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8.2 : Introduction à l'identification bactérienne par test Enterotube - Biologie

8.2 : Introduction à l'identification bactérienne par test Enterotube - Biologie


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Résultats d'apprentissage

  • Observer, interpréter et identifier les bactéries à l'aide du test Enterotubes/Enteropluri

Identification bactérienne

L'identification des micro-organismes est une partie importante de ce que font de nombreux microbiologistes. Comme vous pouvez l'imaginer, les microbiologistes cliniques auraient besoin d'identifier l'agent pathogène qui cause la maladie chez les patients. Un écologiste microbien s'intéresse aux microbes qui contribuent au changement environnemental ou pourrait vouloir identifier de nouvelles espèces sur le terrain. Peut-être que vous travaillez dans un laboratoire et que vous avez un contaminant et que vous voulez savoir d'où il vient et ce que c'est. Nous avons déjà appris quelques façons d'identifier les microbes, dans le dernier module, vous avez découvert les nombreux tests biochimiques disponibles pour les microbiologistes qui les aident à identifier les bactéries. Nous continuerons avec certains de ces tests biochimiques, en nous concentrant sur ceux qui sont capables de combiner plusieurs tests biochimiques en un seul, et l'utilisation de milieux sélectifs et différentiels pour isoler et identifier les bactéries. Ensuite, nous passerons à la génétique bactérienne et à la façon dont nous pouvons utiliser des méthodes moléculaires pour identifier les bactéries.

Enteropluri/Enterotubes

Un certain nombre de techniques peuvent être utilisées pour l'identification d'espèces et de sous-espèces spécifiques de Entérobactéries. La spéciation est importante car elle fournit des données sur les profils de sensibilité aux agents antimicrobiens et les changements qui se produisent sur une période de temps. Elle est également indispensable pour les études épidémiologiques telles que la détermination des infections nosocomiales et leur propagation.

Dans un effort pour simplifier la spéciation des Entérobactéries et réduire la quantité de milieux préparés et d'espace d'incubation nécessaires au laboratoire clinique, un certain nombre de systèmes multi-tests ont été commercialisés. Certains de ces systèmes multi-tests ont été combinés à un manuel préparé par ordinateur pour fournir une identification basée sur l'ensemble probabilité d'occurrence pour chacune des réactions biochimiques. De cette façon, un grand nombre de tests biochimiques peuvent être effectués de manière économique dans un court laps de temps, et les résultats peuvent être interprétés avec précision avec une relative facilité et assurance.

Les EnteroPluri-Test /Enterotube est un tube en plastique autonome et compartimenté contenant 12 géloses différentes (permettant la réalisation d'un total de 15 tests biochimiques standard) et un fil d'ensemencement fermé. Après l'inoculation et l'incubation, la combinaison résultante de réactions, ainsi qu'un système de codage et d'identification informatique (CCIS), permet une identification facile. Les diverses réactions biochimiques de l'EnteroPluri-Test et leur interprétation correcte sont discutés ci-dessous. Bien qu'il soit conçu pour identifier les membres de la famille bactérienne Entérobactéries, il identifiera parfois aussi des biotypes communs de Pseudomonas et d'autres bacilles à Gram négatif non fermentescibles. il n'identifie pas Pseudomonas aeruginosa.

IDENTIFICATION DES MEMBRES DU ENTEROBACTERIACEAE AVEC LE ENTEROPLURI-TEST

L'EnteroPluri-Test contient 12 géloses différentes qui peuvent être utilisées pour effectuer 15 tests biochimiques standard. Interprétez les résultats de votre EnteroPluri-Test est basé sur un tableau de codage inclus avec le test.

L'entérotube est un tube en plastique autonome et compartimenté contenant douze milieux différents qui permettent la détermination de 15 réactions biochimiques (glucose, production de gaz à partir du glucose, lysine décarboxylase, ornithine décarboxylase, sulfure d'hydrogène (H2S), indole, adonitol, lactose, arabinose, sorbitol, Voges-Proskauer (VP), dulcitol, phénylalanine désaminase (PA), urée et citrate). Le fil d'ensemencement inclus permet l'inoculation de tous les compartiments en une seule étape à partir d'une ou de quelques colonies uniques de votre micro-organisme inconnu. La combinaison résultante de réactions entérotubes, ainsi que d'autres tests de métabolisme, peut vous aider à identifier des organismes inconnus.

