Informations

Forte concentration d'amorce en PCR

Forte concentration d'amorce en PCR



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pourquoi est-ce qu'une concentration plus élevée d'amorces que la matrice d'ADN en PCR favorisera l'annelage d'une matrice à une amorce ?


Pour le dire simplement, une concentration plus élevée d'amorces signifie plus d'amorces dans le mélange, donc plus de chances qu'il s'hybride à votre matrice d'ADN, mais plus n'est pas toujours bon. La concentration optimale d'amorces dans une réaction PCR est comprise entre 0,1 et 0,5 µM. Pour la plupart des applications, 0,2 µM suffit. L'utilisation d'une concentration très élevée d'amorces peut être gênante car elle peut amener vos amorces à se lier à des sites partiellement complémentaires, ce qui entraîne des produits PCR non spécifiques.

https://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/cloning/pcr_strategy/optimising_pcr/


L'utilisation d'une concentration élevée d'amorces garantit qu'après la dénaturation, la matrice d'ADN se lie aux amorces au lieu de se lier les unes aux autres. Une concentration d'amorces plus élevée a également amélioré le rendement du produit, car les amorces agissent comme un facteur limitant pour l'hybridation.

(Référence : https://academic.oup.com/nar/article/24/5/985/1047654)


Calcul des concentrations pour la PCR

i) Les amorces oligonucléotidiques sont généralement fournies sous la forme "autant d'unités OD/ml" - mais qu'est-ce que cela signifie moyenne, en termes de mg/ml, ou mmol/ml, etc. ?

Étant donné: une amorce est longue de Y nucléotides (nt)

Étant donné: le MW de ssDNA est (330 daltons par nt) x (longueur en nt) (Sambrook et al., 1989 p. C.1)

Étant donné: la concentration d'amorce (=ssDNA) produisant une DO de 1 à 254 nm dans une cuvette de 1 cm, est de 37 ug/ml

Puis: le MW de l'amorce est de 330.Y daltons

Et: X DO/ml = 37.X ug/ml = 37.X mg/l = 37.X /330.Y mM = 37.X.1000/330.Y uM

Par exemple:

L'amorce B 88/77 - un oligodésoxynucléotide 17-mer - telle que fournie est de 12,6 unités de DO/ml. Nous devons créer une solution mère de 5 uM pour la PCR.

MW: 17 x 330 = 5610

Concentration: 12,6 DO x 37 ug/ml = 466 ug/ml = 466 mg/l = 0,466 g/l

Molarité: 0,466/5610 = 0,000083 Molaire = 83 uM

Par conséquent: nous avons besoin de 5 ul de solution mère d'oligo dans 83 ul (+78 ul d'eau) pour faire une solution de 5 uM (si 1 ul dans 83 ul donne une solution de 1 uM. )

ii) Calcul des quantités pour les réactions PCR : si nous avons besoin d'une concentration finale de 0,5 uM d'oligo dans le mélange réactionnel PCR (volume final 50 ul), nous ajoutons 5 ul de stock 5 uM au mélange réactionnel (dilution finale 1/10) .

B) Nucléotides :

Les stocks de nucléotides pour PCR (ou autre procédure) sont PRESQUE TOUJOURS dNTP s (désoxynucléotides), et les concentrations sont presque toujours données en CHAQUE dNTP : c'est-à-dire que la concentration donnée est CHAQUE nucléotide dans le mélange, NE PAS la concentration totale. Cela signifie qu'un mélange 2,5 mM de dNTP pour PCR contient 2,5 mM de CHAQUE dNTP et 10 mM TOTAL de dNTP.

Exemple:

i) Préparez une solution mère de 2,5 mM de dNTP à partir de 100 mM de dNTP individuels, fournie par Promega :

  • PREMIER mélanger des volumes égaux de chaque nucléotide (par exemple : 50 ul) : cela vous donne 200 ul de 25 mM de dNTP mélangés (Rappel : concn. exprimé en CHAQUE dNTP).
  • ALORS diluer (ou aliquoter) 1/10 avec L'EAU - aliquoter en quantités de 100 ul et congeler.

ii) Préparer un stock de 1 mM de dNTP avec du dTTP substitué à 10 % (p/p) par de la digoxigénine-11-dUTP (DIG-dUTP) à utiliser comme mélange d'étiquetage pour l'étiquetage PCR des produits PCR :

  • DIG-dUTP fourni (par Boehringer Mannheim) à 25 nmol/25 ul = 1 umol/ml = 1 mM la concentration finale de DIG-dUTP doit être 1/10e de celle des autres nucléotides, et [DIG-dUTP] + [dTTP] doit = ​​[ tout autre dNTP]. Par conséquent, pour obtenir un stock de dNTP 1 mM, il faut diluer le stock DIG-dUTP au 1/10.
  • PREMIER diluer les stocks de dNTP 100 mM séparés à 10 mM (par exemple, 5 ul à 50 ul, dans l'eau).
  • ALORS mélanger des volumes égaux (par exemple 10 ul) de 10 mM de dCTP, dGTP et dATP stock, et 9/10ème de volume de dTTP (9 ul). Ajouter un volume égal (par exemple 10 ul) de 1 mM DIG-dUTP.
  • ALORS ajouter de l'eau à 10 vol (=100 ul ajouter 51 ul) : concentration finale de chaque dNTP = 1 mM concentration finale DIG-dUTP = 0,1 mM, et de dTTP = 0,9 mM.

iii) UTILISER le mélange préparé ci-dessus à 50 uM de chaque dNTP dans un mélange de réaction PCR, volume final 25 ul :


Protocole

Configuration de la réaction :

Nous recommandons d'assembler tous les composants de la réaction sur de la glace et de transférer rapidement les réactions dans un thermocycleur préchauffé à la température de dénaturation (95°C).

Composant 25 &mul réaction 50 &mul réaction Concentration finale
Norme 10X Taq Tampon de réaction 2.5 &mul 5 &mul 1 FOIS
10 mM de dNTP 0,5 µl 1 &mul 200 µM
10 µM Forward Primer 0,5 µl 1 &mul 0,2 µM (0,05&ndash1 µM)
Apprêt inverse 10 µM 0,5 µl 1 &mul 0,2 µM (0,05&ndash1 µM)
ADN modèle variable variable <1000 ng
Taq ADN polymérase 0,125 µl 0,25 µl 1,25 unités/50 µl PCR
Eau sans nucléase à 25 µl à 50 µl

Notes : Mélanger doucement la réaction. Recueillir tout le liquide au fond du tube par une rotation rapide si nécessaire. Superposer l'échantillon avec de l'huile minérale si vous utilisez une machine PCR sans couvercle chauffant.

Transférez les tubes PCR de la glace vers une machine PCR avec le bloc préchauffé à 95°C et commencez le thermocyclage.

