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Estimation de la constante de diffusion d'une protéine en fonction du nombre d'acides aminés

Estimation de la constante de diffusion d'une protéine en fonction du nombre d'acides aminés


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Existe-t-il un moyen d'estimer la constante de diffusion d'une protéine en fonction du nombre d'acides aminés qui la composent. Je sais que la forme de la protéine a une influence sur la constante de diffusion, mais je ne savais pas s'il y avait une estimation qui pourrait encore être utilisée pour une bonne approximation.

Si cela n'existe pas, existe-t-il encore un moyen d'approcher la constante de diffusion de certaines protéines. J'essaie de faire un modèle approximatif basé sur des équations de réaction-diffusion, et je voulais estimer les constantes de diffusion de certaines espèces dans le modèle.


Questions sur l'hémoglobine (avec réponses)

(a) Type I, (b) Type II, (c) Type III, (d) Tout ce qui précède.

6. Plus l'abondance trouvée dans la nature est

(a) Série de type I, (b) Série de type II, (c) Série de type III, (d) Aucune des réponses ci-dessus.

7. Dans la biosynthèse des porphyrines, l'activation de la glycine a besoin du coenzyme

8. L'anémie a été observée dans la carence en vitamine

(a) Biotine, (b) Inositol, (c) Niacine, (d) Acide pantothénique.

9. Les composés dipyrryliques sont de deux types

(a) A et B, (b) B et C, (c) A et C, (d) B et D.

10. Une porphyrine de type III résulte de la condensation des composants

(a) Deux des (A), (b) Un (A) et un (B), (c) Deux des (B), (d) Un (A) et un (C).

11. L'enzyme coproporphyrinogène oxydase est abhe d'agir sur le coproporphyrinogène

(a) Type I, (b) Type II, (c) Type III, (d) Tout ce qui précède.

12. Dans le foie des mammifères, la réaction de conversion du corporporphyrinogène en protoporphyrine re­quires

(a) Oxygène moléculaire, (b) Eau, (c) ATP, (d) B6-P04.

13. L'hème est synthétisé par l'incorporation d'ions ferreux (Fe ++) dans la protoporphyrine III catalysée par l'enzyme

(a) Ferroxydase, (b) Ferroreductase, (c) Ferrochélatase, (d) Aucune des réponses ci-dessus.

14. La globine de l'hémoglobine est une protéine composée de chaînes polypeptidiques étroitement emballées de

(a) 6 couches parallèles, (b) 4 couches parallèles, (c) 3 couches parallèles, (d) 2 couches parallèles.

15. Deux chaînes a de la globine ont une composition en acides aminés identique de

16. Le nombre total d'acides aminés dans la globine

17. L'hémoglobine prend le nombre de molécules d'oxygène

18. La carboxyhémoglobine est formée par

19. Une mole d'hémoglobine contient des résidus d'histidine

20. La méthémoglobine est formée à la suite de l'oxydation de l'hémoglobine par un agent oxydant

(a) Oxygène de l'air, (b) Peroxyde d'hydrogène, (c) Ferricyanure de potassium, (d) Permanga­nate de potassium.

21. La méthémoglobine peut être réduite en hémoglobine en

(a) Élimination de l'hydrogène, (b) Vitamine C, (c) Glu­tathion, (d) Créatinine.

22. La couleur de la cyanométhémoglobine

(a) Jaune, (b) Rose, (c) Marron, (d) Rouge vif.

23. Le fer de l'hème est coordonné en chaînes aux positions

(a) 43 et 72, (b) 53 et 82, (c) 63 et 92, (d) 73 et 102.

24. La myoglobine contient le nombre d'atomes-grammes de fer par mole

25. Les catalases contiennent le nombre d'atomes-grammes de fer par mole

Remplir les espaces vides:

1. Les myoglobines sont les pigments _____________ présents dans les cellules _________ des vertébrés et des invertébrés.

Rép. Muscle respiratoire.

2. Le poids moléculaire des catalases est d'environ ____________.

3. La tryptophane pyrrolase catalyse l'oxydation de ____________ en ____________.

Rép. Tryptophane Formyl Kynurénine.

4. Le rôle fondamental des cytochromes est dans ____________.

Rép. Respiration cellulaire.

5. Le cytochrome C a un poids moléculaire d'environ ____________ et contient ____________ de fer.

Rép. 13000 0,43 pour cent.

6. La chaîne peptidique du cytochrome C du cœur humain contient ____________ acides aminés.

7. Les cytochromes oxydases peuvent entraîner trois types généraux de réactions, par exemple le transfert d'oxygène ____________, ____________.

Rép. Oxydation à fonction mixte Transfert d'électrons.

8. L'hémoglobine A a un poids moléculaire de _________ et contient _________ paires de chaînes peptidiques.

9. Les chaînes de l'hémoglobine A contiennent _________ et la chaîne contient _________ acides aminés.

10. L'hémoglobine fœtale A contient _____________ et -chaîne contairis ________ acides aminés.

11. L'hémoglobine fœtale représente _________ pour cent de l'hémoglobine totale du nouveau-né.

12. L'hémoglobine fœtale absorbe __________ plus facilement à faible tension d'oxygène et libère ____________ plus facilement que l'hémoglobine adulte (A).

13. L'hémoglobine F est progressivement remplacée par ___________ au cours des 6 premiers mois de la vie extra-utérine.

Rép. L'hémoglobine A.

14. L'hémoglobine fœtale est plus résistante à la dénaturation d'ici ____________ et est plus susceptible de se transformer en méthémoglobine d'ici ____________.

Rép. Nitrites alcalins.

15. Certaines des hémoglobines anormales sont facilement différenciées par leurs mobilités électrophorétiques et ont donné naissance au concept de ____________.

Rép. Maladie moléculaire.

16. L'acide aminé acide est remplacé par un acide aminé _____________ ou ________ pour la formation d'hémoglobine anormale à partir d'hémoglobine normale.

Rép. Neutre de base.

17. L'anomalie de l'hémoglobine C se trouve dans la chaîne à la position _________ , l'acide aminé acide glutamique est remplacé par ___________.

18. L'hémoglobine C se caractérise par un léger ____________ avec une tendance à ____________.

Rép. Anémie Infarctus.

19. Dans l'hémoglobine S__________, l'anémie se développe et le ________ devient long et en forme de bateau.

Rép. GR drépanocytaire.

20. L'anomalie de l'hémoglobine S se produit dans la chaîne ____________, l'acide glutamique en position 6 est remplacé par ____________.

21. Si l'HbF est présente en grande quantité dans le sang des adultes, elle devient ___________ produisant rapidement ________.

Rép. Thalassémie majeure hémolysée.

22. L'anomalie de l'hémoglobine M se trouve dans la chaîne , les résidus d'histidine dans les positions ___________ et _________ sont remplacés par ______________.

Rép. 58 87 Tyrosine.

23. La méthémoglobine n'est pas réduite à __________ par des agents ____________.

Rép. Réduction de l'hémoglobine.

24. La trypsine divise les peptides dans l'hémoglobine aux points où seulement ____________ et ________ se produisent.

Rép. Lysine Arginine.

25. La met-hémoglobine est une hémoglobine _____________ ____________ est dans la combinaison ferme.

Rép. Oxygène oxydé.

26. Lorsque la concentration de met-hémoglobine atteint ________ pour 1000 ml de sang, __________ se développe généralement.

Rép. 3 grammes de cyanose.

27. La méthémoglobine est présente dans ___________ normale environ _________ pour cent de l'hémoglobine totale.

Rép. Érythrocytes 0,4.

28. L'hémoglobine __________ se combine avec ___________ pour former la sulfhémoglobine.

Rép. H réduit2S.

29. La sulfhémoglobine est également observée chez les sujets avec _________ marqué en présence de bactéries pro­ducatrices ____________ dans l'intestin.

Rép. Nitrite de constipation.

30. La carboxyhémoglobine est formée par la combinaison de ____________ avec le ____________ dans la molécule d'hémoglobine.

31. La carboxyhémoglobine est produite par l'exposition excessive à l'éclairage artificiel ____________ et à l'automobile__________ dans des pièces fermées ou mal ventilées.

Rép. Gaz Gaz d'échappement.

