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20.5 : Techniques d'auto-anticorps fluorescents - Biologie

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Objectifs d'apprentissage

  • Décrire les avantages des dosages d'anticorps immunofluorescents par rapport aux dosages non fluorescents
  • Comparer les dosages d'anticorps fluorescents directs et indirects
  • Expliquer comment un cytomètre en flux peut être utilisé pour quantifier des sous-ensembles spécifiques de cellules présentes dans un mélange complexe de types cellulaires
  • Expliquer comment un trieur de cellules activé par fluorescence peut être utilisé pour séparer des types uniques de cellules

La visualisation rapide des bactéries à partir d'un échantillon clinique tel qu'un prélèvement de gorge ou des expectorations peut être obtenue grâce à des techniques d'anticorps fluorescents (AF) qui attachent un marqueur fluorescent (fluorogène) à la région constante d'un anticorps, ce qui donne une molécule rapporteur qui est rapide à utilisation, facile à voir ou à mesurer, et capable de se lier à des marqueurs cibles avec une spécificité élevée. Nous pouvons également étiqueter les cellules, ce qui nous permet de quantifier avec précision des sous-ensembles particuliers de cellules ou même de purifier ces sous-ensembles pour des recherches ultérieures.

Comme avec les dosages enzymatiques, les méthodes FA peuvent être directes, dans lesquelles un mAb marqué se lie à un antigène, ou indirectes, dans lesquelles les anticorps polyclonaux secondaires se lient aux anticorps du patient qui réagissent à un antigène préparé. Les applications de ces deux méthodes ont été démontrées dans [link]. Les méthodes FA sont également utilisées dans les systèmes automatisés de comptage et de tri des cellules pour énumérer ou séparer les sous-populations étiquetées de cellules dans un échantillon.

Techniques d'anticorps fluorescents directs

Les tests d'anticorps fluorescents directs (DFA) utilisent un mAb marqué par fluorescence pour lier et illuminer un antigène cible. Les tests DFA sont particulièrement utiles pour le diagnostic rapide des maladies bactériennes. Par exemple, des anticorps marqués par fluorescence contre Streptocoque pyogène (streptocoque du groupe A) peut être utilisé pour obtenir un diagnostic d'angine streptococcique à partir d'un prélèvement de gorge. Le diagnostic est prêt en quelques minutes et le patient peut être mis sous antibiotiques avant même de quitter la clinique. Les techniques DFA peuvent également être utilisées pour diagnostiquer une pneumonie causée par Mycoplasma pneumoniae ou Legionella pneumophila à partir d'échantillons d'expectorations (Figure (PageIndex{1})). Les anticorps fluorescents se lient aux bactéries sur une lame de microscope, permettant une détection facile des bactéries à l'aide d'un microscope à fluorescence. Ainsi, la technique DFA est précieuse pour visualiser certaines bactéries difficiles à isoler ou à cultiver à partir d'échantillons de patients.

Regardez l'animation sur cette page pour revoir les procédures du test d'anticorps fluorescent direct.

Exercice (PageIndex{1})

Dans un test d'anticorps fluorescent direct, à quoi l'anticorps fluorescent se lie-t-il ?

Techniques d'anticorps fluorescents indirects

Des tests d'anticorps fluorescents indirects (IFA) (Figure (PageIndex{2})) sont utilisés pour rechercher des anticorps dans le sérum du patient. Par exemple, un test IFA pour le diagnostic de la syphilis utilise T. pallidum cellules isolées d'un animal de laboratoire (les bactéries ne peuvent pas être cultivées sur des milieux de laboratoire) et un frottis préparé sur une lame de verre. Le sérum du patient est étalé sur le frottis et les anticorps anti-tréponémiques, s'ils sont présents, peuvent se lier. Le sérum est lavé et un anticorps secondaire est ajouté. L'anticorps secondaire est une immunoglobuline antihumaine conjuguée à un fluorogène. A l'examen, le T. pallidum les bactéries ne seront visibles que si elles ont été liées par les anticorps du sérum du patient.

Le test IFA pour la syphilis fournit un complément important au test VDRL discuté dans Détection des complexes antigène-anticorps. Le VDRL est plus susceptible de générer des réactions faussement positives que le test IFA ; cependant, le VDRL est un meilleur test pour déterminer si une infection est actuellement active.

Les tests IFA sont également utiles pour le diagnostic des maladies auto-immunes. Par exemple, le lupus érythémateux disséminé (LED) (voir Troubles auto-immuns) est caractérisé par des taux d'expression élevés d'anticorps antinucléaires (ANA). Ces autoanticorps peuvent être exprimés contre une variété de protéines de liaison à l'ADN et même contre l'ADN lui-même. Parce que l'auto-immunité est souvent difficile à diagnostiquer, en particulier au début de la progression de la maladie, le test d'ANA peut être un indice précieux pour poser un diagnostic et commencer un traitement approprié.

L'IFA pour ANA commence par fixer les cellules cultivées sur une lame de verre et les rendre perméables aux anticorps. Les lames sont ensuite incubées avec des dilutions en série de sérum du patient. Après incubation, la lame est lavée pour éliminer les protéines non liées et l'anticorps fluorescent (IgG antihumain conjugué à un fluorogène) est ajouté. Après une incubation et un lavage, les cellules peuvent être examinées pour la fluorescence évidente autour du noyau (Figure (PageIndex{3})). Le titre d'ANA dans le sérum est déterminé par la dilution la plus élevée montrant la fluorescence. Étant donné que de nombreuses personnes en bonne santé expriment l'ANA, l'American College of Rheumatology recommande que le titre soit d'au moins 1:40 en présence de symptômes impliquant deux systèmes organiques ou plus pour être considéré comme révélateur d'un LED.1

Exercice (PageIndex{2})

  1. Dans un test d'anticorps fluorescent indirect, à quoi l'anticorps fluorescent se lie-t-il ?
  2. Que recherche le test ANA ?