Conditions de thermocyclage pour une PCR de routine :

ÉTAPE
TEMPÉRATURE
TEMPS
Dénaturation initiale
95°C
30 secondes
30 cycles 95°C
45-68°C
68°C
15-30 secondes
15-60 secondes
1 minute/ko
Prolongation finale 68°C 5 minutes
Prise 4-10°C


Conditions générales d'Utilisation:

Les amorces oligonucléotidiques ont généralement une longueur de 20 à 40 nucléotides et ont idéalement une teneur en GC de 40 à 60 %. Des programmes informatiques tels que Primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3) peuvent être utilisés pour concevoir ou analyser des amorces. La concentration finale de chaque amorce dans une réaction peut être de 0,05 &ndash1 &muM, typiquement de 0,1&ndash0,5 &muM.

Une concentration en Mg ++ de 1,5&ndash2,0 mM est optimale pour la plupart des produits PCR générés avec Taq ADN polymérase. La concentration finale de Mg ++ dans la norme 1X Taq Le tampon de réaction est de 1,5 mM. Cela permet une amplification satisfaisante de la plupart des amplicons. Cependant, Mg ++ peut être optimisé davantage par incréments de 0,5 ou 1,0 mM à l'aide de MgCl2.

L'amplification de certaines cibles difficiles, comme les séquences riches en GC, peut être améliorée avec des additifs, tels que le DMSO (3) ou le formamide (4).

La concentration finale de dNTP est typiquement de 200 µM de chaque désoxynucléotide.

Nous recommandons généralement d'utiliser Taq ADN polymérase à une concentration de 25 unités/ml (1,25 unités/50 &mul réaction). Cependant, la concentration optimale de Taq L'ADN polymérase peut aller de 5&ndash50 unités/ml (0,25&ndash2,5 unités/50&mul réaction) dans des applications spécialisées.

Une dénaturation initiale de 30 secondes à 95°C est suffisante pour la plupart des amplicons issus de matrices d'ADN pur. Pour les modèles difficiles tels que les séquences riches en GC, une dénaturation initiale plus longue de 2&ndash4 minutes à 95°C est recommandée avant le cycle PCR pour dénaturer complètement le modèle. Avec la PCR sur colonie, une dénaturation initiale de 5 minutes à 95°C est recommandée.

Pendant le thermocyclage, une dénaturation de 15&ndash30 secondes à 95°C est recommandée.

L'étape de recuit est généralement de 15 à 60 secondes. La température de recuit est basée sur le Tm de la paire d'amorces et est typiquement de 45&ndash68°C. Les températures de recuit peuvent être optimisées en effectuant une PCR à gradient de température commençant à 5 °C en dessous de la Tm calculée. Le calculateur NEB Tm est recommandé pour calculer une température de recuit appropriée.

Lorsque des amorces avec des températures de recuit supérieures à 65°C sont utilisées, un protocole PCR en 2 étapes est possible (voir #10).

La température d'extension recommandée est de 68°C. Les temps d'extension sont généralement de 1 minute par ko. Une extension finale de 5 minutes à 68°C est recommandée.

Généralement, 25&ndash35 cycles donnent suffisamment de produit. Jusqu'à 45 cycles peuvent être nécessaires pour détecter les cibles à faible nombre de copies.

Lorsque des amorces avec des températures de recuit supérieures à 65°C sont utilisées, un protocole de thermocyclage en 2 étapes est possible.


Protocole

Configuration de la réaction :

Nous recommandons d'assembler tous les composants de la réaction sur de la glace et de transférer rapidement les réactions dans un thermocycleur préchauffé à la température de dénaturation (95°C).

Composant 25 &mul réaction 50 &mul réaction Concentration finale
Norme 10X Taq Tampon de réaction 2.5 &mul 5 &mul 1 FOIS
10 mM de dNTP 0,5 µl 1 &mul 200 µM
10 µM Forward Primer 0,5 µl 1 &mul 0,2 µM (0,05&ndash1 µM)
Apprêt inverse 10 µM 0,5 µl 1 &mul 0,2 µM (0,05&ndash1 µM)
ADN modèle variable variable <1000 ng
Taq ADN polymérase 0,125 µl 0,25 µl 1,25 unités/50 µl PCR
Eau sans nucléase à 25 µl à 50 µl

Notes : Mélanger doucement la réaction. Recueillir tout le liquide au fond du tube par une rotation rapide si nécessaire. Superposer l'échantillon avec de l'huile minérale si vous utilisez une machine PCR sans couvercle chauffant.

Transférez les tubes PCR de la glace vers une machine PCR avec le bloc préchauffé à 95°C et commencez le thermocyclage.

Conditions de thermocyclage pour une PCR de routine :

ÉTAPE
TEMPÉRATURE
TEMPS
Dénaturation initiale
95°C
30 secondes
30 cycles 95°C
45-68°C
68°C
15-30 secondes
15-60 secondes
1 minute/ko
Prolongation finale 68°C 5 minutes
Prise 4-10°C


Conditions générales d'Utilisation:

Les amorces oligonucléotidiques ont généralement une longueur de 20 à 40 nucléotides et ont idéalement une teneur en GC de 40 à 60 %. Des programmes informatiques tels que Primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3) peuvent être utilisés pour concevoir ou analyser des amorces. La concentration finale de chaque amorce dans une réaction peut être de 0,05 &ndash1 &muM, typiquement de 0,1&ndash0,5 &muM.

Une concentration en Mg ++ de 1,5&ndash2,0 mM est optimale pour la plupart des produits PCR générés avec Taq ADN polymérase. La concentration finale de Mg ++ dans 1X Standard Taq Le tampon de réaction est de 1,5 mM. Cela permet une amplification satisfaisante de la plupart des amplicons. Cependant, Mg ++ peut être optimisé davantage par incréments de 0,5 ou 1,0 mM à l'aide de MgCl2.

L'amplification de certaines cibles difficiles, comme les séquences riches en GC, peut être améliorée avec des additifs, tels que le DMSO (3) ou le formamide (4).

La concentration finale de dNTP est typiquement de 200 µM de chaque désoxynucléotide.

Nous recommandons généralement d'utiliser Taq ADN polymérase à une concentration de 25 unités/ml (1,25 unités/50 &mul réaction). Cependant, la concentration optimale de Taq L'ADN polymérase peut aller de 5&ndash50 unités/ml (0,25&ndash2,5 unités/50&mul réaction) dans des applications spécialisées.

Une dénaturation initiale de 30 secondes à 95°C est suffisante pour la plupart des amplicons issus de matrices d'ADN pur. Pour les modèles difficiles tels que les séquences riches en GC, une dénaturation initiale plus longue de 2&ndash4 minutes à 95°C est recommandée avant le cycle PCR pour dénaturer complètement le modèle. Avec la PCR sur colonie, une dénaturation initiale de 5 minutes à 95°C est recommandée.

Pendant le thermocyclage, une dénaturation de 15&ndash30 secondes à 95°C est recommandée.

