléase à 110 résidus et est inhibée par le barstar à 89 résidus pour supprimer son activité potentiellement mortelle à l'intérieur de la cellule. Le complexe barnase/dCGAC a neuf molécules d'eau structurelles complètement enterrées et cristallographiquement bien définies à l'interface (47) (Fig. 3). La détermination de la thermodynamique de liaison par titrage direct suivi par spectroscopie RMN et ITC indique que l'énergie libre de liaison du dCGAC à la barnase est essentiellement apportée par un gain en entropie (Annexe SI, fig. S3 et tableau S2). L'analyse dynamique indique une augmentation correspondante du mouvement des chaînes latérales lors de la liaison de l'oligonucléotide qui correspond à une contribution favorable à l'entropie de liaison (Annexe SI, fig. S3 et tableau S4). Un inventaire des contributions d'entropie tel que décrit par l'Eq. 3 aboutit à un bon accord, ce qui est en contradiction apparente avec les implications de la structure du complexe noté ci-dessus. Cette contradiction survient parce que la rigidification de neuf molécules d'eau n'est pas prise en compte par le terme de solvatation de l'équation. 3. En utilisant l'entropie de fusion de l'eau (−22 J⋅mol −1 ⋅K −1 ) (48), la rigidification de ces eaux dans le complexe devrait entraîner un écart distinct par rapport à la ligne d'étalonnage (Fig. 1, diamants gris et bleus). Ainsi, soit les eaux de structure retiennent Sr-t dans le complexe et/ou ils sont rigidifiés en barnase libre. Pour répondre à cette question, nous nous sommes tournés vers une approche introduite il y a quelque temps par Wüthrich et ses collaborateurs (49), où l'effet nucléaire Overhauser (NOE) et son homologue à cadre tournant (ROE), entre les hydrogènes de la protéine et les hydrogènes l'eau associée vécue peut fournir des informations sur la dynamique protéine-eau. Un nombre sans précédent de contacts NOE cohérents avec l'attachement de longue durée des neuf eaux enfouies à l'interface dans le complexe sont observés dans la barnase libre (4). Il est à noter que des artefacts peuvent potentiellement se produire lors de l'utilisation de cette approche en solution globale (50). Cependant, l'encapsulation de protéines dans le noyau d'eau protecteur d'une micelle inverse supprime l'échange d'hydrogène et d'autres processus qui peuvent corrompre le NOE et le ROE (51). Des contacts dipolaires cohérents avec neuf des eaux enfouies de la structure cristallographique sont également observés à partir de barnase encapsulée (Fig. 3). Le rapport NOE/ROE moyen de ces contacts eau-protéine en solution en vrac est d'environ -0,15, ce qui indique que les eaux sont relativement rigidement liées à la protéine. Ainsi, l'eau rigidement retenue par la barnase libre semble annuler le coût entropique de l'utilisation de l'eau comme élément structurel dans le complexe.

Identification de l'eau contenue de manière rigide dans la barnase libre. Expansion de la tranche 2D à la résonance de l'eau des spectres 3D de spectroscopie NOE résolue 15 N (NOESY) de barnase en solution aqueuse en vrac (UNE, temps de mélange NOE de 50 ms) et de la barnase encapsulée dans des micelles inverses CTAB/hexanol préparées dans du pentane (B, temps de mélange NOE de 40 ms) est illustré. Ces cross-pics correspondent aux NOE entre les hydrogènes amides de la barnase et l'eau d'hydratation locale. La détection de l'eau d'hydratation dans une solution aqueuse en vrac est potentiellement corrompue par divers mécanismes, notamment l'échange d'hydrogène. Ces artefacts sont supprimés dans la micelle inverse. La correspondance des pics croisés indiquée par des affectations annotées confirme ces pics croisés dans le spectre aqueux comme de véritables NOE. La comparaison des intensités des pics croisés NOE et ROE indique que ces eaux sont rigidement retenues dans la barnase libre. Des NOE supplémentaires dans le spectre des micelles inverses résultent du ralentissement général de l'eau qui amène le mouvement des eaux supplémentaires dans la couche d'hydratation dans un régime temporel détectable. (C) Cartographie structurale des pics croisés NOE entre la protéine et l'eau dans la barnase libre en solution en vrac. Les sites avec des interactions d'hydratation de longue durée sont représentés par des sphères vertes. Les eaux cristallographiques de barnase libre dans le site de liaison sont représentées par des sphères bleues.