Cytométrie en flux

Les anticorps marqués par fluorescence peuvent être utilisés pour quantifier les cellules d'un type spécifique dans un mélange complexe à l'aide de la cytométrie en flux (Figure (PageIndex{4})), un système automatisé de comptage cellulaire qui détecte les cellules fluorescentes lorsqu'elles traversent un étroit tube une cellule à la fois. Par exemple, dans les infections à VIH, il est important de connaître le niveau de cellules T CD4 dans le sang du patient ; si les chiffres tombent en dessous de 500 par L de sang, le patient devient plus susceptible de contracter des infections opportunistes ; en dessous de 200 par L, le patient ne peut plus du tout monter une réponse immunitaire adaptative utile. L'analyse commence par l'incubation d'une population de cellules mixtes (par exemple, des globules blancs d'un donneur) avec un mAb marqué par fluorescence spécifique d'une sous-population de cellules (par exemple, anti-CD4). Certaines expériences examinent deux marqueurs cellulaires simultanément en ajoutant un fluorogène différent au mAb approprié. Les cellules sont ensuite introduites dans le cytomètre en flux à travers un capillaire étroit qui oblige les cellules à passer en file indienne. Un laser est utilisé pour activer le fluorogène. La lumière fluorescente rayonne dans toutes les directions, de sorte que le détecteur de fluorescence peut être positionné à un angle par rapport à la lumière laser incidente.

La figure (PageIndex{4}) montre la barre d'obscurcissement devant le détecteur à diffusion vers l'avant qui empêche la lumière laser d'atteindre le détecteur. Lorsqu'une cellule traverse la barre laser, le détecteur de diffusion vers l'avant détecte la lumière diffusée autour de la barre d'obscurcissement. La lumière diffusée est transformée en une impulsion de tension et le cytomètre compte une cellule. La fluorescence d'une cellule marquée est détectée par les détecteurs à diffusion latérale. La lumière traverse divers miroirs dichroïques de sorte que la lumière émise par le fluorophore est reçue par le bon détecteur.

Les données sont collectées à partir des détecteurs à diffusion directe et latérale. Ces données peuvent être présentées sous la forme d'un histogramme. Le scatter vers l'avant est placé sur le oui-axis (pour représenter le nombre de cellules), et la dispersion latérale est placée sur le X-axe (pour représenter la fluorescence de chaque cellule). La mise à l'échelle pour le X- L'axe est logarithmique, donc l'intensité de fluorescence augmente d'un facteur 10 avec chaque augmentation d'unité le long de l'axe. La figure (PageIndex{5}) illustre un exemple dans lequel une culture de cellules est combinée avec un anticorps attaché à un fluorophore pour détecter les cellules CD8, puis analysée par cytométrie en flux. L'histogramme a deux pics. Le pic de gauche a des lectures de fluorescence inférieures, représentant le sous-ensemble de la population cellulaire (environ 30 cellules) qui ne émet pas de fluorescence ; par conséquent, ils ne sont pas liés par un anticorps et n'expriment donc pas CD8. Le pic de droite a des lectures de fluorescence plus élevées, représentant le sous-ensemble de la population cellulaire (environ 100 cellules) qui présentent une fluorescence ; par conséquent, ils sont liés par l'anticorps et expriment donc CD8.

Exercice (PageIndex{3})

  1. A quoi sert le laser dans un cytomètre en flux ?
  2. Dans la sortie d'un cytomètre en flux, la zone sous l'histogramme est équivalente à quoi ?

orientation clinique - résolution

Après avoir informé les 1 300 patients, l'hôpital commence à programmer le dépistage du VIH. Les rendez-vous étaient programmés au minimum 3 semaines après la dernière visite à l'hôpital du patient afin de minimiser le risque de faux négatifs. En raison de l'anticipation de certains faux positifs, le médecin de santé publique a mis en place un protocole de conseil pour tout patient dont l'ELISA indirect est revenu positif.

Sur les 1300 patients, huit ont été testés positifs à l'aide de l'ELISA. Cinq de ces tests ont été invalidés par des tests de western blot négatifs, mais un western blot est revenu positif, confirmant que le patient avait bien contracté le VIH. Les deux Western blots restants sont revenus indéterminés. Ces individus ont dû se soumettre à un troisième test, une PCR, pour confirmer la présence ou l'absence de séquences du VIH. Heureusement, les deux patients ont été testés négatifs.

Quant au seul patient confirmé séropositif, les tests ne peuvent prouver ou réfuter aucun lien avec les seringues compromises par l'ancien employé de l'hôpital. Même ainsi, l'assurance de l'hôpital couvrira entièrement le traitement du patient, qui a commencé immédiatement.

Bien que nous ayons maintenant des médicaments qui sont généralement efficaces pour contrôler la progression du VIH et du SIDA, il n'existe toujours pas de remède. S'il n'est pas traité ou si le régime médicamenteux échoue, le patient subira une diminution progressive du nombre de lymphocytes T auxiliaires CD4, entraînant une grave altération de toutes les fonctions immunitaires adaptatives. Même une baisse modérée du nombre de lymphocytes T auxiliaires peut entraîner une immunodéficience, laissant le patient vulnérable aux infections opportunistes. Pour surveiller l'état des cellules T auxiliaires du patient, l'hôpital utilisera la cytométrie en flux. Ce test sensible permet aux médecins de déterminer avec précision le nombre de cellules T auxiliaires afin qu'ils puissent ajuster le traitement si le nombre tombe en dessous de 500 cellules/µL.

Tri cellulaire par immunofluorescence

Le cytomètre en flux et l'immunofluorescence peuvent également être modifiés pour trier les cellules d'un seul échantillon en sous-populations purifiées de cellules à des fins de recherche. Cette modification du cytomètre en flux est appelée trieur de cellules activé par fluorescence (FACS). Dans un FACS, la fluorescence d'une cellule induit le dispositif à mettre une charge sur une goutte du fluide de transport contenant cette cellule. La charge est spécifique à la longueur d'onde de la lumière fluorescente, ce qui permet un tri différentiel par ces différentes charges. Le tri est effectué par un déflecteur électrostatique qui déplace la gouttelette chargée contenant la cellule dans un récipient collecteur ou un autre. Le processus aboutit à des sous-populations de cellules hautement purifiées.