Image 1 : Quatre entérotubes illustrés. Tube témoin non ensemencé et 3 tubes ensemencés avec diverses bactéries. Incubation de 24 heures.

Image 2: Chambres entérotubes

Interprétation des résultats de la chambre Enterotube :

A. Fermentation des sucres

Parmi les produits courants de la dégradation des glucides par les micro-organismes utilisant des voies de fermentation figurent les acides organiques (acétique, lactique, etc.), les alcools et les gaz (dioxyde de carbone et hydrogène). Les types de produits formés et la proportion de chacun dépendent de l'espèce de micro-organisme ainsi que du glucide particulier à fermenter.

La capacité à fermenter différents composés de sucre sera testée en inoculant un seul entérotube. Les 5 glucides testés dans 1 entérotube sont : le glucose, l'adonitol, le lactose, l'arabinose et le sorbitol. La formation d'acides peut être facilement détectée en incluant un indicateur de pH dans le milieu de croissance microbienne. La production d'acide abaissera le pH du milieu, entraînant un changement de couleur de l'indicateur, le rouge créosol, du rouge (alcalin) au jaune (acide).

Produits finaux de la fermentation bactérienne de glucose sont soit de l'acide, soit de l'acide et du gaz. Production de gaz sera indiqué par la séparation définitive et complète de la couche de cire de la surface de la chambre de glucose. Le milieu de la chambre de glucose est recouvert de cire pour fournir des conditions anaérobies permettant la détection de la formation de gaz. Fermentation de adonitol, lactose, arabinose, et sorbitol entraînera également la formation de produits finaux acides indiqués par un changement de couleur de l'indicateur présent dans le milieu du rouge au jaune. Tout signe de jaune est interprété comme une réaction positive ; le rouge doit être considéré comme négatif. Certaines souches donneront des réactions légèrement variables, reportez-vous au tableau à la page 84-85 pour les détails.

B. Uréase

De nombreuses bactéries sont capables d'utiliser l'urée comme source d'azote en la divisant en ammoniac et en dioxyde de carbone grâce à la réaction d'hydrolyse catalysée par l'enzyme uréase :

O

?? uréase

NH2 — C—NH2 + H20 ------------------ ► 2NH3 + CO2

urée

L'ammoniac réagit en solution pour former du carbonate d'ammonium, ce qui entraîne une augmentation du pH du milieu. L'activité uréasique est détectée par l'ensemencement d'un milieu contenant de l'urée et un indicateur de pH, le rouge de phénol (jaune/beige/ambre clair à pH acide et rouge-violet à pH alcalin). Initialement, la chambre à milieu d'urée est principalement jaune. Après incubation, une couleur rouge-violet dans tout le milieu indique une séparation rapide de l'urée, une uréase positive résultat. Aucun changement de couleur, (la gélose reste jaune/beige/ambre clair) est un uréase négative résultat. Le test d'uréase est inclus dans l'entérotube. Votre TA fera les organismes de contrôle ci-dessous :

Escherichia coli n'a normalement pas l'enzyme uréase. Proteus vulgaris est un séparateur d'urée rapide.

C. Décarboxylation de la lysine et de l'ornithine

Les tests de décarboxylase sont utiles pour différencier les bactéries. Les micro-organismes qui possèdent l'enzyme décarboxylase peuvent éliminer le groupe carboxyle d'un acide aminé. Certaines bactéries peuvent décarboxyler l'acide aminé lysine à l'aide de l'enzyme lysine décarboxylase, ce qui entraîne la formation du produit final alcalin, la cadavérine. Certaines bactéries peuvent décarboxyler l'ornithine (un produit de l'hydrolyse de l'arginine) à l'aide de l'enzyme ornithine décarboxylase (ODC), ce qui entraîne la formation du produit final alcalin, la putrescine. La présence de ces sous-produits de décarboxylation, cadavérine et putrescine, est indiquée par un changement de couleur du pourpre de bromocrésol, l'indicateur de pH dans le milieu entérotube, du jaune pâle (acide) au violet (alcalin). Le milieu est recouvert de cire pour fournir des conditions anaérobies. Tout degré de violet doit être interprété comme une réaction positive. Le milieu reste jaune, une réaction négative, si la décarboxylation de la lysine ou de l'ornithine ne se produit pas. Ces tests sont inclus dans l'entérotube

Image 3 Réactions de décarboxylation de la lysine et de l'ornithine. La réaction enzymatique catalysée par l'ornithine décarboxylase. L'enzyme ODC dépendante du phosphate de pyridoxal (PLP) catalyse la décarboxylation de l'ornithine et produit de la putrescine.

