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8.3 : Préparation des échantillons - Biologie

8.3 : Préparation des échantillons - Biologie


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Préparez vos échantillons pour l'électrophorèse pendant que le gel durcit en ajoutant un tampon de charge concentré. Le tampon de chargement contient également du glycérol, ce qui rend l'échantillon suffisamment dense pour couler au fond du puits d'échantillon.

Ajouter 4 L de tampon de chargement 6X directement à chacune des 20 réactions de PCR L du dernier laboratoire. Brièvement, centrifuger chaque tube pour mélanger le colorant et les échantillons, si nécessaire. Vous utiliserez la moitié de chaque échantillon dans vos gels. Conservez l'échantillon restant au réfrigérateur.


8.3 : Préparation des échantillons - Biologie

Principe de la PAGE native :

La PAGE native utilise les mêmes fronts discontinus d'ions chlorure et glycine que la SDS-PAGE pour former des frontières mobiles qui empilent puis séparent les polypeptides par rapport charge/masse. Les protéines sont préparées dans un tampon d'échantillon non réducteur et non dénaturant, qui maintient la structure secondaire des protéines et la densité de charge native. Par conséquent, vous pouvez facilement voir plusieurs bandes à partir du camshot de votre gel PAGE natif si votre protéine cible a des formes polymérisées dans votre échantillon. En électrophorèse PAGE native, la plupart des protéines ont un pl acide ou légèrement basique (point isoélectrique) (

3-8) et migrent vers la polaire négative. Si le pl de votre protéine est supérieur à 8,9, par exemple, vous devriez probablement inverser l'anode et exécuter le gel PAGE natif.

En savoir plus sur Native-PAGE :

  • Pour le système d'électrophorèse, un système bio-rad est recommandé.
  • Pour un gel d'empilement PAGE natif de 5 ml

* : Ajouté juste avant chaque utilisation.

Pour un gel séparateur PAGE natif de 10 ml :

Pourcentage d'acyamide 6% 8% 10% 12% 15%
Acrylamide/Bis-acrylamide (30 %/0,8 % p/v) 2 ml 2,6 ml 3,4 ml 4 ml 5 ml
0,375M Tris-HCl (pH = 8,8) 7,89 ml 7,29 ml 6,49 ml 5,89 ml 4,89 ml
*10 % (p/v) de persulfate d'ammonium (PA) 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl
*TEMED 10μl 10μl 10μl 10μl 10μl

* : Ajouté juste avant chaque utilisation.

Tampon d'échantillon (2x) :

Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,8
25% de glycérol Glycérol
1% de bleu de bromophénol

25 mM Tris
192 mM de glycine

Remarque : le tampon d'exécution doit être

pH 8,3. Ne pas ajuster le pH.

Protocole de course au gel :

1. Préparez une quantité appropriée de gel de séparation dans un petit bécher, puis ajoutez un volume spécifique. de AP et TEMED et agiter doucement le bécher pour assurer un mélange suffisant. Pipeter la solution de gel dans l'espace entre les plaques de verre du moulage de gel (ne pas remplir complètement). Remplissez l'espace de repos avec de l'eau (alternativement de l'isopropanol). Attendre 20-30min pour une gélification complète.

2. Vous pouvez préparer la solution de gel d'empilement pendant que le gel de séparation gélifie. Préparer la quantité appropriée de gel d'empilement dans un bécher et mélanger avec 10% AP et 1% TEMED. Versez l'eau dans la première étape et pipetez la solution de gel d'empilement dans l'espace et insérez le peigne. Attendre 20-30min pour le laisser gélifier.

3. Mélangez votre échantillon avec le tampon d'échantillon. Ne chauffez pas votre échantillon !

4. Chargez le mélange d'échantillons et réglez une tension appropriée pour exécuter l'électrophorèse.

Remarque : Il est préférable de mettre le système sur de la glace et de ne pas régler une tension relativement élevée au cas où les protéines se dégraderaient.

5. Colorez comme vous le feriez avec un protocole standard au bleu de Coomassie ou procédez à une procédure d'immuno-empreinte (western-blot).


8.3 : Préparation des échantillons - Biologie

PAGE-SDS Protocole Laemmli


% Acrylamide 10% 10% 12% 12% 15%
Nombre de minigels 5 8 5 8 5
1,5M TrisHCl pH 8,3 + 0,4% SDS 7,0 ml 10,5 ml 7,0 ml 10,5 ml 7,0 ml
30% Acrylamide 0,8% Méthylène bis Acrylamide 9,3 ml 13,9 ml 11,3 ml 16,9 ml 13,9 ml
H 2 O 12,3 ml 18,4 ml 9,3 ml 13,9 ml 6,3 ml
10 % de l'APS 100 ul 150 ul 100 ul 150 ul 100 ul
TEMED 23 ul 35 ul 23 ul 35 ul 23 ul

% Acrylamide 10% 10% 12% 12% 15%
Nombre de minigels 5 8 5 8 5
1,5M TrisHCl pH 8,3 + 0,4% SDS 7,0 ml 10,5 ml 7,0 ml 10,5 ml 7,0 ml
40% Acrylamide / Méthylène bis Acrylamide (ratio : 37,5:1) 7,2 ml 10,8 ml 8,6 ml 12,9 ml 10,8 ml
H 2 O 14,4 ml 21,5 ml 12 ml 17,9 ml 9,4 ml
10 % de l'APS 100 ul 150 ul 100 ul 150 ul 100 ul
TEMED 23 ul 35 ul 23 ul 35 ul 23 ul

Ajoutez TEMED et APS à la fin. Agiter doucement le ballon pour mélanger, en veillant à ne pas générer de bulles. Pipeter la solution à un niveau de 4 cm du haut. Ajouter 0,3 ml de n-buthanol. Une interface liquide très nette sera visible dans les 10 à 20 minutes. Laisser polymériser le gel encore une heure au moins. Rincer la surface du gel à l'eau avant de verser le gel d'empilement.

Gel d'empilage

Nombre de minigels 2 5 8
Nombre de minigels 2 5 8
0,5M TrisHCl pH 6,8+ 0,4% SDS 2,5 ml 4,0 ml 5,2 ml 0,5M TrisHCl pH 6,8+ 0,4% SDS 2,5 ml 4,0 ml 5,2 ml
30 % Acrylamide 0,8% Méthylène bis Acrylamide 1,0 ml 1,5 ml 2,0 ml 40 % Acrylamide / Méthylène bis Acrylamide (ratio : 37,5:1) 0,75 ml 1,1 ml 1,4 ml
H 2 O 6,4 ml 9,6 ml 12,8 ml H 2 O 6,6 ml 10 ml 13,4 ml
10 % de l'APS 100 ul 150 ul 200 ul 10 % de l'APS 100 ul 150 ul 200 ul
TEMED 10 ul 15 ul 20 ul TEMED 10 ul 15 ul 20 ul

Remplissez chaque sandwich de solution de gel empilable et insérez un peigne à chaque endroit en prenant soin de ne pas piéger de bulles sous les dents. Le gel doit être complètement polymérisé après 1 heure. Couvrir le gel avec une pellicule de nylon. Conserver les gels pas plus de 2 semaines à 4°C.

Avant d'ajouter le tampon d'échantillon, gardez les échantillons à 0°C. Ajouter le tampon d'échantillon SDS (RT) à l'échantillon (toujours sur de la glace) et faire bouillir à 100°C immédiatement 3 à 5 min. NE PAS laisser l'échantillon dans le tampon d'échantillon SDS sans chauffer. Les protéases endogènes sont très actives dans le tampon d'échantillon SDS et peuvent provoquer une grave dégradation. Une fois chauffé, l'échantillon peut rester à température ambiante pendant une courte période jusqu'au chargement, ou à -20 °C pendant une longue période.
Pour une épaisseur de gel de 0,75 mm et 15 puits, appliquez 10 à 25 µg de protéine d'un mélange complexe, lors de la coloration au bleu de Coomasie et 0,5 à 5 µg pour les échantillons d'une ou de quelques protéines. Si le colorant à l'argent est utilisé, 10 à 100 fois moins de protéines peuvent être utilisées.
Les échantillons peuvent être concentrés ou les interférences (sels, etc.) éliminées avec du TCA, de l'acétone, du TCA-DOC, de l'éthanol, etc. (voir Protocole ci-joint). Les ions potassium en particulier doivent être éliminés car ils précipitent le SDS.
Certaines protéines, telles que les protéines nucléaires non histones et les protéines membranaires, nécessitent la présence d'urée 8M dans le tampon d'échantillon SDS pour obtenir une solubilisation complète.
Certaines protéines liées à la membrane subissent une agrégation à des températures supérieures à 40-50 °C. Dans ce cas incuber 30min à 40 °C avec tampon d'échantillon.
Un changement dans les distances de migration des protéines
avec ponts disulfure internes pourraient être observés en incubant des échantillons dans du SDS en présence ou en l'absence d'agents réducteurs (mercaptoéthanol, DTT, DTE, etc.)


