Informations

Étapes pour confirmer si le miARN prédit est bon ou mauvais

Étapes pour confirmer si le miARN prédit est bon ou mauvais


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

J'ai aligné tous les miARN disponibles sur les supercontigs d'un génome particulier avec certains paramètres (valeur e de 0,01 et correspondance de mots d'au moins 7 comme suggéré dans cet article). J'ai également isolé les pré-miARN (+100 nucléotides à chaque extrémité de la zone de match). Que suggéreriez-vous comme méthodes ab-initio idéales pour confirmer que ces miARN existent dans ce génome particulier ? Certains papiers que j'ai trouvés utilisent mFOLD comme celui-ci.

Que suggéreriez-vous comme meilleures étapes pour confirmer si un miARN/pré-miARN prédit est réellement présent dans le génome.


Il n'y aura pas de doublons dans miRBase (pour un organisme donné). Choisissez le taxon le plus proche de votre organisme si vous faites une découverte basée sur l'homologie. Si vous voulez prendre tous/plusieurs organismes, vous pouvez utiliserfastx_collapserpour réduire les séquences redondantes. Cependant, vous perdrez le nom du miARN. Vous pouvez utiliserokaussi pour cela et il conservera l'en-tête de séquence du premier organisme de la liste.

awk '/>/{$0=h} !(/>/){if($0 dans a){next} else{a[$0];print h"
"$0}}' organisme1.fa organisme2.fa… organismeN.fa

Assurez-vous qu'il n'y a pas de nouvelles lignes supplémentaires, sinon vous pourriez avoir besoin d'une petite modification

Pour savoir si quelque chose est un miARN exprimé, vous devez effectuer un petit séquençage d'ARN. Il existe des outils tels que mirdeep et mirSVR que vous pouvez utiliser pour découvrir des séquences de miARN.


L'induction de miR-493 au cours de la cancérogenèse bloque la fixation métastatique des cellules cancéreuses du côlon dans le foie

La métastase hépatique est une complication mortelle majeure associée au cancer du côlon, et les étapes post-intravasation de la métastase sont importantes pour son intervention clinique. Afin d'identifier les microARN inhibiteurs (miARN) pour ces étapes, nous avons effectué des criblages "d'abandon" d'une bibliothèque de miARN dans un modèle murin de métastases hépatiques. Des analyses fonctionnelles ont montré que miR-493 et ​​dans une moindre mesure miR-493 * étaient capables d'inhiber les métastases hépatiques. miR-493 inhibe la rétention des cellules métastasées dans le parenchyme hépatique et induit leur mort cellulaire. IGF1R a été identifié comme une cible directe de miR-493, et son inhibition a partiellement phénocopé les effets anti-métastatiques. Des niveaux élevés de miR-493 et ​​de miR-493 *, mais pas de pri-miR-493, dans le cancer du côlon primitif étaient inversement liés à la présence de métastases hépatiques et attribués à une augmentation de l'expression de miR-493 au cours de la carcinogenèse. Nous proposons que, dans un sous-ensemble de cancer du côlon, la régulation à la hausse de miR-493 au cours de la carcinogenèse empêche les métastases hépatiques via l'induction de la mort cellulaire des cellules métastasées.


1. Introduction

Les mutations sont l'une des forces fondamentales de l'évolution car elles alimentent la variabilité des populations et permettent ainsi des changements évolutifs. Sur la base de leurs effets sur la forme physique, les mutations peuvent être divisées en trois grandes catégories : les « bonnes ou avantageuses » qui augmentent la forme physique, les « m pas affectés par la sélection car leurs effets sont trop faibles. Alors que cette vision simpliste sert de première règle empirique pour comprendre le devenir des mutations, la recherche au cours des dernières décennies a découvert un réseau complexe d'interactions. Par exemple, (i) les effets des mutations dépendent souvent de la présence ou de l'absence d'autres mutations, (ii) leurs effets peuvent également dépendre de l'environnement, (iii) le devenir des mutations peut dépendre de la taille et de la structure de la population , ce qui peut sévèrement limiter la capacité de sélection à discriminer entre les trois types (ce qui fait que tous semblent presque « indifférents ») et (iv) le sort des mutations peut également dépendre du sort d'autres qui ont des effets plus prononcés et sont en proximité sur le même chromosome.

Un objectif théorique majeur dans l'étude de la génétique des mutations des populations est de comprendre comment les mutations modifient les populations à long terme. À cette fin, nous devons considérer de nombreuses caractéristiques de l'évolution et des populations existantes au niveau phénotypique et moléculaire, et nous demander comment celles-ci peuvent être expliquées en termes de taux et de types de mutations et comment elles sont affectées par les forces qui influencent leur destin. .

Nous disposons de plus en plus d'informations pour nous aider à répondre à ces questions. L'amélioration continue de la technologie de séquençage de l'ADN fournit des génotypes plus détaillés sur plus d'espèces et des observations de plus de phénomènes au niveau génomique. Nous comprenons également mieux les processus qui conduisent des changements au niveau des génotypes à travers divers changements moléculaires intermédiaires chez les individus à de nouveaux phénotypes visibles. L'utilisation de ces nouvelles connaissances présente à la fois des opportunités et des défis pour notre compréhension, et de nouvelles méthodes ont été développées pour les aborder.

Brian Charlesworth a été à l'avant-garde de nombreux développements dans la génétique des mutations des populations, à la fois dans la collecte et l'analyse de nouvelles données et en fournissant de nouveaux modèles pour expliquer les observations que lui et d'autres ont faites. Ce numéro thématique de Phil. Trans. R. Soc. B lui est dédié à l'occasion de son 65e anniversaire. Les auteurs des articles qui l'accompagnent ont individuellement apporté d'importantes contributions dans le domaine et ont été directement associés ou indirectement influencés par son travail.

Dans cette collection d'articles, divers aspects sont examinés en détail, et dans cette introduction, nous visons à fournir une vue d'ensemble comme base pour les traitements approfondis qui suivent. Nous décrivons certaines des théories qui servent de base quantitative à des questions plus appliquées et ont été développées dans le but principal de : (i) mesurer les taux auxquels différents types de mutations se produisent dans la nature, (ii) prédire quantitativement leur devenir ultérieur dans les populations, et (iii) évaluer comment elles affectent certaines propriétés des populations et pourraient donc être utilisées à des fins d'inférence. Les articles suivants sont largement organisés dans un continuum allant des questions spécifiques d'estimation des paramètres de base (force de mutation, sélection, recombinaison), en passant par celles qui contribuent à une combinaison de théories biologiques et de données sur ces paramètres, à celles qui traitent principalement de théories biologiques plus larges.

Il existe une vaste gamme d'effets mutationnels sur la valeur adaptative, et de grandes différences existent dans la force des autres forces évolutives qui opèrent sur les populations. Cela génère un éventail de phénomènes complexes qui continuent de défier notre capacité à comprendre mécaniquement l'évolution. Pour résoudre les problèmes, les théoriciens ont divisé l'espace des paramètres en régions plus petites de manière à pouvoir formuler des hypothèses simplificatrices spécifiques. Celles-ci consistent généralement à supposer l'absence d'événements particuliers (par exemple, aucune recombinaison) ou la présence d'équilibres particuliers (par exemple, l'équilibre mutation-sélection). Par la suite, de nouvelles théories sont souvent développées dans lesquelles ces hypothèses sont assouplies de manière à réduire l'écart avec la réalité, incluant généralement plus d'interactions entre diverses forces évolutives, bien qu'au prix de devenir moins faciles à analyser.

La dynamique des mutations est dominée par le hasard, mais nous recherchons des principes généraux indépendants d'événements aléatoires particuliers. Cette tension se reflète dans les modèles utilisés. Toutes les mutations commencent sous forme de copies uniques et la plupart sont perdues à nouveau par hasard, nous pouvons donc au mieux prédire les probabilités de destins particuliers, mais les modèles stochastiques qui peuvent traiter rigoureusement le caractère aléatoire sont souvent trop complexes pour être analysés pour des scénarios réalistes. Si nous ne nous intéressons qu'au résultat moyen de nombreux événements aléatoires individuels, nous pouvons approximer le processus par des modèles déterministes qui prédisent un résultat précis, mais ces approximations peuvent échouer si seuls quelques individus ou événements rares sont impliqués.

Pour faciliter les descriptions concises, il y a une longue histoire en génétique des populations d'utiliser des symboles mathématiques comme abréviations pour divers paramètres et observations, mais malheureusement il n'y a pas de nomenclature unique. Pour essayer d'atteindre nos deux objectifs contradictoires de concision et de lisibilité, nous énumérons quelques paramètres évolutifs importants et leurs abréviations communes dans le tableauਁ . Néanmoins, pour de bonnes raisons d'histoire ou de convention locale, certains de ces symboles sont définis différemment dans certains articles de cette collection.