32. On dit que la condition par laquelle l'excrétion de la coproporphyrine et de l'uroporphyrine augmente est ____________.

33. La prophyrie érythropoïétique a tendance à ____________ et défectueuse ____________.

Rép. Hémolyse Érythropoïèse

34. Dans la protoporphyrie érythropoïétique, il y a une augmentation de ____________ et ____________ dans les érythrocytes circulants, le plasma et les selles.

Rép. Protoporphyrine Uroporphyrine.

35. La porphyrie aiguë intermittente est due à une augmentation marquée des ____________ hépatiques.

Rép. ALA synthase.

36. Une augmentation du PBI sérique et une hypercholestérolémie se produisent dans la porphyrie ____________ aiguë.

Rép. Intermittent.

37. Dans Porphyria variegata, il y a une augmentation du ____________ hépatique.

Rép. ALA synthase.

38. La coproporphyrie héréditaire provoque une augmentation du débit urinaire de ____________ et ____________ lors d'attaques aiguës.

Rép. Porphobilinogène ALA.

39. La porphyrie acquise est causée par des maladies graves de ___________ et l'ingestion de certains ___________.

Rép. Toxines du foie.

40. Dans la porphyrie acquise, il y a une excrétion accrue de ____________ dans l'urine.

Rép. Uroporphyrine.

41. La porphyrie cutanée tardive montre une augmentation fréquente du sérum ____________.

42. Les porphyrines sont des composés ___________ de structure __________.

Rép. Tétrapyrrole cyclique.

43. Le fer à l'état _________ est lié à l'atome _________ des cycles pyrrole.

Rép. Azote ferreux.

44. Le fer est également lié de manière interne à l'azote du cycle _________ de _________ des chaînes polypeptidiques.

Rép. Imidazole histidine.

45. L'acide propionique de __________ et ________ en position d'hème des pyrroles III et IV sont également liés aux acides aminés __________ et _______ de la chaîne polypeptidique respectivement.

Rép. Sixième Septième ariginine lysine.

46. ​​La globine de l'hémoglobine est un ___________ qui est composé de ___________ couches parallèles de chaînes ___________ étroitement serrées.

Rép. Protéine 4 Polypeptide.

47. Chacune des deux chaînes alpha de la globine a ___________ acides aminés et chacune des deux autres chaînes a ________ acides aminés. Par conséquent, le nombre total d'acides aminés dans la globine est __________ .

Rép. 141 146 574.

48. La molécule d'hémoglobine et ses sous-unités contiennent ________ acides aminés à l'intérieur et ______________ acides aminés à leur surface. Ils forment donc ____________.

Rép. Poches hydrophiles hydrophobes “heme”.

49. Dans “heme pocket” les sous-unités permettent l'entrée de la molécule _________ mais la même entrée dans la sous-unité est bloquée par le résidu ___________.

Rép. Oxygène Valine.

50. La quantité d'hémoglobine brisée chaque jour chez un adulte normal est d'environ ____________ qui contient ________ de fer.

Rép. 8 g 27 mg.

51. La protoporphyrine produit environ _________ de bi­lirubine.

52. Lorsque l'hémoglobine est catabolisée dans l'organisme, la globine est réutilisée__________ ou sous la forme de son constituant__________ et le fer entre__________ pour être réutilisé.

Rép. En tant que tels acides aminés ferritine “pool”

53. La choléglobine est formée à partir de l'hémoglobine par ____________ en présence de ____________.

Rép. Oxygène acide ascorbique.

54. La bilirubine est formée à partir de la biliverdine par_______ en présence de__________ ou____________ .

Rép. Bilirubine réductase NADP + NAD*.

55. La bilirubine se conjugue avec l'acide UDP-glucuronique par l'enzyme__________ pour former___________ qui peut traverser__________ .

Rép. Filtre glomérulaire UDP-glucuronyltransférase bilirubine diglucuronide.

56. L'activité de la glucuronyltransférase est inhibée par ____________.

Rép. Novobiocine.

57. L'urobilinogène lorsqu'il est exposé à l'oxygène est oxydé en ____________, ce qui donne le ____________ des selles.

Rép. Noircissement de l'urobiline.

58. Dans l'anémie falciforme, l'hémoglobine____ apparaît en raison d'une anomalie de la chaîne où ________ est remplacé par ____________ à la position ________.

Rép. δ β acide glutamique valine 6.

59. Les cellules falciformes sont plus ________ et provoquent _____________ et__________.

Rép. Jaunisse anémie hémolytique fragile.

60. Les personnes atteintes de drépanocytose présentent une résistance accrue à _________ et _________ , l'infection se retrouve davantage dans cette maladie.

Rép. Paludisme Salmonella.

Indiquez “Vrai” ou “Faux” des éléments suivants:

1. La chlorophylle est la porphyre contenant du magnésium et le pigment photosynthétique des plantes.

2. La chlorophylle et l'hème de l'hémoglobine sont synthétisés dans les cellules vivantes par différentes voies.

3. La condensation du succinate actif et de la glycine est catalysée par l'enzyme Amlev synthetase.

4. Deux moles d'Amlev se condensent pour former du porpho­bilinogène catalysé par l'enzyme Amlev déshydrase.

5. Le tripyrrylméthane est formé par la condensation de 2 moles de porphobilinogène.

6. En basse tension d'oxygène, l'oxyhémoglobine absorbe plus d'oxygène.

7. L'histidine contenue dans l'hémoglobine exerce son action tamponnante grâce à son noyau imidazole basique pour lequel l'hémoglobine joue un rôle important dans la régulation de l'équilibre acido-basique du sang.

8. La méthémoglobine peut transporter l'oxygène dans le sang.

9. La sulphémoglobine formée par l'administration de certains médicaments reste dans le sang et peut être convertie en hémoglobine.

10. L'hémoglobine réduite dans les spectres d'absorption montre une seule bande large dans la ré­gion verte.

11. L'oxyhémoglobine dans les spectres d'absorption montre trois bandes.

12. La biosynthèse de l'hémoglobine a lieu dans les cellules a du pancréas.

13. Le fer à l'état ferreux est incorporé à la proshytoporphyrine pour former l'hème.

14. Le fer de l'hème est coordonné au 2 azote imidazole de l'histidine aux positions 36 et 85.

15. La fonction des érythrocruorines est différente de celle de l'hémoglobine.

16. Les catalases sont des enzymes porphyrines de zinc.

17. Dans les plantes, les activités des catalases sont importantes.

18. Les cytochromes sont des porphyrines de fer et agissent comme agent de transfert d'électrons dans les réactions d'oxydation et de réduction.

19. La forme réduite du cytochrome C est auto-oxydable.

20. Cytochrome Q3 se trouve dans le rein.

21. La méthémoglobine fonctionne également comme car­rier d'oxygène.

22. Les porphyries sont de deux types : congénitales et acquises.

23. La porphyrie érythropoïétique provoque une excrétion fortement accrue d'uroporphyrine I et d'une moindre excrétion de coproporphyrine I dans l'urine et les fèces.

24. La coproporphyrie érythropoïétique montre de grandes quantités de coproporphyrine II dans les érythrocytes.

25. La porphyrie aiguë intermittente provoque des crises périodiques de douleurs abdominales associées à de la fièvre et une leucocytose.


Une renaissance des techniques classiques

La dégradation d'Edman, la MS et le dosage immunoenzymatique (ELISA) sont largement utilisés pour le séquençage et l'identification de protéines/peptides depuis plusieurs décennies. Il n'est donc pas surprenant que de nouvelles améliorations de ces technologies classiques soient recherchées. La communauté biophysique a développé des méthodes pour augmenter le débit 5 et la sensibilité 6 de l'ELISA à molécule unique, la dégradation d'Edman, la SM à particule unique, la SM nanomécanique à particule neutre et l'électrospray à particule unique. Même les outils établis couramment utilisés dans la science des matériaux, tels que l'effet tunnel électrique et les mesures de courant continu, peuvent être réutilisés pour le séquençage des protéines.