Contenu

Préparation de la bibliothèque Modifier

Les étapes générales pour préparer une bibliothèque d'ADN complémentaire (ADNc) pour le séquençage sont décrites ci-dessous, mais varient souvent d'une plateforme à l'autre. [8] [3] [9]

  1. Isolement de l'ARN :L'ARN est isolé du tissu et mélangé à de la désoxyribonucléase (DNase). La DNase réduit la quantité d'ADN génomique. La quantité de dégradation de l'ARN est vérifiée par électrophorèse sur gel et capillaire et est utilisée pour attribuer un numéro d'intégrité de l'ARN à l'échantillon. Cette qualité d'ARN et la quantité totale d'ARN de départ sont prises en compte lors des étapes ultérieures de préparation, de séquençage et d'analyse de la bibliothèque.
  1. Sélection/déplétion d'ARN : Pour analyser les signaux d'intérêt, l'ARN isolé peut être soit conservé tel quel, filtré pour l'ARN avec des queues polyadénylées en 3' (poly (A)) pour inclure uniquement l'ARNm, appauvri en ARN ribosomique (ARNr) et/ou filtré pour l'ARN qui lie des séquences spécifiques (Méthodes de sélection et de déplétion d'ARN tableau ci-dessous). L'ARN avec des queues poly(A) 3' est principalement composé de séquences codantes matures, traitées. La sélection poly(A) est effectuée en mélangeant de l'ARN avec des oligomères poly(T) attachés de manière covalente à un substrat, généralement des billes magnétiques. [10][11] La sélection Poly(A) a des limitations importantes dans la détection des biotypes d'ARN. De nombreux biotypes d'ARN ne sont pas polyadénylés, y compris de nombreux transcrits d'ARN non codants et de protéines à noyau d'histone, ou sont régulés par la longueur de leur queue poly(A) (par exemple, les cytokines) et peuvent donc ne pas être détectés après la sélection poly(A). [12] De plus, la sélection poly(A) peut augmenter le biais 3', en particulier avec un ARN de qualité inférieure. [13][14] Ces limitations peuvent être évitées avec l'épuisement ribosomique, en éliminant l'ARNr qui représente généralement plus de 90 % de l'ARN dans une cellule. Les étapes d'enrichissement en poly(A) et d'épuisement ribosomique demandent beaucoup de travail et pourraient introduire des biais, des approches plus simples ont donc été développées pour omettre ces étapes. [15] Les petites cibles d'ARN, telles que le miARN, peuvent être davantage isolées par sélection de taille avec des gels d'exclusion, des billes magnétiques ou des kits commerciaux.
  1. Synthèse d'ADNc : L'ARN est transcrit à l'envers en ADNc parce que l'ADN est plus stable et pour permettre l'amplification (qui utilise des ADN polymérases) et tirer parti d'une technologie de séquençage d'ADN plus mature. L'amplification consécutive à la transcription inverse entraîne une perte de brin, qui peut être évitée grâce au marquage chimique ou au séquençage d'une seule molécule. La fragmentation et la sélection de la taille sont effectuées pour purifier les séquences qui ont la longueur appropriée pour la machine de séquençage. L'ARN, l'ADNc ou les deux sont fragmentés avec des enzymes, une sonication ou des nébuliseurs. La fragmentation de l'ARN réduit le biais 5' de la transcription inverse amorcée au hasard et l'influence des sites de liaison des amorces, [11] avec l'inconvénient que les extrémités 5' et 3' sont converties en ADN moins efficacement. La fragmentation est suivie d'une sélection de taille, où soit de petites séquences sont supprimées, soit une gamme étroite de longueurs de séquence est sélectionnée. Parce que les petits ARN comme les miARN sont perdus, ceux-ci sont analysés indépendamment. L'ADNc de chaque expérience peut être indexé avec un code-barres hexamère ou octamère, de sorte que ces expériences puissent être regroupées en une seule voie pour un séquençage multiplexé.

Séquençage d'ADN complémentaire (cDNA-Seq) Modifier

La bibliothèque d'ADNc dérivée de biotypes d'ARN est ensuite séquencée dans un format lisible par ordinateur. Il existe de nombreuses technologies de séquençage à haut débit pour le séquençage d'ADNc, notamment des plates-formes développées par Illumina, Thermo Fisher, BGI/MGI, PacBio et Oxford Nanopore Technologies. [16] Pour le séquençage à lecture courte d'Illumina, une technologie courante pour le séquençage de l'ADNc, les adaptateurs sont liés à l'ADNc, l'ADN est attaché à une cellule d'écoulement, les clusters sont générés par des cycles d'amplification de pont et de dénaturation, et la séquence par synthèse est réalisée dans des cycles de synthèse de brins complémentaires et d'excitation laser de bases avec des terminateurs réversibles. Le choix et les paramètres de la plate-forme de séquençage sont guidés par la conception expérimentale et le coût. Les considérations courantes relatives à la conception expérimentale incluent le choix de la longueur du séquençage, de la profondeur du séquençage, de l'utilisation d'un séquençage simple ou apparié, du nombre de répétitions, du multiplexage, de la randomisation et des pointes. [17]

Séquençage du petit ARN/ARN non codant Modifier

Lors du séquençage d'ARN autre que l'ARNm, la préparation de la banque est modifiée. L'ARN cellulaire est sélectionné en fonction de la plage de tailles souhaitée. Pour les petites cibles d'ARN, telles que le miARN, l'ARN est isolé par sélection de taille. Cela peut être effectué avec un gel d'exclusion stérique, par des billes magnétiques de sélection de taille ou avec un kit développé commercialement. Une fois isolés, les linkers sont ajoutés aux extrémités 3' et 5' puis purifiés. La dernière étape est la génération d'ADNc par transcription inverse.

Séquençage direct d'ARN Modifier

Comme il a été démontré que la conversion de l'ARN en ADNc, la ligature, l'amplification et d'autres manipulations d'échantillons introduisent des biais et des artefacts pouvant interférer à la fois avec la caractérisation et la quantification appropriées des transcrits, [18] le séquençage direct d'ARN à molécule unique a été exploré par des sociétés comme Helicos (faillite), Oxford Nanopore Technologies, [19] et autres. Cette technologie séquence les molécules d'ARN directement de manière massivement parallèle.

Séquençage d'ARN en temps réel d'une molécule unique Modifier

L'ARN-Seq direct à molécule unique massivement parallèle a été exploré comme alternative à l'ARN-Seq traditionnel, dans lequel la conversion d'ARN en ADNc, la ligature, l'amplification et d'autres étapes de manipulation d'échantillons peuvent introduire des biais et des artefacts. [20] Les plates-formes technologiques qui exécutent l'ARN-Seq en temps réel d'une molécule unique comprennent le séquençage Nanopore d'Oxford Nanopore Technologies (ONT), [19] PacBio IsoSeq et Helicos (faillite). Le séquençage de l'ARN sous sa forme native préserve les modifications telles que la méthylation, ce qui permet de les étudier directement et simultanément. [19] Un autre avantage de l'ARN-Seq à molécule unique est que les transcrits peuvent être couverts sur toute la longueur, ce qui permet une détection et une quantification des isoformes plus fiables que le séquençage à lecture courte. Traditionnellement, les méthodes RNA-Seq à molécule unique ont des taux d'erreur plus élevés que le séquençage à lecture courte, mais les méthodes plus récentes comme ONT direct RNA-Seq limitent les erreurs en évitant la fragmentation et la conversion d'ADNc. Les utilisations récentes de l'ARN-Seq direct ONT pour l'expression différentielle dans les populations de cellules humaines ont démontré que cette technologie peut surmonter de nombreuses limitations du séquençage court et long de l'ADNc. [21]

Séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-Seq) Modifier

Les méthodes standard telles que les puces à ADN et l'analyse standard de l'ARN-Seq en vrac analysent l'expression des ARN de grandes populations de cellules. Dans les populations de cellules mixtes, ces mesures peuvent masquer des différences critiques entre les cellules individuelles au sein de ces populations. [22] [23]