Tableauਁ.

Quelques paramètres dans la génétique des populations des mutations*.

Utaux de mutation par génération par génome vérifier le contexte pour les effets des mutations
ge, gtaille effective du génome haploïde (toutes les paires de bases fonctionnelles), taille totale du génome haploïde (avec sites neutres)
μ, μ10, μ01taux de mutation par locus ou par site par génération, loin de la base préférée, et retour
κ, tn/tvbiais mutationnel : μ10/μ01, rapport transition/transversion
re, rco, rgctaux de recombinaison effectif, taux de croisement, taux de conversion génique
sle coefficient de sélection mesure les changements dans le contexte du bilan de condition physique pour des définitions exactes (homozygote ou hétérozygote positif ou négatif)
hcoefficient de dominance de sorte que sh est l'effet des mutations hétérozygotes
DME (ou DFE)distribution des effets mutationnels sur la forme physique
WUNEFitness Wrightian d'un génotype A (l'une des nombreuses façons de définir la fitness)
εepistasis : interactions des effets mutationnels. Si la fitness est multiplicative, ε = WUN BWUNEWB
Ne, Ntaille effective de la population, taille de la population du recensement
mtaux de migration
Préparerprobabilité de fixation d'un allèle (mutant)
Tréparer, Tpertetemps de fixation, perte de générations
KUNE, KS (ou N, S)taux de divergence d'ADN par site entre deux espèces corrigé pour les occurrences multiples (voir le contexte pour la méthode) les substitutions peuvent être non synonymes (changer les acides aminés) ou synonymes (ou silencieux) (vérifier le contexte)
πUNE, πS, θWashington, θWSDiversité de l'ADN au sein d'une population par site : π est la diversité nucléotidique moyenne par paire, θW est l'estimation de Watterson pour l'explication des indices voir KUNE, KS
D, D&# x02032, r 2 mesures du déséquilibre de liaison (LD)
Vgvariance génétique dans un caractère quantitatif
VMincrémenter en Vg de nouvelles mutations par génération
VEvariance environnementale d'un caractère quantitatif

*Pour des raisons historiques et en raison des limitations de l'alphabet, plusieurs symboles ont des significations différentes dans des contextes différents. Exemples: h 2 = héritabilité d'un caractère quantitatif r = taux d'autofécondation r = taux de croissance démographique = 𠆍’ de Tajima, où < 0 peut indiquer une expansion de la population ou une sélection directionnelle et > 0 un goulot d'étranglement ou une sélection d'équilibrage.

Naturellement, un examen de cette longueur ne peut pas couvrir tous les aspects de la génétique des mutations des populations. Par exemple, la mutation joue un rôle central dans la théorie de la coalescence (Hein et al. 2005) et dans la construction de cartes de génotype–phénotype qui sont au cœur de certains efforts pour comprendre les paysages adaptatifs, qui fournissent un paradigme pour comprendre de nombreux aspects plus larges de la génétique des populations du point de vue des mutations individuelles (�use le cancer ou non&# x02019), comme examiné ailleurs (Loewe 2009). Ici, nous nous concentrons presque entièrement sur la façon dont les populations d'individus sont modifiées par un grand nombre de mutations qui ont des effets spécifiques sur la forme physique.

Dans ੲ de cet article, nous discutons de ce que l'on sait de la diversité des mutations, et ici et par la suite, nous nous référons à d'autres articles de ce numéro thématique qui fournissent des informations plus approfondies. Dans ੳ, nous passons en revue certaines des théories pertinentes en génétique des populations, en commençant par (i) des théories simples qui traitent le sort des mutations individuelles de manière isolée avant de passer à des modèles plus complexes qui prennent en compte (ii) la liaison, (iii) l'épistasie, (iv) les approches génétiques quantitatives, et (v) les défis rencontrés lors de la tentative d'intégration de toutes celles-ci. Par la suite, nous donnons un aperçu de plusieurs questions générales qui ont été résolues et d'autres qui restent (ੴ) et enfin quelques conclusions (ੵ).


2. Procédures expérimentales

2.1. Tumeurs de rhabdomyosarcome humain

Dix-sept patients traités pour rhabdomyosarcome au Centre Léon Bérard ont été inclus dans cette étude. Quatre tumeurs congelées et treize tumeurs fixées au formol et incluses en paraffine ont été obtenues à partir des biopsies réalisées au diagnostic. Les diagnostics tumoraux ont été réalisés par un anatomopathologiste référent spécialiste de cette pathologie par immunohistochimie, FISH et qPCR.

2.2. Lignées cellulaires cancéreuses

Cinq lignées cellulaires cancéreuses ont été obtenues auprès de l'ATCC (Manassas, VA, USA) : les deux ostéosarcomes humains MNNG/HOS Cl #5 [R-1059-D] (référence CRL-15-47) et Saos-2 (HTB-85) cellules, la lignée cellulaire de chondrosarcome SW1353 (HTB-94) et les deux cellules de lymphome de Burkitt Daudi (CCL-213) et Namalwa (CRL-1432). Des cellules d'ostéosarcome et de chondrosarcome ont été cultivées dans du DMEM (Gibco, Carlsbad, CA, États-Unis), supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal décomplémenté (Lonza, Bâle, Suisse), 10 02009 ml de pénicilline streptomycine (10 02009U/mL/10 02009μg/mL, Gibco, Carlsbad, CA, USA) et 5 mL L-glutamin (200 mM Gibco) à 37ଌ atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2. Des cellules de lymphome ont été cultivées dans du RPMI (Gibco, Carlsbad, CA, USA). Les cellules ont été exposées à 100 nM RAD-001 (Novartis), 50 μM ifosfamide (ifos, Baxter) ou 1 μM cisplatine (CDDP, TEVA) ou 100 μM méthotrexate (MTX, TEVA) pour 24, 48 et 72 h.

2.3. Modèle d'ostéosarcome chez le rat

Les procédures de soins aux animaux ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles et nationales. Les animaux ont été anesthésiés tout au long de toutes les procédures chirurgicales et d'imagerie avec de l'isoflurane/oxygène (2,5%/2,5%, v/v) (Minerve, Esternay, France). Le modèle d'ostéosarcome de rat orthotopique et métastatique transplantable a déjà été décrit [21&# x0201323]. Ce modèle imite son homologue humain en termes d'agressivité, de propagation métastatique et de phénotype de chimiorésistance [21&# x0201323]. Toutes les tumeurs obtenues ont été classées comme ostéoblastiques à la suite d'analyses histologiques. Brièvement, de petits fragments tumoraux (100 & 02009 mm 3 ) prélevés sur une zone tumorale ostéogénique hyperproliférative ont été greffés sur des rats Sprague-Dawley immunocompétents âgés de 3 semaines (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA). Par voie d'abord latérale, un fragment tumoral a été placé en contiguïté de la diaphyse tibiale après abrasion périostée puis, les plaies cutanées et musculaires ont été suturées. Quatorze jours après la transplantation tumorale, les animaux ont subi une première TEP au 18 F − FDG et ont été répartis au hasard dans un groupe témoin traité avec une solution saline ou dans un groupe traité exposé à une dose sous-cutanée de 10 mg/kg d'ifosfamide (ifos, Baxter , Deerfield, IL, USA), à 7 jours d'intervalle (aux jours 15 et 22 après la transplantation tumorale). Un deuxième TEP au 18 F − FDG a été réalisé 7 jours après la deuxième administration d'ifos. Les animaux ont été sacrifiés une semaine après la fin du traitement. Des fragments de tumeur et de tissu normal (muscle, os et poumon) ont été collectés pour des extractions d'ARN.

2.4. Extraction d'ARN et PCR quantitative en temps réel

Les tumeurs FFPE ont été lysées pendant 24 heures dans du tampon ATL (Qiagen, France) supplémenté en protéinase K (Qiagen) à 60 ° C en agitation rotative après différents lavages avec du toluène, de l'éthanol et du tris/EDTA dans cet ordre. L'ARN total a été extrait de culots tumoraux ou cellulaires en utilisant un seul protocole d'extraction au phénol/chloroforme avec Trizol, selon les instructions du fabricant (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Cinq cents nanogrammes d'ARN total ont été soumis à la technologie PCR microfluidique réalisée par Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). En bref, l'ARN a été reverse transcrit, en utilisant des amorces de miARN en boucle spécifiques multiplexées du kit Taqman MicroRNA Reverse Transcription. La deuxième étape consiste en une PCR quantitative en temps réel sur TLDA : les produits de RT sont introduits via des microcanaux dans des puits miniatures préchargés avec des amorces et des sondes spécifiques déshydratées. Récemment, Applied biosystems a publié la deuxième version de TLDA, composée de deux cartes A et B. Des analyses ont été effectuées pour 377 miARN sur la carte A et 290 sur la carte B.