Une limitation d'un FACS est qu'il ne fonctionne que sur des cellules isolées. Ainsi, la méthode fonctionnerait dans le tri des globules blancs, puisqu'ils existent sous forme de cellules isolées. Mais pour les cellules d'un tissu, la cytométrie en flux ne peut être appliquée que si nous pouvons exciser le tissu et le séparer en cellules individuelles (en utilisant des protéases pour cliver les molécules d'adhésion cellule-cellule) sans perturber l'intégrité cellulaire. Cette méthode peut être utilisée sur les tumeurs, mais le plus souvent, l'immunohistochimie et l'immunocytochimie sont utilisées pour étudier les cellules dans les tissus.

Regardez des vidéos pour en savoir plus sur le fonctionnement de la cytométrie en flux et d'un FACS.

Exercice (PageIndex{4})

Dans le tri cellulaire activé par fluorescence, quelle caractéristique des cellules cibles permet de les séparer ?

Le tableau (PageIndex{1}) compare les mécanismes des techniques d'anticorps fluorescents abordés dans cette section.

Tableau (PageIndex{1}) : Techniques d'anticorps fluorescents
Type d'analyseMécanismeExemples
Anticorps fluorescent direct (DFA)Utilise des conjugués fluorogène-anticorps pour marquer les bactéries des échantillons de patientsVisualisation Legionella pneumophila d'un prélèvement de gorge
Anticorps fluorescents indirects (IFA)Détecte les anticorps spécifiques de la maladie dans le sérum brevetéDiagnostiquer la syphilis; détecter les anticorps antinucléaires (ANA) pour le lupus et d'autres maladies auto-immunes
Cytométrie en fluxMarque les membranes cellulaires avec des marqueurs conjugués fluorogène-anticorps excités par un laser ; la machine compte la cellule et enregistre la fluorescence relativeCompter le nombre de cellules CD4 ou CD8 marquées par fluorescence dans un échantillon
Trieur de cellules activé par fluorescence (FACS)Forme de cytométrie en flux qui compte les cellules et les sépare physiquement en pools de cellules à fluorescence élevée et faibleTri des cellules cancéreuses

Concepts clés et résumé

  • Immunofluorescence Les tests utilisent des conjugués anticorps-fluorogène pour éclairer les antigènes pour une détection facile et rapide.
  • Immunofluorescence directe peut être utilisé pour détecter la présence de bactéries dans des échantillons cliniques tels que les expectorations.
  • Immunofluorescence indirecte détecte la présence d'anticorps spécifiques de l'antigène dans le sérum des patients. L'anticorps fluorescent se lie à l'anticorps spécifique de l'antigène plutôt qu'à l'antigène.
  • L'utilisation de tests d'immunofluorescence indirecte pour détecter anticorps antinucléaires est un outil important dans le diagnostic de plusieurs maladies auto-immunes.
  • Cytométrie en flux utilise des mAb fluorescents contre des protéines de membrane cellulaire pour quantifier des sous-ensembles spécifiques de cellules dans des mélanges complexes.
  • Trieurs de cellules activés par fluorescence sont une extension de la cytométrie en flux dans laquelle l'intensité de fluorescence est utilisée pour séparer physiquement les cellules en populations de fluorescence élevée et faible.

Choix multiple

Supposons que vous ayez besoin de quantifier le niveau de cellules T CD8 dans le sang d'un patient en convalescence. Vous traitez un échantillon de globules blancs du patient à l'aide d'un mAb fluorescent contre CD8, passez les cellules à travers un cytomètre en flux et produisez l'histogramme ci-dessous. L'aire sous le pic à gauche (bleu) est trois fois plus grande que l'aire du pic à droite (rouge). Que pouvez-vous déterminer à partir de ces données ?

A. Il n'y a pas de cellules CD8 détectables.
B. Il y a trois fois plus de cellules CD4 que de cellules CD8.
C. Il y a trois fois plus de cellules CD8 que de cellules CD4.
D. Les cellules CD8 représentent environ un quart du nombre total de cellules.

Dans les données décrites dans la question précédente, l'intensité moyenne de fluorescence des cellules dans le deuxième pic (rouge) est d'environ ________ celle du premier pic (bleu).

A. trois fois
B. 100 fois
C. un tiers
D. 1000 fois

B

Dans un test d'anticorps fluorescent direct, lequel des éléments suivants recherchons-nous le plus probablement en utilisant un mAb marqué par fluorescence ?

A. bactéries dans un échantillon de patient
B. bactéries isolées d'un patient et cultivées sur des plaques de gélose
C. antisérum d'un patient étalé sur une lame de verre
D. antisérum d'un patient qui s'était lié à des billes enrobées d'antigène

UNE

Remplir les trous

En cytométrie en flux, les sous-ensembles cellulaires sont marqués à l'aide d'un anticorps fluorescent dirigé contre une protéine membranaire. Le fluorogène est activé par a(n)________ au passage des cellules devant les détecteurs.

laser

La fluorescence dans un cytomètre en flux est mesurée par un détecteur placé à un angle par rapport à la source lumineuse. Il existe également un détecteur en ligne qui peut détecter des amas de cellules ou ________.

fragments

Esprit critique

Un patient suspecté d'avoir la syphilis est testé en utilisant à la fois le test VDRL et l'IFA. Le test IFA revient positif, mais le test VDRL est négatif. Quelle est la raison la plus probable de ces résultats ?

Un clinicien soupçonne qu'un patient atteint de pneumonie peut être infecté par Legionella pneumophila. Décrivez brièvement deux raisons pour lesquelles un test DFA pourrait être meilleur pour détecter ce pathogène que les techniques bactériologiques standard.

Notes de bas de page

  1. 1 Gill, James M., ANNA M. Quisel, PETER V. Rocca et DENE T. Walters. « Diagnostic du lupus érythémateux disséminé. » médecin de famille américain 68, non. 11 (2003) : 2179-2186.