Dégradation d'Edman massivement parallèle

La dégradation d'Edman 7 a été la première méthode pour déterminer la séquence d'acides aminés d'un peptide purifié. La méthode implique la modification chimique de l'acide aminé N-terminal, le clivage de cet acide aminé du peptide et la détermination de l'identité de l'acide aminé marqué clivé par chromatographie liquide haute performance. Jusqu'à récemment, effectuer un séquençage de ce type de manière massivement parallèle n'était pas possible car la méthode nécessite des peptides hautement purifiés. Cependant, les récentes stratégies de multiplexage qui utilisent des matrices de peptides et soit séquencent des peptides marqués chimiquement (« fluoroséquençage ») ou détectent successivement l'acide aminé N-terminal font des percées.

Le fluoroséquençage combine la chimie d'Edman, la microscopie à molécule unique et la chimie des fluorophores synthétiques stables (Fig. 2a). Les protéines sont digérées en peptides plus courts et immobilisées sur une surface de verre en utilisant l'extrémité C terminale 8 . Des millions de peptides individuels marqués par fluorescence peuvent être visualisés en parallèle, et les intensités de fluorescence changeantes sont surveillées tandis que les acides aminés N-terminaux sont éliminés séquentiellement par plusieurs cycles de dégradation d'Edman. Les signatures de fluorescence résultantes servent à identifier de manière unique les peptides individuels 8 . Cette méthode permet à des millions de molécules peptidiques distinctes d'être séquencées en parallèle, identifiées et quantifiées numériquement à l'échelle du zeptomole 9 . Des acides aminés spécifiques sont marqués de manière covalente avec des fluorophores spectralement distincts, et l'empreinte peptidique provient de la mesure de la diminution de la fluorescence des peptides suite à la dégradation d'Edman 9 . Tout comme dans la SEP, la séquence partielle est mappée vers un protéome de référence dans un cadre probabiliste.

une,b, Fluoroséquençage à haut débit par dégradation d'Edman avec modification chimique spécifique aux acides aminés des peptides avec des fluorophores (une) et la reconnaissance des acides aminés N-terminaux à l'aide d'une pluralité de sondes (b). c, La SEP à particules neutres est une technique prometteuse pour caractériser les protéoformes. Actuellement, la technologie peut être utilisée pour caractériser de grands complexes à l'échelle du mégadalton à l'aide de nanocapteurs à base de silicium. Les nanocapteurs de graphène et les développements ultérieurs pourraient pousser la technologie vers des protéines de plus en plus petites et potentiellement conduire à une couverture de séquence accrue en protéomique mondiale. ESI, ionisation électrospray. , Nanopore electrospray est un mariage de nanopores, d'électrospray classique et de techniques de détection de particules uniques pour séquencer des protéines individuelles en mesurant les acides aminés un à la fois. Panneau une adapté avec l'autorisation de réf. 9, Springer Nature.

La technologie n'est pas sans défis, car les réactifs utilisés pour la chimie de dégradation d'Edman entraînent des taux accrus de destruction des colorants fluorescents, ce qui à son tour limite la longueur de lecture. Ces réactifs comprennent des structures légèrement basiques telles que la pyridine, des acides forts tels que l'acide trifluoroacétique et l'isothiocyanate de phényle électrophile. De plus, le recours au marquage chimique conduit à un séquençage partiel du peptide, le reste non identifié étant déduit par comparaison à un protéome de référence. En outre, un étiquetage inefficace peut entraîner des erreurs qui doivent être modélisées dans la comparaison du protéome de référence, ce qui stimule le développement de nouveaux protocoles pour augmenter les rendements 10 . De nouvelles propositions passionnantes pourraient ajouter la dimension du séquençage basé sur la protonation. Le pKune de l'acide aminé N-terminal pourrait être utilisé pour l'identification en observant et en interprétant le signal de protonation-déprotonation du peptide à pH fixe à travers le processus de dégradation d'Edman 11 . Tout comme le fluoroséquençage, le signal observé serait pour l'ensemble du peptide et le schéma de désintégration serait interprété pour dériver un pKune pour chaque acide aminé N-terminal.

Plusieurs protéines naturelles et molécules d'ARN reconnaissent des acides aminés spécifiques soit comme acides aminés libres, soit comme partie d'une chaîne polypeptidique 12 . Ces protéines et acides nucléiques fournissent différentes solutions pour la reconnaissance des acides aminés N-terminaux. Chaque sonde de liant d'acide aminé N-terminal (NAAB) identifie sélectivement un acide aminé N-terminal spécifique ou un dérivé d'acide aminé N-terminal. A chaque cycle, un autre acide aminé est révélé dans la séquence du peptide. Cependant, une évolution et une ingénierie plus poussées des sondes NAAB sont nécessaires pour répondre aux exigences strictes d'affinité, de sélectivité et de stabilité pour les applications de séquençage sans erreur. De plus, de telles sondes devraient discriminer entre tous les acides aminés, y compris le même acide aminé dans des positions alternatives dans la séquence peptidique. Des sondes qui se lient à une classe d'acides aminés N-terminaux (par exemple, de courts résidus aliphatiques) pourraient également être utiles mais introduiraient une ambiguïté dans le processus de séquençage. Différentes sondes pourraient également être conçues pour reconnaître les courts N-terminal k-mers, ce qui augmenterait le nombre de sondes nécessaires mais réduirait l'ambiguïté dans les informations de séquençage résultantes.Pour contourner cette limitation, il peut être possible de séquencer l'acide aminé N-terminal par reconnaissance sélective en utilisant une pluralité de sondes dans chaque cycle de dégradation d'Edman 13,14 (Fig. 2b).

Spectrométrie de masse à molécule unique

MS est une méthode centenaire qui mesure la masse à charge (m/z) rapport ions, en particulier peptides/protéines chargés et leurs assemblages. La détection d'ions uniques est possible depuis les années 1990, par exemple, dans les instruments à résonance cyclotron ionique à transformée de Fourier 15 . La détection de charge MS (CDMS) est une méthode à ion unique où l'attribution de charge de chaque ion individuel est déterminée directement, permettant la conversion du rapport masse/charge dans le domaine de masse neutre. Cette approche s'est concentrée sur l'analyse de grands complexes biomoléculaires, en particulier des virus dans la gamme de 1 à 100 MDa 16 . Alors qu'auparavant le CDMS était limité à l'instrumentation spécialisée, l'année dernière a vu des percées fondées sur les premiers travaux produisant des spectres de masse d'ions uniques dans les analyseurs de masse Orbitrap 17,18,19. Aujourd'hui, ces analyseurs de masse peuvent être utilisés pour dériver directement les états de charge de protéines individuelles et même de leurs fragments d'ions 20 . Les instruments Orbitrap sont particulièrement utiles car la lecture des ions individuels peut être multiplexée de 100 à 1 000 fois dans le CDMS basé sur Orbitrap 20 . Ion individuel MS a déjà montré la résolution des mélanges avec environ 1 000 protéoformes qui n'ont fourni aucune donnée en utilisant la norme MS 20,21. Cela a considérablement élargi l'approche descendante pour confirmer les séquences inférées par l'ADN de protéines entières, y compris la localisation de leurs modifications post-traductionnelles 20,21,22. Sans modification importante, les analyseurs de masse Orbitrap peuvent ainsi mesurer des dizaines de milliers de protéines en quelques minutes. Avec ces technologies en évolution rapide, la cartographie de l'atlas complet des protéoformes humaines a déjà commencé 23 , faisant des progrès vers un projet complet de protéoformes humaines. Cependant, l'ionisation est une exigence critique pour la SM des protéines et des peptides, et tous les peptides ne sont pas efficacement ionisés et transmis à travers le spectromètre de masse. Cela pourrait restreindre certains des efforts de cartographie des protéoformes, offrant une niche pour les autres technologies de la figure 1.