Un deuxième exemple des informations supplémentaires qui peuvent être recueillies à partir du compteur d'entropie se concentre sur l'idée que la perte d'entropie rotation-translationnelle diminuera pour des interactions plus faibles (c'est-à-dire, K > 100 M) en raison d'un mouvement résiduel important dans le complexe. Pour explorer cette idée, nous avons examiné l'interaction de l'histamine et de la sérotonine avec la protéine de liaison à l'histamine (HBP) de la Rhipicephalus appendiculatus cocher. L'HBP fait partie de la famille des lipocalines, dont il a été démontré qu'elles se lient à l'histamine et à la sérotonine (52). Ces molécules hétérocycliques servent de médiateurs primaires de la réponse inflammatoire lors de lésions tissulaires (53). HBP est une protéine -baril à 171 résidus qui, contrairement à la plupart des autres protéines de la famille des lipocalines, a évolué pour posséder deux sites de liaison à l'histamine, l'un ayant une haute affinité (site H) et l'autre ayant une faible affinité (site L) (52). La tique sécrète de l'HBP pour interférer avec la réponse inflammatoire défensive de l'hôte. Pour nos études, nous avons utilisé la mutation D24R située dans le site L qui abolit en grande partie la liaison de la deuxième molécule d'histamine tout en conservant la liaison primaire à l'histamine de haute affinité (site H) (54). L'ITC a établi que l'histamine se lie avec une très grande affinité à HBP(D24R) [K = 3,2 ± 0,7 nM, cohérent avec les mesures antérieures utilisant le radiomarquage des traces (52)] et s'accompagne d'un grand changement favorable de l'enthalpie et d'une entropie de liaison totale défavorable (Annexe SI, tableau S2). L'analyse de relaxation RMN indique une réponse hétérogène de la protéine à la liaison de l'histamine (Annexe SI, fig. S4). Ces résultats donnent une donnée très proche de la droite d'ajustement consensus de l'entropie-mètre. Le titrage du complexe HBP(D24R)•histamine avec la sérotonine révèle un site de liaison faible largement centré sur les résidus Y30, V49, V51, A53, F67, E82, qui sont proches du site L (Annexe SI, fig. S5). Cette découverte pourrait être indicative d'une activité de liaison résiduelle au site L. L'ITC ne révèle aucune chaleur détectable, ce qui indique que la modeste énergie libre de liaison (-13,7 kJ/mol) est entièrement due à l'entropie. L'analyse de relaxation RMN indique une augmentation de la dynamique des chaînes latérales qui correspond à un très modesteSconf de 3 ± 1 J⋅mol -1 ⋅K -1 . Il est intéressant de noter qu'en complétant l'inventaire d'entropie, on ne trouve qu'un petit écart par rapport à l'entropie prédite (Fig. 1). Cet écart est probablement attribué à une incertitude dans les paramètres de solvatation pour ce complexe et peut-être à un petit résidu Sr-t du ligand de sérotonine dans le complexe. Ainsi,Sr-t estimée sur la figure 1 est probablement valable jusqu'à des affinités relativement faibles correspondant à des constantes de dissociation dans la gamme millimolaire.

En résumé, les coefficients reliant les modifications du mouvement rapide des chaînes latérales des protéines aux modifications de l'entropie conformationnelle, les modifications de la surface accessible aux modifications de l'entropie du solvant et la perte d'entropie rotationnelle-translationnelle dans les complexes de haute affinité ont été déterminés. La gamme de types de ligands utilisés ici démontre que la relation entre le mouvement rapide des chaînes latérales internes et l'entropie conformationnelle sous-jacente est universelle et représente une propriété fondamentale des protéines solubles. Il est démontré que l'entropie conformationnelle a un rôle très variable dans la formation de complexes impliquant des protéines : elle peut favoriser, défavoriser ou n'avoir aucun impact sur l'énergie libre de liaison. Il n'y a pas de corrélats structurels évidents apparents pour ce comportement. Le lien entre la structure, l'enthalpie qu'elle représente, l'entropie conformationnelle et le mouvement interne représente un défi immédiat pour notre compréhension actuelle de la thermodynamique et de la fonction des protéines. Dans cette veine, le point de vue émergeant de l'analyse cristallographique des conformères mineurs dans les protéines (55 ⇓ -57), combiné avec le proxy dynamique validé ici, fournit un moyen de quantifier le rôle de l'entropie conformationnelle dans la structure et la fonction des protéines.