L'étape de recuit est généralement de 15 à 60 secondes. La température de recuit est basée sur le Tm de la paire d'amorces et est typiquement de 45&ndash68°C. Les températures de recuit peuvent être optimisées en effectuant une PCR à gradient de température commençant à 5 °C en dessous de la Tm calculée. Le calculateur NEB Tm est recommandé pour calculer une température de recuit appropriée.

Lorsque des amorces avec des températures de recuit supérieures à 65°C sont utilisées, un protocole PCR en 2 étapes est possible (voir #10).

La température d'extension recommandée est de 68°C. Les temps d'extension sont généralement de 1 minute par ko. Une extension finale de 5 minutes à 68°C est recommandée.

Généralement, 25&ndash35 cycles donnent suffisamment de produit. Jusqu'à 45 cycles peuvent être nécessaires pour détecter les cibles à faible nombre de copies.

Lorsque des amorces avec des températures de recuit supérieures à 65°C sont utilisées, un protocole de thermocyclage en 2 étapes est possible.


Résultats

Blocage des performances de l'apprêt

L'ajout d'une amorce de blocage au mélange PCR a clairement diminué le nombre de fragments de prédateurs amplifiés et enrichi le nombre de fragments de proies plus rares. Dans les mélanges d'ADNr contenant 1000 fois plus de fragments d'ADNr "prédateurs" (krill) que de fragments d'ADNr "proies" (algues), seuls les pics correspondant à l'ADNr de krill ont pu être détectés par analyse de fragments lorsqu'aucune amorce de blocage n'a été ajoutée (tableau 3). L'ajout d'une amorce bloquante inhibant l'hybridation dans un rapport de 4:1 par rapport à l'amorce universelle correspondante (1,0 L d'amorce bloquante et 0,25 L d'amorce universelle, les deux 10 M) a conduit à une amplification réduite des ADNr de krill mais pas à l'arrêt complet de l'amplification (tableau 3) . Et en ajoutant 10 fois plus d'amorce de blocage que d'amorces universelles (2,5 L d'amorce de blocage et 0,25 L de chaque amorce universelle), l'ADNr d'algues a été presque exclusivement amplifié (tableau 3). L'ajout de 20 fois plus d'amorce de blocage (5,0 L d'amorce de blocage et 0,25 L de chaque amorce universelle) a encore réduit le pic de krill (tableau 3).

L'amorce "normale" Short28SR-blkKrill3'c3 semble être un peu plus efficace pour bloquer l'ADN des prédateurs par rapport à l'amorce DPO Short28SF-DPO-blkKrill. Les pics correspondant à l'ADNr de krill étaient plus faibles dans les mélanges d'amorces bloquantes 4:1 : amorces universelles pour les échantillons de proie 1:100 et 1:1000 : échantillons d'ADNr prédateur avec l'amorce normale par rapport aux mélanges avec l'amorce DPO (tableau 3) . Cependant, l'amorce DPO bloquait largement l'amplification de l'ADN de krill lorsqu'elle était ajoutée dans un rapport de 10:1 à l'amorce non modifiée (tableau 3).

L'amorce d'arrêt d'allongement 28S-ElArKrill-3'c3 n'a pas fonctionné. Aucun produit de PCR n'a été généré lorsqu'il a été ajouté au mélange de PCR (données non présentées).

Analyse de l'estomac de krill

Au total, 111 clones de 13 estomacs de krill différents ont été séquencés, révélant 36 séquences différentes se répartissant en 6 groupes principaux. Parmi eux, il n'y avait pas de séquences correspondant au type sauvage d'ADNr 28s de krill. 10 séquences différentes (15 au total) étaient cependant clairement d'origine krill (Figure 3) et probablement des pseudogènes ou des versions à faible nombre de copies normalement non détectées par séquençage direct.

Arbre de similarité de séquence. Arbre de similarité de séquences de séquences amplifiées à partir d'estomacs de krill et de séquences apparentées. Les séquences stomacales de krill sont nommées de sorte que les trois premières lettres signifient la date d'échantillonnage, c'est-à-dire M24 = 24 mars 2007, S17 et S20 = 17 septembre et 20 septembre 2007, St. signifie numéro d'estomac et le nombre entre parenthèses est égal au nombre de séquences identiques de chaque séquence différente trouvée dans les différents estomacs. L'arbre n'est pas enraciné.

Quatre groupes différents de séquences d'algues ont été trouvés. Deux de ces groupes, uniquement détectés dans les échantillons de mars, correspondaient le plus à des espèces appartenant à Bacillariophyta, respectivement au genre Phéodactyle et le genre Squelette (Figure 3). Un troisième groupe, trouvé dans les estomacs des trois dates d'échantillonnage, semblait être quelque peu similaire aux Bacillariophyta, mais ne correspondait à rien dans GenBank (Figure 3). La zone de 200 pb séquencée était trop peu informative pour révéler l'appartenance du groupe par analyse phylogénétique, en plus du fait que le groupe était très probablement d'origine algale. Le dernier groupe d'algues était une séquence de septembre appartenant à Chlorophyta (Figure 3).

Un grand groupe de séquences, qui prévalait dans l'échantillon de septembre, n'a pas pu être identifié sans équivoque par référence aux séquences actuelles de GenBank. Les correspondances les plus proches étaient une correspondance à 96 % avec Stauroteuthis (Mollusca). Il est possible que cela représente des aliments pour mollusques tels que des larves de calmar. Cependant, il est également possible que le Stauroteuthis la séquence a été mal rapportée et est en fait dérivée d'un contaminant de l'original Stauroteuthis échantillon.

Les séquences ont été déposées auprès de GenBank sous les numéros d'accès EU378965 – EU379000.


Taq Polymérase


Définition de l'unité : Une unité est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour catalyser l'incorporation de 10 nmoles de dNTP sous une forme insoluble dans l'acide en 30 minutes à 70 °C en utilisant l'ADN de sperme de Hering comme substrat.

Expédition: expédié sur glace bleue

Conditions de stockage: conserver à -20 °C
éviter les cycles gel/dégel

Durée de conservation : 12 mois

Concentration: 5 unités/&mul

La description:
La Taq Polymerase est recommandée pour les applications PCR de routine (jusqu'à 4 kb de longueur de fragment), la PCR à haut débit ou le génotypage. Le système tampon garantit des résultats d'amplification robustes et fiables dans presque toutes les applications PCR. Le Crystal Buffer contient un rapport bien équilibré d'ions potassium, ammonium et magnésium pour assurer une spécificité élevée et une formation minimale de sous-produits sans avoir besoin d'étapes d'optimisation supplémentaires.
Ruby Buffer contient en outre un tampon de chargement de gel et un colorant rouge inhérent. Le colorant rouge permet un contrôle visuel facile pendant la configuration de la PCR et, en combinaison avec le réactif de densité, le chargement direct du produit de réaction dans le gel.
L'enzyme réplique l'ADN à 72 °C. Il catalyse la polymérisation des nucléotides en ADN duplex dans le sens 5'→3' en présence de magnésium. Il possède également une activité de remplacement d'exonucléase dépendante de la polymérisation 5'→3' mais n'a pas d'activité d'exonucléase 3'→5' (relecture).