Pour les espèces de poids moléculaire plus élevé, l'ionisation des protéines et des complexes produit un mélange de macro-ions avec des états de charge variables, entraînant une nette réduction de la sensibilité lorsque le signal se répartit sur plusieurs pics dans la dimension masse à charge. De plus, les distributions d'états de charge peuvent se chevaucher au-dessus d'une certaine masse ou dans le cas de mélanges, créant des défis dans l'identification des espèces. Depuis leur création 24 , les capteurs de masse nanomécaniques ont fait d'énormes progrès vers la caractérisation des protéines 25 . De tels dispositifs, qui prennent la forme de porte-à-faux ou de poutres avec des dimensions latérales de l'ordre de centaines de nanomètres, peuvent détecter des particules individuelles s'accrétant sur leur surface active par des changements de fréquence de vibration. Fait important, comme la masse inertielle d'une particule est déterminée directement à partir du changement de fréquence, ces dispositifs sont insensibles aux états de charge 26 . Cette prise de conscience a incité le développement de nouvelles conceptions d'instruments MS dépourvus de guides d'ions, qui ne dépendent plus des champs électromagnétiques pour collecter et transmettre les analytes (Fig. 2c). Il a récemment été démontré qu'un tel système MS basé sur un résonateur nanomécanique avait la capacité de caractériser de grands assemblages de protéines tels que des capsides virales individuelles supérieures à 100 MDa en taille 27. En dehors de la protéomique, une résolution de 1 Da a été démontrée avec des nanotubes de carbone 28 . De plus, des rapports récents suggèrent la possibilité de déterminer d'autres paramètres physiques tels que la rigidité ou la forme de l'analyte en surveillant plusieurs modes de vibration 29,30. Ces métriques auparavant inaccessibles peuvent ouvrir de nouvelles voies pour discriminer les peptides, les protéines et leurs complexes. Néanmoins, l'un des défis du spectromètre de masse à nanorésonateur réside dans la conception de moyens efficaces pour amener des protéines individuelles sur la surface active du résonateur pour la détection de masse.

L'ionisation est généralement réalisée par ionisation électrospray d'une solution contenant le ou les composés d'intérêt. L'utilisation d'ouvertures de source d'ions électrospray toujours plus petites a conduit à des améliorations substantielles de la sensibilité de MS 31,32. Des spectromètres de masse avec une source d'ions nanopore ont été développés dans le but de séquencer des protéines uniques 33 (Fig. 2d). Un électrospray à nanopores peut potentiellement fournir des ions d'acides aminés individuels directement dans une phase gazeuse à vide poussé, où les ions peuvent être efficacement détectés par leurs rapports masse/charge. Cela ouvre la voie au séquençage des peptides un acide aminé à la fois. Le concept utilise des nanopores pour guider une protéine dans une configuration linéaire afin que ses monomères puissent être introduits dans le spectromètre de masse de manière séquentielle 34 . Les acides aminés individuels doivent être clivés de la molécule de protéine lorsqu'elle transite par le nanopore, ce qui pourrait potentiellement être accompli avec des méthodes de photodissociation 35 ou de digestion chimique. La bande passante de 100 MHz des détecteurs d'ions uniques Channeltron utilisés dans cette configuration est également suffisante pour résoudre l'ordre d'arrivée des ions. La haute résolution en masse rend cette technique prometteuse pour identifier les modifications post-traductionnelles, qui modifient les masses d'acides aminés particuliers par des quantités prévisibles. L'un des défis sur le chemin de cette technologie sera d'atteindre un débit élevé, ce qui pourrait nécessiter une stratégie de parallélisation de l'analyse de masse.

Mesures de conductance tunnel

L'apparition du microscope à effet tunnel dans les années 1980 a introduit une nouvelle façon d'analyser les molécules. De petites molécules organiques peuvent être temporairement piégées entre deux électrodes métalliques avec une séparation inférieure au nanomètre, les courants tunnel entre les électrodes rendant compte de la signature moléculaire de l'analyte. Récemment, plusieurs avancées techniques ont été réalisées pour évoluer vers l'analyse des acides aminés et des protéines à molécule unique. L'extraction d'informations pertinentes à partir de l'effet tunnel d'électrons est compliquée par le bruit résultant de l'eau et des contaminants atteignant les surfaces des électrodes. Pour surmonter ce problème, un tunnel de reconnaissance a été développé dans lequel les électrodes sont modifiées de manière covalente avec des molécules adaptatrices qui forment des liens transitoires mais bien définis avec la molécule cible 36 . Les signaux de courant tunnel fluctuant rapidement sont traités à l'aide d'algorithmes d'apprentissage automatique, ce qui permet de distinguer les acides aminés individuels et les petits peptides 37 . De plus, des écarts d'électrodes plus petits ont été introduits pour obtenir des signaux distincts de différents acides aminés et des modifications post-traductionnelles 38 . Le développement ultérieur de la technologie dépendra d'une source fiable de jonctions tunnel avec un espace défini pour remplacer la microscopie à effet tunnel encombrante, mais il est clair que la séquence et les modifications post-traductionnelles des petits peptides peuvent être déterminées 37 . Actuellement, la conductance tunnel est une technologie de preuve de concept pour le séquençage complet de peptides courts qui pourraient un jour être utilisés pour l'analyse des digestions protéiques et étendu à l'analyse des modifications post-traductionnelles (Fig. 1).

Récemment, il a été découvert que les charges électriques peuvent être transmises à travers une protéine si les électrodes sont pontées par une protéine via la formation de liaisons chimiques ou la liaison de ligand 39 . Plus précisément, les changements dans la conformation des protéines lors de l'ajout de nucléotides pourraient être suivis en temps réel à partir des courants continus traversant une ADN polymérase 40 . Bien que l'observation soit préliminaire, les signatures électroniques étaient distinctives lorsque la polymérase était associée à différentes séquences d'ADN, permettant une nouvelle approche du séquençage d'ADN à molécule unique sans marqueur. Une approche similaire pourrait potentiellement être utilisée pour le séquençage des protéines avec des enzymes telles que des protéases ou des glycopeptidases qui traitent les substrats de manière séquentielle.


Résumé

Une paramétrisation structurelle de l'énergie de repliement a été utilisée pour prédire l'effet de mutations d'un seul acide aminé aux emplacements exposés dans les hélices . Les résultats ont été utilisés pour dériver une échelle thermodynamique basée sur la structure des propensions de l'hélice pour les acides aminés. L'analyse thermodynamique basée sur la structure a été réalisée pour quatre systèmes différents pour lesquels des données thermodynamiques structurelles et expérimentales sont disponibles : le lysozyme T4 [Blaber et al. (1994) J. Mol. Biol. 235, 600-624], barnase [Horovitz et al. (1992) J. Mol. Biol. 227, 560-568], une fermeture à glissière synthétique en leucine [O'Neil & Degrado (1990) Sciences 250, 646-651], et un peptide synthétique [Lyu et al. (1990) Sciences 250, 669-673]. Ces études ont permis d'optimiser l'ensemble des surfaces accessibles aux solvants (ASA) pour tous les acides aminés à l'état déplié. Il est montré qu'un seul ensemble de paramètres structure/thermodynamique rend bien compte de tous les ensembles de données expérimentales de propensions d'hélice. Pour le lysozyme T4, la valeur moyenne de la différence absolue entre prédit et expérimentalg valeurs est de 0,09 kcal/mol, pour la barnase 0,14 kcal/mol, pour le coiled-coil synthétique 0,11 kcal/mol et pour le peptide synthétique 0,08 kcal/mol. De plus, cette approche prédit bien la stabilité globale des protéines et rationalise les différences de propensions à l'hélice entre les acides aminés. L'excellent accord observé entre prédit et expérimentalg valeurs pour tous les acides aminés valide l'utilisation de cette paramétrisation structurelle dans les calculs d'énergie libre pour le pliage ou la liaison.

Soutenu par des subventions des National Institutes of Health (RR04328 et GM51362). I.L. est un étudiant invité de l'Universidad de Granada, Granada, Espagne, partiellement soutenu par une bourse du Ministerio de Educación y Ciencia (PB93-1163).