D. Voges-Proskauer

Différentes bactéries convertissent le dextrose et le glucose en pyruvate en utilisant différentes voies métaboliques. Certaines de ces voies produisent des produits acides instables qui se transforment rapidement en composés neutres. Certains organismes utilisent la voie du butylène glycol, qui produit des produits finaux neutres, notamment l'acétylméthylcarbinol (acétoïne) et le 2,3-butanediol. Le test de Voges-Proskauer (VP) détecte les organismes qui utilisent la voie du butylène glycol et produisent de l'acétoïne pendant le métabolisme du glucose. Après inoculation et incubation de l'entérotube, la production d'acétoïne est détectée à l'aide du réactif de Barritt (hydroxyde de potassium et alpha-naphtol) dans la chambre VP. Le produit acétoïne est oxydé en présence de KOH en diacétyle. Le diacétyle réagit alors pour produire une couleur rouge. La présence d'acétoïne, un résultat positif, est indiquée par le développement d'une couleur rouge en 20 minutes, une réaction négative apparaîtra incolore ou ambre clair. L'utilisation du réactif de Barritt dans la chambre VP sera effectuée après que tous les résultats sont lus pour les autres chambres dans l'entérotube.

E. Utilisation du citrate

Ce test détecte les organismes capables d'utiliser le citrate, sous forme de son sel de sodium, comme seule source de carbone. Les organismes capables d'utiliser le citrate produisent des métabolites alcalins qui changent la couleur de l'indicateur du vert (acide) au bleu foncé (alcalin). Tout degré de bleu doit être considéré comme positif. Certains micro-organismes ne produiront pas toujours le changement de couleur positif « fort » idéal. Les nuances plus claires de la même couleur de base doivent être considérées comme positives ici. L'utilisation du citrate est testée dans l'entérotube.

Comment inoculer et interpréter un Enterotube

Regardez la vidéo 1 : comment ensemencer un Enterotube avec votre échantillon bactérien

Regardez la vidéo 1 : comment inoculer un entérotube réalisé dans les laboratoires de microbiologie de l'État de Caroline du Nord. (5:08) URL : https://youtu.be/3pmaDdZPLJg

Regardez la vidéo 2 : comment interpréter les résultats d'Enterotube

Regardez la vidéo 2 : comment interpréter les résultats d'Enterotube. Vidéo du professeur B (5:23). URL : https://youtu.be/CwxvUq4lTZ4


Identification microbienne

9.7 Conclusion

Ce chapitre a décrit certaines des techniques d'identification microbienne utilisées. Les techniques décrites ont été divisées entre les méthodes phénotypiques et génotypiques. Il est important de noter que les regroupements établis par les systèmes phénétiques et phylogénétiques ne concordent pas toujours et qu'au sein de chaque regroupement, les différences méthodologiques et les contenus variables des différentes bases de données conduiront parfois à des analyses contradictoires.

Il est en outre important de comprendre que tous les systèmes utilisés pour identifier les bactéries, qu'elles soient phénotypiques ou génotypiques, auront des limites, car aucune méthodologie de test unique ne fournira des résultats précis à 100 %.

En termes de choix entre les méthodes, cela dépendra des coûts et des ressources, du temps que le microbiologiste est prêt à attendre et du niveau d'identification requis. Certains microbiologistes sont d'avis que la seule façon de caractériser correctement un micro-organisme consiste à utiliser une « approche polyphasique » qui est une combinaison de méthodes d'analyse phénotypique et de méthodes d'analyse génotypique. Cela prend cependant beaucoup trop de temps et un coût prohibitif pour les laboratoires standard. La plupart des laboratoires de tests de routine sélectionnent des kits de tests phénotypiques et utilisent des installations de test contractuelles établies où des tests génotypiques sont requis.

Ce qui est important, lors d'une sélection, c'est de revenir à l'essentiel et de se demander : quel est le but de l'identification ? que doit savoir le microbiologiste ? et que dit le résultat au microbiologiste ? Ces questions peuvent aider à sélectionner et à mettre en œuvre le test d'identification microbienne approprié.