Teneur:
Taq Polymérase (bouchon rouge)
5 unités/&mul Taq ADN polymérase dans 20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 % Tween-20, 0,5 % Nonidet P-40, 50 % (v/v) Glycérol, pH 8,0 (25°C)

Ruby Buffer (capuchon noir)
10 x conc. tampon PCR complet contenant 200 mM Tris-HCl, KCl, (NH4)2DONC4 et 20 mM de MgCl2, colorant de suivi rouge et réactif de densité pour le chargement de gel

Crystal Buffer (capuchon vert)
10 x conc. tampon PCR complet contenant 200 mM Tris-HCl, KCl, (NH4)2DONC4 et 20 mM de MgCl2

composantPCR-211SPCR-211LPCR-211XL
Taq
Polymérase
200 unités
/ 40 &mul
1000 unités
/ 200 &mul
5000 unités
/ 1ml
Tampon Rubis1,2 ml5 x 1,2 ml25 ml
Cristal
Amortir
1,2 ml5 x 1,2 ml25 ml


Configuration du test :
Avant de commencer, vortexer soigneusement tous les composants pour assurer l'homogénéité.
Préparez un prémix pour le nombre de dosages dont vous avez besoin selon le protocole suivant :

comp.casquetteconc.conc.1 dosage @ 20 &mul1 dosage @ 50 &mul
Eau de qualité PCRblanche remplir jusqu'à 20 &mulremplir jusqu'à 50 &mul
Tampon Rubis ou Tampon Cristalnoir ou vert10x1 fois2 &mul5 &mul
Mélange dNTP / 10 mM #NU-1006blanche10 mm200 &muM0,4 &mul1 &mul
Taq Polyméraserouge5 unités/&mul0,025 unités/&mul0,1 &mul0,25 &mul
mélange d'amorces ou chaque amorce 10 &muM chaque amorce200 - 400 nM chaque amorce0,4-0,8 &mul1 - 2 &mul
modèle
/échantillon d'ADN
10 &mul 1)
allongement 2)
95 °C
50 - 68 °C
72°C
10 - 20 secondes
10 - 20 secondes
20 s - 4 mn

25 - 35x

Applications de chargement de gel et en aval :
Tampon Rubis (#PCR-272) comprend un réactif de densité + un colorant de suivi et permet le chargement direct des produits PCR dans un gel d'électrophorèse. Pour la détection de l'ADN / la coloration fluorescente de l'ADN, nous recommandons d'utiliser des colorants de nouvelle génération (par exemple, SYBR DNA Stain, # PCR-273) au lieu du bromure d'éthidium classique mais hautement mutagène.
Tampon de cristal (#PCR-271) est recommandé pour les applications en aval telles que le séquençage d'ADN, la ligature, la digestion par restriction ou lorsqu'une analyse du produit PCR par absorbance ou excitation par fluorescence est requise. Pour l'électrophorèse sur gel, ajoutez un tampon de chargement de gel et un colorant d'ADN fluorescent (par exemple, un tampon de chargement de gel avec un colorant d'ADN, #PCR-274 - #PCR-276) avant de charger la PCR dans le gel. L'utilisation de gels pré-colorés ou de protocoles de coloration post-analyse est également possible.

Systèmes tampons supplémentaires :
Tampon de marquage (#PCR-263) est recommandé pour les applications de marquage d'ADN ou de mutagenèse. Le tampon est spécialement optimisé pour l'incorporation de nucléotides marqués ou modifiés dans l'ADN. Il donne des résultats supérieurs dans une large gamme de conditions de réaction avec la plupart des paires amorce-matrice, mais l'amplification peut également avoir tendance à augmenter l'imprécision.
Tampon KCl (#PCR-262) est recommandé pour une utilisation dans les réactions PCR de routine. Le tampon est optimisé pour une spécificité la plus élevée, mais peut nécessiter un réglage fin supplémentaire des paramètres de dosage comme le MgCl2 concentration et température de recuit.

Optimisation du MgCl2 concentration:
Une concentration finale de Mg 2+ de 2,0 mM est recommandée en combinaison avec le tampon de marquage. Cependant, si une optimisation individuelle de Mg 2+ est essentielle, ajoutez 25 mM de MgCl2 solution mère (#PCR-266) comme indiqué dans le tableau ci-dessous.

MgCl final2 conc.20 &mul volume de dosage final50 &mul volume de dosage final
2 mm--
3 mm0,8 &mul2.0 &mul
4 mm1.6 &mul4.0 &mul
5 mm2.4 &mul6.0 &mul

Citations de produits :
Veuillez cliquer sur la flèche noire à droite pour développer la liste des citations. Cliquez sur le titre de la publication pour le texte intégral.


Discussion

Nous décrivons ici une nouvelle technique pour amplifier l'ADN afin de réduire les effets négatifs des mésappariements entre l'amorce et la matrice sur l'efficacité de l'amplification des matrices cibles. Cette méthode est une modification extrêmement générale et simple de la réaction PCR, et implique trois étapes enzymatiques, y compris une copie linéaire médiée par la polymérase de matrices d'ADN génomique, une digestion par exonucléase des amorces et une amplification PCR finale à l'aide d'amorces ciblant un lieur indépendant de la cible. séquences. Comme le montre ce manuscrit, cette approche permet à l'amplification exponentielle de la cible d'intérêt d'être réalisée avec des amorces qui n'ont aucun décalage avec les modèles dans la réaction. Cela réduit considérablement les biais associés aux mésappariements et aux amorces dégénérées qui peuvent s'accumuler pendant la PCR en limitant les interactions amorce-modèle à deux cycles seulement.