De nouvelles perspectives dans la mesure des hormones

Dosage immunologique par fluorescence

L'utilisation de sondes fluorescentes en remplacement des isotopes radioactifs dans les immunodosages hormonaux a été largement étudiée [ 26 ]. Des substrats fluorescents de faible poids moléculaire peuvent être couplés facilement à un antigène ou à un anticorps sans perte d'affinité de la réaction antigène-anticorps. La petite taille du marqueur fluorescent ne restreint pas la méthode de séparation comme avec le dosage immunoenzymatique, et dans certains systèmes, une séparation complète des fractions liées et libres n'est pas nécessaire.

Les techniques d'immunodosage utilisant la fluorescence ont le potentiel d'une activité spécifique très élevée en termes de photons émis par seconde. Typiquement ils peuvent atteindre dix millions de photons par s pour 1 pmole de composé marqué, alors que 125 I ne dépasserait pas 1000 désintégrations par s. Malgré cela, l'utilisation de sondes fluorescentes pour remplacer les isotopes radioactifs a été entravée par la diminution de sensibilité obtenue. Ceci est causé, dans une large mesure, par une interférence de fond provenant à la fois des composants biologiques présents dans l'échantillon, tels que des protéines, et de la diffusion de la lumière par les composants de la cuvette de dosage.

Comme pour les enzymes, les fluorophores ont été utilisés en remplacement direct des radiomarqueurs dans les dosages immunofluorimétriques compétitifs, les dosages immunofluorimétriques et les dosages immunofluorimétriques à deux sites. Ces tests ont été appliqués à un large éventail d'hormones, mais jusqu'à récemment, la plupart étaient moins sensibles que le RIA en raison de la fluorescence de fond élevée. Une manière d'augmenter la sensibilité de ces dosages a été l'utilisation d'instruments. Dans les fluorimètres à résolution temporelle, une impulsion lumineuse rapide est utilisée qui excite le fluorophore, et la fluorescence est mesurée après un certain temps à partir du moment de l'excitation [ 27 ]. Le temps de décroissance de la fluorescence naturelle des échantillons biologiques est de l'ordre de 1 à 20 ns. Ainsi, en utilisant cet instrument en combinaison avec des sondes fluorescentes dont l'état excité a un long temps de décroissance (comme les chélates de lanthanide) et en mesurant la fluorescence après 100 ns, ce type d'interférence de fond peut être éliminé. Wallac-Oy (LKB Limited, Turku, Finlande) a commercialisé des kits de dosage fluorimmun à résolution temporelle pour la TSH, l'HCG, l'AFP et la ferritine basés sur ce type d'approche. La méthode, connue sous le nom de DELFIA (dissociation-enhanide lanthanide fluorimmunoassay), implique l'utilisation d'un anticorps marqué avec un chélate d'europium (un lanthanide-métal) et un second anticorps immobilisé à la surface des puits de microtitration. La fluorescence de l'ion europium est développée et fortement intensifiée par l'ajout d'une solution d'amélioration (contenant un chélate de -dicétone) une fois l'immunoréaction terminée. L'émission lumineuse est ensuite mesurée dans le fluorimètre à résolution temporelle.

Cette approche offre une amélioration considérable de la sensibilité par rapport aux méthodes de mesure conventionnelles, et l'évaluation de la méthode DELFIA pour la TSH a montré qu'elle était simple, rapide, précise et sensible (0,05 mU/1) avec une plage de travail s'étendant au-delà de 324 mU/1 [ 28 ].

Des marqueurs fluorescents ont également été utilisés pour développer des dosages immunologiques homogènes par de nombreuses techniques différentes. En 1977, un dosage immuno-fluoré d'amélioration de la thyroxine a été décrit [ 29 ]. La thyroxine marquée à la fluorescéine s'est avérée donner un rendement de fluorescence anormalement faible qui augmentait lorsque l'anticorps anti-thyroxine y était lié. Lorsque de la thyroxine non marquée est ajoutée, l'amélioration de la fluorescence est diminuée.

À l'opposé de cela, il existe des dosages immunologiques fluorés qui dépendent de la liaison d'anticorps conduisant à une réduction de la fluorescence. Dans ces types de dosage immuno-fluoré à extinction directe, la liaison de l'anticorps au conjugué antigène-fluorophore diminue le rendement quantique de fluorescence. Par exemple, la liaison d'un anticorps anti-cortisol au conjugué cortisol-isothiocyanate de fluorescéine (FITC) provoque une diminution de l'intensité de fluorescence du FITC par extinction. Lorsque du cortisol non marqué est ajouté, la forme libre du cortisol-FITC augmente tout comme l'intensité de fluorescence [ 30 ]. Le dosage immuno-fluoré à extinction directe n'est applicable qu'au dosage des haptènes puisque la liaison à l'anticorps d'une protéine marquée avec un fluorophore entraîne rarement un changement significatif de l'intensité de fluorescence, probablement en raison de la distance entre le déterminant antigénique et le site de fixation du marqueur.

Cependant, un dosage immunologique par extinction indirecte ou un dosage immunologique de protection par fluorescence a été appliqué aux protéines [ 31 ]. Dans cette méthode, l'antigène, l'antigène marqué à la fluroescéine et l'anticorps sont incubés. Un anticorps anti-fluorescéine est ajouté, ce qui désactive tout marqueur dans la fraction libre, mais en raison de l'encombrement stérique du premier anticorps, il est incapable de lier les groupes fluorescéine de la fraction liée qui sont « protégés » et l'intensité de fluorescence diminue donc.

De nombreux autres types de dosage immunologique fluoré homogène tels que le dosage immunologique par transfert d'excitation [ 32 ] et le dosage immunologique par polarisation de fluorescence [ 33 ] ont été décrits. La vitesse, la simplicité et la précision de la détection du point final indiquent que le dosage immunologique au fluor jouera un rôle de plus en plus important, d'autant plus que les améliorations technologiques telles que les fluorimètres à résolution temporelle entraînent une nette amélioration de la sensibilité.


Analyse moléculaire de l'ADN

Dans cette sous-section, nous décrirons certaines des méthodes de base utilisées pour séparer et visualiser des fragments spécifiques d'ADN qui intéressent un scientifique. Certaines de ces méthodes ne nécessitent pas la connaissance de la séquence complète de la molécule d'ADN. Avant l'avènement du séquençage rapide de l'ADN, ces méthodes étaient les seules disponibles pour travailler avec l'ADN, mais elles constituent toujours l'arsenal de base des outils utilisés par les généticiens moléculaires pour étudier les réponses du corps aux maladies microbiennes et autres.