La correspondance doit être adressée à cet auteur. Voix : (410) 516-7743. Télécopieur : (410) 516-6469. Courriel : [e-mail protected]


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Spectres d'absorbance des molécules biologiques

Protéines

Les protéines n'absorbent pas dans la longueur d'onde visible à moins qu'elles n'aient un groupe prothétique (par exemple Fe 2+ ) ou un acide aminé non naturel. Cependant, les acides aminés tryptophane, tyrosine et cystéine absorbent la lumière dans la longueur d'onde UV :

Figure 5.3.1 :Absorption du tryptophane

  • Le tryptophane a un pic d'absorption à 280 nm dans la gamme UV
  • C'est une longueur d'onde utile pour quantifier l'absorption du tryptophane
  • Étant donné que l'absorption est proportionnelle à la concentration, c'est un moyen utile de quantifier la concentration en protéines (pour les protéines contenant Trp)

Acides nucléiques

Les cycles aromatiques des bases des acides nucléiques absorbent également dans la gamme UV :

Graphique 5.3.2 : Absorption dAMP

  • Chaque base d'ADN et d'ARN a un spectre d'absorption légèrement différent
  • 260 ou 280 nm est une longueur d'onde généralement utile pour surveiller la concentration d'acides nucléiques

Notez que les échantillons d'acides nucléiques et de protéines peuvent tous deux absorber à 280 nm, par conséquent, les échantillons de molécules biologiques doivent être pur afin de quantifier en utilisant la spectroscopie d'absorption UV (tout acide nucléique contaminant dans un échantillon de protéine augmentera l'absorbance apparente, de même pour les protéines contaminantes dans un échantillon d'acide nucléique).


Méthodes

Covariation entre les fréquences d'équilibre

Pour la covariation entre les fréquences d'équilibre représentées sur la figure 1, des sites aléatoires ont été sélectionnés à partir de la base de données Pfam 29.0 30 ensemble d'alignements de protéines. Pour chacun de ces états, les fréquences d'équilibre pour chaque paire d'acides aminés ont été extraites en utilisant une pondération de séquence développée par Henikoff et Henikoff. 54 Seuls les alignements de plus de 100 sites avec plus de 100 séquences ont été pris en compte, et les sites avec des lacunes dans plus de 50 % des séquences (pondérées) ont été exclus. Ces fréquences d'équilibre ont été utilisées pour calculer les échangeabilités (Fig. 2) en utilisant l'Eq. (5).

Nombre effectif d'acides aminés accessibles et taux de substitution correspondant

Pour les modèles de substitution standard (par exemple, Dayhoff, WAG, JTT, Blossum62, LG), les fréquences d'équilibre publiées ont été utilisées pour calculer le nombre effectif d'acides aminés accessibles en utilisant l'Eq. (6). Le taux de substitution global par rapport au taux neutre a également été calculé en utilisant ces fréquences d'équilibre en utilisant (7) où est calculé avec l'équation. (3) en utilisant le nombre de codons codant pour chaque acide aminé (X) calculer , et est calculé sur la base du modèle nucléotidique K80 ( ). 55 Les calculs avec les modèles CAT 36 ont été effectués de manière similaire, en faisant la moyenne sur l'ensemble des modèles de classe de site. Chaque point de l'ensemble Pfam 30 représente la moyenne sur un seul alignement de protéine.

Simulations évolutives

(8)

En partant d'une séquence aléatoire de codons (à l'exclusion des codons d'arrêt), le taux de toutes les substitutions de base unique possibles a été calculé en utilisant l'équation. 2, en utilisant le modèle nucléotidique K80 ( ). 55 Le temps était avancé d'un montant choisi dans une distribution exponentielle basée sur la somme des taux de substitution, tandis qu'une substitution était acceptée proportionnellement aux taux relatifs. Les simulations ont permis d'atteindre un état d'équilibre dérive-sélection mutationnelle, dans lequel la pression sélective pour une stabilité accrue était en équilibre avec le nombre beaucoup plus important de mutations déstabilisantes. Après ce point, tous les résultats ont été obtenus avec des simulations dans lesquelles la fitness de la protéine a subi des fluctuations aléatoires non biaisées. Les simulations étaient totalement transparentes, ce qui signifie que le moment et la nature de chaque substitution, les taux de substitution instantanés et les fréquences d'équilibre instantané à chaque emplacement étaient accessibles.


Estimation de la constante de diffusion d'une protéine en fonction du nombre d'acides aminés - Biologie

Malgré les efforts déployés au cours du dernier demi-siècle, il existe toujours un besoin de méthodes et de données harmonisées au niveau international. En fait, comme décrit au chapitre 1, le développement de nouvelles méthodes d'analyse de composants spécifiques des macronutriments énergétiques a accru la complexité et rendu ce besoin plus grand que jamais.

Ce chapitre traite des méthodes analytiques couramment utilisées pour les protéines, les lipides et les glucides, et formule des recommandations concernant les méthodes préférées pour l'état actuel de l'art et la technologie disponible. Les méthodes qui continuent d'être acceptables lorsque les méthodes préférées ne peuvent pas être utilisées sont également indiquées. Les méthodes d'analyse pour l'alcool, qui peut être une source importante d'énergie dans certains régimes, les polyols et les acides organiques n'ont pas été discutés, et aucune recommandation de méthodes n'est donc formulée.

2.1 MÉTHODES D'ANALYSE DES PROTÉINES DANS LES ALIMENTS

Pendant de nombreuses années, la teneur en protéines des aliments a été déterminée sur la base de la teneur en azote total, tandis que la méthode Kjeldahl (ou similaire) a été presque universellement appliquée pour déterminer la teneur en azote (AOAC, 2000). La teneur en azote est ensuite multipliée par un facteur pour arriver à la teneur en protéines. Cette approche est basée sur deux hypothèses : que les glucides et les graisses alimentaires ne contiennent pas d'azote, et que presque tout l'azote de l'alimentation est présent sous forme d'acides aminés dans les protéines. Sur la base des premières déterminations, la teneur moyenne en azote (N) des protéines était d'environ 16 pour cent, ce qui a conduit à utiliser le calcul N x 6,25 (1/0,16 = 6,25) pour convertir la teneur en azote en teneur en protéines.

Cette utilisation d'un seul facteur, 6,25, est confondue par deux considérations. Premièrement, tout l'azote des aliments ne se trouve pas dans les protéines : il est également contenu dans des quantités variables d'autres composés, tels que les acides aminés libres, les nucléotides, la créatine et la choline, où il est appelé azote non protéique (NPN). Seule une petite partie du NPN est disponible pour la synthèse des acides aminés (non essentiels). Deuxièmement, la teneur en azote d'acides aminés spécifiques (en pourcentage du poids) varie en fonction du poids moléculaire de l'acide aminé et du nombre d'atomes d'azote qu'il contient (de un à quatre, selon l'acide aminé en question). Sur la base de ces faits et des différentes compositions d'acides aminés de diverses protéines, la teneur en azote des protéines varie en fait d'environ 13 à 19 pour cent. Cela équivaudrait à des facteurs de conversion d'azote allant de 5,26 (1/0,19) à 7,69 (1/0,13).

En réponse à ces considérations, Jones (1941) a suggéré que N x 6,25 soit abandonné et remplacé par N x un facteur spécifique à l'aliment en question. Ces facteurs spécifiques, désormais appelés « facteurs de Jones » ont été largement adoptés.Les facteurs de Jones pour les aliments les plus couramment consommés vont de 5,18 (noix, graines) à 6,38 (lait). Il s'avère, cependant, que la plupart des aliments avec une forte proportion d'azote comme NPN contiennent des quantités relativement faibles de N total (Merrill et Watt, 1955 et 1973). [4] En conséquence, la gamme des facteurs de Jones pour les principales sources de protéines dans l'alimentation est plus étroite. Les facteurs de Jones pour les protéines animales telles que la viande, le lait et les œufs sont compris entre 6,25 et 6,38, ceux des protéines végétales qui fournissent des quantités substantielles de protéines dans les régimes à base de céréales/légumineuses sont généralement compris entre 5,7 et 6,25. L'utilisation du facteur haut de gamme (6,38) par rapport à 6,25 augmente la teneur apparente en protéines de 2 %. L'utilisation d'un facteur spécifique de 5,7 (Sosulski et Imafidon, 1990) plutôt que du facteur général de 6,25 diminue la teneur apparente en protéines de 9 pour cent pour des aliments spécifiques. Concrètement, l'éventail des différences entre le facteur général de 6,25 et les facteurs de Jones est plus étroit qu'il n'y paraît à première vue (environ 1 %), en particulier pour les régimes mixtes. Le tableau 2.1 donne des exemples de facteurs de Jones pour une sélection d'aliments.