2.5. Normalisation des données PCR

Pour chaque miARN, le cycle seuil (Ct) a été calculé par le logiciel ABI 7900 Sequence Detection System (analyse Ct manuelle plaque par plaque avec un seuil à 0,25 et une ligne de base automatique). Toutes les autres manipulations de données ont été effectuées à l'aide de scripts R. Un seuil de 32 a été appliqué pour éliminer les valeurs tardives de Ct, à l'exception de l'analyse RMS. Environ 60% des miARN ont passé les critères de filtrage et ont été utilisés pour une analyse plus approfondie. Pour chaque TLDA, des contrôles de qualité ont été effectués sur les données brutes en vérifiant les contrôles internes et en utilisant des diagrammes en boîte et en nuage de points. Les échantillons présentant tout type de problèmes ont été rejetés afin qu'ils n'introduisent pas de biais lors des procédures de normalisation suivantes. Nous avons testé différentes méthodes de normalisation car le facteur de normalisation recommandé “pseudo” mammU6 tracé dans chaque carte n'était pas exprimé de manière stable dans nos différents échantillons. La normalisation avec les deux miARN les plus stables identifiés par GeNorm n'était pas optimale non plus. Enfin, une normalisation globale par la médiane a été choisie pour sa fiabilité par rapport aux expériences. Les tissus inclus dans une analyse donnée ont été traités dans leur ensemble, la procédure de normalisation étant appliquée séparément pour les deux types de cartes, A et B. La distribution des données normalisées a été vérifiée avec des box plots et des plots de corrélation. La formule suivante a été utilisée pour corriger les valeurs Ct de chaque carte :

Grâce à cette approche, la nouvelle valeur médiane partagée par tous les échantillons peut être considérée comme une sorte de « gène de ménage virtuel » parfait. Par conséquent, la méthode standard Δ㥌t peut être utilisée pour déterminer les quantités relatives (RQ) comme suit :

Pour le calcul du Δ㥌t, il était plus pertinent pour les analyses statistiques d'utiliser la moyenne de tous les 㥌t obtenus à travers les échantillons pour chaque miARN, au lieu d'utiliser le 㥌t d'un échantillon de référence

2.6. Prédictions cibles miARN

Nous avons compilé 4 bases de données pour déterminer les cibles miARN : TargetScan 5.1, MiRanda, PICTAR et les bases de données miRbase.Ces bases de données recherchent la présence de sites 8mer et 7mer conservés sur les parties 3 & 02032UTR de l'ARN messager qui correspondent à la région de graine de chaque miARN. Il prédit également l'efficacité du ciblage pour chaque site correspondant. Nous avons créé notre propre base de données qui regroupait chaque miARN avec le geneID de toutes leurs cibles protéiques, pour le rat et l'humain. Nous n'avons conservé que les couples miARN/geneID présents dans au moins deux bases de données.

2.7. Prédictions des voies de signalisation cellulaire régulées par miARN

Nous avons utilisé l'application Web “G-language microarray”, qui permet la cartographie de l'ensemble de données moléculaires sur les cartes des voies de l'“Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes” (KEGG) [24]. Nous avons d'abord saisi les protéines d'intérêt ciblées par les miARN et la somme des valeurs RQ pour tous les miARN qui régulent ces protéines, contenues entre 1 et 50, puis le logiciel génère des données KEGG pour créer des graphiques FLASH des voies de signalisation cellulaire dans lesquelles les protéines sont impliquées. L'intensité de la couleur d'une protéine mise en évidence varie avec la force de sa régulation par les miARN.

2.8. Essai de prolifération

Les cellules ont été étalées dans des plaques à 96 puits à 5 000 cellules/puits et exposées à 100 ° x 02009 nM RAD-001, 50 ° x 02009μM ifosfamide, 100 μM méthotrexate, ou 1 μM cisplatine ou non (NT). La croissance cellulaire a été mesurée 24, 48 et 72 h plus tard avec 20 %μRéactif luminescent L Cell Titer Glo (Promega, Madison, WI, USA) pendant 10 min. La luminescence a été enregistrée en utilisant un lecteur Microbeta (PerkinElmer, Fremont, CA, USA).

2.9. Western Blot

Les cellules granulées ont été remises en suspension dans du tampon de lyse (Tris 50 mM pH 7,4, NaCl 250 mM, EDTA 5 mM, NaF 50 mM, Triton X-100 0,1%, orthovanadate 1 μM) plus des inhibiteurs de protéase pendant 30 minutes sur glace. Après une centrifugation à 14 000 tr/min pendant 10 minutes, les surnageants ont été bouillis pendant 5 minutes dans du tampon d'échantillon Laemmli (Biorad, Hercules, CA, USA). L'analyse de la teneur en protéines a été réalisée sur un gel à gradient de 4%�%. Après séparation électrophorétique, 30&# x02009μLes protéines g ont été électrotransférées sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (Immobilon P, Millipore corp., Bedford, MA, USA). La membrane a ensuite été bloquée pendant 1 h à température ambiante avec un agent bloquant 0,2% dans du PBS/Tween 0,1%, sondée une nuit avec un anticorps primaire de lapin contre la protéine d'intérêt, et enfin révélée avec un anticorps secondaire anti-lapin conjugué HRP (Upstate Biotechnology , Lake Placid, NY, USA) et le système ECL Advance (GEhealthcare, Chicago, IL, USA). L'anticorps primaire utilisé a été obtenu auprès de Cell Signaling (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) utilisé à 1/1000. Les β l'actine a été utilisée comme référence (Sigma).

2.10. Tableau CGH

L'analyse des puces à ADN à base d'oligonucléotides a été réalisée à l'aide d'une puce à génome de rat entier conçue sur mesure et dotée de 244K, fabriquée par Agilent Technologies (Santa Clara, CA). Le marquage de l'ADN génomique, l'hybridation sur puce et le lavage ont été effectués comme spécifié par le fabricant (Agilent Technologies). Les résultats des appels d'aberration constitués de trois oligos consécutifs ou plus ont ensuite été affichés à l'aide d'un logiciel d'analyse CGH d'oligonucléotides personnalisé (Genespring).

2.11. Analyses statistiques

Les données RQ normalisées ont été directement entrées dans le logiciel d'analyse TIBCO Spotfire DecisionSite for Functional Genomics. Nous avons effectué un regroupement hiérarchique non supervisé pour classer les échantillons par groupes. La sélection des miARN utiles pour prédire la réponse tumorale au traitement a été réalisée statistiquement à l'aide de tests ANOVA avec P valeurs de  .05 au moins. Les résultats ont été vérifiés par un regroupement hiérarchique supervisé.

Les données des listes de miARN d'intérêt ont ensuite été utilisées comme variables dans une analyse en composantes principales (ACP) tridimensionnelle réalisée avec le package R 2.9.0 pour démontrer leurs capacités à distinguer les types de tumeurs. L'ACP fournit une image tridimensionnelle simplifiée à notre ensemble de données multivariées de valeurs RQ de miARN. Par combinaison mathématique de valeurs en fonction de leur force, trois composantes principales sont créées qui représentent autant que possible la variabilité des données. Ainsi, les tumeurs possèdent trois nouvelles coordonnées dans un espace tridimensionnel. Selon leur localisation dans cet espace, les tumeurs forment des groupes, et leurs sous-types peuvent être prédits.


3. Débat

Un potentiel de régénération accru du cœur humain à la suite d'une lésion ischémique peut réduire la survenue d'une insuffisance cardiaque chez les patients. Ici, nous avons délimité la réponse du transcriptome à court et à long terme dans les cœurs de poisson zèbre après une cryoblessure pour mieux comprendre la dynamique de l'ARNm et les régulateurs de miARN pendant la régénération cardiaque du poisson zèbre. À notre connaissance, il s'agit de la plus grande étude de données multi-omiques surveillant la régénération cardiaque jusqu'à 160 dpi chez le poisson zèbre. Alors que la cryo-lésion s'est avérée être un bon modèle pour imiter l'infarctus du myocarde [6,8], l'impact de la chirurgie précédente affecte clairement le transcriptome et doit être pris en compte, par exemple, avec l'utilisation de contrôles simulés. De plus, les modifications du transcriptome avec l'augmentation de l'âge doivent être ajustées à l'aide de contrôles appariés selon l'âge. Par conséquent, des contrôles appariés selon l'âge et opérés de manière fictive sont recommandés pour étudier au mieux la réponse liée à la régénération chez le poisson zèbre.