Microscopie optique à fluorescence

Epifluorescence de base et microscopie confocale

La microscopie à épifluorescence et la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) sont des techniques de microscopie bien établies. L'épifluorescence implique l'illumination et la détection simultanées de l'ensemble du champ de vision, permettant de faibles doses de photons et une imagerie rapide pour un contrôle efficace de la phototoxicité, mais une grande quantité de lumière floue est collectée. CLSM a les limitations opposées, en utilisant un laser d'excitation focalisé brillant qui est balayé à travers l'échantillon, en supprimant le signal d'émission indésirable par le passage de la lumière renvoyée à travers un trou d'épingle avant détection. Cela donne des images nettes, au détriment des doses de photons élevées et des temps d'imagerie lents. Les images CLSM ou d'épifluorescence de base peuvent être particulièrement utiles lors de l'utilisation de l'imagerie en superrésolution, car la comparaison des images réalisées avec ces nouvelles méthodes et des techniques traditionnelles bien comprises permet de déterminer clairement quelles caractéristiques doivent être évaluées en tant qu'artefacts potentiels ou en tant que nouvelles découvertes. La microscopie confocale à disque rotatif surmonte l'inconvénient des longs temps d'acquisition d'image CLSM traditionnels et des intensités d'éclairage élevées tout en rejetant une très grande fraction de la lumière floue en utilisant plusieurs trous d'épingle pour projeter une série de faisceaux lumineux d'excitation parallèles et mobiles sur l'échantillon. Ces caractéristiques le rendent idéal pour étudier la dynamique des processus biologiques rapides avec des niveaux beaucoup plus faibles de photoblanchiment et de phototoxicité.

Déconvolution et microscopie grand champ

Les techniques de déconvolution servent des objectifs similaires à la restriction de la lumière par des trous d'épingle confocaux, réduisant la quantité de lumière floue dans l'image résultante. Cependant, plutôt que de bloquer la lumière, la déconvolution la réaffecte à sa véritable source en corrigeant la dispersion du signal via un problème (relativement difficile) d'optimisation de l'analyse des données [32]. Bien qu'il soit possible d'appliquer la technique à des images en 2D uniquement, un processus souvent appelé débrouillage, il est plus efficace lorsqu'il est utilisé avec une pile 3D d'images prises à plusieurs plans focaux [33]. L'utilisation de techniques de déconvolution avec l'imagerie à grand champ est l'un des meilleurs moyens d'éviter les dommages photographiques d'échantillons vivants.

Déconvolution et microscopie confocale

Les images confocales n'ont pas de restriction parfaite de la lumière hors foyer, et les ensembles de données peuvent être quelque peu améliorés avec des méthodes de déconvolution appropriées [34]. De plus, plusieurs techniques d'imagerie et microscopes combinent désormais les principes de la microscopie confocale et de la déconvolution pour fournir des capacités de super-résolution modestes. Une telle classe de techniques est connue sous le nom de microscopie à balayage d'image (ISM) [35], utilisée par des instruments comme le Zeiss Airyscan, qui remplace le sténopé de détection confocale par un réseau de tubes photomultiplicateurs. Une amélioration de la résolution 2 est réalisée en supprimant le compromis entre la résolution latérale et le débit de signal inhérent aux instruments à sténopé, et parce que le réseau de détecteurs collecte physiquement une estimation du motif d'Airy de la lumière émise, la déconvolution peut être appliquée pour augmenter encore la capacité de superrésolution jusqu'à une limite de facteur de 2 [36]. Sur un instrument confocal à disque rotatif, la mise en forme de la lumière passant à travers les trous d'épingle avec un réseau de microlentilles et le grossissement de la lumière émise sur le capteur de la caméra par réaffectation optique permet une amélioration de résolution similaire d'un facteur de 2 lorsqu'elle est couplée à une déconvolution de l'image [37]. Ces types de microscopes confocaux améliorés sont de plus en plus utilisés dans la recherche sur les cellules végétales, par exemple pour étudier les nanodomaines membranaires plasmiques sur des cellules vivantes [38], ou la morphologie du pollen [39].

Microscopie de fluorescence à réflexion interne totale

La microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRFM) fournit l'énergie d'excitation sous la forme d'un front d'onde évanescent fin ( ≈ 100 nm) au niveau de la zone de contact entre l'échantillon et la lamelle, ce qui permet une qualité d'image exceptionnelle dans cette région. De plus, la microscopie à épifluorescence à angle variable (VAEM) peut être utilisée sur des échantillons de cellules végétales et de parois cellulaires plus épais que le front d'onde TIRF, avec une réduction similaire de l'éclairage de fond [40]. La figure ​ La figure 1a 1 a montre un exemple d'analyse TIRF d'une cellule épidermique d'oignon avec un colorant spécifique à la cellulose, montrant une section optique étroite à travers la surface de la paroi cellulaire ainsi qu'un éclairage à haute intensité pour l'imagerie superrésolution, illustré dans Fig. ​ Fig.1b. 1 b. TIRFM est également entièrement compatible avec l'imagerie des cellules vivantes, par exemple, il a été utilisé pour étudier le mouvement des complexes CesA le long des microtubules [41].