Méthodes d'identification bioinformatique de lipoprotéines bactériennes codées dans les génomes de bactéries Gram-positives

Les lipoprotéines bactériennes sont un groupe diversifié et fonctionnellement important de protéines qui se prêtent à des analyses bioinformatiques en raison de leurs caractéristiques uniques de peptide signal. Ici, nous avons utilisé un ensemble de données de séquences de lipoprotéines vérifiées expérimentalement de bactéries Gram-positives pour affiner notre modèle de reconnaissance des lipoprotéines précédemment décrit (G + LPP). Les génomes bactériens séquencés peuvent être criblés pour les lipoprotéines putatives en utilisant le modèle G+LPP. Les séquences identifiées peuvent ensuite être validées à l'aide d'outils en ligne pour l'identification des séquences de lipoprotéines. Nous avons utilisé nos ensembles de données de séquences de protéines pour évaluer six outils en ligne pour l'efficacité de l'identification des séquences de lipoprotéines. Nos analyses démontrent que LipoP (http://www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/) fonctionne mieux individuellement, mais qu'une approche consensuelle, incorporant les résultats des prédicteurs des propriétés générales des peptides de signal, est la plus informative.

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Les figures

Les souches bactériennes utilisées dans ce travail sont répertoriées dans le dossier supplémentaire 1. L'ensemble du panel était composé de : i) une collection de souches Bcc représentatives des dix-huit espèces décrites jusqu'à présent (Peeters et al., 2013, Vandamme et Dawyndt, 2011) et d'origine clinique ou environnementale ii) 3 Cupriavidus et 3 Ralstonie souches iii) un panel de souches environnementales appartenant à différents genres bactériens provenant de CRA-ABP et iv) différentes souches cliniques isolées de patients atteints de mucoviscidose


Matériaux et méthodes

Le PAFC génère des ondes ultrasonores résultant de l'absorption de la lumière dans les particules sous flux. 32 Ces ondes ultrasonores sont souvent créées par l'expansion et la contraction thermoélastiques d'un objet qui a absorbé la lumière laser. 33, 34 Dans notre configuration PAFC, un laser nanoseconde fonctionnant à 532 nm est utilisé pour irradier un échantillon sous flux. Les ondes ultrasonores sont détectées par un transducteur piézoélectrique et enregistrées sur un ordinateur. Notre configuration de détection photoacoustique est directement basée sur notre système utilisé pour détecter les cellules de mélanome circulant dans le sang. 35 – 37

Les bactériophages ont une faible absorbance optique à une longueur d'onde de 532 nm. Pour fournir un contraste optique au bactériophage Det7, un colorant Direct Red 81, un colorant protéique photostable polysulfaté capable de générer des ondes photoacoustiques après irradiation laser, a été attaché. Les spectres d'absorption du bactériophage Det7 teint et non teint ont été mesurés à l'aide d'un Nanodrop 2300. Le bactériophage reste coloré en permanence par le Direct Red 81, qui contient deux groupes acide sulfonique avec des valeurs de pKa dans la plage négative, permettant la formation de ponts salins avec des groupes basiques tels que la lysine et chaînes latérales d'arginine. Ces ponts salins sont plus tenaces que certaines liaisons covalentes à des valeurs de pH relativement neutres et, par conséquent, ces liaisons ne sont rompues qu'à un pH élevé dans des concentrations élevées de sel.

Cytométrie en flux photoacoustique

Un laser Nd:YAG (Litron Nano, Bozeman, Montana) couplé à une fibre optique de 1000 μm, ouverture numérique 0,39 (Thorlabs, Newton, New Jersey) a été utilisé pour produire une lumière laser de 532 nm avec des impulsions de 5 ns. L'énergie du faisceau laser couplé à travers la fibre optique a été maintenue et mesurée de 1,9 à 2,1 mJ pour la plupart des expériences de détection. L'énergie laser a été augmentée à 4 mJ pour une expérience de détection de cellule unique. La lumière laser a été dirigée vers un tube de quartz (Quartz 10 QZ, Charles Supper, Natick, Massachusetts) avec des parois de 10 à μ m d'épaisseur passant à travers une chambre à circulation imprimée en 3D. Les parois de 10 m d'épaisseur permettent la propagation des ondes ultrasonores, ainsi qu'une voie optiquement transparente pour le passage de l'échantillon. La fibre optique a été placée à 5 mm du tube de quartz pour créer un volume de détection de 0,04 µl. La forme du faisceau laser était gaussienne et la fluence calculée était de 0,014 mJ/cm 2 .