Cependant, la préparation de contrôles fictifs et appariés selon l'âge pour chaque point dans le temps augmente considérablement le temps et les dépenses d'exploitation. Alors que d'autres études utilisaient soit des témoins opérés de manière fictive qui se sont rétablis à un moment donné [12,16], soit des témoins sains [34], nous avons utilisé un groupe témoin avec des poids dépendant du temps de poissons opérés de manière fictive (récupérés à 1 dpi) et non opérés. des poissons sains couvrant tous les âges pour extraire des modifications particulières de la régénération cardiaque induites par la cryo-blessure. Pourtant, cette approche sous-tend l'hypothèse d'une décroissance exponentielle de l'influence de la chirurgie et seuls des contrôles simulés à chaque instant peuvent imiter exactement l'impact chirurgical dans les changements transcriptomiques. Les contrôles opérés de manière fictive peuvent être particulièrement importants pour étudier les changements du miRNAome des poissons cryoblessés à des moments tardifs, car même à 160 dpi, les échantillons étaient toujours séparés des contrôles sains (Figure 2 B). Alternativement, cela pourrait suggérer un possible changement permanent du miRNAome après une lésion cardiaque.

À l'aide d'un groupe témoin mixte, l'analyse de l'expression différentielle a montré les changements de transcriptome les plus importants à des moments précoces (1&# x020137 dpi) suggérant une réponse majeure et rapide à la cryoblessure. Les voies les plus importantes correspondent au cycle cellulaire et aux processus de réplication de l'ADN, ce qui est conforme aux études précédentes [4,12,16] et au fait que la régénération se produit principalement par la prolifération des CM plutôt que par les processus de différenciation [10,11]. Au cours de la réponse intermédiaire (14� dpi), les processus du cycle cellulaire sont toujours régulés à la hausse, mais les processus d'organisation de la MEC deviennent plus importants, indiquant un remodelage toujours en cours du tissu cicatriciel. À des moments tardifs (60 ppp x02013160), nous n'avons observé aucune altération significative du cycle cellulaire, suggérant un achèvement de la régénération cardiaque et du remodelage des tissus jusqu'à 60 dpi après une cryoblessure. Pourtant, la récupération fonctionnelle complète n'a pas été accomplie, les processus de restauration de la fonction cardiaque étant toujours régulés à la hausse à 60� dpi, tels que le développement cardiovasculaire, la contraction cardiaque et la croissance.

Ces résultats ont été corroborés par la délimitation de la réponse du transcriptome à l'aide de techniques de clustering souple. Ici, les régulateurs de la prolifération ont montré une augmentation rapide jusqu'à 4𠄷 dpi et une lente diminution jusqu'à 45 dpi, ce qui confirme les données phénotypiques précédemment observées du volume de la cicatrice [7,8]. Une fois que le tissu cardiaque est rétabli, les processus de restauration de la fonction cardiaque sont activés. Cela peut être vu pour les clusters 3 et 4, qui ne sont pas revenus aux niveaux de base à 160 dpi et ont été enrichis pour les processus de développement cardiaque et d'adhésion. Par conséquent, la réponse du transcriptome de la régénération cardiaque après cryo-lésion est un processus assez long jusqu'à 160 dpi [6], ce qui est en outre en accord avec les observations phénotypiques de Hein et al. qui retrouvaient encore un déplacement limité de la paroi radiale et la présence de tissu cicatriciel à 180 dpi [8].

À l'aide de données de transcriptome résolues spatialement [15], nous avons attribué aux clusters dynamiques leurs principaux sites de localisation dans le cœur blessé. Les gènes impliqués dans les processus de prolifération étaient les plus exprimés dans le site de la lésion du cœur, ce qui montre que le tissu lésé est la principale source de prolifération, peut-être en envahissant la CM du myocarde non lésé [13].

Comme il est suggéré que les miARN jouent un rôle majeur dans la régulation de la régénération cardiaque [19], nous avons étudié à la fois le mRNAome et le miRNAome. En corrélant les ARNm avec la dynamique des miARN, nous avons identifié des gènes cibles des miARN avec une répression visible (anti-corrélation) dans l'expression et donc diminué les sites de liaison faux positifs qui sont souvent présents dans les bases de données d'interaction cible des miARN [21]. Parmi les 10 premiers miARN régulant le plus de gènes, nous avons trouvé de nouveaux candidats potentiels décrits précédemment.

Nous avons identifié miR-144 comme étant régulé à la hausse dans la réponse initiale (1� dpi Figure supplémentaire S5) et ciblant principalement les gènes des groupes 3 et 5 qui étaient initialement régulés à la baisse. Fait intéressant, il a été démontré que miR-144 jouait un rôle important dans l'hématopoïèse et le développement vasculaire chez le poisson zèbre par l'inhibition de meis1 [35], mais dans nos données, miR-144 et meis1 étaient régulés à la hausse jusqu'à 21 dpi, suggérant un mécanisme différent . Cependant, nous avons pu confirmer l'enrichissement du développement d'organes hématopoïétiques ou lymphoïdes GO:0048534 pour des gènes régulés à la baisse dans la réponse précoce, tardive et intermédiaire, ce qui correspond à la dynamique de miR-144 et à son rôle dans l'hématopoïèse. Bien que l'on puisse supposer que ces miARN entravent le processus de régénération, nous pensons que la régulation négative des gènes des clusters 3 et 5 appartient à un processus de régénération bien orchestré et est initialement nécessaire lorsque la prolifération est la plus importante.

D'autre part, miR-218b était initialement régulé à la baisse et ses gènes cibles (régulés à la hausse) étaient associés à la réplication de l'ADN (Figure supplémentaire S5). Dans le cancer, le miR-218 agit comme un suppresseur de tumeur en inhibant la prolifération et la migration dans les cellules de gliome [36], le cancer de la vessie [37] et le cancer du poumon non à petites cellules [38], indiquant des mécanismes similaires concernant la prolifération.

De plus, la régulation à la baisse de la famille miR-148/152 pourrait être liée à la régulation à la hausse de gènes principalement impliqués dans les processus de prolifération (cluster 2), suggérant un rôle inhibiteur de la prolifération lors de la régénération cardiaque chez le poisson zèbre. En outre, dans la carcinogenèse, le miR-148 s'est avéré inhiber la prolifération en ciblant les gènes pro-prolifératifs et en agissant ainsi comme un suppresseur de tumeur [39], indiquant un rôle similaire et son potentiel multifonctionnel. Il était également lié à la suppression de la migration et de l'invasion dans les cellules tumorales [39], qui jouent à nouveau un rôle important dans la régénération cardiaque [13]. À 160 dpi, les miR-148/152 étaient régulés à la hausse, suggérant un mécanisme d'arrêt possible des processus de prolifération.

De plus, nous avons identifié la régulation à la baisse de la famille miR-19 comme une régulation clé de la prolifération accrue (groupe 2), miR-19b ayant été précédemment observé comme étant régulé à la baisse pendant la régénération cardiaque du poisson zèbre [24].

Parmi les régulateurs de miARN connus de la régénération cardiaque du poisson zèbre, nous avons confirmé le rôle important de la famille miR-133, dont il a été démontré que l'épuisement améliore la prolifération des CM [23]. Il a été démontré que MiR-26a cible les activateurs du cycle cellulaire et que l'inhibition stimule la prolifération des cardiomyocytes dans les cœurs de souris post-natals [25], soulignant son importance dans la régénération cardiaque du poisson zèbre et de la souris.

Pour miR-101a, nous avons pu corroborer une dynamique d'expression similaire dans les cœurs de poisson zèbre blessés, comme indiqué précédemment [24]. Alors que le miR-101a est initialement régulé à la baisse (1𠄳 dpi) après l'amputation et qu'il améliore la prolifération des CM [24], il reste régulé à la baisse jusqu'à 120 dpi après la cryo-lésion. À des moments ultérieurs après l'amputation (7� dpi), le miR-101 devient régulé à la hausse par rapport aux cœurs non blessés, ce qui pourrait être associé à l'élimination du tissu cicatriciel [24]. Chez les poissons cryoblessés, cependant, la régulation à la hausse ne se produit pas avant 160 dpi, suggérant une réponse régénérative similaire mais beaucoup plus lente par rapport aux expériences de résection (Figure supplémentaire S5).

Un autre candidat connu est miR-29b qui inhibe les gènes impliqués dans la MEC, confirmant les résultats chez la souris, où il a été démontré que la régulation négative de la famille miR-29 régule la fibrose après un infarctus du myocarde [31].