Le séquençage de l'ARN unicellulaire (scRNA-Seq) fournit les profils d'expression des cellules individuelles. Bien qu'il ne soit pas possible d'obtenir des informations complètes sur chaque ARN exprimé par chaque cellule, en raison de la petite quantité de matériel disponible, les modèles d'expression génique peuvent être identifiés par des analyses de regroupement de gènes. Cela peut révéler l'existence de types cellulaires rares au sein d'une population cellulaire qui n'ont peut-être jamais été vus auparavant. Par exemple, de rares cellules spécialisées dans le poumon appelées ionocytes pulmonaires qui expriment le régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose ont été identifiées en 2018 par deux groupes réalisant des scRNA-Seq sur l'épithélium des voies respiratoires pulmonaires. [24] [25]

Procédures expérimentales Modifier

Les protocoles scRNA-Seq actuels impliquent les étapes suivantes : isolement de cellule unique et d'ARN, transcription inverse (RT), amplification, génération de bibliothèque et séquençage. Les cellules individuelles sont soit séparées mécaniquement dans des micropuits (par exemple, BD Rhapsody, Takara ICELL8, Vycap Puncher Platform ou CellMicrosystems CellRaft) soit encapsulées dans des gouttelettes (par exemple, 10x Genomics Chromium, Illumina Bio-Rad ddSEQ, 1CellBio InDrop, Dolomite Bio Nadia). [26] Les cellules individuelles sont étiquetées en ajoutant des billes avec des oligonucléotides à code-barres. Les cellules et les billes sont fournies en quantités limitées, de sorte que la co-occupation avec plusieurs cellules et billes est un événement très rare. Une fois la transcription inverse terminée, les ADNc de nombreuses cellules peuvent être mélangés pour le séquençage. Les transcriptions d'une cellule particulière sont identifiées par le code-barres unique de chaque cellule. [27] [28] L'identifiant moléculaire unique (UMI) peut être attaché aux séquences cibles d'ARNm/ADNc pour aider à identifier les artefacts pendant la préparation de la bibliothèque. [29]

Les défis pour scRNA-Seq comprennent la préservation de l'abondance relative initiale de l'ARNm dans une cellule et l'identification de transcrits rares. [30] L'étape de transcription inverse est critique car l'efficacité de la réaction RT détermine combien de la population d'ARN de la cellule sera finalement analysée par le séquenceur. La processivité des transcriptases inverses et les stratégies d'amorçage utilisées peuvent affecter la production d'ADNc pleine longueur et la génération de bibliothèques biaisées vers l'extrémité 3' ou 5' des gènes.

Dans l'étape d'amplification, la PCR ou la transcription in vitro (IVT) est actuellement utilisée pour amplifier l'ADNc. L'un des avantages des méthodes basées sur la PCR est la capacité de générer un ADNc complet. Cependant, une efficacité PCR différente sur des séquences particulières (par exemple, le contenu GC et la structure de snapback) peut également être amplifiée de manière exponentielle, produisant des bibliothèques avec une couverture inégale. D'autre part, alors que les bibliothèques générées par IVT peuvent éviter le biais de séquence induit par PCR, des séquences spécifiques peuvent être transcrites de manière inefficace, provoquant ainsi un abandon de séquence ou générant des séquences incomplètes. [31] [22] Plusieurs protocoles scRNA-Seq ont été publiés : Tang et al., [32] STRT, [33] SMART-seq, [34] CEL-seq, [35] RAGE-seq, [36] Quartz -seq [37] et C1-CAGE. [38] Ces protocoles diffèrent en termes de stratégies de transcription inverse, de synthèse et d'amplification d'ADNc, et de possibilité d'accueillir des codes-barres spécifiques à une séquence (c'est-à-dire des UMI) ou la capacité de traiter des échantillons regroupés. [39]

En 2017, deux approches ont été introduites pour mesurer simultanément l'expression de l'ARNm et des protéines unicellulaires par le biais d'anticorps marqués par des oligonucléotides connus sous le nom de REAP-seq, [40] et CITE-seq. [41]

Applications Modifier

scRNA-Seq est de plus en plus utilisé dans les disciplines biologiques, y compris le développement, la neurologie, [42] l'oncologie, [43] [44] [45] les maladies auto-immunes, [46] et les maladies infectieuses. [47]

scRNA-Seq a fourni des informations considérables sur le développement des embryons et des organismes, y compris le ver Caenorhabditis elegans, [48] et la planaire régénérative Schmidtea mediterranea. [49] [50] Les premiers animaux vertébrés à être cartographiés de cette manière étaient le poisson zèbre [51] [52] et Xénope laevis. [53] Dans chaque cas, plusieurs stades de l'embryon ont été étudiés, permettant de cartographier l'ensemble du processus de développement cellule par cellule. [8] La science a reconnu ces avancées comme la percée de l'année 2018. [54]

Considérations expérimentales Modifier

Une variété de paramètres sont pris en compte lors de la conception et de la réalisation d'expériences RNA-Seq :

  • Spécificité tissulaire : L'expression des gènes varie à l'intérieur et entre les tissus, et RNA-Seq mesure ce mélange de types cellulaires. Cela peut rendre difficile l'isolement du mécanisme biologique d'intérêt. Le séquençage à cellule unique peut être utilisé pour étudier chaque cellule individuellement, atténuant ce problème.
  • Dépendance temporelle : L'expression des gènes change au fil du temps et RNA-Seq ne prend qu'un instantané. Des expériences de cours dans le temps peuvent être effectuées pour observer les changements dans le transcriptome.
  • Couverture (également appelée profondeur) : L'ARN héberge les mêmes mutations que celles observées dans l'ADN, et la détection nécessite une couverture plus approfondie. Avec une couverture suffisamment élevée, RNA-Seq peut être utilisé pour estimer l'expression de chaque allèle. Cela peut donner un aperçu de phénomènes tels que l'impression ou les effets cis-régulateurs. La profondeur de séquençage requise pour des applications spécifiques peut être extrapolée à partir d'une expérience pilote. [55]
  • Artefacts de génération de données (également appelés variance technique) : Les réactifs (par exemple, kit de préparation de bibliothèque), le personnel impliqué et le type de séquenceur (par exemple, Illumina, Pacific Biosciences) peuvent entraîner des artefacts techniques qui pourraient être mal interprétés comme des résultats significatifs. Comme pour toute expérience scientifique, il est prudent de mener RNA-Seq dans un cadre bien contrôlé. Si cela n'est pas possible ou si l'étude est une méta-analyse, une autre solution consiste à détecter les artefacts techniques en inférant des variables latentes (généralement une analyse en composantes principales ou une analyse factorielle) et en corrigeant par la suite ces variables. [56]
  • Gestion de données: Une seule expérience RNA-Seq chez l'homme est généralement de 1 à 5 Gb (compressé), ou plus en incluant des fichiers intermédiaires. [57] Ce grand volume de données peut poser des problèmes de stockage. Une solution consiste à compresser les données à l'aide de schémas informatiques polyvalents (par exemple, gzip) ou de schémas spécifiques à la génomique. Ces dernières peuvent être basées sur des séquences de référence ou de novo. Une autre solution consiste à effectuer des expériences de microréseau, ce qui peut être suffisant pour un travail basé sur des hypothèses ou des études de réplication (par opposition à la recherche exploratoire).