Étant donné que les protéines sont constituées de chaînes d'acides aminés reliées par des liaisons peptidiques, elles peuvent être hydrolysées en leurs acides aminés constitutifs, qui peuvent ensuite être mesurés par chromatographie échangeuse d'ions, gaz-liquide ou liquide haute performance. La somme des acides aminés représente alors la teneur en protéines (en poids) de l'aliment. C'est ce qu'on appelle parfois une « vraie protéine ». L'avantage de cette approche est qu'elle ne nécessite aucune hypothèse ou connaissance de la teneur en NPN de l'aliment ou des proportions relatives d'acides aminés spécifiques - éliminant ainsi les deux problèmes liés à l'utilisation du N x total facteur de conversion. Son inconvénient est qu'elle nécessite un équipement plus sophistiqué que la méthode Kjeldahl, et peut donc dépasser la capacité de nombreux laboratoires, en particulier ceux qui n'effectuent que des analyses intermittentes. De plus, l'expérience avec la méthode est importante, certains acides aminés (par exemple les acides aminés contenant du soufre et le tryptophane) sont plus difficiles à déterminer que d'autres. Malgré les complexités de l'analyse des acides aminés, en général, il y a eu un assez bon accord entre les laboratoires et les méthodes (King-Brink et Sebranek, 1993).

TABLEAU 2.1
Facteurs spécifiques (Jones) pour la conversion de la teneur en azote en teneur en protéines (aliments sélectionnés)

Source : Adapté et modifié de Merrill et Watt (1973).

  • les aliments utilisés comme seule source de nourriture, comme les préparations pour nourrissons
  • aliments/formules conçus spécifiquement pour des conditions diététiques particulières
  • nouveaux aliments.

2.2 MÉTHODES D'ANALYSE DES GRAISSES DANS LES ALIMENTS

Il y a peut-être plus d'accord sur les méthodes d'analyse standardisées pour les graisses que pour les protéines et les glucides. La plupart des graisses dans l'alimentation se présentent sous la forme de triglycérides (trois acides gras estérifiés en une molécule de glycérol). Il existe également des composants non glycéridés tels que des stérols, par ex. cholestérol. Bien qu'il y ait un intérêt considérable pour les rôles que ces composants non glycéridés peuvent jouer dans le métabolisme, ils ne sont pas d'importantes sources d'énergie dans l'alimentation (FAO, 1994).

Il existe des méthodes gravimétriques AOAC acceptées pour les matières grasses brutes, qui comprennent les phospholipides et les esters de cire, ainsi que des quantités mineures de matières non grasses (AOAC, 2000). Les graisses totales peuvent être exprimées en équivalents triglycérides déterminés comme la somme des acides gras individuels et exprimés en triglycérides (FAO, 1994). Cette méthode est satisfaisante pour la détermination des matières grasses dans une grande variété d'aliments.

1) À des fins énergétiques, il est recommandé que les graisses soient analysées en acides gras et exprimées en équivalents triglycérides, car cette approche exclut les cires et la teneur en phosphate des phospholipides, dont aucun ne peut être utilisé pour l'énergie (James, Body et Smith, 1986 ).

2) Une méthode gravimétrique, bien que moins souhaitable, est acceptable à des fins d'évaluation énergétique (AOAC, 2000).

2.3 MÉTHODES D'ANALYSE DES GLUCIDES DANS LES ALIMENTS

La FAO/OMS a organisé une consultation d'experts sur les glucides en 1997. Le rapport de cette réunion (FAO, 1998) présente une description détaillée des différents types de glucides et un examen des méthodes utilisées pour l'analyse, résumé conceptuellement dans les paragraphes suivants. D'autres recommandations de la consultation de 1997, par ex. la nomenclature des glucides, ont été examinés par les participants à l'atelier technique actuel.

La teneur totale en glucides des aliments a, pendant de nombreuses années, été calculée par différence plutôt qu'analysée directement. Selon cette approche, les autres constituants de l'aliment (protéines, graisses, eau, alcool, cendres) sont déterminés individuellement, additionnés et soustraits du poids total de l'aliment. Ceci est appelé glucides totaux par différence et est calculé par la formule suivante :

100 - (poids en grammes [protéines + graisses + eau + cendres + alcool] dans 100 g d'aliments)

Il doit être clair que les glucides estimés de cette manière incluent les fibres, ainsi que certains composants qui ne sont pas à proprement parler des glucides, par ex. acides organiques (Merrill et Watt, 1973). Les glucides totaux peuvent également être calculés à partir de la somme des poids des glucides et des fibres individuels après que chacun a été directement analysé.

Les glucides disponibles représentent la fraction des glucides qui peut être digérée par les enzymes humaines, est absorbée et entre dans le métabolisme intermédiaire. (Il n'inclut pas les fibres alimentaires, qui ne peuvent être une source d'énergie qu'après fermentation - voir les sous-sections suivantes.) Les glucides disponibles peuvent être déterminés de deux manières différentes : ils peuvent être estimés par différence ou analysés directement. [6] Pour calculer les glucides disponibles par différence, la quantité de fibres alimentaires est analysée et soustraite des glucides totaux, ainsi :

100 - (poids en grammes [protéines + graisses + eau + cendres + alcool + fibres alimentaires] dans 100 g d'aliments)

Cela donne le poids estimé de glucides disponibles, mais ne donne aucune indication sur la composition des divers saccharides comprenant des glucides disponibles. Alternativement, les glucides disponibles peuvent être dérivés en additionnant les poids analysés des glucides disponibles individuels. Dans les deux cas, les glucides disponibles peuvent être exprimés en poids de glucides ou en équivalents monosaccharides. Pour un résumé de toutes ces méthodes, voir le tableau 2.2.

Les fibres alimentaires sont un concept physiologique et nutritionnel relatif aux composants glucidiques des aliments qui ne sont pas digérés dans l'intestin grêle. Les fibres alimentaires passent non digérées de l'intestin grêle dans le côlon, où elles peuvent être fermentées par des bactéries (la microflore), le résultat final étant des quantités variables d'acides gras à chaîne courte et plusieurs gaz tels que le dioxyde de carbone, l'hydrogène et le méthane. Les acides gras à chaîne courte sont une importante source directe d'énergie pour la muqueuse colique, ils sont également absorbés et entrent dans le métabolisme intermédiaire (Cummings, 1981).

TABLEAU 2.2
Glucides totaux et disponibles

Par différence : 100 - (poids en grammes [protéines + graisses + eau + cendres + alcool] dans 100 g d'aliment)
Par analyse directe : poids en grammes (mono- + disaccharides + oligosaccharides + polysaccharides, dont fibre)

Par différence : 100 - (poids en grammes [protéines + matières grasses + eau + cendres + alcool + fibres] dans 100 g d'aliment)
Par analyse directe : poids en grammes (mono- + disaccharides + oligosaccharides + polysaccharides, hors fibre)*

* Peut être exprimé en poids (forme anhydre) ou en équivalents monosaccharides (forme hydratée incluant l'eau).

Chimiquement, les fibres alimentaires peuvent comprendre : de la cellulose, de l'hémicellulose, de la lignine et des pectines provenant des parois des cellules, de l'amidon résistant et plusieurs autres composés (voir Figure 2.1). Au fur et à mesure que l'on en apprenait davantage sur les fibres, diverses méthodes d'analyse ont été développées. Beaucoup d'entre eux mesurent différents composants de la fibre et donnent ainsi différentes définitions et valeurs pour celle-ci. Trois méthodes ont fait l'objet d'essais collaboratifs suffisants pour être généralement acceptées par des organismes tels que l'AOAC International et le Bureau Communautaire de Référence (BCR) de la Communauté européenne (CE) (FAO, 1998) : la méthode enzymatique et gravimétrique AOAC (2000) - Prosky (985.29) la méthode chimique enzymatique de Englyst et Cummings (1988) et la méthode chimique enzymatique de Theander et Aman (1982). Monro et Burlingame (1996) ont cependant souligné qu'au moins 15 méthodes différentes sont appliquées pour déterminer les valeurs de fibres alimentaires utilisées dans les tables de composition des aliments. Leur publication et le rapport FAO/OMS sur les glucides dans la nutrition humaine (FAO, 1998) traitent de ces questions plus en détail. L'effet d'avoir une telle variété de méthodes pour les fibres alimentaires, chacune donnant une valeur quelque peu différente, affecte non seulement les valeurs des tables de composition des aliments pour les fibres alimentaires en soi, mais aussi celles des glucides disponibles par différence.