Les objectifs de cette étude étaient de : (i) démontrer que les première et deuxième étapes de la PCR pouvaient être séparées tout en générant une amplification fiable (ii) déterminer si des dégénérescences dans les pools d'amorces entraînaient une distorsion évidente de la communauté microbienne observée, et si la technique PEX PCR peut être utilisée pour contourner ou réduire une telle distorsion, (iii) développer un flux de travail robuste pour que cette approche soit mise en œuvre pour tout ou plusieurs ensembles d'amorces, et (iv) identifier les applications auxquelles cette approche est la mieux adaptée. Les résultats ici démontrent qu'en effet les deux types d'interactions définis au sein de la PCR (je.e. interactions naturelles et artificielles) peuvent et doivent être séparés lorsque des amorces dégénérées sont utilisées ou lorsque des discordances avec la matrice sont anticipées. Les étapes doivent être séparées car les interactions matrice-amorce d'ADN génomique ont le plus grand potentiel de biais en raison de mésappariements dérivés de vrais mésappariements dans l'ADNg et de dégénérescences dans le pool d'amorces. Notre analyse d'une communauté fictive synthétisée artificiellement démontre le fort potentiel d'un pool d'amorces dégénérées d'oligonucléotides de différentes températures de fusion pour sélectionner préférentiellement des modèles basés sur des variations de séquence dans le site d'amorce. Notre stratégie limite l'interaction matrice-amorce d'ADNg à deux cycles, tous les cycles d'amplification ultérieurs utilisant des interactions non dégénérées et sans matrice. En outre, étant donné que seuls deux cycles sont utilisés au cours de la première étape des interactions ADNg-amorce, des conditions d'hybridation et d'allongement inhabituelles peuvent être utilisées. Dans cette étude, nous avons utilisé de longs temps de recuit (20 minutes) à des températures de recuit basses pour laisser suffisamment de temps à la polymérase pour se lier aux sites cibles et s'allonger sans augmenter la température de réaction. De telles conditions de réaction sont probablement plus tolérantes à une faible efficacité de recuit d'amorce des appariements amorce-matrice avec des mésappariements. Dans une étude systématique des interactions amorce-matrice, Wu et al. [31] ont rapporté que des mésappariements uniques se produisant dans les 3-4 dernières positions à partir de l'extrémité 3' de l'amorce ont donné une extension d'amorce minimale ou nulle. Nous observons ici que les mésappariements 3' peuvent être surmontés à l'aide de la méthode PEX PCR, et que les amorces avec 3 ou 4 mésappariements peuvent toujours s'hybrider avec des cibles d'ADN génomique et produire une extension de polymérase. Cela a été révélé par une analyse des modèles d'utilisation des amorces dans des analyses de la communauté fictive. Nous notons qu'une telle analyse ne peut pas être effectuée en utilisant des approches PCR standard et nécessite la méthode PEX PCR.

De plus, nous démontrons par la comparaison de la méthode PEX PCR avec et sans exonucléase que les amorces ciblant l'ADNg source (ou l'ADN fictif) contribuent à la distorsion au cours des cycles ultérieurs de PCR, même en présence de concentrations élevées des amorces PCR de deuxième étape. . L'élimination complète des amorces non incorporées de la réaction de première étape, bien que souhaitable, s'est avérée difficile. Même après dilution, digestion par exonucléase et diminution de la concentration d'amorce au cours des deux premiers cycles, une certaine quantité limitée d'amorce de première étape peut être propagée à la PCR de deuxième étape. Malgré cela, le traitement à l'exonucléase réduit considérablement l'impact du transfert d'amorces et constitue une partie essentielle de la méthodologie PEX PCR. Dans les analyses de la communauté fictive et de l'ADNg environnemental, le traitement à l'exonucléase modifie considérablement la communauté microbienne observée. Il est possible qu'à la place du traitement à l'exonucléase, les oligonucléotides bloquants du complément inverse des amorces spécifiques de la matrice directe et inverse (e.g. complément inverse des amorces 515F et 806R sans lieurs CS1 et CS2) pourraient être ajoutés à la deuxième étape de PCR de la réaction PEX PCR pour empêcher les interactions matrice-amorce d'ADNg.

La méthode PEX PCR fournit également un mécanisme nouveau et robuste pour explorer les interactions amorce-modèle dans les analyses d'échantillons d'ADNg complexes. La méthode PEX PCR préserve la séquence de l'annelage de l'amorce à la matrice d'ADNg pendant les deux premiers cycles de la réaction, et ceux-ci peuvent être interrogés de manière bioinformatique pour déterminer quelles amorces au sein d'un pool dégénéré sont vraiment impliquées dans l'annelage et l'extension. Nous avons observé qu'à des températures de recuit élevées, un recuit d'appariement parfait est favorisé, et une plus faible diversité des amorces dans le pool a été utilisée. Cela semble être préjudiciable à la réaction d'amplification, car des amorces parfaitement correspondantes sont présentes à une faible abondance globale dans un pool d'amorces fortement dégénérées. À des températures de recuit inférieures, un spectre plus large d'amorces, contenant des mésappariements avec la matrice, est impliqué dans le recuit et l'allongement. Cela semble être bénéfique, car les analyses de la communauté fictive dans des conditions de recuit inférieures ont généré de meilleures représentations de la véritable distribution sous-jacente des ADN fictifs. On a observé que les amorces avec 0 à 4 mésappariements avec diverses matrices s'hybrident et permettent l'extension de la polymérase. Lorsque des mésappariements 3' ont été introduits dans des modèles d'ADN fictifs, la distribution d'utilisation des amorces s'est déplacée vers des amorces avec 1 ou 2 mésappariements totaux par rapport à la matrice. Par conséquent, la forte dégénérescence des jeux d'amorces peut ne pas être bénéfique lors de l'utilisation de la méthode PEX PCR. Au lieu de cela, il peut être approprié de sélectionner des amorces « intermédiaires » qui ont au plus 1 ou 2 mésappariements à tous les sites d'amorçage potentiels, en supposant que chaque variante ne nécessite pas une amorce unique pour être ciblée. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déterminer la meilleure combinaison de températures de dégénérescence des amorces et de recuit pour d'autres cibles plus dégénérées telles que les gènes fonctionnels microbiens. Une telle stratégie peut permettre une méthode directe basée sur la PCR pour l'analyse d'un gène à copie unique présent dans tous les micro-organismes à des fins d'analyse de la structure de la communauté. Nous notons en outre que des stratégies supplémentaires peuvent être nécessaires pour permettre à la méthode PEX PCR de fonctionner efficacement à des températures de recuit plus basses (e.g. <45°C), comme l'introduction d'une protéine de liaison à l'ADN simple brin dans les mélanges maîtres d'amplification.

La méthode PEX PCR est recommandée pour : (i) toute réaction PCR dans laquelle un pool d'amorces dégénérées est utilisé (ii) toute réaction PCR dans laquelle une amorce non dégénérée est utilisée mais où la variabilité de la matrice d'ADN au site d'amorçage est possible (iii ) les réactions dans lesquelles une dégénérescence de haut niveau peut être utilisée pour cibler toutes les variantes connues d'un gène et (iv) lorsque plusieurs paires d'amorces doivent être utilisées simultanément. Nous montrons ici que la méthode peut être utilisée pour amplifier et séquencer des matrices avec des mésappariements à l'extrémité 3' du site d'amorce, qui se sont avérées hautement déstabilisantes en PCR [31,32]. Crosby et Criddle [33] ont précédemment utilisé une stratégie utilisant la capture par hybridation suivie d'une amplification et d'un séquençage aléatoires pour cibler les gènes de l'ARN polymérase dirigées contre l'ADN (rpoC). La méthode PEX PCR peut être adaptable à une amplification PCR directe de rpoC gènes de tous les micro-organismes au sein d'une seule réaction d'amplification. Cela préserverait l'abondance relative d'origine trouvée dans l'ADN matrice et fournirait une approximation directe de l'abondance relative des organismes dans l'échantillon. Ceci est différent de l'amplification et du séquençage des gènes d'ARNr, tels qu'ils sont réalisés dans cette étude, car une large gamme de copies de gènes d'opérons d'ARNr se trouve dans les domaines Bacteria et Archaea [34]. Nous ne savons pas encore si le niveau de dégénérescence des régions conservées de la rpoC (ou un autre gène similaire) est susceptible d'être un obstacle majeur au cours des deux premiers cycles de l'étape « A » de la méthode PEX PCR, mais il s'agit clairement d'une prochaine étape dans le développement de cette technique. Si la dimérisation des amorces dans les réactions avec des pools d'amorces extrêmement dégénérées est observée, la purification des composants de l'étape « A » à l'aide d'un protocole de sélection de taille (e.g. billes AMPure) au lieu de l'exonucléase réduira le transfert de dimères d'amorces qui sont insensibles à l'activité d'exonucléase simple brin.