De plus, le miR-142a s'est avéré jouer un rôle important dans l'intégrité vasculaire et l'angiogenèse développementale, avec une surexpression conduisant à une perte de ces fonctions [40]. Fait intéressant, miR-142a est régulé à la hausse pendant la régénération cardiaque, suggérant que miR-142 est un antagoniste de la régénération cardiaque. Cependant, la perte de ces processus peut également être nécessaire pour le début de la réponse.

Enfin, nous avons identifié miR-16c comme un nouvel acteur de la régénération cardiaque chez le poisson zèbre avec une association avec les processus du cycle cellulaire.

Pour rechercher le potentiel interspécifique des candidats identifiés dans les processus de prolifération de la régénération cardiaque du poisson zèbre, nous avons comparé nos résultats à une lignée cellulaire différenciante H9c2 qui perd sa capacité de prolifération avec une différenciation continue [33]. Fait intéressant, nous avons trouvé une association significative entre les gènes du groupe 2 chez le poisson zèbre et les gènes régulés à la baisse dans les cellules différenciées de type CM de rat, les deux étant impliqués dans les processus de prolifération. En outre, les gènes cibles des miARN impliqués dans la régénération cardiaque du poisson zèbre étaient liés aux gènes régulés à la baisse dans le phénotype non prolifératif des cellules différenciées de type CM, indiquant des mécanismes similaires concernant la prolifération. Cependant, les miARN associés à la prolifération dans la lignée cellulaire H9c2 n'incluaient que la famille miR-133 en tant qu'acteur commun entre le poisson zèbre et le rat, renforçant son rôle important dans la prolifération pour les deux espèces et les deux modèles expérimentaux. De plus, l'analyse comprenait miR-125a, qui s'est avéré inhiber la prolifération dans les myoblastes C2C12 en ciblant E2F3 [41], une interaction que nous avons pu confirmer dans la lignée cellulaire H9c2 ( Figure 6 D) et miR-128, dont la perte a été identifiée à favorisent la prolifération des CM et la régénération cardiaque chez les souris postnatales [42]. Les écarts entre les deux organismes étudiés peuvent s'expliquer par (i) les montages expérimentaux : in vivo vs. in vitro. La plupart des miARN qui ont joué un rôle important dans le cadre in vivo du poisson zèbre n'étaient pas exprimés dans le cadre in vitro de la lignée cellulaire H9c2. En revanche, tous les miARN ont été exprimés dans un modèle murin in vivo [25]. (ii) La composition cellulaire : cœurs entiers vs myoblastes qui se différencient en cellules de type CM, (iii) les différences de sites de liaison des miARN entre poisson et rat [22] et (iv) le déclencheur/arrêt de la prolifération : cryo-blessure vs différenciation . Tous ces éléments peuvent entraîner une expression différente des miARN, ce qui entrave l'analyse comparative entre les deux systèmes. De plus, afin de surmonter ces divergences, nous effectuerons d'autres expériences de validation des miARN candidats prédits chez le poisson zèbre, par exemple, en utilisant des oligos morpholino pour bloquer les miARN, afin de comprendre l'influence réelle des miARN prédits dans la régénération cardiaque.


3 Matériels et méthodes

3.1 Ensembles de données

3.1.1 Les miARN et leurs gènes cibles

De nombreuses bases de données publiques fournissent des informations cibles pour les miARN, telles que TarBase ( Vlachos et al., 2015), TargetScan ( Lewis et al., 2003), PicTar ( Krek et al., 2005), miRanda ( John et al., 2004), DIANA-microT-v4 ( Reczko et al., 2012) et mirDB ( Wong et Wang, 2015). TarBase héberge les interactions miARN-gène validées expérimentalement, tandis que les autres fournissent des outils de calcul pour la prédiction des cibles miARN. Afin de permettre l'analyse d'un ensemble de données miARN à grande échelle, nous téléchargeons des informations sur les cibles miARN à partir de deux bases de données, à savoir microRNA.org et mirDB, qui adoptent respectivement miRanda et MirTarget V3 comme outil de prédiction. Le microRNA.org (publié en août 2010) fournit des cibles calculées par calcul avec de bons scores mirSVR pour les miARN humains conservés et non conservés de www.microrna.org, y compris 1100 miARN (ici le «bon score mirSVR» signifie que la valeur mirSVR est moins de –0,1) tandis que mirDB (version 5.0 publiée en août 2014) couvre encore plus de miARN (2588 miARN humains). Notez que ces deux bases de données ont des paramètres de rigueur différents pour les cibles prédites. Plus précisément, le nombre moyen de cibles par miARN dans microRNA.org et mirDB est de 717 et 4016, respectivement, ce qui indique que microRNA.org a un seuil de confiance beaucoup plus lâche pour l'identification des cibles.

3.1.2 La construction d'un ensemble de références pour la localisation subcellulaire des miARN

Téléchargez les 7449 entrées de miARN humains avec une localisation subcellulaire organisée à partir de la base de données RNAlocate et fusionnez-les en 1048 miARN uniques, car les miARN multi-emplacements ont plusieurs enregistrements dans la base de données (Nous vérifions les alias dans miRBase.org )

Supprimez les miARN qui ne sont pas couverts par microRNA.org et obtenez 813 miARN, dont 266 mono-localisés et 547 multi-localisés

Supprimer en outre trois emplacements, à savoir le réticulum endoplasmique, la vésicule extracellulaire et le nucléole, car ils ont trop peu d'échantillons.

Distribution des données de l'ensemble de référence de la localisation subcellulaire des miARN

Emplacement . # miARN .
Cytoplasme 206
Microvésicule 329
Mitochondrie 294
Noyau 319
Circulé 419
exosomes 712
Nombre total d'étiquettes 2279
Nombre total de miARN 813
Emplacement . # miARN .
Cytoplasme 206
Microvésicule 329
Mitochondrie 294
Noyau 319
Circulé 419
exosomes 712
Nombre total d'étiquettes 2279
Nombre total de miARN 813

Distribution des données de l'ensemble de référence de la localisation subcellulaire des miARN

Emplacement . # miARN .
Cytoplasme 206
Microvésicule 329
Mitochondrie 294
Noyau 319
Circulé 419
exosomes 712
Nombre total d'étiquettes 2279
Nombre total de miARN 813
Emplacement . # miARN .
Cytoplasme 206
Microvésicule 329
Mitochondrie 294
Noyau 319
Circulé 419
exosomes 712
Nombre total d'étiquettes 2279
Nombre total de miARN 813

3.1.3 Ensembles de données de référence sur l'association miARN-maladie

Au cours de la dernière décennie, de nombreuses méthodes de calcul pour la prédiction des associations miARN-maladie ont été développées et diverses bases de données publiques et ensembles de données de référence ont fusionné, tels que HMDD (Li et al., 2013) et miR2Disease ( Jiang et al., 2009), qui abritent les associations miARN-maladie rapportées dans les littératures existantes.Afin de comparer la métrique de similarité fonctionnelle proposée avec d'autres métriques, nous sélectionnons deux ensembles de références largement utilisés et les nommons Data1 et Data2 comme suit.

Données1 contient tous les enregistrements de la base de données HMDD (publiée en septembre 2009) créée par Wang et al. (2010), dont 1616 associations miARN-maladie. Afin de générer les scores MISIM ( mi RNA sim ilarity), Wang et al. (2010) ont fusionné les enregistrements avec les mêmes miARN matures (tels que hsa-mir-376a-1 et hsa-mir-376a-2), puis l'ensemble comprend 1395 associations, couvrant 271 miARN et 137 maladies. Dans cet ensemble, 267 miARN ont des informations cibles dans microRNA.org . Ainsi, l'ensemble de données final utilisé dans notre expérience comprend 1388 associations, 267 miARN et 137 maladies.

Données2 a été initialement collecté auprès de HMDD et de miR2Disease par Jiang et al. (2010), et contient 270 associations microARN-maladie vérifiées expérimentalement. Ensuite, Chen et Zhang (2013) ont utilisé cet ensemble de données pour valider leurs méthodes proposées, PBSI, MBSI et NetCBI, qui reposent également sur MISIM, et ils ont supprimé 19 miARN qui ne sont pas couverts par MISIM, restant ainsi 242 associations miARN-maladie, y compris 99 miARN et 51 maladies. Afin de comparer notre résultat avec ces trois méthodes, nous adoptons l'ensemble réduit (242 associations) dans nos expériences, où tous les miARN sont couverts dans miRGOFS.