Un transducteur de 2,25 MHz focalisé sur le tube d'échantillon en quartz a été installé à la base de la chambre à circulation imprimée en 3D (Fig. 2). Le volume interne de la chambre a été rempli de gel acoustique Sonotech LithoClear (NeXT Medical Products Company, Branchburg, New Jersey) pour fournir un milieu pour la propagation des ondes acoustiques. Des pompes à seringue ont été utilisées pour créer un débit alternatif d'échantillon et d'huile minérale égal à un débit de 60/min. L'introduction de l'échantillon et de l'huile minérale non miscible induit un écoulement diphasique. 37 Un écoulement à deux phases a été utilisé pour permettre la collecte future des échantillons pour une analyse plus approfondie tout en éliminant la possibilité que les échantillons se coincent ou retardent à l'intérieur du tube. Les signaux ont été amplifiés avec un gain de 50 à l'aide d'un amplificateur Tegam 4040B (Tegam, Inc., Genève, Ohio) et envoyés à un ordinateur de bureau exécutant un programme LabView personnalisé. Cet ordinateur servait également au contrôle du système et à la collecte des données. Cette configuration de chambre à circulation a servi de dispositif d'excitation et de collecte d'ondes acoustiques.


La cellule bactérienne

Tous les organismes vivants sur Terre sont constitués de l'un des deux types de cellules de base : les cellules eucaryotes, dans lesquelles le matériel génétique est enfermé dans une membrane nucléaire, ou les cellules procaryotes, dans lesquelles le matériel génétique n'est pas séparé du reste de la cellule. . Traditionnellement, toutes les cellules procaryotes étaient appelées bactéries et étaient classées dans le royaume procaryote Monera. Cependant, leur classification comme Monera, équivalente en taxonomie aux autres règnes - Plantae, Animalia, Fungi et Protista - sous-estimait la remarquable diversité génétique et métabolique présentée par les cellules procaryotes par rapport aux cellules eucaryotes. À la fin des années 1970, le microbiologiste américain Carl Woese a été le pionnier d'un changement majeur dans la classification en plaçant tous les organismes dans trois domaines - Eucarya, Bactéries (à l'origine appelée Eubactéries) et Archaea (à l'origine appelée Archaebactéries) - pour refléter les trois anciennes lignes d'évolution. Les organismes procaryotes anciennement connus sous le nom de bactéries ont ensuite été divisés en deux de ces domaines, les bactéries et les archées. Les bactéries et les archées sont superficiellement similaires, par exemple, elles n'ont pas d'organites intracellulaires et elles ont un ADN circulaire. Cependant, ils sont fondamentalement distincts et leur séparation est basée sur les preuves génétiques de leurs lignées évolutives anciennes et séparées, ainsi que sur des différences fondamentales dans leur chimie et leur physiologie. Les membres de ces deux domaines procaryotes sont aussi différents les uns des autres que des cellules eucaryotes.

Les cellules procaryotes (c'est-à-dire les bactéries et les archées) sont fondamentalement différentes des cellules eucaryotes qui constituent d'autres formes de vie. Les cellules procaryotes sont définies par une conception beaucoup plus simple que celle trouvée dans les cellules eucaryotes. La simplification la plus apparente est le manque d'organites intracellulaires, qui sont des caractéristiques caractéristiques des cellules eucaryotes. Les organites sont des structures discrètes enfermées dans une membrane qui sont contenues dans le cytoplasme et comprennent le noyau, où l'information génétique est conservée, copiée et exprimée les mitochondries et les chloroplastes, où l'énergie chimique ou lumineuse est convertie en énergie métabolique le lysosome, où les protéines ingérées sont les nutriments digérés et autres sont rendus disponibles et le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi, où les protéines synthétisées et libérées par la cellule sont assemblées, modifiées et exportées. Toutes les activités exercées par les organites se déroulent également dans les bactéries, mais elles ne sont pas réalisées par des structures spécialisées. De plus, les cellules procaryotes sont généralement beaucoup plus petites que les cellules eucaryotes. La petite taille, la conception simple et les larges capacités métaboliques des bactéries leur permettent de croître et de se diviser très rapidement et d'habiter et de prospérer dans presque tous les environnements.