Assemblage du transcriptome Modifier

Deux méthodes sont utilisées pour attribuer des lectures de séquences brutes aux caractéristiques génomiques (c'est-à-dire assembler le transcriptome) :

  • De novo : Cette approche ne nécessite pas de génome de référence pour reconstruire le transcriptome, et est généralement utilisée si le génome est inconnu, incomplet ou substantiellement altéré par rapport à la référence. [58] Les défis lors de l'utilisation de lectures courtes pour l'assemblage de novo incluent 1) déterminer quelles lectures doivent être jointes en séquences contiguës (contigs), 2) robustesse aux erreurs de séquençage et autres artefacts, et 3) efficacité de calcul. L'algorithme principal utilisé pour l'assemblage de novo est passé des graphiques de chevauchement, qui identifient tous les chevauchements par paires entre les lectures, aux graphiques de de Bruijn, qui divisent les lectures en séquences de longueur k et regroupent tous les k-mers dans une table de hachage. [59] Les graphiques de chevauchement ont été utilisés avec le séquençage de Sanger, mais ne s'adaptent pas bien aux millions de lectures générées avec RNA-Seq. Des exemples d'assembleurs qui utilisent les graphes de Bruijn sont Trinity, [58] Oases [60] (dérivé de l'assembleur de génome Velvet[61] ), Bridger, [62] et rnaSPAdes. [63] Le séquençage apparié et à lecture longue du même échantillon peut atténuer les déficits du séquençage à lecture courte en servant de modèle ou de squelette. Les mesures permettant d'évaluer la qualité d'un assemblage de novo comprennent la longueur médiane des contigs, le nombre de contigs et N50. [64]
  • Génome guidé : Cette approche repose sur les mêmes méthodes que celles utilisées pour l'alignement de l'ADN, avec la complexité supplémentaire des lectures d'alignement qui couvrent les parties non continues du génome de référence. [65] Ces lectures non continues sont le résultat du séquençage de transcriptions épissées (voir figure). En règle générale, les algorithmes d'alignement comportent deux étapes : 1) aligner de courtes portions de la lecture (c'est-à-dire ensemencer le génome) et 2) utiliser la programmation dynamique pour trouver un alignement optimal, parfois en combinaison avec des annotations connues. Les outils logiciels qui utilisent l'alignement guidé par le génome incluent Bowtie, [66] TopHat (qui s'appuie sur les résultats de BowTie pour aligner les jonctions d'épissage), [67][68] Subread, [69] STAR, [65] HISAT2, [70] et GMAP . [71] La sortie des outils d'alignement (cartographie) guidé par le génome peut être davantage utilisée par des outils tels que Cufflinks [68] ou StringTie [72] pour reconstruire des séquences de transcription contiguës (c'est à dire., un fichier FASTA). La qualité d'un assemblage guidé par le génome peut être mesurée à la fois avec 1) des mesures d'assemblage de novo (par exemple, N50) et 2) des comparaisons avec des séquences connues de transcrits, de jonctions d'épissage, de génome et de protéines en utilisant la précision, le rappel, ou leur combinaison (par exemple, le score F1). [64] De plus, in silico l'évaluation pourrait être effectuée à l'aide de lectures simulées. [73][74]

Une note sur la qualité de l'assemblage : Le consensus actuel est que 1) la qualité de l'assemblage peut varier en fonction de la métrique utilisée, 2) les outils d'assemblage qui ont obtenu de bons résultats dans une espèce ne fonctionnent pas nécessairement bien dans les autres espèces, et 3) la combinaison de différentes approches pourrait être la plus fiable. [75] [76] [77]

Quantification de l'expression génique Modifier

L'expression est quantifiée pour étudier les changements cellulaires en réponse à des stimuli externes, les différences entre les états sains et malades et d'autres questions de recherche. Les niveaux de transcription sont souvent utilisés comme indicateur de l'abondance des protéines, mais ils ne sont souvent pas équivalents en raison d'événements post-transcriptionnels tels que l'interférence ARN et la désintégration induite par un non-sens. [78]

L'expression est quantifiée en comptant le nombre de lectures mappées à chaque locus dans l'étape d'assemblage du transcriptome. L'expression peut être quantifiée pour les exons ou les gènes en utilisant des contigs ou des annotations de transcription de référence. [8] Ces comptes de lecture d'ARN-Seq observés ont été solidement validés par rapport à des technologies plus anciennes, y compris les microarrays d'expression et la qPCR. [55] [79] Les outils qui quantifient les comptes sont HTSeq, [80] FeatureCounts, [81] Rcount, [82] maxcounts, [83] FIXSEQ, [84] et Cuffquant. Ces outils déterminent les comptes de lecture à partir de données RNA-Seq alignées, mais des comptes sans alignement peuvent également être obtenus avec Sailfish [85] et Kallisto. [86] Les comptes de lecture sont ensuite convertis en mesures appropriées pour les tests d'hypothèse, les régressions et d'autres analyses. Les paramètres de cette conversion sont :

  • Profondeur/couverture de séquençage : Bien que la profondeur soit pré-spécifiée lors de la conduite de plusieurs expériences RNA-Seq, elle variera encore considérablement entre les expériences. [87] Par conséquent, le nombre total de lectures générées dans une seule expérience est généralement normalisé en convertissant les comptes en fragments, lectures ou comptes par million de lectures mappées (FPM, RPM ou CPM). La différence entre RPM et FPM a été historiquement dérivée au cours de l'évolution du séquençage à une seule extrémité de fragments au séquençage à deux extrémités. Dans le séquençage à une seule extrémité, il n'y a qu'une seule lecture par fragment (c'est à dire., tr/min = pi/min). Dans le séquençage apparié, il y a deux lectures par fragment (c'est à dire., tr/min = 2 x pi/min). La profondeur de séquençage est parfois appelée taille de la bibliothèque, le nombre de molécules d'ADNc intermédiaires dans l'expérience.
  • Longueur des gènes : Les gènes plus longs auront plus de fragments/lectures/comptes que les gènes plus courts si l'expression du transcrit est la même. Ceci est ajusté en divisant le FPM par la longueur d'une caractéristique (qui peut être un gène, un transcrit ou un exon), ce qui donne les fragments métriques par kilobase de caractéristique par million de lectures cartographiées (FPKM). [88] Lorsque l'on examine des groupes de caractéristiques à travers des échantillons, le FPKM est converti en transcriptions par million (TPM) en divisant chaque FPKM par la somme des FPKM dans un échantillon. [89][90][91]
  • Sortie totale d'ARN d'échantillon : Parce que la même quantité d'ARN est extraite de chaque échantillon, les échantillons avec plus d'ARN total auront moins d'ARN par gène. Ces gènes semblent avoir une expression réduite, ce qui entraîne des faux positifs dans les analyses en aval. [87] Les stratégies de normalisation comprenant quantile, DESeq2, TMM et Median Ratio tentent de tenir compte de cette différence en comparant un ensemble de gènes exprimés de manière non différentielle entre les échantillons et en les mettant à l'échelle en conséquence. [92]
  • Variance pour l'expression de chaque gène : est modélisé pour tenir compte de l'erreur d'échantillonnage (important pour les gènes avec un faible nombre de lectures), augmenter la puissance et diminuer les faux positifs. La variance peut être estimée comme une distribution binomiale normale, de Poisson ou négative [93][94][95] et est fréquemment décomposée en variance technique et biologique.

Spike-ins pour la quantification absolue et la détection des effets à l'échelle du génome Modifier

Les pics d'ARN sont des échantillons d'ARN à des concentrations connues qui peuvent être utilisés comme étalons-or dans la conception expérimentale et pendant les analyses en aval pour la quantification absolue et la détection des effets à l'échelle du génome.

  • Quantification absolue : La quantification absolue de l'expression génique n'est pas possible avec la plupart des expériences RNA-Seq, qui quantifient l'expression par rapport à tous les transcrits. C'est possible en effectuant des RNA-Seq avec des spikes, des échantillons d'ARN à des concentrations connues. Après le séquençage, les comptes de lecture des séquences de pointe sont utilisés pour déterminer la relation entre les comptes de lecture de chaque gène et les quantités absolues de fragments biologiques [11][96] Dans un exemple, cette technique a été utilisée dans Xenopus tropicalis embryons pour déterminer la cinétique de transcription. [97]
  • Détection des effets à l'échelle du génome : Les changements dans les régulateurs globaux, y compris les remodeleurs de la chromatine, les facteurs de transcription (par exemple, MYC), les complexes d'acétyltransférase et le positionnement des nucléosomes ne sont pas conformes aux hypothèses de normalisation et les contrôles de pointe peuvent offrir une interprétation précise. [98][99]

Expression différentielle Modifier

L'utilisation la plus simple mais souvent la plus puissante de RNA-Seq consiste à trouver des différences dans l'expression des gènes entre deux ou plusieurs conditions (par exemple., traité vs non traité) ce processus est appelé expression différentielle. Les sorties sont souvent appelées gènes différentiellement exprimés (DEG) et ces gènes peuvent être régulés à la hausse ou à la baisse (c'est à dire., supérieur ou inférieur dans la condition d'intérêt). Il existe de nombreux outils qui effectuent une expression différentielle. La plupart sont exécutés en R, Python ou la ligne de commande Unix. Les outils couramment utilisés incluent DESeq, [94] edgeR, [95] et voom+limma, [93] [100] qui sont tous disponibles via R/Bioconductor. [101] [102] Voici les considérations courantes lors de l'exécution d'une expression différentielle :