3.2 Méthodes

3.2.1 GO Terme similitude

Comme indiqué dans la section 2.1, pour les méthodes basées sur IC, la proximité d'une paire de termes GO est normalement mesurée par l'IC de leurs plus petits ancêtres communs (ACV). Dans cette étude, nous prenons en considération non seulement les LCA mais aussi les HCD (plus hauts descendants communs) qui étaient souvent négligés dans les études précédentes. L'importance des informations sur la descendance est illustrée à la figure 1. Pour les deux paires, (UNE1, UNE2) et (B1, B2), les LCA sont leur ancêtre adjacent, E, mais la structure locale sous les deux paires est très différente. Apparemment, UNE1 et UNE2 sont plus semblables que B1 et B2.

Un exemple de deux paires de nœuds avec le même ancêtre mais une structure locale de descendants différente

Un exemple de deux paires de nœuds avec le même ancêtre mais une structure locale de descendants différente

Selon la définition de l'ACV (Bender et al., 2005), si un nœud est un ancêtre commun de X et oui, et ce n'est pas un ancêtre d'un autre ancêtre commun de X et oui, alors le nœud appartient à l'ensemble LCA. L'ensemble HCD peut être défini de manière analogue. Par exemple, dans la figure supplémentaire S1 , GO : 0006119 est un HCD de GO : 0006091 et GO : 0016310, et GO : 000977 est également un HCD d'entre eux bien qu'il soit inférieur à GO : 0006119 dans le DAG.

Il est simple de justifier ces deux règles. Généralement, pour une paire de termes GO, plus ils partagent de LCA/HCD, plus ils sont similaires. Selon la règle d'intersection, plus d'ACV conduiront à un ensemble plus petit avec un contenu d'informations plus élevé tandis qu'en utilisant la règle d'union, plus de HCD conduiront à un ensemble plus grand avec un contenu d'informations plus faible. De plus, une IC élevée des ACV et une IC faible des HCD entraînent un score de similitude élevé, comme le montre l'Eq. (3).

Pour illustrer ces deux opérations d'ensemble, nous extrayons un GO DAG partiel de la base de données GO, comme indiqué dans la figure supplémentaire S1 . Prenons par exemple la paire de GO : 0006091 et GO : 0016310, ce sont les ACV de GO : 0042773 et GO : 0009777. L'ensemble d'intersection de leurs descendants comprend GO : 0006119, GO : 0009777, les descendants de GO : 0006119 et les descendants de GO : 0009777, tandis que l'ensemble d'union de leurs descendants se compose de tous les descendants de GO : 0006091 et GO : 0016310. De toute évidence, l'ensemble d'intersection de LCA ne serait jamais vide, qui contient au moins la paire de nœuds de requête. Cependant, deux termes GO peuvent n'avoir aucun HCD. Dans un tel cas, l'éq. (3) va dégénérer à la somme des deux premiers termes.

3.2.2 Similarité entre les miARN

La méthode miRGOFS est implémentée en C# avec la bibliothèque parallèle de tâches (TPL), qui permet à plusieurs threads de s'exécuter en parallèle. Et le code source est disponible sur https://github.com/yangy09/MiRGOFS.

3.2.3 Règle d'inférence

Compte tenu des valeurs de corrélation, nous les utilisons pour tracer une courbe ROC pour l'évaluation des performances dans la prédiction de l'association miARN-maladie, qui a un grand nombre d'étiquettes (maladies) tandis que pour la localisation subcellulaire miARN, nous la traitons comme un problème de classification multi-étiquette , et convertissez les valeurs de corrélation en vecteurs de caractéristiques comme suggéré dans Zhou et al. (2017). Supposons qu'il y ait un total de k emplacements, nous générons un k-Dim vecteur pour chaque miARN, où les éléments du vecteur sont les valeurs de corrélation au k emplacements respectivement. Étant donné que les trois catégories GO, BP, MF et CC, présentent des similitudes différentes pour les miARN, qui peuvent être complémentaires, nous générons un k-Dim vecteur pour chaque catégorie GO et les combiner en un ( 3 × k ) -Dim vecteur.


Comment un ARN non codant favorise la croissance du cancer et les métastases

Un mécanisme qui pousse un certain gène à produire une forme d'ARN non codante au lieu de son alternative codant pour une protéine peut favoriser la croissance du cancer, rapportent des chercheurs de la Medical University of South Carolina (MUSC) dans un article publié en ligne avant impression. le 21 août 2017 par Biologie cellulaire naturelle. L'ARN non codant absorbe un microARN qui empêche la transition épithéliale-mésenchymateuse, l'une des principales caractéristiques du développement tumoral.

À partir d'un gène, les cellules peuvent souvent produire différentes formes d'ARN. La copie exacte de pré-ARN d'un brin d'ADN dans un gène doit être coupée et assemblée en sa forme finale d'ARN, ou plusieurs formes, dans un processus connu sous le nom d'épissage alternatif. Pourtant, alors que ces formes alternatives d'ARN peuvent coder différentes protéines, les scientifiques découvrent que de nombreux types d'ARN ne le font pas, remplissant à la place des fonctions très différentes qui régulent le destin et le comportement des cellules. Les microARN, par exemple, se concentrent sur certains ARN codant pour des protéines et aident à les dégrader.

Il s'agit d'une autre classe, appelée ARN long non codant (lncRNA), qui intéresse particulièrement Philip H. Howe, Ph.D., président du département de biochimie et biologie moléculaire, et la chaire Hans et Helen Koebig en Oncologie au MUSC Hollings Cancer Center. Howe et son équipe ont découvert qu'un pré-ARN pour une protéine appelée PNUTS peut être épissé alternativement pour former un lncRNA qui contribue à la progression du cancer. Le PNUTS lncRNA ne code pas pour une protéine, mais absorbe plutôt comme une éponge un certain microARN qui est généralement chargé d'empêcher la transition épithéliale-mésenchymateuse, qui est une caractéristique clé de la croissance tumorale et des métastases.

Le groupe de Howe a relié un certain nombre de points pour expliquer comment cela se produit. Premièrement, ils ont découvert que les cellules cancéreuses du sein contenaient plus d'ARNnc PNUTS que les cellules épithéliales mammaires normales - un bon signe initial que l'ARN non codant était associé au développement du cancer. Ces cellules étaient également plus mésenchymateuses, ce qui signifie qu'elles étaient plus susceptibles de former des tumeurs.

Ils ont ensuite examiné une ribonucléoprotéine appelée hnRNP E1, qui se lie au pré-ARN et supprime l'épissage alternatif. Surtout, ils savaient que le TGF-bêta, qui est libéré en grande quantité par les cellules tumorales, pourrait empêcher sa liaison, permettant potentiellement la création de formes alternatives. Des modèles informatiques ont prédit que cette ribonucléoprotéine pourrait se lier au pré-ARN PNUTS sur son site d'épissage alternatif. Dans les lignées cellulaires du cancer du poumon et du sein, des sondes d'ARN spécialement conçues ont confirmé que ce site d'épissage exact était plus exposé lorsque la ribonucléoprotéine était renversée et que ces cellules avaient plus d'ARNnc PNUTS. Lorsque les cellules ont été exposées au TGF-bêta au fil du temps, l'ARNnc de PNUTS a été produit en quantités croissantes. Il s'avère que la ribonucléoprotéine était liée plus étroitement avec le site d'épissage alternatif. Dans des conditions normales, cela a permis de fabriquer la protéine PNUTS, mais dans les tumeurs, le site d'épissage alternatif a été exposé et davantage d'ARNnc a été produit à la place.

Pourtant, le groupe a voulu confirmer exactement comment l'ARNnc de PNUTS pouvait favoriser la formation de tumeurs. Des simulations informatiques supplémentaires ont prédit que, sur la base de sa séquence, il y avait sept emplacements potentiels sur l'ARNnc PNUTS pour la liaison du microARN-205. Ce microARN se lie et détruit un régulateur transcriptionnel appelé ZEB1 qui encourage les cellules à se détacher les unes des autres et à se propager - une étape majeure qui permet à la transition épithéliale-mésenchymateuse de se produire. Comme prévu, sans ces emplacements de liaison potentiels, l'ARNnc et le microARN étaient incapables de se lier ensemble. Cela a aidé les cellules à se serrer les coudes et à moins se propager, même avec l'ajout de TGF-bêta pour les pousser à se propager.

Il est apparu que l'ARNnc de PNUTS absorbait le microARN-205, ce qui a libéré ZEB1 pour encourager les cellules à se comporter davantage comme des tumeurs. Pour être sûr que cela était vrai, le groupe a collé des molécules fluorescentes à ZEB1 pour le suivre et a découvert qu'il y en avait plus lorsqu'il y avait plus de PNUTS lncRNA.