La méthode PEX PCR peut également trouver une application répandue pour les PCR quantitatives dans lesquelles des amorces dégénérées sont utilisées. Les PCR quantitatives pourraient être réalisées en traitant initialement des échantillons d'ADN préparés à l'aide de l'étape « A » de la méthode PEX PCR. Par la suite, la qPCR serait effectuée en utilisant des amorces ciblant des séquences de liaison au lieu d'amorces spécifiques à la matrice. Cela pourrait potentiellement augmenter considérablement l'efficacité de la qPCR et la plage de cibles pour les amorces dégénérées à large cible communes à la microbiologie environnementale, et éviter les problèmes découlant des efficacités d'amplification différentielles pour différentes cibles. Une approche similaire a en effet été développée, dans le but de réduire l'impact de la contamination de l'ADN bactérien dans les réactions qPCR [35].

Enfin, nous notons que cette méthode présente des similitudes conceptuelles avec une étude précédemment réalisée par Crosby et Criddle [33], dans laquelle des séquences de liaison connectées à des amorces aléatoires ont été utilisées pour amplifier des gènes fonctionnels capturés à l'aide de sondes d'hybridation. Dans cette étude, deux cycles d'hybridation et d'élongation ont été utilisés pour le marquage, avec amplification ultérieure. En outre, Illumina a développé une approche de capture de cible dans laquelle deux amorces avec des lieurs aux extrémités 5' ou 3' sont autorisées à s'hybrider à un seul brin d'ADN matrice (je.e. Amplicon TruSeq). Après l'extension de la polymérase, la ligature est utilisée pour lier le fragment allongé à l'amorce terminale 3' avec un lieur flanquant 3'. Par la suite, l'amplification PCR utilisant les séquences de liaison est utilisée pour préparer des fragments pour le séquençage.


Courbes standard qRT-PCR en temps réel. l'efficacité est trop élevée! - (29 juin 2005 )

Dans mes expériences qRT-PCR en temps réel, j'utilise la méthode de la courbe standard pour la quantification de l'expression génique. Cependant, les courbes standard semblent être une énorme procédure aléatoire pour moi, même avec des gènes bien établis pour bien fonctionner avec le temps réel tels que GAPDH.

Parfois, je suis capable de produire d'excellentes courbes standard avec des pentes d'environ -3,3 (

100 % d'efficacité), les courbes de fusion associées à chaque dilution sont également excellentes.

Cependant, la plupart du temps, je peux obtenir d'excellentes courbes de fusion pour chaque dilution, mais la pente de ma courbe standard peut tomber à environ -2,6 (

Quelqu'un peut-il offrir des explications à cet étrange dilemme? Par conséquent, quelqu'un peut-il proposer des suggestions pour résoudre ce problème?

Une chose à laquelle je peux penser est que j'obtiens des efficacités d'amplification non uniformes à différentes concentrations d'ARN. Pour info, j'utilise généralement 100 ng/ul d'ARN pour "1x" et je fais des dilutions en série jusqu'à 100x. Je comprends que je devrais vraiment utiliser une plus grande gamme de dilutions, mais des dilutions supérieures à 100x ne fonctionnent tout simplement pas pour mes gènes/amorces.

Merci pour toute aide que je peux obtenir.

Quelle est la portée des Cts ? Avez-vous vu une contamination dans votre contrôle négatif ?

Mes valeurs Ct pour les courbes standard vont généralement d'environ 14 à 20, et les contrôles négatifs ne montrent aucune contamination par l'ADN.

Quel instrument utilisez-vous ?

Cher YuJ,
Utilisez-vous SYBR Green comme colorant reporter et utilisez-vous iCycler ?
Quelle est votre plus faible dilution dans votre étalon ?

C'est ce qui m'arrive toujours. Si j'exécute un test SYBR Green en utilisant une norme allant de 10e6 à 1, j'obtiendrai une efficacité de > 100%.
Donc, ce que j'ai fait, c'est de désélectionner les deux dernières dilutions (10 et 1) et l'efficacité est devenue

3.3.
Je pense que cela est dû à la formation de dimères d'amorces qui contribuent au faux signal de votre réaction. Et l'effet du dimère d'amorce est suffisamment important pour vous donner des données, en particulier dans l'étalon à faible concentration.

J'utilise en effet la chimie SYBR Green (ABI SYBR Green PCR Mix), mais l'instrument que j'utilise est l'Applied Biosystems 7900HT.

J'ai essayé de supprimer certaines dilutions dans toutes les permutations possibles avant de tracer les lignes de tendance, mais les résultats sont incohérents entre les expériences. Je ne pense pas non plus avoir d'amorces-dimères en raison des pics de produits très prononcés et de l'absence totale de pics d'amorces-dimères dans les données de dissociation/fusion.

Salut YuJ,
Pourriez-vous s'il vous plaît décrire comment vous préparez votre norme quantitative ?

Mes étalons quantitatifs sont préparés comme tels.

1. RNA isolation using TRIZOL reagent following manufacturer instructions plus an additional overnight purification step with ethanol (100%) and sodium acetate (3 M).

2. Spectrophotometric determination of [RNA]. A260/A280 ratio is usually at around 1.8.

3. Serial dilution of RNA at 1x, 10x, 25x, 75x, 100x, and sometimes 1000x (with 1x being 100 ng/uL diluted from stock, 10x being 10 ng/uL, etc.) using DEPC-treated water. I make sure to vortex each tube very well before pipetting for the next dilution.

4. Reagents in RT-PCR reactions include: Multiscribe Reverse Transcriptase (ABI), RNaseOUT RNase Inhibitor (Invitrogen), SYBR Green 2x PCR Mix (ABI). These, plus DEPC-treated water, are combined as a master mix.

5. Primer concentrations have been previously optimized for each primer. In the case of GAPDH, I determined the ideal concentration to use would be 0.06 uM per reaction for both the forward and reverse primer.

6. In each reaction tube, I first add the water and master mix, then the primers, and then finally the appropriate RNA template.

7. Each tube is vortexed and loaded in triplicate into the appropriate optical reaction plate. Plate is centrifuged to get rid of air bubbles and placed into the ABI 7900HT.