  • Contributions: Les entrées d'expression différentielle comprennent (1) une matrice d'expression ARN-Seq (M gènes x N échantillons) et (2) une matrice de conception contenant des conditions expérimentales pour N échantillons. La matrice de conception la plus simple contient une colonne, correspondant aux étiquettes de la condition testée. D'autres covariables (également appelées facteurs, caractéristiques, étiquettes ou paramètres) peuvent inclure des effets de lot, des artefacts connus et toutes les métadonnées qui pourraient confondre ou médier l'expression des gènes. En plus des covariables connues, des covariables inconnues peuvent également être estimées grâce à des approches d'apprentissage automatique non supervisées, notamment des analyses en composante principale, variable de substitution, [103] et PEER [56]. Les analyses de variables cachées sont souvent utilisées pour les données d'ARN-Seq de tissus humains, qui comportent généralement des artefacts supplémentaires non capturés dans les métadonnées (par exemple., temps ischémique, approvisionnement auprès de plusieurs institutions, traits cliniques sous-jacents, collecte de données sur de nombreuses années avec de nombreux membres du personnel).
  • Méthodes : La plupart des outils utilisent des statistiques de régression ou non paramétriques pour identifier les gènes exprimés de manière différentielle, et sont basés soit sur des nombres de lectures mappés sur un génome de référence (DESeq2, limma, edgeR) soit sur des nombres de lectures dérivés d'une quantification sans alignement (détective, [104 ] Cuffdiff, [105] Ballgown [106] ). [107] Suite à la régression, la plupart des outils utilisent des ajustements de la valeur p soit du taux d'erreur familial (FWER) ou du taux de fausse découverte (FDR) pour tenir compte de plusieurs hypothèses (dans les études humaines,

20 000 gènes codant pour des protéines ou

Les analyses en aval d'une liste de gènes exprimés de manière différentielle se présentent sous deux formes, validant les observations et faisant des inférences biologiques. En raison des pièges de l'expression différentielle et de l'ARN-Seq, des observations importantes sont répliquées avec (1) une méthode orthogonale dans les mêmes échantillons (comme la PCR en temps réel) ou (2) une autre expérience, parfois pré-enregistrée, dans une nouvelle cohorte . Ce dernier permet d'assurer la généralisation et peut généralement être suivi d'une méta-analyse de toutes les cohortes regroupées. La méthode la plus courante pour obtenir une compréhension biologique de haut niveau des résultats est l'analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes, bien que parfois des approches de gènes candidats soient utilisées. L'enrichissement de l'ensemble de gènes détermine si le chevauchement entre deux ensembles de gènes est statistiquement significatif, dans ce cas le chevauchement entre les gènes exprimés de manière différentielle et les ensembles de gènes provenant de voies/bases de données connues (par exemple., Gene Ontology, KEGG, Human Phenotype Ontology) ou à partir d'analyses complémentaires dans les mêmes données (comme les réseaux de co-expression). Les outils courants pour l'enrichissement des ensembles de gènes incluent les interfaces Web (par exemple., ENRICHR, g:profiler, WEBGESTALT) [114] et les progiciels. Lors de l'évaluation des résultats d'enrichissement, une heuristique consiste à rechercher d'abord l'enrichissement de la biologie connue en tant que contrôle de la santé mentale, puis à élargir la portée pour rechercher une nouvelle biologie.

Épissage alternatif Modifier

L'épissage de l'ARN fait partie intégrante des eucaryotes et contribue de manière significative à la régulation et à la diversité des protéines, se produisant dans plus de 90 % des gènes humains. [115] Il existe plusieurs modes d'épissage alternatifs : saut d'exon (mode d'épissage le plus courant chez l'homme et les eucaryotes supérieurs), exons mutuellement exclusifs, sites donneurs ou accepteurs alternatifs, rétention d'intron (mode d'épissage le plus courant chez les plantes, les champignons et les protozoaires), site alternatif de démarrage de la transcription (promoteur) et polyadénylation alternative. [115] L'un des objectifs de RNA-Seq est d'identifier des événements d'épissage alternatifs et de tester s'ils diffèrent entre les conditions. Le séquençage à lecture longue capture la transcription complète et minimise ainsi de nombreux problèmes liés à l'estimation de l'abondance des isoformes, comme le mappage de lecture ambigu. Pour l'ARN-Seq à lecture courte, il existe plusieurs méthodes pour détecter l'épissage alternatif qui peuvent être classées en trois groupes principaux : [116] [89] [117]

  • Basé sur le nombre (également basé sur les événements, épissage différentiel) : estimate exon retention. Examples are DEXSeq, [118] MATS, [119] and SeqGSEA. [120]
  • Isoform-based (also multi-read modules, differential isoform expression): estimate isoform abundance first, and then relative abundance between conditions. Examples are Cufflinks 2 [121] and DiffSplice. [122]
  • Intron excision based: calculate alternative splicing using split reads. Examples are MAJIQ [123] and Leafcutter. [117]

Differential gene expression tools can also be used for differential isoform expression if isoforms are quantified ahead of time with other tools like RSEM. [124]

Coexpression networks Edit

Coexpression networks are data-derived representations of genes behaving in a similar way across tissues and experimental conditions. [125] Their main purpose lies in hypothesis generation and guilt-by-association approaches for inferring functions of previously unknown genes. [125] RNA-Seq data has been used to infer genes involved in specific pathways based on Pearson correlation, both in plants [126] and mammals. [127] The main advantage of RNA-Seq data in this kind of analysis over the microarray platforms is the capability to cover the entire transcriptome, therefore allowing the possibility to unravel more complete representations of the gene regulatory networks. Differential regulation of the splice isoforms of the same gene can be detected and used to predict their biological functions. [128] [129] Weighted gene co-expression network analysis has been successfully used to identify co-expression modules and intramodular hub genes based on RNA seq data. Co-expression modules may correspond to cell types or pathways. Highly connected intramodular hubs can be interpreted as representatives of their respective module. An eigengene is a weighted sum of expression of all genes in a module. Eigengenes are useful biomarkers (features) for diagnosis and prognosis. [130] Variance-Stabilizing Transformation approaches for estimating correlation coefficients based on RNA seq data have been proposed. [126]

Variant discovery Edit

RNA-Seq captures DNA variation, including single nucleotide variants, small insertions/deletions. and structural variation. Variant calling in RNA-Seq is similar to DNA variant calling and often employs the same tools (including SAMtools mpileup [131] and GATK HaplotypeCaller [132] ) with adjustments to account for splicing. One unique dimension for RNA variants is allele-specific expression (ASE): the variants from only one haplotype might be preferentially expressed due to regulatory effects including imprinting and expression quantitative trait loci, and noncoding rare variants. [133] [134] Limitations of RNA variant identification include that it only reflects expressed regions (in humans, <5% of the genome), could be subject to biases introduced by data processing (e.g., de novo transcriptome assemblies underestimate heterozygosity [135] ), and has lower quality when compared to direct DNA sequencing.

RNA editing (post-transcriptional alterations) Edit

Having the matching genomic and transcriptomic sequences of an individual can help detect post-transcriptional edits (RNA editing). [3] A post-transcriptional modification event is identified if the gene's transcript has an allele/variant not observed in the genomic data.

Fusion gene detection Edit

Caused by different structural modifications in the genome, fusion genes have gained attention because of their relationship with cancer. [136] The ability of RNA-Seq to analyze a sample's whole transcriptome in an unbiased fashion makes it an attractive tool to find these kinds of common events in cancer. [4]

The idea follows from the process of aligning the short transcriptomic reads to a reference genome. Most of the short reads will fall within one complete exon, and a smaller but still large set would be expected to map to known exon-exon junctions. The remaining unmapped short reads would then be further analyzed to determine whether they match an exon-exon junction where the exons come from different genes. This would be evidence of a possible fusion event, however, because of the length of the reads, this could prove to be very noisy. An alternative approach is to use paired-end reads, when a potentially large number of paired reads would map each end to a different exon, giving better coverage of these events (see figure). Nonetheless, the end result consists of multiple and potentially novel combinations of genes providing an ideal starting point for further validation.