1) Les glucides disponibles sont un concept utile dans l'évaluation énergétique et doivent être conservés. Cette recommandation est en contradiction avec le point de vue de la consultation d'experts de 1997, qui a approuvé l'utilisation du terme « glucides glycémiques » pour signifier « fournir des glucides pour le métabolisme » (FAO, 1998). Le groupe actuel a exprimé des inquiétudes quant au fait que les « glucides glycémiques » pourraient être confondus ou même assimilés au concept « de l'« index glycémique » , qui est un indice qui décrit la réponse relative de la glycémie aux différents « glucides disponibles ». Le terme « disponible » semble exprimer adéquatement le concept de « fournir des glucides pour le métabolisme », tout en évitant cette confusion.

2) Les glucides doivent être analysés par une méthode permettant de déterminer à la fois les glucides disponibles et les fibres alimentaires. À des fins d'évaluation énergétique, une analyse directe standardisée des glucides disponibles par sommation des glucides individuels (Southgate, 1976 Hicks, 1988) est préférable à l'évaluation des glucides disponibles par différence, c'est-à-dire des glucides totaux par différence moins les fibres alimentaires. Cela permet de séparer les mono- et disaccharides des amidons, ce qui est utile pour déterminer la teneur en énergie, comme discuté au chapitre 3.

3) La détermination des glucides disponibles par différence est considérée comme acceptable aux fins de l'évaluation énergétique pour la plupart des aliments, mais pas pour les nouveaux aliments ou les aliments pour lesquels une allégation de teneur réduite en énergie doit être faite. Dans ces cas, une analyse directe standardisée des glucides disponibles doit être effectuée.

4) Les « fibres alimentaires » sont un concept utile qui est familier aux consommateurs et qui devrait être conservé sur l'étiquetage des aliments et dans les tableaux des aliments. Étant donné que la caractéristique physique de solubilité/insolubilité n'est pas strictement corrélée à la fermentescibilité/non-fermentation, la distinction entre fibres solubles et insolubles n'a pas de valeur dans l'évaluation énergétique, ni pour le consommateur.

5) L'analyse AOAC (2000) - Prosky (985,29) ou une méthode similaire doit être utilisée pour l'analyse des fibres alimentaires.

6) Étant donné que les fibres alimentaires peuvent être déterminées par un certain nombre de méthodes qui donnent des résultats différents, lorsque la méthode de Prosky n'est pas utilisée, la méthode utilisée doit être indiquée et la valeur doit être identifiée par les étiquettes INFOODS [7] (Klensin et al., 1989 ). De plus, la méthode doit être identifiée avec le nom d'étiquette dans les tableaux de composition des aliments.

7) Des recherches supplémentaires et un consensus scientifique sont nécessaires afin de développer des méthodes normalisées d'analyse de l'amidon résistant.

Figure 2.1 - Fibres alimentaires : constituants et fractions polysaccharidiques associées


2 RÉSULTATS

Nous avons étudié le comportement des mélanges polyR/polyU et polyK/polyU en utilisant comme modèles moléculaires des peptides longs d'arginine et de lysine à cinq résidus (R5 et K5, respectivement) avec de longs fragments d'ARN d'acide polyuridylique à cinq résidus (U5). Ce choix est justifié par plusieurs facteurs : (a) la bonne précision des champs de force de dernière génération pour reproduire l'ensemble structural des petits oligonucléotides 22, (b) les difficultés potentielles d'échantillonnage associées à une dynamique conformationnelle plus lente des peptides/oligonucléotides longs 23 et, plus important encore, (c) l'observation expérimentale que le comportement différentiel de polyR/polyU et polyK/polyU ne dépend pas de la taille moléculaire. 16

Nous avons d'abord caractérisé l'affinité relative de R5 et K5 avec u5 dans des conditions hautement diluées en effectuant des simulations MD impartiales d'une seule chaîne peptidique avec une chaîne oligonucléotidique. Les trajectoires MD (voir Méthodes) ont révélé de multiples événements de liaison/déliaison bien que les goulots d'étranglement cinétiques empêchent une détermination précise de la stabilité thermodynamique des complexes peptide/nucléotide, en particulier dans le cas de R5/U5 système, à l'échelle de la microseconde (Figure 1(a), (b)). Pour surmonter ces difficultés d'échantillonnage, nous nous sommes appuyés sur la méthode d'échange de répliques hamiltonienne REST2 (voir Méthodes) qui s'est avérée accélérer considérablement l'échantillonnage conformationnel pour les biomolécules solvatées. 24 En adoptant cette approche, nous avons pu évaluer de manière fiable la stabilité des complexes peptide/oligonucléotide en déterminant le profil d'énergie libre (FEP) en fonction de la surface d'interaction intermoléculaire pour les deux R5/U5 et K5/U5 (Figure 1(c)). Les deux profils affichent un minimum d'énergie libre correspondant aux états non liés (surface d'interaction = 0) et un grand bassin associé à une variété de complexes structurellement hétérogènes, comme prévu pour une interaction dynamique et électrostatique entre deux biomolécules flexibles. La comparaison des FEP indique que dans des conditions fortement diluées R5 se lie à U5 plus fortement que K5 et il forme des complexes caractérisés par une plus grande surface d'interaction, comme cela a déjà été suggéré par les simulations impartiales. Une analyse plus quantitative des simulations REST a fourni une estimation approximative des constantes de dissociation complexes, qui diffèrent de plus d'un ordre de grandeur (K = 23 M pour R5/U5, et K = 850 µM pour K5/U5, voir Méthodes).

Nous avons ensuite cherché à caractériser les interactions moléculaires dans des conditions mimant les coacervats denses protéine/ARN. Malheureusement, la composition moléculaire réelle des phases condensées polyK/polyU ou polyR/polyU, en termes de rapport ARN/protéine et teneur en eau, reste à déterminer expérimentalement. Les simulations de coexistence de phases 25, 26 pourraient en principe donner accès à ces informations mais leurs applications au niveau atomistique nécessiteraient un effort de calcul prohibitif même dans le cas de petits peptides/oligonucléotides. Pour contourner cette difficulté, nous avons décidé de nous concentrer ici sur R5/U5 et K5/U5 mélanges avec un rapport moléculaire 1:1 et de caractériser leur comportement dans une gamme de concentrations comparables à celles déterminées pour des condensats biomoléculaires modèles in vitro. Pour cette raison, nous avons simulé des mélanges de peptides/oligonucléotides avec des densités biomoléculaires d'environ 125, 250 et 500 mg/ml, qui correspondent à diverses fractions d'emballage de volume (figure 2(a)-(c), tableau S1). Même dans ces conditions très encombrées, les peptides et les nucléotides forment des contacts intermoléculaires dynamiques, sans formation de complexes irréversibles (Figure S1). Nous avons d'abord inspecté l'arrangement global des biomolécules dans les différents systèmes en déterminant la fonction de distribution radiale (RDF) des distances intermoléculaires entre tous les atomes lourds biomoléculaires (Figure 2(d)-(f)). La comparaison de ces RDF intermoléculaires avec les distributions correspondant à des arrangements aléatoires a révélé des attractions notables entre les biomolécules, indépendamment de la concentration et de la nature des peptides. Ces interactions favorables se traduisent par une augmentation de la densité locale moyenne à l'échelle nanométrique qui est particulièrement évidente à des concentrations plus faibles et plus prononcée pour R5/U5 systèmes, suggérant une liaison intermoléculaire plus forte. Afin de disséquer les forces motrices moléculaires, nous avons ensuite analysé le nombre moyen de contacts protéine-protéine, protéine-ARN et ARN-ARN par molécule (voir Méthodes et Figure 2(g)-(i)). Dans tous les systèmes, les interactions hétérotypiques entre les peptides et les oligonucléotides représentent la plus grande contribution aux contacts intermoléculaires, comme prévu en raison de l'attraction électrostatique entre les fractions de charge opposée. Par conséquent, les interactions homotypiques jouent un rôle plus limité. En particulier, les contacts protéine-protéine sont extrêmement limités dans tous les mélanges, en raison des répulsions électrostatiques entre les peptides chargés positivement. Cet effet est moins prononcé dans le cas des interactions ARN-ARN, qui représentent une fraction importante des contacts intermoléculaires, probablement en raison de la plus faible densité de charge de U5 oligonucléotides qui sont plus gros et ont une charge nette plus petite que R5/K5 peptides. Néanmoins, les interactions électrostatiques ne peuvent pas expliquer la propension d'interaction plus élevée de polyR par rapport à polyK. Les contacts homotypiques polyR-polyR sont en effet plus fréquents que ceux polyK-polyK à toutes les concentrations, comme prévu en raison de la tendance bien connue des chaînes latérales de l'arginine à former des interactions d'empilement favorables. Plus frappant encore, R5 les peptides affichent une propension significativement plus élevée à se lier aux oligonucléotides U5 à toutes les concentrations, même si la différence entre le nombre de contacts hétérotypiques est atténuée dans les systèmes plus denses et plus encombrés (