Images en superrésolution de fibrilles de cellulose colorées au Pontamine Fast Scarlet 4B dans des cellules d'épiderme à écailles d'oignon. une Image de fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) de la surface cellulaire b La section a ensuite été blanchie à l'aide d'une lumière laser puissante pour obtenir l'enregistrement des événements uniques de clignotement des fluorophores. L'image montre le rendu des résultats de la microscopie à reconstruction optique stochastique (STORM). Notez la résolution beaucoup plus fine des fibrilles de cellulose. Barres d'échelle 10, 1 μm en inserts (Réimpression de [42]), CC BY 2.0

Microscopie fluorescente à feuille de lumière

La microscopie à fluorescence par feuille de lumière (LSFM) peut être appliquée aux processus de développement d'images dans les cellules végétales qui sont cachées sous d'épaisses couches de tissus végétaux et qui sont difficiles à extraire physiquement (par exemple, les lignées germinales mâles et femelles [43]). LSFM utilise une optique spécialisée à deux objectifs qui permet la création d'un plan d'éclairage très localisé. Cette technique minimise les dommages photo, a une vitesse d'imagerie élevée qui est comparable à la microscopie à disque rotatif ( ≈ 100 fps), et permet une rotation de 360° des échantillons. Plus important encore, il est compatible avec l'imagerie en direct sur plusieurs jours [44] et peut être utilisé pour des échantillons de plantes avec une faible expression de protéines marquées par fluorescence. LSFM a récemment été utilisé pour imager les processus cellulaires dans Arabidopsis fleurs [45], et cette technique est prometteuse pour étudier la synthèse et le remodelage des enzymes de la paroi cellulaire sur de longues périodes. L'un de ses inconvénients est que la géométrie requise typique des deux objectifs fixés à 90° signifie que les résolutions x, y et z sont limitées en raison des exigences de distance de travail plus importantes (par exemple, la résolution z dans LSFM est de ≈ 2 μ m à ≈ 700 nm) [46].

Présentation de la microscopie superrésolution

Même les meilleures lentilles d'objectif ne peuvent résoudre que latéralement la lumière des longueurs d'onde visibles jusqu'à environ 200 nm, mais les protéines et les glycanes individuels sont généralement un ou deux ordres de grandeur plus petits, de 2 à 20 nm de largeur. Afin de se rapprocher de la résolution de la structure fine des parois cellulaires, l'imagerie fluorescente avec des techniques de superrésolution qui dépassent la limite de résolution d'un système optique de microscope est de plus en plus utilisée dans la recherche sur les cellules végétales (examiné dans [47, 48]). Certains exemples incluent l'organisation des microfibrilles de cellulose [42], ou le rôle des bâtonnets de pectine putatifs impliqués dans la formation des lobes des cellules épidermiques des feuilles [16, 17].

Il est essentiel que l'utilisateur comprenne que de nombreuses images de superrésolution sont le produit d'une analyse et d'un ajustement approfondis des données et peuvent être fondamentalement différentes de celles créées avec l'optique traditionnelle. Ce problème est plus prononcé pour les images produites avec des techniques de microscopie de localisation, et moins pour la microscopie à illumination structurée (SIM) ou la microscopie à émission stimulée (STED). Ceci est rapidement apprécié en considérant de quoi est composée une zone sombre d'une image pour des images normales ou basées sur la localisation. Avec la microscopie à fluorescence à grand champ, confocale, SIM ou STED, une zone sombre sur une image est physiquement mesurée pour n'avoir aucun signal fluorescent à l'emplacement correspondant dans l'échantillon. Cependant, pour la microscopie de localisation (comme discuté ci-dessous dans la section « Méthodes de superrésolution basées sur la localisation »), une tache sombre peut n'avoir aucun marqueur fluorescent, un marqueur irréversiblement blanchi ou manquant, ou une molécule de marqueur fonctionnel qui n'a tout simplement pas été activée. encore sorti de son état sombre. De même, il est facile pour le bruit d'injecter des erreurs d'ajustement de localisation dans les régions claires d'une image de microscopie de localisation, ce qui conduit à une situation où les régions sombres et claires ne sont que des estimations statistiques de ce à quoi ressemble le véritable échantillon. L'élimination ou la compensation de ces effets est difficile et, malheureusement, ils peuvent amener les images résultantes à contenir des artefacts [49]. Le lecteur est dirigé vers Baumgart et al. [50] pour une présentation divertissante de la façon dont ces artefacts peuvent être créés par le processus spécial de microscopie de localisation.

Microscopie à illumination structurée

En microscopie à illumination structurée (SIM) [51], le modèle d'éclairage d'un microscope à fluorescence à grand champ est modifié de sorte qu'il arrive avec un modèle d'interférence sinusoïdal, qui est ensuite déplacé le long de l'échantillon à plusieurs phases différentes. Les données sont collectées avec les lignes d'éclairage définies à trois angles différents ou plus, et les images sont combinées en une seule image avec un maximum de deux fois la résolution que le microscope pourrait normalement obtenir ce principe peut être étendu aux ensembles de données 3D ou à la microscopie TIRF avec optique conçu pour fournir des modèles d'éclairage plus complexes. Les améliorations de résolution proviennent de l'obtention d'informations similaires à celles enregistrées par la microscopie confocale à balayage d'images discutée ci-dessus, mais avec une extraction plus efficace des informations spatiales à haute fréquence [52]. SIM a été utilisé pour étudier l'association des microtubules et des protéines [53], ou l'orientation des microfibrilles de cellulose dans les cellules d'oignon [42].

Appauvrissement des émissions stimulé

La microscopie à déplétion par émission stimulée (STED) est une technique de superrésolution basée sur la microscopie confocale, mais elle utilise un faisceau sophistiqué à deux lasers pour réduire efficacement la taille du spot du laser d'excitation à balayage [54]. Bien qu'assez simple dans son concept et adaptée à de nombreux échantillons pouvant être imagés par microscopie confocale traditionnelle, la technique nécessite un équipement assez avancé et coûteux et est frustrée dans de nombreux échantillons de cellules végétales qui contiennent une autofluorescence rouge et/ou de forts changements d'indice de réfraction [47]. Malgré ces défis, une récente étude STED sur les parois cellulaires végétales avec un conjugué PEG-rhodamine comme sonde fluorescente pour la lignine a démontré une résolution améliorée pour l'imagerie de l'organisation des lamelles moyennes dans le bois [55].

Microscopie à expansion

Expansion microscopy (ExM) relies on physical expansion of biological structures by flooding a sample with acrylamide and then polymerizing the monomers into a hydrophilic polyacrylamide gel cross-linked to cellular components or fluorescent labels. The sample is then enzymatically digested and the polymer is carefully swollen from 4 to 10 times the original size, effectively allowing a 4-10x higher resolution image to be taken on completely standard imaging equipment. Application of this method to organisms with strong cell walls lags significantly behind its use with softer cell types, but there are a few reported examples. Several fungal species were recently successfully expanded [56], and the technique was also used in plants to image the chromatin ultrastructure in barley [57], and aspects of transcription regulation during Arabidopsis embryo fertilization [58]. With continued method development, this technique has a strong potential to enable nanoscale fluorescent imaging of otherwise inaccessible cell wall epitopes.