RNA-Seq was first developed in mid 2000s with the advent of next-generation sequencing technology. [139] The first manuscripts that used RNA-Seq even without using the term includes those of prostate cancer cell lines [140] (dated 2006), Medicago truncatula [141] (2006), maize [142] (2007), and Arabidopsis thaliana [143] (2007), while the term "RNA-Seq" itself was first mentioned in 2008 [144] The number of manuscripts referring to RNA-Seq in the title or abstract (Figure, blue line) is continuously increasing with 6754 manuscripts published in 2018. The intersection of RNA-Seq and medicine (Figure, gold line) has similar celerity. [145]

Applications to medicine Edit

RNA-Seq has the potential to identify new disease biology, profile biomarkers for clinical indications, infer druggable pathways, and make genetic diagnoses. These results could be further personalized for subgroups or even individual patients, potentially highlighting more effective prevention, diagnostics, and therapy. The feasibility of this approach is in part dictated by costs in money and time a related limitation is the required team of specialists (bioinformaticians, physicians/clinicians, basic researchers, technicians) to fully interpret the huge amount of data generated by this analysis. [146]

Large-scale sequencing efforts Edit

A lot of emphasis has been given to RNA-Seq data after the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) and The Cancer Genome Atlas (TCGA) projects have used this approach to characterize dozens of cell lines [147] and thousands of primary tumor samples, [148] respectively. ENCODE aimed to identify genome-wide regulatory regions in different cohort of cell lines and transcriptomic data are paramount in order to understand the downstream effect of those epigenetic and genetic regulatory layers. TCGA, instead, aimed to collect and analyze thousands of patient's samples from 30 different tumor types in order to understand the underlying mechanisms of malignant transformation and progression. In this context RNA-Seq data provide a unique snapshot of the transcriptomic status of the disease and look at an unbiased population of transcripts that allows the identification of novel transcripts, fusion transcripts and non-coding RNAs that could be undetected with different technologies.

This article was submitted to WikiJournal of Science for external academic peer review in 2019 (reviewer reports). The updated content was reintegrated into the Wikipedia page under a CC-BY-SA-3.0 license ( 2021 ). The version of record as reviewed is: Felix Richter et al. (17 May 2021). "A broad introduction to RNA-Seq". WikiJournal of Science. 4 (2): 4. doi:10.15347/WJS/2021.004. ISSN 2470-6345. Wikidata Q100146647.


1 An introduction to statistics

1.3 Why biologists have to repeat everything

1.4 Why biologists have to bother with statistics

1.5 Why statistical logic is so strange

1.6 Why there are so many statistical tests

1.7 Using the decision chart

2 Dealing with variability

2.2 Examining the distribution of data

2.3 The normal distribution

2.4 Describing the normal distribution

2.5 The variability of samples

2.7 Presenting descriptive statistics and confidence limits

2.8 Introducing computer programs

2.9 Calculating descriptive statistics

2.10 Self-assessment problems

3 Testing for normality and transforming data

3.1 The importance of normality testing

3.3 What to do if your data has a significantly different distribution from the normal

3.4 Examining data in practice

3.6 The complete testing procedure

3.7 Self-assessment problems

4 Testing for differences from an expected value or between two groups

4.2 Why we need statistical tests for differences

4.3 How we test for differences

4.4 One- and two-tailed tests

4.5 The types of t test and their non-parametric equivalents

4.9 Introduction to non-parametric tests for differences

4.10 The one-sample sign test

4.11 The Wilcoxon matched pairs test

4.12 The Mann–Whitney U test

4.13 Self-assessment problems

5 Testing for differences between more than two groups: ANOVA and its non-parametric equivalents

5.3 Deciding which groups are different – post hoc tests

5.4 Presenting the results of one-way ANOVAs

5.5 Repeated measures ANOVA

5.6 The Kruskal–Wallis test

5.9 The Scheirer–Ray–Hare Test

5.11 Self-assessment problems

6 Investigating relationships

6.2 Examining data for relationships

6.5 Statistical tests for linear relationships

6.8 Studying common non-linear relationships

6.9 Dealing with non-normally distributed data: rank correlation

6.10 Self-assessment problems

7 Dealing with categorical data

7.2 The problem of variation

7.3 The x2 test for differences

7.4 The x2 test for association

7.7 Self-assessment problems

8.3 Excluding confounding variables

8.4 Replication and pseudoreplication

8.5 Randomisation and blocking

8.6 Choosing the statistical test

8.7 Choosing the number of replicates: power calculations

8.8 Dealing with your results

8.9 Self-assessment problems

9 More complex statistical analysis

9.1 Introduction to complex statistics

9.2 Experiments investigating several factors

9.3 Experiments in which you cannot control all the variables

9.4 Investigating the relationships between several variables

9.5 Exploring data to investigate groupings

10 Presenting and writing about statistics

10.1 Introduction – less is more!

10.2 The introduction section

10.5 The discussion section

10.6 The abstract or summary

Table S1: Critical values for the t statistic

Table S2: Critical values for the correlation coefficient r

Table S3: Critical values for the x2 statistic

Table S4: Critical values for the Wilcoxon T distribution

Table S5: Critical values for the Mann–Whitney U distribution

Table S6: Critical values for the Friedman x2 distribution

Table S7: Critical values for the Spearman rank correlation coefficient r


Sample Preparation with Nanomaterials. Next Generation Techniques and Applications. Edition No. 1

Sample Preparation with Nanomaterials: Next Generation Techniques for Sample Preparation delivers insightful and complete overview of recent progress in the use of nanomaterials in sample preparation. The book begins with an overview of special features of nanomaterials and their applications in analytical sciences. Important types of nanomaterials, like carbon nanotubes and magnetic particles, are reviewed and biological sample preparation and lab-on-a-chip systems are presented.

The distinguished author places special emphasis on approaches that tend to green and reduce the cost of sample treatment processes. He also discusses the legal, economical, and toxicity aspects of nanomaterial samples. This book includes extensive reference material, like a complete list of manufacturers, that makes it invaluable for professionals in analytical chemistry.

Sample Preparation with Nanomaterials offers considerations of the economic aspects of nanomaterials, as well as the assessment of their toxicity and risk. Readers will also benefit from the inclusion of:

  • A thorough introduction to nanomaterials in the analytical sciences and special properties of nanomaterials for sample preparation
  • An exploration of the mechanism of adsorption and desorption on nanomaterials, including carbon nanomaterials used as adsorbents
  • Discussions of membrane applications of nanomaterials, surface enhanced raman spectroscopy, and the use of nanomaterials for biological sample preparation
  • A treatment of magnetic nanomaterials, lab-on-a-chip nanomaterials, and toxicity and risk assessment of nanomaterials

Perfect for analytical chemists, materials scientists, and process engineers, Sample Preparation with Nanomaterials: Next Generation Techniques for Sample Preparation will also earn a place in the libraries of analytical laboratories, universities, and companies who conduct research into nanomaterials and seek a one-stop resource for sample preparation.

1 Nanomaterials (NMs) in Analytical Sciences
1.1 Introduction
1.2 Types of NMs
1.3 Applications of NMs
1.4 Conclusions
Les références

2 Special Properties of Nanomaterials (NMs) for SamplePreparation
2.1 Introduction
2.2 Mechanical Properties of NMs
2.3 Thermal Properties of NMs
2.4 Electrical Properties of NMs
2.5 Optical Properties of NMs
2.6 Magnetic Properties of NMs
2.7 Adsorption Properties of NMs
2.8 Conclusions
Les références

3 Adsorption Mechanism on Nanomaterials (NMs)
3. 1Introduction
3.2 Adsorption Process
3.3 Conclusions and Future Perspective
Les références

4 Carbon Nanomaterials (CNMs) as Adsorbents for SamplePreparation
4.1 Introduction
4.2 Carbon Nanomaterials (CNMs)
4.3 Adsorption on CNMs
4.4 Applications of CNMs
4.5 Conclusions
Les références

5 Membrane Applications of Nanomaterials (NMs)
5.1 Introduction935.2Traditional Membranes
5.2 Traditional Membranes
5.3 Carbon Nanomaterial-based Membranes
5.4 Nanoparticle-based Membranes
5.5 Molecularly Imprinted Polymer (MIP)-based Membranes
5.6 Conclusions
Les références

6 Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) withNanomaterials (NMs)
6.1 Introduction
6.2 Theory of SERS
6.3 SERS Mechanisms
6.4 Determination of SERS Enhancement Factor
6.5 Selection Rules
6.6 Fabrications of SERS Substrates
6.7 Applications of SERS
6.8 Conclusions
Les références

7 Nanomaterials (NMs) for Biological Sample Preparations
7.1 Introduction
7.2 The Use of NMs in Diagnostic Platforms
7.3 NMs-based Lab-on-a-chip (LOC) Platforms
7.4 Biomedical Applications of NMs
7.5 Sensor Applications of NMs
7.6 Conclusions