Les cellules procaryotes et eucaryotes diffèrent à bien d'autres égards, notamment la composition lipidique, la structure des enzymes métaboliques clés, les réponses aux antibiotiques et aux toxines et le mécanisme d'expression de l'information génétique. Les organismes eucaryotes contiennent de multiples chromosomes linéaires avec des gènes beaucoup plus gros qu'ils ne devraient l'être pour coder la synthèse des protéines. Des portions substantielles de la copie d'acide ribonucléique (ARN) de l'information génétique (acide désoxyribonucléique ou ADN) sont rejetées, et l'ARN messager restant (ARNm) est substantiellement modifié avant d'être traduit en protéine. En revanche, les bactéries ont un chromosome circulaire qui contient toute leur information génétique, et leurs ARNm sont des copies exactes de leurs gènes et ne sont pas modifiés.


Conclusion

Ici, nous montrons empiriquement que les tailles du génome des symbiotes et la diversité fonctionnelle sont prédites par le taux de flux de gènes dans et entre les populations de symbiotes via la transmission horizontale et la recombinaison homologue. Bien que nous n'ayons étudié que trois associations ayant évolué indépendamment, nous voyons ce système servir de microcosme pour les associations marines plus généralement, car de nombreuses autres associations présentent des biologies similaires (e.g., intracellulaire, autotrophe, reproduction à la volée, etc. [36]) et tous sont régis par les mêmes principes de génétique des populations. Étonnamment, nous avons découvert que le flux de gènes symbiotes entre les hôtes se poursuit dans l'une des associations marines les plus intimes, les vésicomyidés transmis verticalement. Ces résultats suggèrent qu'il existe une gamme d'états de dégradation du génome intermédiaires possibles qui peuvent être maintenus sur des millions d'années avec une recombinaison suffisante. Par conséquent, l'évolution du génome des symbiotes suite à la restriction de l'hôte n'est pas un processus à sens unique et inévitable qui se termine dans un état semblable à celui d'un organite comme il est couramment présenté [2,5,6]. Ces résultats valident une théorie ancienne mais non testée et suggèrent que la diversité des symbioses qui présentent des taux intermédiaires de transmission horizontale et de dégradation incomplète du génome peut subir des processus similaires au niveau de la population.


Conclusion

La maladie du flétrissement bactérien chez C. maxima dans le Guangdong, en Chine, est causée par R. solanacearum. Les 24 souches isolées de C. maxima dans cette étude appartiennent au phylotype I, race 1 et biovar 3 ou 4. Ces isolats se sont regroupés dans les séquelles 17, 45 et 56. Le séquvar 45 a été identifié en Chine pour la première fois dans cette étude, et le séquvar 56 est un nouveau séquvar qui n'a pas été décrit précédemment. Cette étude est le premier rapport à identifier R. solanacearum infections de race 1 dans C. maxima. Deux C. moschata cultivars, Xiangyu1 et Xiangmi, étaient résistants ou modérément résistants à R. solanacearum souche RS378. Nos résultats fournissent des informations précieuses pour le développement ultérieur de stratégies de contrôle pour C. maxima maladie de flétrissement.


Conclusion

La nature polymicrobienne de la VB nécessite l'utilisation de tests diagnostiques basés sur des critères combinés. Une partie du défi consiste à déterminer quels critères de combinaison sont suffisamment sensibles et spécifiques comme critères de diagnostic pour la VB. L'autre défi consiste à développer des tests de diagnostic rentables, qui pourraient de préférence être utilisés au POC. Bien qu'il existe une interaction complexe entre le pH vaginal et la concentration de différentes espèces bactériennes, il est évident que le pH vaginal, en particulier supérieur à 4,5, améliore les performances des tests de diagnostic lorsqu'il est associé à d'autres composants du CVF.