Comme prévu, les modèles précliniques ont révélé que les tumeurs du sein et du poumon se développaient plus rapidement et plus grosses lorsque leurs cellules contenaient plus d'ARNnc PNUTS. En reliant tous les points, le groupe de Howe a montré qu'un gène peut produire soit un ARN codant pour une protéine, soit un long ARN non codant. Avec le TGF-bêta, l'ARNnc a absorbé le microARN-205 comme une éponge, libérant le ZEB pour conduire la transition épithéliale-mésenchymateuse, un événement critique dans le développement et la propagation du cancer.

Il s'agit de la première étude à montrer exactement comment le TGF-bêta provoque le cancer par la formation d'un long ARN non codant. Howe et son équipe mènent des expériences pour trouver d'autres ARN non codants aussi longs qui suivent ce même mécanisme dans le cancer, dans le but de développer des thérapies pour les cibler.

"Ma prédiction est que ce mécanisme n'a pas évolué pour produire un seul long ARN non codant", explique Howe. "Il y en a probablement d'autres qui sont générés de la même manière."


Introduction

La leucémie lymphoïde chronique B (LLC), la leucémie la plus courante dans les pays occidentaux 1 est caractérisée par un nombre élevé de cellules B leucémiques clonales circulantes. Elle était classiquement considérée comme résultant d'une accumulation de cellules B à auto-renouvellement minime à la suite d'un défaut d'apoptose. 2, 3 La plupart des cellules CLL périphériques sont généralement en G0/G1 ayant tendance à être cinétiquement au repos, phénotypiquement activés et fonctionnellement anergiques avec des niveaux réduits des composants du récepteur antigénique des cellules B IgM, IgD et CD79b avec la plupart des cellules B malignes surexprimant la protéine anti-apoptotique du lymphome à cellules B 2 (Bcl-2). 4, 5, 6 Cependant, des preuves récentes indiquent que la LLC n'est pas une maladie statique qui résulte simplement de l'accumulation de lymphocytes à longue durée de vie, mais comme un processus dynamique dans lequel les cellules prolifèrent et meurent, souvent à des niveaux appréciables. 7 La LLC montre une évolution clinique très variable allant de comportements rapidement agressifs à complètement indolents. 5 Plusieurs marqueurs biologiques ont été décrits qui peuvent prédire l'évolution clinique et sont utiles pour séparer les patients en deux groupes principaux selon le statut mutationnel du gène de la région variable des chaînes lourdes des immunoglobulines (IgVH), les niveaux d'expression de la tyrosine kinase ZAP-70 et l'expression de CD38+, 8, 9, 10, 11 ainsi que la présence d'anomalies cytogénétiques, telles que des délétions 11q ou 17p. 12 patients avec des clones ayant des IgV non mutés (NM)H gènes ou avec une expression élevée des délétions CD38 ou ZAP-70 et/ou 11q ou 17p ont fréquemment une évolution rapidement fatale malgré une thérapie agressive, tandis que les patients avec des clones mutés (M) ou une faible expression CD38 ou ZAP-70 et aucune anomalie cytogénétique délétère ont une évolution indolente et meurent fréquemment de maladies non apparentées. Malgré les progrès récents de la biologie de la LLC, le mécanisme moléculaire impliqué dans son initiation et sa progression reste insaisissable. Récemment, une nouvelle classe de petits ARN non codants appelés microARN (miARN) a été identifiée chez les plantes et les animaux. 13, 14 Des miARN matures de 19 à 24 nt de longueur régulent l'expression des gènes cibles après la transcription par appariement de bases dans les régions 3'-UTR des ARN messagers cibles induisant la dégradation et/ou l'inhibition traductionnelle. 13, 15 Bien que les fonctions biologiques des miARN ne soient pas encore entièrement comprises, il a été démontré qu'ils participent à la régulation du temps de développement, de la mort cellulaire, de la prolifération cellulaire, du métabolisme des graisses, de l'hématopoïèse et de la structuration du système nerveux. 16 La découverte que plus de la moitié des miARN humains connus sont situés dans des régions du génome associées au cancer suggère que les miARN pourraient jouer un rôle important dans la pathogenèse du cancer. 17 En accord avec cette notion est l'expression aberrante observée de miARN dans divers sous-types de cancer, y compris le lymphome de Burkitt, 18 cancer colorectal, 19 cancer du poumon, 20 cancer du sein 21 et glioblastome. 22 De plus en plus de preuves expérimentales impliquent des miARN en tant qu'oncogènes ou suppresseurs de tumeurs. 23, 24, 25, 26 Récemment, deux stratégies différentes ont été utilisées pour profiler l'expression des miARN dans la LLC. 27, 28 Par une approche microarray, une signature d'expression spécifique composée de 13 miARN, dont miR-15a et miR-16, a été associée à des facteurs pronostiques pertinents. 29 Suite au rapport de bcl-2 en tant que cible physiologique de ces deux miARN, 30 un rôle de miR-15a et miR-16 dans la pathogenèse de la LLC a également été proposé via la régulation positive de bcl-2. Cependant, des rapports récents ont révélé qu'une réduction significative des niveaux d'expression de miR-15 et/ou miR-16 dans la LLC n'était accompagnée d'aucun changement significatif dans bcl-2. 28 Dans une autre étude récente utilisant une stratégie basée sur le clonage, le profil d'expression aberrant des miARN dans la LLC a montré que miR-21, miR-150 et miR-155 étaient significativement surexprimés. 28 Les méthodes de microarray sont puissantes pour l'analyse globale, mais elles ont des limites techniques lorsqu'elles sont utilisées avec des miARN en raison de leur petite taille et de la similitude de séquence entre les membres de la famille. De plus et surtout, les études sur les puces à ADN sont dirigées vers les miARN signalés, à l'exclusion de l'analyse des candidats non annotés. Par conséquent, pour mieux comprendre le rôle des miARN dans la LLC, nous avons utilisé une approche basée sur le clonage combinée à des tests de Northern blot rigoureux pour étudier les petits ARN de patients atteints de LLC. Nos résultats montrent la fluctuation globale des niveaux d'expression des miARN dans les cellules LLC par rapport aux cellules B normales et l'identification de cinq nouveaux candidats miARN des cellules LLC. Les changements observés sont associés à une surexpression significative de miR-155 en combinaison avec une réduction de miR-181a, let-7a et miR-30d. Notamment, le profil différentiel de l'expression des miARN est associé à des facteurs pronostiques moléculaires et à l'évolution clinique de la LLC.


Résumé

Les altérations des microARN (miARN) sont impliquées dans l'initiation et la progression du cancer humain. Les causes de l'expression différentielle généralisée des gènes de miARN dans les cellules malignes par rapport aux cellules normales peuvent s'expliquer par la localisation de ces gènes dans les régions génomiques associées au cancer, par des mécanismes épigénétiques et par des altérations de la machinerie de traitement des miARN. Le profilage d'expression de miARN des tumeurs humaines a identifié des signatures associées au diagnostic, à la stadification, à la progression, au pronostic et à la réponse au traitement. En outre, le profilage a été exploité pour identifier des gènes de miARN qui pourraient représenter des cibles en aval des voies oncogènes activées, ou qui ciblent des gènes codant pour des protéines impliqués dans le cancer.


Profilage miARN : comment contourner les difficultés actuelles dans le diagnostic et le traitement des sarcomes

Les sarcomes sont divisés en un groupe avec des altérations spécifiques et un second présentant un caryotype complexe, parfois difficile à diagnostiquer ou avec peu d'options thérapeutiques disponibles. Nous avons évalué si le profilage des miARN par puces à faible densité TaqMan pouvait prédire la réponse du rhabdomyosarcome indifférencié (RMS) et de l'ostéosarcome au traitement. Nous avons montré que les signatures de miARN en réponse à un agent thérapeutique (chimiothérapie ou inhibiteur de mTOR RAD-001) étaient spécifiques aux cellules et aux médicaments sur des lignées cellulaires et un modèle d'ostéosarcome de rat. Cette signature de miARN était liée à la sensibilité cellulaire ou tumorale à ce traitement et pourrait ne pas être due à des aberrations chromosomiques, comme l'a révélé une analyse par puce à ADN de tumeurs de rat. De manière frappante, le profilage des miARN a donné des résultats prometteurs pour le rhabdomyosarcome des patients, discriminant tous les types de RMS : (Pax+) ou RMS alvéolaire indifférencié ainsi que RMS embryonnaire. Comme le soulignent ces résultats, le profilage des miARN apparaît comme un puissant outil de diagnostic moléculaire pour les sarcomes à caryotype complexes.