8 Magnetic Nanomaterials for Sample Preparation
8.1 Introduction
8.2 Synthesis of Magnetic Nanoparticles
8.3 Solid-Phase Extraction (SPE)
8.4 Magnetic Solid-Phase Extraction (MSPE)
8.5 Conclusions and Future Trends
Les références

9 Lab on Chip with Nanomaterials (NMs)
9.1 Introduction
9.2 Lab-on-a-Chip (LOC) Concept
9.3 NM-Based LOC Platforms
9.4 Conclusions and Future Perspectives
Les références

10 Toxicity and Risk Assessment of Nanomaterials
10.1 Introduction
10.2 Hazard Assessment of Nanomaterials
10.3 Toxicity Mechanism of Nanomaterials
10.4 The Traditional Risk Assessment Paradigm
10.5 Strategies for Improving Specific Risk Assessment
10.6 Conclusions
Les références

11 Economic Aspects of Nanomaterials (NMs) for SamplePreparation
11.1 Introduction
11.2 Toxicity Concerns of NMs
11.3 Global Market for NM-Based Products
11.4 Conclusions
Les références

12 Legal Aspects of Nanomaterials (NMs) for SamplePreparation
12.1 Introduction
12.2 Safety Issues of NMs
12.3 Regulatory Aspects of NMs
12.4 Conclusions
Les références

13 Monitoring of Nanomaterials (NMs) in the Environment
13.1 Introduction
13.2 Toxicity and Safety Concerns of NMs
13.3 Main Sources and Transport Routes of Nanopollutants
13.4 Requirements of Analytical Approaches
13.5 Sampling of NMs in Environmental Samples
13.6 Separation of NMs in Environmental Samples
13.7 Detection Techniques for the Characterization of NMs
13.8 Conclusions
Les références

14 Future Prospect of Sampling
14.1 Introduction
14.2 Sampling
14.3 Sample Preparation
14.4 Green Chemistry
14.5 Miniaturization of Analytical Systems
14.6 Conclusions
Les références


4. Discussion

Given the urgent need to control the COVID-19 pandemic, vaccine development is being accelerated into the clinical trials phase [4] , [7] , [8] , even though understanding of the immunologic features of the antigens of SARS-CoV-2 remains poor. In this phase I trial, a study was performed to investigate the safety and immunogenicity of this inactivated vaccine in 191 subjects. The data collected show several notable features. First, the clinical safety observations among the 191 subjects suggest that there were no severe adverse reactions related to vaccination, and the most frequently reported events were mild, including redness, itching and swelling at the inoculation site and a few cases of slight fatigue there were no significant differences between the vaccine and control groups. These data support the clinical safety of this vaccine. However, based on the current concern about the possibility of immunopathology due to SARS-Cov-2 infection [16] , we extended our safety observations to the investigation of variations in immune cell populations and cytokine levels in the peripheral blood. The test results suggested that there were no abnormalities in most of the 48 detected cytokines and the proportions of immune cells. Second, not only did serological detection show the presence of neutralizing antibodies, antibodies against the S protein, the N protein and the complete virion antigens were also found in ELISA assays to have been elicited in the vaccinated population, and there were dynamic alterations in the levels of these antibodies based on the dose and the vaccination schedule. However, the medium and high doses in both the 0, 14 and 0, 28 schedule groups led to 100% seroconversion of ELISA anti-S antibody after two inoculations, and interestingly, the medium dose group assigned to the 0, 14 schedule reached 100% seroconversion of the neutralizing antibody with the highest GMT value. However, the high-dose group exhibited lower seroconversion and GMT values. According to our understanding, this result might be due to the medium dose providing suitable signal stimulation to the immune system or the limited sample size. Therefore, further investigations in phase II and III trials are necessary. Additionally, the neutralizing antibody can neutralize different pandemic strains with diverse mutations. However, the GMT of neutralizing antibodies measured in this trial is obviously lower than the GMTs observed in the trials of mRNA vaccines developed by Moderna and Pfizer [17] , [18] this difference suggests that characteristic immune responses are elicited by mRNA vaccines and vaccines against the inactivated virus and that these vaccines should be evaluated based upon their clinical protective efficacy [19] . At the time of the antibody response, a CTL response with IFN-gamma specificity against the S, N and virion antigens was detected in immunized individuals in comparison with individuals receiving the placebo this suggests that any one of these three antigens enables the specific activation of T cells even if the immune response does not show dose-dependent effects. These immunological indexes indicate that a systemic immune response was elicited by our vaccine in the human population. To examine the genetic diversity of the specific immunity elicited by the vaccine, we examined the mRNA gene profile of the PBMCs from vaccinated individuals and found that most of the expressed mRNA genes were related to various signaling pathways of the innate and adaptive immune systems, and the immune functions were upregulated in comparison with the placebo group. Here, activation of the multiple signaling pathways involved in the immune response resulted in variations in hundreds of genes related to activation of innate immunity at day 7 after booster immunization regardless of the immunization schedule however, the cytokines that were found to have elevated levels in COVID-19 patients had only mild variations and were at levels similar to those in the placebo control group, which corresponded with those detected in the serum. The activation of genes related to T cells, B cells, DCs and mononuclear cells/macrophages with varying dynamics is evidence of the immune resonse elicited by the vaccine. All the data obtained in this trial support the safety and immunogenicity of this inactivated vaccine and are encouraging with regard to further studies of its efficacy in the future.

A limitation of this study is the lack of analysis of the protective efficacy of the vaccine and the lack of a comparative transcriptional analysis of PBMCs from vaccinated individuals and COVID-19 patients the latter comparison was not possible because few blood samples have been obtained from COVID-19 patients in mainland China at this time.


The Exams

The external assessment

The IB uses a criterion based approach to assessment. This means that students work is judged against identified levels of attainment and not against the work of other students. At the grade award meeting which takes place once all the papers have been marked levels of attainment, in the form of grade boundaries are agreed. There is consideration of the difficulty of the exams and the performance of students and a committee of people are involved.

Several methods of assessment are used: Assessment criteria when the task in open ended, Markbands with a range of level descriptors used to judge students answers to some extended response questions, Analytic markschemes where a particular kind of response is required, and Marking notes are used to clarify assessment criteria.

Examiners are monitored throughout the marking process and ever effort is made to ensure consistency in marking.

Standard Level

Multiple choice questions are quite challenging and students need practice with the style.

Each question has a "distractor" or answer which is almost correct. Usually one or two answers are quite obviously wrong.

The data analysis questions at the beginning of this paper require good skills in the interpretation of graphs but also an ability to cope with unfamiliar material.

The short answer questions are the least complicated part of the external assessment. If a student knows the biology these questions resemble the work a student often does using text books and worksheets in lessons. The challenge is to be prepared to answer questions on any part of the IB Biology guide.

There is a choice of two extended response questions, students must answer all three sections of one question. Care is required in reading the questions, in particular the command term so that students give the right sort of answers. Often there is one part which requires a diagram.

Historically, many students find this exam easier than paper 2 because there is less syllabus coverage and students can prepare more thoroughly for the option material. There are two or three questions in section A which will test knowledge of practical experiment skills and analysis of results from any part of the core topics and the prescribed experiments. Section B resembles the short answer section of paper 2 except that it covers only material from the chosen option. Students should be trained in choosing the correct option and only answering questions from one option.

Internal Assessment

This investigation is assessed by the teacher in school and a sample of work is moderated by the IB and adjustments made to marks so that all centres are awarding marks in a similar standard. For further details see The Investigation pages.

Higher Level

Although the length of all the exams for HL is longer than the SL exams, the structure of all examinations and the investigation is the same as for SL.

The only exception is in Paper 2 where students will have a choice of two out of three extended response questions. The weighting of paper two is slightly less that the SL paper 2 to allow for assessment of the extra HL material in the option paper.


Riffle Sample Splitters with chutes

Riffle sample Splitters, also called Sample Dividers with Chutes, allow dividing samples into two representative subsamples with a good accuracy.

Riffle Sample Splitter is the most universally used sampling device for preparing representative splits of dry, free-flowing granular product.

The technique is rapid and the equipment is economical.

It is precisely designed to reduce the bulk of material to a convenient representative size for laboratory analysis. When used properly, it provides an accuracy that is recognized through out the industry

With Riffle Sample Splitters, a homogenous, dry, free-flowing sample is poured evenly into the hopper / funnel. The material flows through the alternately arranged passages in the opposite direction (chutes / riffle bank) into the two collecting pans under the dividing head outlets. With every operation the feed sample is divided in two representative subsamples. The operation can be repeated as many times as necessary, until the required dividing quantity has been obtained.