8. Thermocycler is set for a 45C RT phase (30min), 95C melting + 60C annealing phase (40 cycles), and then an additional dissociation phase at the end for generating the dissociation curves.

I probably included a lot of irrelevant facts, but hopefully this is what you meant by how I prepare my quantiative standards.

Dear YuJ,
Thanks for your description. I would strongly suggest you to use invitro transcription to prepare your GAPDH mRNA rather than using TRIzol extracted total RNA.

The reason is when you use TRIzol to extraction, you will get total RNA not GAPDH specific mRNA. So when you quantitate using spetrophotometrically, the reading will be out. Thus it would not give you a

You may try to clone the GAPDH gene into a plasmid and invitro trascripted(IVT) into GAPDH mRNA --> treat with DNase I to completly remove DNA conteminant--> stop DNase reaction --> purify the mRNA --> quantitate you mRNA*-->converte xx ug/ul into xx RNA copy/ul--> perform 10 fold serial dilution --> run RT-PCR.

This should give you a batter result.

*optional:
If you want to make sure that you IVT GAPDH mRNA is free from DNA conteminat, you may run a RT-PCR and a PCR (no RT) simultaneously. Your (no RT) PCR should not give you any band. If it does, treat you standard again with DNase I.

Noter:
when you do a cloning please in clude 10-20 bp extra flanking at the both 3' and 5' end of your acture mRNA target. This will provide bater stability against exonuclease and yield prolong shelf life to your standard.

I would like to recommend you to use Ambion produst for IVT purpose.

Thank you for your advice, Hadrian, but I do not believe that method is suitable for me.

Although I've only mentioned GAPDH serial dilution as an example, I am actually conducting a gene expression study for some other genes, merely using GAPDH as an internal control.

Also, when I made the spectrophotometric measurements, I was just interested in the A260/A280 ratio as a measure of RNA purity and a rough estimate of the total RNA concentration in the stock tube. Indeed I am measuring total RNA, but gene-specific primers are used in the RT-PCR for actual quantification.

Sorry, I should have first mentioned what I'm actually doing instead of assuming that others can read my mind.


The Degenerate Primer Design Problem: Theory and Applications

A PCR primer sequence is called dégénérer if some of its positions have several possible bases. Les dégénérescence of the primer is the number of unique sequence combinations it contains. We study the problem of designing a pair of primers with prescribed degeneracy that match a maximum number of given input sequences. Such problems occur when studying a family of genes that is known only in part, or is known in a related species. We prove that various simplified versions of the problem are hard, show the polynomiality of some restricted cases, and develop approximation algorithms for one variant. Based on these algorithms, we implemented a program called HYDEN for designing highly degenerate primers for a set of genomic sequences. We report on the success of the program in several applications, one of which is an experimental scheme for identifying all human olfactory receptor (OR) genes. In that project, HYDEN was used to design primers with degeneracies up to 10 10 that amplified with high specificity many novel genes of that family, tripling the number of OR genes known at the time.


High concentration of primer in PCR - Biology

The 64-bit Mac version should work on most modern Macs (OS X 10.7 or newer).

FreeBSD users may simply type pkg install pooler

For all other systems (GNU/Linux, older Mac, Solaris. ) please compile from source (below).

Example primers file

Source code

  • a C compiler (GCC or Clang) and basic Unix tools,
  • MingW compiler(s) if you want to cross-compile for Windows.

Usage

  • If you opt to use Score when your primers and/or tags are very long, you will be asked if you are really sure you don't want to use deltaG instead.
  • If you opt for deltaG, the following questions will be asked: Temperature: Enter a number (decimal fractions are allowed). You can enter it in Celsius, Kelvin, Fahrenheit or Rankine. Do not enter the suffix C or K or F or R---Primer Pooler will determine for itself which unit was meant, and ask you to confirm. (Recent versions of Primer Pooler offer 5 additional obscure temperature scales if you decline all of the more probable ones.) Magnesium concentration in mM (0 for no correction): Enter your concentration of magnesium in nanomoles per cubic metre (decimal fractions are allowed). Enter 0 if you don't mind the deltaG figures not being corrected for magnesium concentration. Monovalent cation (e.g. sodium) concentration in mM: Enter your concentration of sodium etc in nanomoles per cubic metre (decimal fractions are allowed). If in doubt, try 50. dNTP concentration in mM (0 for no correction): Enter your concentration of deoxynucleotide (dNTP) in nanomoles per cubic metre (decimal fractions are allowed). Enter 0 if you don't mind the deltaG figures not being corrected for dNTP concentration.
  • If you answered yes to this question, the summary will be displayed on screen, and you will be asked if you also want to save it to a file. If you answer yes to this, you will be asked for a filename.
  • These up-front counts will include self-interactions (a primer interacting with itself), and interactions between the pair of primers in any given set. Self-interactions and in-set interactions are ne pas counted when summarizing the counts of each pool (below).
  1. Go to http:// hgdownload. cse. ucsc. edu/ downloads. html
  2. Choose a species (e.g. Human)
  3. Choose "Genome sequence files"
  4. If you're under hg38, choose "Standard genome sequence files"
  5. Scroll down to the links, and choose the one that ends .2bit (e.g. hg38.2bit)
  • After the overlap scan is complete, Primer Pooler will then have enough data to write an input file for MultiPLX if you wish to run that software as well for comparison. If you decline this, it will ask if you want it to write a simple text file with the locations of all amplicons, which you may accept or decline.
  • Si tu fais ne pas opt to check for overlaps in the genome, then Primer Pooler will ne pas take overlaps into account when generating its pools. This is rarely useful unless you have déjà ensured there are no overlaps in the set of amplicons under consideration. Even then, I would recommend performing a scan anyway, just to double-check: an early version found 11 overlaps in a supposedly overlap-free batch drawn up by an experienced academic---we all make mistakes. But bypassing the overlap check might be useful si you are sure there are no overlaps and you don't want to download a very large genome file to the workstation you're using.