Localization-based superresolution methods

A large number of fluorescent superresolution imaging techniques that have been developed in the last ≈ 15 years are based on estimation of a point-source fluorescent emitter’s position. Techniques like stochastic optical reconstruction microscopy (STORM), photo-activated localization microscopy (PALM), and many others share a large number of basic principles [59, 60]. Fundamentally, they all find a way to reduce the number of fluorophores detected in an image to a small fraction of the total, and then, the individual fluorophores are analyzed as single molecules with a defined spatial position. Many images are taken with different subsets of fluorophores activated, and then, the corresponding positions of the detected molecules are added together into a composite superresolution image. The process typically requires special imaging conditions, for instance, the fluorophore blinking for STORM usually needs special hypoxic buffers and high illumination intensities, which may alter the specimen’s physiological state or binding of a fluorescent probe [61, 62]. There are already a handful of examples of using STORM for plant cell wall biology some of the most notable are a recent study elucidating the role of pectin in pavement cell morphogenesis [16] and an application of multicolor 3D-STORM to study the assembly of three major cell wall components during nascent cell wall formation [63].

Live cell imaging

Live cell imaging is important for studying biological processes, such as cell wall biosynthesis and remodeling, in real time [64, 65]. A widely used approach for visualizing the cell wall formation in living specimens combines the selective enzymatic removal of cell wall components with probe-assisted polysaccharide labeling. In one example, homogalacturonan (HG) secretion in the unicellular green algae Penium sp. was visualized in living cells via CLSM after treatment with pectate lyase and labeling with various antibodies. This showed that HG is secreted into certain cell wall areas as a highly methylated form before it becomes demethylated and cross-linked by Ca 2 + [66].

While unicellular organisms are relatively easy to image, visualizing cell wall dynamics in living land plants can be challenging. Sample mounting and protection usually requires special growth systems that allow for non-invasive imaging of intact plant organs such as roots. Optimally, such systems provide measures to control the environmental conditions during the experiment. Placing specimens in sealed chambered slides and/or under agar or phytagel is a straightforward measure to control humidity [67]. However, hypoxic responses during longer imaging sessions should be excluded, which can be, for example, tested for by using ADH:GFP plant lines [68]. An efficient strategy to establish controlled micro-environments is imaging plants in microfluidic devices [69]. For example, the RootChip allows for growing seedling roots in individual channels that can be infused with dyes and other liquids [70], see Fig.  2 c. Advantageously, the RootChip can be directly mounted onto the microscope thus the consequences of experimental treatments can be visualized immediately via time-lapse microscopy. Using this setup combined with propidium iodide staining (see "Small fluorescent molecular probes" section ) revealed that the cell wall formation in growing root hairs depends on an auxin-mediated oscillating demethylation of homogalacturonan (Fig.  2 d [71]). Major disadvantages of microfluidic devices are that their preparation can be laborious (e.g., setting up the RootChip takes ∼ 1.5 weeks) and that they are only compatible with small, young plants, isolated plant cells, or thallus cultures.

Strategies for imaging living plants in their natural, upright position or in a microfluidic device: une Inverted microscope mounted vertically on a metal plate, CC BY 4.0 [72]. b Periscope tube and a vertical sample stage [73] (Marianas Plant Scope with Spinning Disk, image courtesy of 3i Intelligent Imaging Innovations). Scheme of the RootChip [70]: Tubes connected to inlet and outlet allow for exposing the root to solvents during imaging. Image series of an Arabidopsis root hair tip over 9 minutes, which is grown in the RootChip system. Pectin Ca 2+ egg box complexes are visualized by staining with propidium iodide (right). Corresponding bright-field images are also shown (left) (Image adapted from Schoenaers et al. [71] with permission)

More advanced live cell imaging setups usually require special and/or customized microscopic equipment. As an illustration, plant roots are frequently used models to study various physiological or developmental processes. One way to monitor root biomass formation under a natural gravity vector is to use vertical imaging setups to counteract gravitropism. Customization usually starts from standard inverted CLSM systems, and in recent years, a number of laboratories published their imaging systems and described the customization steps in detail. This includes mounting a microscope on a metal plate, which can be flipped 90° [72] (see Fig. ​ Fig.2a), 2 a), adding a periscope tube in the optical path [73] (see Fig. ​ Fig.2), 2 ), or equipping a microscope with a special imaging chamber [46]. Flipping the whole microscope brings the advantage that all parts function as they do under normal orientation.

To study cell wall dynamics in planta with superresolution techniques, 2D or 3D SIM is typically chosen as the most compatible technique with the sample requirements of live cells. STORM and PALM are possible to use as well however, longer imaging series might be limited due to photobleaching of fluorophores (for a recent review see Komis et al. [74]). Exciting new tools to overcome these limitations await introduction to the plant cell wall field for example, the technique known as LIVE-PAINT was used to visualize cytoskeletal dynamics in living yeast below the diffraction limit and is compatible with standard confocal or TIRF microscopy systems [75]. It is based on the continuous imaging of genetically encoded, transiently binding small peptides, an approach that is expected to have high potential to track systems such as the dynamic microtubule-mediated cell wall biosynthetic machinery at high temporal and spatial resolutions.

Autofluorescence in plants

In plant tissues, autofluorescence can be used for label-free cell wall imaging of phenolic-containing polymers like lignin or ferulates, but it can be obstructive when using exogenous fluorescent probes [76, 77], as their specific fluorescence has to be separated from the autofluorescence. This is typically done by intensity, where excitation and emission wavelengths are chosen so the dye is much brighter than the autofluorescence, but methods like time-gating [78] or fluorescence lifetime imaging [79] have also been used to distinguish fluorophores from the background autofluorescence. Additionally, spectral unmixing techniques can accurately correct for autofluorescence [80], and a variety of new linear, nonlinear, and unsupervised-learning algorithms have recently been developed that can make excellent use of multiwavelength imaging data to, for example, distinguish combinations of 16 different fluorophores in the same image [81], or unmix underdetermined signals without any reference input [82].