8.3: Sample preparation - Biology

There are two methods to transform E. coli cells with plasmid DNA - chemical transformation and electroporation. For chemical transformation, cells are grown to mid-log phase, harvested and treated with divalent cations such as CaCl2. Cells treated in such a way are said to be competent. To chemically transform cells, competent cells are mixed with the DNA , on ice, followed by a brief heat shock. Then, cells are incubated with rich medium and allowed to express the antibiotic resistant gene for 30-60 minutes prior to plating. For electroporation, cells are also grown to mid-log phase but are then washed extensively with water to eliminate all salts. Usually, glycerol is added to the water to a final concentration of 10% so that the cells can be stored frozen and saved for future experiments. To electroporate DNA into cells, washed E. coli are mixed with the DNA to be transformed and then pipetted into a plastic cuvette containing electrodes. A short electric pulse, about 2400 volts/cm, is applied to the cells causing smalls holes in the membrane through which the DNA enters. The cells are then incubated with broth as above before plating.

For chemical transformation, there is no need to pre-treat the DNA. For electroporation, the DNA must be free of all salts so the ligations are first precipitated with alcohol before they are used.

Conception expérimentale :

To determine the efficiency of transformation, a positive control transformation should be done using 1 ng of uncut plasmid DNA, e.g. pUC19. The efficiency of transformation is calculated as the number of transformants/&mug of input DNA. A negative control should also be included that contains cells with no added DNA.

A negative control with cells only (no added DNA) should also be included.

For most cloning applications, we use DH5&alpha host cells. These cells are compatible with lacZ blue/white selection procedures, are easily transformed, and good quality plasmid DNA can be recovered from transformants. One notable exception is when transforming with plasmid constructs containing recombinant genes under control of the T7 polymerase. These constructs are typically transformed into DH5&alpha for the cloning phase, but need to be transformed into a different bacterial strain, BL21(DE3) for expression of the recombinant protein (BL21 strains carry the gene for expression of the T7 polymerase).

Electroporation of E. coli:

  • Sterile centrifuge bottles &ndash 250 ml for GSA rotor
  • SOB medium
  • E. coli host strain such as DH5&alpha
  • WB (10% redistilled glycerol, 90% distilled water, v/v) chilled to 4°C&ndash need 500 ml of WB for each 250 ml of culture
  • tRNA (5-10 µg/ml &ndash used as a mass carrier to increase the efficiency of precipitation)
  • 5 M ammonium acetate
  • 100% ethanol
  • 70% ethanol
  • 0.5X TE or EB (10 mM Tris, pH 8.3)
  • SOC medium
  • transformation plates

I. Preparation of E. coli cells for electroporation.

1. Use a fresh colony of DH5&alpha (or other appropriate host strain) to inoculate 5 ml of SOB (without magnesium) medium in a 50 ml sterile conical tube. Grow cells with vigorous aeration overnight at 37°C.

2. Dilute 2.5 ml of cells into 250 ml of SOB (without magnesium) in a 1 liter flask. Grow for 2 to 3 hours with vigorous aeration at 37°C until the cells reach an OD550 = 0.8.

3. Harvest cells by centrifugation at 5000 RPM in a GSA rotor for 10 min in sterile centrifuge bottles. (Make sure you use autoclaved bottles!).

4. Wash the cell pellet in 250 ml of ice-cold WB as follows. First, add a small amount of WB to cell pellet pipet up and down or gently vortex until cells are resuspended. Then fill centrifuge bottle with ice cold WB and gently mix. NOTE- the absolute volume of WB added at this point is not important.

5. Centrifuge the cell suspension at 5,000 RPM for 15 min and carefully pour off the supernatant as soon as the rotor stops. Cells washed in WB do not pellet well. If the supernatant is turbid, increase the centrifugation time.

6. Wash the cell pellet a second time by resuspending in 250 ml of sterile ice-cold WB using the same technique described above. Centrifuge the cell suspension at 5000 RPM for 15 min.

7. Gently pour off the supernatant leaving a small amount of WB in the bottom of the bottle. Resuspend the cell pellet in the WB - no additional WB needs to be added &ndash and the final volume should be about 1 ml. Cells can be used immediately or can be frozen in 0.2 ml aliquots in freezer vials using a dry ice-ethanol bath. Store frozen cells at -70°C.

II. Preparing DNA for Electroporation

DNA for electroporation must have a very low ionic strength and a high resistance. The DNA may be purified by either dilution, precipitation or dialysis.

  • For transformation of purified plasmid DNA, dilute DNA in 10 mM Tris pH 8-8.3 to about 1-50 ng/µl (do not use TE). Use 1 µl for transformation.
  • For ligation reactions, use the following procedure.

Purifying DNA by Precipitation:

1. Add 5 to 10 &mug of tRNA to a 20 &mul ligation reaction in a 1.5 ml tube. Add 22 &mul 5M ammonium acetate (or an equal volume of ligation reaction with added tRNA). Bien mélanger.

2. Add 100 &mul absolute ethanol (or 2.5 volumes of ligation reaction, tRNA and salt). Ice 15 min.

3. Centrifuge at >12,000 x g for 15 min at 4°C. Carefully decant the supernatant.

4. Wash the pellet with 1 ml of 70% ethanol. Centrifuge at >12,000 x g for 15 min at room temperature. Remove the supernate.

5. Air dry the pellet (speed vac okay but don't overdry).

6. Resuspend the DNA in EB buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3) or 0.5X TE buffer [5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA (pH 7.5)] to a concentration of 10 ng/ul of DNA. For ligation reactions, it is convenient to resuspend in 10 µl. Use 1 &mul per transformation of 20 &mul of cell suspension.

III. Electroporation.

1. Mark the required number of micro centrifuge tubes. Place the required number of Micro-electroporation Chambers on ice. Fill the temperature control compartment of the Chamber Safe with

250 ml of ice-water slurry and place the Chamber Rack in the Chamber Safe.

2. Thaw an aliquot of cells that have prepared as in Section I and aliquot 20 µ l of cells to the required number of microfuge tubes on ice. Add 1 µ l of the DNA (or ligation reaction) prepared as in Section II.

3. Using a micro pipette, pipette 20 µ l of the cell-DNA mixture between the bosses in a Micro-Electroporation Chamber. Do not leave an air bubble in the droplet of cells the pressure of a bubble may cause arcing and loss of the sample. Place the chamber in a slot in the Chamber Rack and note its position. Repeat the process if more than one sample is to be pulsed. Up to 4 samples can be placed in the Chamber Rack at one time. Handle the chambers gently to avoid accidentally displacing the sample from between the bosses.

4. Close the lid of the Chamber safe and secure it with the draw latch.

5. Plug the pulse cable into the right side of the Chamber safe.

6. Turn the chamber selection knob on top of the Chamber Safe to direct the electrical pulse to the desired Micro-Electroporation Chamber.

7. Set the resistance on the Voltage Booster to 4 k&Omega set the Pulse Control unit to LOW and 330 µ F double check connections.

8. Charge the Pulse Control unit by setting the CHARGE ARM switch on the Pulse Control unit to CHARGE and then pressing the UP voltage control button until the voltage reading is 5 to 10 volts higher than the desired discharge voltage. Pour E. coli, the standard conditions are 2.4 kv, which means setting the Pulse Control unit to 405 volts (400 volts is the desired discharge voltage + 5). The voltage booster amplifies the volts by

6-fold such that the total discharge voltage is 2400 volts, or 2.4 kv. The actual peak voltage delivered to the sample will be shown on the Voltage Booster meter après the pulse is delivered.

9. Set the CHARGE/ARM switch to the ARM position. The green light indicates that the unit is ready to deliver a DC pulse. Depress the pulse discharge TRIGGER button and hold for 1 second.

NOTE: The DC voltage display on the Pulse Control unit should read <10 volts after a pulse has been delivered. If not, discharge the capacitor using the DOWN button.

10. For additional samples, turn the chamber selection knob to the next desired position and repeat steps 8 and 9 until all samples are pulsed.

11. For ampicillin selection, inoculate the samples into 2 ml of SOC medium and shake for 30 minutes (for amp), 60 minutes (for Kan) to allow expression of the antibiotic gene. Plate cells on LB medium with appropriate antibiotic or screening reagent (e.g. 100 µg/ml ampicillin, and/or 40 &mul of 20 mg/ml X-Gal, XP, and 40 &mul of 100 mM IPTG) .

This Web page is maintained by Julie B. Wolf, UMBC
Last updated on 3/2/2010

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