La détection efficace et précise de la dysbiose vaginale a toujours été entravée par des facteurs tels que la différence de niveaux de biomarqueurs entre les populations (par exemple, les espèces bactériennes) et les variations de type d'échantillon (Kyongo et al., 2015 Masson et al., 2018). De nombreuses études discutées dans cette revue ont mis en évidence le potentiel de différents critères de combinaison avec des biomarqueurs au-delà du niveau génétique pour améliorer le diagnostic de la VB. Si le but du diagnostic est de traiter, la question doit être posée de savoir s'il existe un équilibre parfait entre le VMB et tous ses composants associés. Autrement dit, la concentration bactérienne se traduit-elle par des niveaux correspondants de métabolites, de protéines et de marqueurs inflammatoires ? Néanmoins, la réduction continue des coûts opérationnels des technologies à haut débit offre l'opportunité d'étudier le milieu vaginal avec une approche de biologie des systèmes à grande échelle pour cartographier et relier des biomarqueurs potentiels. Cette revue ne suggère pas nécessairement le remplacement des outils de diagnostic actuellement disponibles pour la VB, mais met en évidence les limites de ces outils et appelle à l'expansion du domaine du diagnostic de la VB en explorant la vaste gamme d'opportunités de diagnostic discutées ici.

Dans de nombreux contextes à ressources limitées, cependant, les tests POC pour la VB ne sont pas disponibles ou tout simplement trop chers pour une utilisation diagnostique de routine et les professionnels de la santé doivent se fier à la gestion syndromique du syndrome des pertes vaginales. Il est donc impératif que le développement et l'évaluation de nouveaux tests de diagnostic incluent à la fois une analyse des coûts et des avantages pour la santé dans divers contextes, en particulier lorsqu'une instrumentation coûteuse est requise. Les profils de risque de différentes populations pour les séquelles indésirables de l'infection par la VB, telles qu'un risque accru d'infection par le VIH et de mauvais résultats de grossesse, devraient guider la sélection des tests de diagnostic. Dans de telles populations à risque, nous devons nous demander quel est le coût du coût ?


Catégorie : Micro-organismes

Introduction:
La transformation bactérienne se produit lorsqu'une cellule bactérienne absorbe de l'ADN étranger et l'intègre dans son propre ADN. Cette transformation se produit généralement dans les plasmides, qui sont de petites molécules d'ADN circulaires séparées de son chromosome. Il peut y avoir 10 à 200 copies du même plasmide dans une cellule. Ces plasmides peuvent se répliquer lorsque le chromosome le fait, ou ils peuvent se répliquer indépendamment. Chaque plasmide contient de 1 000 à 200 000 paires de bases. Certains plasmides, appelés plasmides R, portent le gène de résistance aux antibiotiques comme l'ampicilline, qui est utilisé dans ce laboratoire.

Les plasmides fonctionnent en transformation de deux manières différentes. Ils peuvent transférer des gènes qui se produisent naturellement en leur sein, ou ils peuvent agir comme vecteurs pour l'introduction d'ADN étranger. Des enzymes de restriction peuvent être utilisées pour couper l'ADN étranger et l'insérer dans les vecteurs plasmidiques. Les bactéries utilisées dans ce laboratoire étaient Escherichia coli (E. coli). Il était idéal pour cette étude de transformation car il peut être facilement cultivé dans un bouillon Luria ou sur gélose, et il possède un génome relativement petit d'environ cinq millions de paires de bases.

La transformation n'est pas la seule méthode de transfert d'ADN au sein des bactéries. La conjugaison est un transfert d'ADN qui se produit entre deux cellules bactériennes. Un pont se forme entre les deux cellules et l'information génétique est échangée. En transduction, un virus est utilisé pour transférer de l'ADN étranger dans une cellule bactérienne.

Hypothèse:
L'E. coli transformé avec le gène de résistance à l'ampicilline pourra se développer dans les plaques d'ampicilline, mais pas l'E. coli non transformé.

Matériaux:
Le matériel nécessaire pour ce laboratoire était 2 tubes à essai stériles, 500 L de CaCl2 0,05 M glacé, des cultures de bactéries E. coli, une anse d'inoculation stérile, une micropipette stérile, 10 L de solution pAMP, une minuterie, de la glace, un bain-marie , 500 μL de bouillon Luria, une tige d'étalement, 4 plaques : 2 ampicilline+ et 2 ampicilline – , et un incubateur.

Méthodes :
Un tube stérile était étiqueté “+” et l'autre “-“. Une micropipette stérile a été utilisée pour transférer 250 L de CaCl2 0,05 M glacé dans chaque tube. Une grande colonie d'E. coli a été transférée avec une anse d'inoculation dans chaque tube. La suspension a ensuite été mélangée en aspirant et en vidant à plusieurs reprises une micropipette stérile. 10μL de solution de pAMP ont été ajoutés à la suspension cellulaire dans le tube marqué « + » et mélangés en tapotant le tube. Les deux tubes ont été immédiatement placés sur de la glace pendant 15 minutes puis trempés dans un bain-marie à 42°C pendant 90 secondes. Les tubes ont ensuite été remis dans la glace pendant 2 minutes supplémentaires.