50 % d'augmentation relative à 125 mg/ml par rapport à

25 % à 500 mg/ml). Ensuite, nous avons évalué la mobilité des chaînes peptidiques et oligonucléotidiques dans les systèmes étudiés en estimant les coefficients de diffusion pour les différentes espèces à différentes concentrations (Figure 2(j)-(l)). Les résultats indiquent que la diffusion moléculaire est fortement dépendante de la concentration car les coefficients de diffusion diminuent approximativement de deux ordres de grandeur entre les mélanges à 125 mg/ml et ceux à 500 mg/ml. Au-delà de cette tendance globale, l'analyse suggère que les oligonucléotides sont légèrement moins mobiles que les polypeptides, de manière cohérente avec leur taille et leur poids moléculaire plus importants. Les interactions intermoléculaires plus fortes et les densités locales plus élevées observées dans R5/U5 systèmes ralentissent la diffusion de tous leurs composants d'un facteur de

2 par rapport à K5/U5 à concentration équivalente.

Afin d'avoir un aperçu plus approfondi des déterminants microscopiques des interactions protéine-ARN et d'élucider les différents comportements entre les résidus d'arginine et de lysine, nous avons d'abord divisé les contributions des groupes de chaînes principales et latérales au nombre de contacts protéine-ARN (Figure 3(a),(b)). Cette analyse a indiqué que les interactions hétérotypiques médiées par le squelette sont similaires pour R5 et K5 et que la propension différente à l'interaction avec les oligonucléotides provient principalement des contacts avec les chaînes latérales structurellement diverses. Ainsi, nous nous sommes concentrés sur ce dernier et nous avons déterminé le RDF entre les chaînes latérales peptidiques et les différents groupes chimiques dans les oligonucléotides, à savoir phosphate, ribose et base (voir Méthodes). Globalement, les RDF correspondant à R5/U5 et K5/U5 Les systèmes présentent des différences significatives à la fois dans la position et l'intensité des pics, suggérant immédiatement des modes de liaison distincts pour les chaînes latérales de l'arginine et de la lysine. Dans les deux systèmes, l'interaction directe avec le groupe phosphate est caractérisée par un pic majeur à <0,5 nm (figure 3(c),(d) panneau supérieur), qui correspond à la formation de liaisons hydrogène (liaisons H) entre les oxygènes phosphates et les groupes basiques des chaînes latérales (figure 3(c), (d) encarts et panneau inférieur). Remarquablement, le nombre moyen de liaisons H simultanées formées par l'arginine est environ le double de celui formé par la lysine. L'interprétation des interactions des chaînes latérales avec le ribose (Figure 3 (e), (f) panneau supérieur) est moins simple. Le large pic entre 0,4 et 0,7 nm observé pour polyK et polyR indique une variété de modes de liaison caractérisés par des distances similaires, qui peuvent être attribuées à la forme complexe du groupe sucre. Pour les deux chaînes latérales, une fraction de ces interactions implique la formation de liaisons H avec le groupe hydroxyle du sucre (figure 3 (e), (f) encarts et panneau inférieur). À l'inverse, les RDF suggèrent que les interactions de l'arginine et de la lysine avec les bases d'ARN diffèrent significativement (figure 3(g), (h) panneau supérieur) : tandis que la lysine présente un pic unique à une distance de

0,6 nm, correspondant à la liaison H avec les oxygènes carbonyle du cycle de la nucléobase, les chaînes latérales de l'arginine présentent également un mode de liaison alternatif à des distances inférieures, représentant un arrangement d'empilement de la nucléobase et du groupe guanidinium plan (Figure 3(g), ( h) encarts et panneau inférieur) qui rappelle les interactions d'empilement entre l'arginine et les acides aminés aromatiques.

L'analyse précédente a mis en évidence que les chaînes latérales de l'arginine et de la lysine peuvent former une variété de liaisons H avec les divers groupes chimiques d'oligonucléotides. Afin de rationaliser le comportement différent de polyR et polyK, nous avons ainsi calculé le nombre moyen de liaisons H formées simultanément par un seul acide aminé, en limitant la moyenne aux résidus qui sont en contact direct avec polyU pour réduire sa dépendance à la densité du système (Figure 4(a)). Cette analyse révèle que chaque arginine forme environ deux fois plus de liaisons H que les chaînes latérales de la lysine. Ce résultat ne dépend pas de la concentration globale du système et peut être attribué aux différences structurelles entre les chaînes latérales d'acides aminés et à la disponibilité de plus d'atomes donneurs d'hydrogène dans les chaînes latérales d'arginine. De plus, les groupes guanidinium peuvent contribuer au réseau de contact intermoléculaire également par le biais d'interactions d'empilement avec les bases nucléotidiques comme suggéré par RDF. Le nombre moyen de ces interactions formées par chaque arginine est significativement plus petit que le nombre de liaisons H mais loin d'être négligeable (figure 4(b)). Par conséquent, la chaîne latérale d'arginine à deux volets et plane permet la formation simultanée d'un ensemble plus large et plus diversifié d'interactions protéine-ARN que la chaîne latérale de lysine. Cette multivalence est illustrée par certaines conformations représentatives extraites de trajectoires MD où les groupes de guanidinium coordonnent plusieurs bases via des liaisons H et des interactions d'empilement (figure 4 (c), panneau de gauche) ou un pont. En fait, divers exemples peuvent être identifiés de groupes guanidinium coordonnant plusieurs bases via des liaisons hydrogène et des interactions pi-pi (Figure 4 (c), panneau de gauche), ou formant des interactions de pont entre les groupes phosphate et bases (Figure 4 (c), centrale et panneau de droite).


Expliquez les preuves biochimiques de l'ascendance commune des organismes sur Terre.

tous les organismes utilisent l'ADN comme matériel génétique

les quatre mêmes bases (nucléotidiques) constituent l'ADN de tous les organismes

le nombre de mutations reflète les différences entre les organismes

tous les organismes utilisent le même code génétique / différences mineures

le code génétique est dégénéré/OWTTE

tous les organismes utilisent les mêmes 20 acides aminés

fonction des protéines constante entre les espèces

exemples de protéines/molécules (par exemple hémoglobine, cytochrome, chlorophylle)

seuls les acides aminés gauchers ont été observés dans les organismes vivants

bien que les acides aminés droitiers auront été disponibles

seulement le glucose/hydrates de carbone droitiers utilisés dans les organismes

similitudes dans la glycolyse/voies métaboliques

tous utilisent l'ARN/les mêmes enzymes dans la transcription/la traduction


Dosage de fluorescence en biologie et médecine

Biologie moléculaire : une série internationale de monographies et de manuels : Essai de fluorescence en biologie et en médecine, le volume II couvre les nombreuses applications de la fluorescence et de la phosphorescence. Ce livre traite des principes de la polarisation de la fluorescence, de la comparaison des méthodes d'analyse de la luminescence et de la mesure directe des temps de décroissance de la fluorescence. La photodécomposition, les composés sulfhydryles, la détermination de la structure primaire et la coloration fluorescente sont également examinés. Ce texte couvre également le dosage des purines dans les hydrolysats d'acides nucléiques, la formyltétrahydrofolate synthétase et les hormones ovariennes. Ce volume est précieux pour les chimistes, les physiciens et les biophysiciens ayant l'intention d'utiliser la fluorescence pour étudier les mécanismes de réaction et élucider la structure des biopolymères complexes.

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Voir la vidéo: Cours Protéines - Partie 2: Peptides (Décembre 2022).