You will not be allowed to set the maximum size of each pool lower than the average size of each pool, since that would make it logically impossible to fit all primer-sets into all pools. It is not advisable to set it just above the average either, since being overly strict about the evenness of the pools could hinder Primer Pooler from finding a solution with lower dimer formation. You might want to experiment with different maxima---you will be able to come back to this question and try again. Do you want to give me a time limit? (y/n): If you answer oui, you will be asked to set a time limit in minutes. Normally 1 or 2 is enough, although you may wish to let it run a long time to see if it can find better solutions. Vous ne ont to set a time limit: you may manually interrupt the pooling process at any time and have it give the best solution it has found so far, whether a time limit is in place or not. Additionally, Primer Pooler will stop automatically when it detects better solutions are unlikely to be found. Do you want my "random" choices to be 100% reproducible for demonstrations? (y/n): If you answer oui, Primer Pooler's random choices will be generated in a way that merely voir random but are in fact completely reproducible. This is useful for demonstration purposes---you'll know how long it will take to find the solution you want. Otherwise, the random choices will be less predictable, as a different sequence will be chosen depending on the exact time at which the pooling was started. Pooling display While pooling is in progress, Primer Pooler will periodically display a brief summary of the best solution found so far, showing the pool sizes, and the counts of interactions (by deltaG range or score) within each pool. As instructed on screen, you may press Ctrl-C (i.e. hold down Ctrl while pressing and releasing C, then release Ctrl) to cancel further exploration and use the best solution found so far. Do you want to see the statistics of each pool? (y/n): After the pooling is complete, or after you have interrupted it (by pressing Ctrl-C as instructed on screen), you will be asked if you wish to see the interaction counts of chaque pool (rather than a simple summary of tous pools as appeared during pooling). If you want this, you will also be asked if you wish to save them to a file, and, if so, what file name. Do you want to see the highest bonds of these pools? (y/n): If you answer Yes, you will be asked for a deltaG or score threshold, and all interactions worse than that threshold will be displayed on-screen with bonds diagrams such as:and you will then be asked if you wish to save it to a file, and, if so, what file name. You will then be asked if you would like to try another threshold. Shall I write each pool to a different result file? (y/n): If you answer oui to this, you will be asked for a prefix, which will be used to name the individual results files. Otherwise, you will be asked if you wish to save all results to a single file. If you decline saving all results to a single file, the results will not be saved at all---this is for when you weren't happy with the solution and want to go back to try a different number of pools or a different maximum pool size. Do you want to try a different number of pools? (y/n): This question is self-explanatory. You can go back as many times as you like, trying different numbers of pools. But many researchers have a pretty good idea of how many pools they want to use, or else are happy with the computer's initial suggestion. Would you like another go? (y/n): If you answered No to trying a different number of pools, or if you didn't want the program to do pooling at all, then you will be asked if you want to start the program again. Answering No to this question will exit.

Command-line usage

Le seul obligatoire argument (if not running interactively) is a filename for the primers file. This should be a text file in multiple-sequence FASTA format, such as:(this example does not represent real primers). Degenerate bases are allowed using the normal letters, and both upper and lower case is allowed. Names of amplicons' primers should end with F or R, and otherwise match. Optionally include tags (tails, barcoding) to apply to all primers: >tagF and >tagR (tags can also be changed part-way through the file).

Processing options should be placed before this filename. Options are as follows: --help or /help or /? Show a brief help message and exit. --counts Show score or deltaG-range pair counts for the whole input. deltaG will be used if the --dg option is set (see below). This option produces a fast summary of how many primer pairs (in the entire collection, before pooling) have what range of interaction strengths. This could be used for example to check a pool that you have already chosen manually, or if you want a rough idea of the worst-case scenario that pooling aims to avoid. --self-omit Causes the --counts option to avoid counting self-interactions(a primer interacting with itself), and interactions between the pair of primers in any given set. --print-bonds=THRESHOLD Similar to --counts , this can be useful for checking a manual selection or for a rough idea. All interactions worse than the given threshold (deltaG if --dg is in use, otherwise score) will be written to standard output, with bonds diagrams. --dg[= temperature[, mg[, cation[, dNTP]]]] Set this option to use deltaG instead of score. Optional parameters are the temperature (default is human blood heat), the concentration of magnesium (default 0), the concentration of monovalent cation (e.g. sodium, default 50), and the concentration of deoxynucleotide (dNTP, default 0). Decimal fractions are allowed in all of these. Temperature is specified in kelvin, and all concentrations are specified in nanomoles per cubic metre. --suggest-pools Outputs a suggested number of pools. This is the approximate lowest number of pools needed to achieve no worse than a deltaG of -7 (or a score of 7) in each. --pools[= NUM[, MINS[, PREFIX]]] Splits the primers into pools. Optional parameters are the number of pools (if omitted or set to ? then the suggested number will be calculated and used), a time limit in minutes, and a prefix for the filenames of each pool (set this to - to write all to standard output). --max-count=NUM Set the maximum number of pairs per pool. This is optional but can make the pools more even. A maximum lower than the average is not allowed, and it's usually best to allow a generous margin above the average. --genome=PATH Check the amplicons for overlaps in the genome, and avoid these overlaps during pooling. The genome file may be in .2bit format as supplied by UCSC, or in .fa (FASTA) format. --scan-variants When searching for amplicons in a genome file, scan variant sequences in that file too, i.e. sequences with _ and - in their names. By default such sequences are omitted as they're not normally needed if using hg38. --amp-max=LENGTH Sets maximum amplicon length for the overlap check. The default is 220. --multiplx=FILE Write a MultiPLX input file after the --genome stage, to assist comparisons with MultiPLX's pooling etc. --seedless Don't seed the random number generator --version Just show the program version number and exit.

Changements

Defects fixed

  1. an error in incremental-update logic sometimes had the effect of generating suboptimal solutions (in particular, pools could be unnecessarily empty, and/or full beyond any limit that was set)
  2. an error in the user-interface loop meant that if you use tags, run interactively, and answer "yes" to the question "Do you want to try a different number of pools", the seconde run will have been done without the tags, and its results will have been de-tagged à deux reprises, removing some bases from the output moreover, the resulting truncated versions of your primers will have made it into the interaction calculations for any third run.

Versions prior to 1.17 also had a display bug: the concentrations for the deltaG calculation are in millimoles per litre, not nanomoles as stated on-screen in interactive mode (please ignore the on-screen instruction and enter millimoles, or upgrade to the latest version which fixes that instruction).

Versions prior to 1.34 would round down any decimal fraction you type when in interactive mode (for deltaG temperature, concentration and threshold settings). Internal calculation and command-line use was not affected by this bug.

Versions prior to 1.37 did not ignore whitespace characters after FASTA labels and the label) -->.

Notable additions

Version 1.2 added the MultiPLX output option, and Version 1.33 fixed a bug when MultiPLX output was used with tags and multiple chromosomes. Version 1.3 added genome reading from FASTA (not just 2bit), auto-open browser, and suggest number of pools.

Version 1.36 clarified the use of Taq probes, and allowed these to be in the input file during the overlap check. It's consequently stricter about the requirement that reverse primers must end with R or B : previous versions would accept any letter other than F for these.

Version 1.4 allows tags to be changed part-way through a FASTA file. For example, if there are two >tagF sequences, the first >tagF will set the tags for all F primers between the beginning of the file and the point at which the second >tagF is given the second >tagF will set the tags for all F primers from that point forward. You can change tags as often as you like.

Version 1.5 allows primer sets to be "fixed" to predetermined pools by specifying these as primer name prefixes , e.g. [email protected]:myPrimer-F fixes myPrimer-F to pool 2.

Version 1.6 detects and warns about alternative products of non-unique PCR. It was followed within hours by Version 1.61 which fixed a regression in the amplicon overlap check.

Version 1.7 makes the ignoring of variant sequences in the genome optional, and warns if primers not being found might be due to variant sequences having been ignored.


Voir la vidéo: Primer Design for PCR (Août 2022).