Comprendre les mécanismes moléculaires de l'administration et de la stabilité des médicaments biologiques à partir de la spectroscopie RMN ☆

Les thérapies protéiques comportent des limitations inhérentes d'imperméabilité membranaire et d'instabilité structurelle, malgré leur rôle prédominant sur le marché pharmaceutique moderne. Des formulations efficaces sont nécessaires pour surmonter les barrières physiologiques et physico-chimiques, respectivement, pour améliorer la biodisponibilité et la stabilité. La connaissance de l'affinité membranaire, de l'internalisation cellulaire, de l'encapsulation et de la libération de véhicules porteurs chargés de médicaments permet de découvrir la base structurelle pour la conception et l'optimisation de produits biopharmaceutiques avec une efficacité d'administration et une efficacité thérapeutique améliorées. Comprendre les interactions stabilisantes et déstabilisantes entre les médicaments protéiques et les excipients de formulation fournit des mécanismes fondamentaux pour assurer la stabilité et la qualité des produits biologiques. Cet article passe en revue les études moléculaires de produits biologiques utilisant la spectroscopie RMN en solution et à l'état solide sur les attributs structurels essentiels à l'administration et à la stabilité du médicament. Étude approfondie de la relation structure-fonction des systèmes d'administration de médicaments basés sur des peptides pénétrant dans les cellules, des nanoparticules lipidiques et des colloïdes polymères, et la stabilité biophysique et biochimique des peptides, des protéines, des anticorps monoclonaux et des vaccins, en tant qu'efforts d'intégration sur le produit médicamenteux conception, sera élaboré.


Remerciements

Nous remercions Y.-J. Wang, Q.-C. Zhu, Q. Sun, Q.-Y. Li, J.-W. Wang, T.-L. Xu, Y. Chen, F.-L. Wei, G.-C. Shen, X.-L. Wen et L.-S. Li pour leur aimable aide dans les expériences sur le terrain X.-L. Wen, L.-S. Li et le Public Technology Service Center de XTBG (CAS) pour avoir assisté à l'analyse active des COV et X.-G. Mao, P.-Y. Hua et D.-Y. Zhang pour ses suggestions constructives dans l'analyse des données. Ce travail est soutenu par les subventions NSFC 31630008 et 31870356 (X.-Y.C.) et 31870359 (G.W.), et une bourse Talents 1000 de la province du Shaanxi (D.W.D.). S.T.S. reconnaît le soutien du département de l'Université Harper Adams.


Nicking par transestérification : la réaction catalysée par une relaxase

Curriculum en génétique et biologie moléculaire, Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, Chapel Hill, NC 27599, États-Unis.

Département de biologie et,

Département de biologie et,

Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC 27599, USA.

Résumé

Les ADN relaxases jouent un rôle essentiel dans l'initiation et la terminaison du transfert d'ADN conjugatif. La purification et la caractérisation des relaxases à partir de plusieurs plasmides ont révélé le mécanisme de réaction : les relaxases coupent l'ADN de manière spécifique au site et au brin en catalysant une transestérification. Le produit de la réaction est une molécule d'ADN double brin coupée avec un 3'-OH séquestré et la relaxase liée de manière covalente à l'extrémité 5' du brin clivé via une liaison phosphotyrosyle. La transestérification catalysée par la relaxase est isoénergétique et réversible, une seconde transestérification ligature l'ADN coupé. Cependant, le complexe nucléoprotéique covalent a une durée de vie relativement longue, une propriété qui est susceptible d'être essentielle pour son rôle d'intermédiaire dans le processus de transfert d'ADN conjugatif. Le déroulement ultérieur de l'intermédiaire d'ADN entaillé est nécessaire pour produire le simple brin d'ADN transféré à la cellule receveuse. Cette réaction est catalysée par une ADN hélicase, une activité intrinsèque à la protéine relaxase dans certains systèmes plasmidiques, mais pas tous. La première transestérification catalysée par la relaxase est essentielle pour l'initiation du transfert de brin conjugatif, tandis que la seconde est vraisemblablement requise pour la fin du processus. La relaxase, en conjonction avec plusieurs protéines auxiliaires, forme le complexe de relaxation ou relaxosome décrit pour la première fois il y a près de 30 ans comme étant associé à des plasmides conjugatifs et mobilisables.


Cinétique et thermodynamique de la formation de l'arséniate de glucose. Réaction de l'arséniate de glucose avec la phosphoglucomutase

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