In photosynthetic cells, chlorophyll is the major source of autofluorescence, joined by the cell wall phenolics and other endogenous fluorophores such as ferulates, flavonoids, etc., recently extensively reviewed by Donaldson [84]. Figure ​ Figure3 3 shows the emission spectra for many of these molecules in Arabidopsis, which falls mainly in the blue-green and red regions of the optical spectra. Therefore, fluorophores with green excitation laser and an emission peak in the yellow-red region should be preferred when imaging this plant tissue [85, 86]. It is important to note that the intensity of the autofluorescence depends very much on the imaging parameters (e.g., excitation wavelength, emission filters) therefore, it is recommended to image the plant tissue of an untreated wild-type plant with the imaging settings of the chosen fluorophores before staining plant material or transforming plants.

Emission spectra of autofluorescent molecules: fluorescence emission spectra of various components of Arabidopsis tissues, taken with two-photon excitation at 790 nM. Potential overlap with fluorophores is possible in the blue–green and red region of the visible spectra. Note that this spectra is very specific to the respective plant and tissue material. Adapted from Berg and Beachy [83] with permission

One way to simply remove autofluorescence from images is using the ClearSee or related protocols, designed to preserve fluorescent protein (FP) signals while optically clearing samples [87]. Although it is slow on thick samples, it is an inexpensive way to obtain excellent images of FP-based gene fusions and is compatible with several cell wall histological stains [88]. Some recent examples of its use are the simultaneous imaging of gene expression patterns and cell wall physiology of lateral root formation [89], or immune response [90] in Arabidopsis racines.


Fluorescence

In 2005, Active Motif acquired Chromeon GmbH, a German company established in 2001 by Professor Otto Wolfbeis, a world leader in fluorescent biosensors. Chromeon GmbH had identified early on the need to develop improved fluorescence-based biological assays.

By pairing the assay development of Active Motif with the fluorescent chemistry of Chromeon, we strive to develop innovative cell and molecular biology assays that incorporate the proprietary fluorescent dyes and substrates developed at Chromeon GmbH. Providing sensitivity and flexibility, Active Motif Chromeo dyes exhibit superior luminescence properties, including a broad range of fluorescence excitation and emission, large Stokes shifts, limited photobleaching and a broad pH tolerance.

Fluorescent Microscopy with fluorescently labeled antibodies (Immunofluorescence, or IF) is widely used to detect specific proteins in their cellular environment, and to answer questions regarding their localization, modification, interactions and life cycle. However, until recently the use of fluorescence microscopy in cell biology research has been limited by the resolution that can be achieved in imaging experiments.

The resolution of images is limited to the size of the spot that the excitation beam of the microscope can be focused. This is dependent on the wavelength of the emitting light and the parameters of the instrument. The highest resolution achievable is defined by Abbe's Law:

Figure 1: The Abbe Law describes the resolution that is achievable in microscopy.

x = spatial resolution lambda = wavelength of the excited light
2n sin &alpha = numerical aperture of the microscope

Les Abbe limit restricts the ability of the observer to visually resolve objects separated by less than

200 nm. This makes it impossible to study smaller bacteria, viruses, ribosomes or protein clusters by fluorescence microscopy. However, within the last few years several novel technologies have been developed that overcome this limitation.

Super-resolution fluorescence microscopy (aussi connu sous le nom high-resolution microscopy) describes a group of techniques that &ldquobreak&rdquo the diffraction barrier, enabling the resolution to be as low as 20-30 nm. These techniques take advantage of special physics & instrument settings, and the properties of high-quality fluorescent dyes to improve resolution dramatically. Although these techniques can be separated into two different approaches, they have one common basis: the ability to turn fluorescent molecules off when desired.

Figure 2: Active Motif's primary antibodies and fluorescent secondary antibodies in confocal and STED microscopy.

HeLa cells were stained with alpha Tubulin mouse mAb (Clone 5-B-1-2) and ATTO 647N (STED/GSD) Goat anti-mouse IgG (Catalog No. 15038). Histone H3 was stained with Histone H3 trimethyl Lys4 rabbit polyclonal antibody (Catalog No. 39159) and the Chromeo 488 Goat anti-rabbit IgG (Catalog No. 15041) secondary antibody. The confocal (left) and STED (right) images are courtesy of Leica Microsystems, Germany.

Super-resolution by direct optical imaging

The first approach is based on confocal microscopy, where molecules in the outer regions of the focal spot are turned off. This reduces the size of the fluorescent spot, as only dyes in the center of the excitation area are allowed to emit fluorescence. STED (STimulated Emission epletion) and STED CW (Continuous Wave) belong to these direct optical imaging techniques. They do not require any computational evaluation as the samples are scanned in the normal manner. For more information please visit our STED microscopy products pages.

Super-resolution by localization

In this approach the majority of the molecules within the excited area are turned into a dark state only some single dye-molecules are allowed to emit fluorescent light. The position of these individual molecules is determined by a mathematical algorithm, and each is visualized. By repeating the cycle of turning dyes off and detecting the fluorescence of the remaining individual emitters, thousands of images are created these images are combined to form the final high-resolution image. Several techniques belong to this class of stochastic readout of individual molecule localization: STORM (STochastic Optical Reconstruction Microscopy), PALM (PhotoUNEctivated Localization Microscopy) and GSDIM (gtour State epletion with jendividual Molecule return). For more information on localization based microscopy, please visit our GSDIM microscopy products pages.

With high-resolution microscopy it is possible to exceed the Abbe limit and achieve resolution improvements of up to 12-fold over classical confocal microscopy. The ability to perform imaging experiments at resolutions below 50 nm facilitates the separation of sub-cellular structures that previously could not be resolved, and increases the confidence in the biological roles of proteins and structures that co-localize.


Voir la vidéo: Auto-anticorps et maladies auto-immunes partie1 (Août 2022).