Après le choc thermique, 250 μL de bouillon Luria ont été ajoutés dans chaque tube. Les tubes ont été mélangés par tapotement. Deux plaques d'ampicilline + gélose ont été marquées LB/AMP+ et LB/AMP-. Les deux plaques d'ampicilline-agar ont été étiquetées LB+ et LB-. 100 L de la suspension cellulaire dans le tube “+” ont été déposés sur les plaques LB+ et LB/AMP+. 100μL de la suspension cellulaire dans le tube "-" ont été ajoutés aux plaques LB- et LB/AMP-. Ceux-ci ont été étalés avec une tige d'épandage qui a été stérilisée en la passant au-dessus d'une flamme après chaque utilisation. Les plaques ont été laissées au repos pendant plusieurs minutes puis incubées pendant la nuit à l'envers à 37°C.

Des questions:
1. Comparez et contrastez le nombre de colonies sur chacune des paires de plaques suivantes. Qu'est-ce que chaque paire de résultats vous dit sur l'expérience ?
LB+ et LB- Ces deux plaques avaient un tapis de bactéries. Cela prouve que les bactéries sont capables de se développer sur la gélose et que rien n'empêche la croissance à côté de l'ampicilline.

LB/AMP- et LB/AMP+ Le LB/AMP- n'avait pas de croissance, mais le LB/AMP+ avait une petite croissance. Cela montre que la bactérie s'est transformée et a développé une résistance à l'ampicilline.

LB/AMP+ et LB+ Le LB/AMP+ avait une croissance moindre que le LB+. Cela montre que la transformation n'a pas été complètement efficace et n'a transformé que certaines des cellules bactériennes les plus compétentes.

2. Masse totale de pAMP utilisé = 0,05 g

Volume total de suspension cellulaire = 510 L

Fraction de suspension cellulaire étalée sur les plaques = 0,196

Masse de pAMP en suspension cellulaire = 0,0098

Nombre de colonies par µg de plasmide = 0,0294

3. Quels facteurs pourraient influencer l'efficacité de la transformation ? Expliquez l'effet de chacun que vous mentionnez.
L'efficacité de la transformation pourrait être affectée par la taille de la colonie ajoutée à la solution. Dans une colonie plus grande, l'efficacité augmenterait car il y aurait plus de cellules réceptives. Un autre facteur serait la quantité de pAMP ajoutée. Plus on ajoute de pAMP, plus l'efficacité est élevée. La quantité de bouillon Luria ajoutée pourrait également affecter l'efficacité. Si la quantité de bouillon Luria était augmentée, l'efficacité diminuerait.

Erreur d'analyse:
Ce laboratoire comportait plusieurs étapes, chacune donnant un risque d'erreur. Toutes les mesures devaient être précises et exactes, et le moment du choc thermique était également une procédure très compliquée. L'erreur dans ce laboratoire pourrait avoir été causée par la concentration de CaCl2 en raison du fait que la majeure partie était congelée.

Discussion et conclusion:
Les bactéries traitées avec la solution de pAMP ont développé une résistance à l'ampicilline et ont pu se développer sur la plaque ampicilline+. Ceux qui n'ont pas été traités avec le pAMP n'ont pas pu croître sur ce milieu. Les plaques sans ampicilline ont servi de contrôle pour montrer à quoi ressembleraient les bactéries dans des conditions normales. La transformation n'est jamais pleinement efficace, seules les cellules suffisamment compétentes sont capables d'absorber l'ADN étranger. Par conséquent, les plaques ampicilline + ont montré moins de croissance que la plaque témoin.


Voir la vidéo: Etude de la croissance bactérienne (Mai 2022).


Commentaires:

  1. Darwin

    Je m'excuse, mais à mon avis, vous admettez l'erreur. Écrivez-moi dans PM, nous parlerons.

  2. Higgins

    À mon avis, vous êtes sur la mauvaise voie.

  3. Moogutilar

    Je suis sûr que ce n'est pas vrai.

  4. Adil

    C'est remarquable, les informations précieuses



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