1. Introduction

Les sarcomes sont des tumeurs malignes rares apparaissant dans les tissus conjonctifs comme la graisse, les muscles, les os et le cartilage. Selon les altérations cytogénétiques moléculaires, les sarcomes pourraient être divisés en deux classes : (1) les sarcomes avec des altérations spécifiques (translocation, mutation oncogène) incluant le sarcome d'Ewing, les tumeurs stromales gastro-intestinales et le rhabdomyosarcome alvéolaire (2) les sarcomes à caryotype complexe comme le léiomyosarcome, le liposarcome pléomorphe , ou ostéosarcome. L'ostéosarcome est la tumeur osseuse maligne primitive la plus fréquente, caractérisée par son pouvoir métastatique en particulier dans les sites pulmonaires et sa résistance aux traitements conventionnels comme la chimiothérapie et la radiothérapie [1]. Même si la survie médiane des patients atteints d'ostéosarcome a été améliorée grâce à l'administration préopératoire d'agents chimiothérapeutiques, il existe aujourd'hui environ 40 % de patients mauvais répondeurs [2]. En effet, les tumeurs de l'ostéosarcome résistent souvent ou récidivent au traitement chimiothérapeutique préchirurgical, et seules quelques options thérapeutiques sont possibles et généralement non curatives [3]. Une seconde cure intensive de chimiothérapie est actuellement administrée dans ce cas. Ainsi, il semble essentiel de développer un outil de diagnostic pour prédire la réponse tumorale à la chimiothérapie afin d'éviter l'administration de médicaments inefficaces. Il existe également un besoin d'alternatives thérapeutiques efficaces basées sur la découverte de nouvelles cibles impliquées dans la tumorigenèse des ostéosarcomes.

Le rhabdomyosarcome (RMS) est l'un des sarcomes des tissus mous les plus courants. Trois types de RMS sont observés : le RMS alvéolaire (20 %), le RMS embryonnaire (eRMS, 60 %) et le RMS pléomorphe (20 %). 70 % d'aRMS présentent une translocation spécifique du facteur de transcription Pax3 à l'extrémité 3′ de FOXO1, créant un puissant facteur de transcription capable d'induire la myogenèse et la survie [4]. 10 % d'aRMS présentent une translocation de Pax7 avec FOXO1 [5]. Les aRMS sont de mauvais pronostic par rapport aux eRMS, en particulier ceux avec le gène de fusion Pax3 [6].Ainsi, il apparaît primordial d'obtenir un outil de diagnostic identifiant précisément les sous-types de RMS, et particulièrement discriminant Pax-aRMS de l'eRMS, difficile à séparer selon les caractéristiques de survie des patients, les profils d'expression génique et les puces CGH [7].

Les micro-ARN (miARN) sont des biomarqueurs de diagnostic prometteurs par leurs spécificités tissulaires et leur implication dans les processus oncogènes [8]. Les miARN sont de petites molécules d'ARN non codantes synthétisées à partir de régions introniques d'une taille allant de 16 à 35 nucléotides. Ils sont traités par des complexes spécifiques de protéines contenant Drosha et Dicer pour être mûris et finalement intégrés dans des complexes RISC [9, 10]. Les miARN matures correspondent à des séquences complémentaires dans les ARN messagers, ce qui entraîne une inhibition de la traduction et une dégradation accélérée des ARNm [11]. Les niveaux d'expression des miARN sont caractéristiques d'un tissu pour réguler l'expression des gènes pendant la croissance et le développement, comme cela a été montré pour le développement du tissu squelettique et musculaire [12-14]. Leur expression est également dérégulée dans de nombreux cancers [15, 16], entraînant une signature de miARN tumoral, ce qui pourrait être utile pour leur classification en fonction de leur origine tissulaire et de leurs altérations moléculaires [17-19]. Ainsi, ils constituent actuellement de puissants biomarqueurs pour le diagnostic du cancer [18, 20] avec leurs capacités à être détectés dans le sérum des patients. Un outil de diagnostic non invasif basé sur les miARN pour l'ostéosarcome pourrait être très utile pour adapter les protocoles de chimiothérapie aux spécificités biologiques tumorales.

Dans cette étude, nous avons effectué le profilage des miARN de lignées cellulaires de sarcomes, de tumeurs humaines ou de rat, afin d'évaluer si les miARN pourraient constituer de puissants biomarqueurs pour dépasser les limites actuelles du diagnostic du rhabdomyosarcome et du traitement de l'ostéosarcome. Les niveaux d'expression des miARN ont été déterminés à l'aide de cartes microfluidiques effectuant des matrices TaqMan à faible densité (TLDA) à haut débit, des tests de PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR) basés sur la technologie TaqMan. Nous avons d'abord étudié les effets de différents agents chimiothérapeutiques sur les profils de miARN des cellules d'ostéosarcome, nous avons observé que ces signatures de miARN étaient spécifiques à la cellule et au médicament. Un tableau CGH de tumeurs d'ostéosarcome obtenu à partir d'un modèle de rat a révélé que cette signature de miARN, conservée dans des cellules de rat et humaines, était indépendante des réarrangements chromosomiques, suggérant que les profils de miARN étaient liés aux phénotypes tumoraux plutôt qu'à leur patrimoine génétique. D'un grand intérêt, une signature miARN a été identifiée dans des tumeurs de rhabdomyosarcome de patients selon la translocation moléculaire Pax3 ou Pax7. Cette signature était en fait un outil puissant pour discriminer le RMS alvéolaire (Pax-) du RMS embryonnaire, impossible à distinguer par les techniques moléculaires actuellement utilisées. En conclusion, le profilage des miARN constitue une technologie prometteuse en tant qu'alternative ou partenaire des techniques moléculaires habituelles pour surmonter les difficultés actuelles de diagnostic et de traitement des sarcomes.

2. Procédures expérimentales

2.1. Tumeurs de rhabdomyosarcome humain

Dix-sept patients traités pour rhabdomyosarcome au Centre Léon Bérard ont été inclus dans cette étude. Quatre tumeurs congelées et treize tumeurs fixées au formol et incluses en paraffine ont été obtenues à partir des biopsies réalisées au diagnostic. Les diagnostics tumoraux ont été réalisés par un anatomopathologiste référent spécialiste de cette pathologie par immunohistochimie, FISH et qPCR.

2.2. Lignées cellulaires cancéreuses

Cinq lignées cellulaires cancéreuses ont été obtenues auprès de l'ATCC (Manassas, VA, USA) : les deux ostéosarcomes humains MNNG/HOS Cl #5 [R-1059-D] (référence CRL-15-47) et Saos-2 (HTB-85) cellules, la lignée cellulaire de chondrosarcome SW1353 (HTB-94) et les deux cellules de lymphome de Burkitt Daudi (CCL-213) et Namalwa (CRL-1432). Des cellules d'ostéosarcome et de chondrosarcome ont été cultivées dans du DMEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA), additionné de 10 % de sérum de veau fœtal décomplémenté (Lonza, Bâle, Suisse), 10 ml de pénicilline streptomycine (10 U/ml/10 ??g/mL, Gibco, Carlsbad, CA, USA) et 5 mL de L-glutamine (200 mM Gibco) à 37°C en atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2. Des cellules de lymphome ont été cultivées dans du RPMI (Gibco, Carlsbad, CA, USA). Les cellules ont été exposées à 100 nM de RAD-001 (Novartis), 50 ??M ifosfamide (ifos, Baxter) ou 1 ??M cisplatine (CDDP, TEVA) ou 100 ??M méthotrexate (MTX, TEVA) pendant 24, 48 et 72 h.

2.3. Modèle d'ostéosarcome chez le rat

Les procédures de soins aux animaux ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles et nationales. Les animaux ont été anesthésiés tout au long de toutes les procédures chirurgicales et d'imagerie avec de l'isoflurane/oxygène (2,5%/2,5%, v/v) (Minerve, Esternay, France). Le modèle d'ostéosarcome de rat orthotopique et métastatique transplantable a déjà été décrit [21–23]. Ce modèle imite son homologue humain en termes d'agressivité, de propagation métastatique et de phénotype de chimiorésistance [21-23]. Toutes les tumeurs obtenues ont été classées comme ostéoblastiques à la suite d'analyses histologiques. Brièvement, de petits fragments tumoraux (100 mm3) prélevés dans une zone tumorale ostéogénique hyperproliférative ont été greffés sur des rats Sprague-Dawley immunocompétents âgés de 3 semaines (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA). Par voie d'abord latérale, un fragment tumoral a été placé en contiguïté de la diaphyse tibiale après abrasion périostée puis, les plaies cutanées et musculaires ont été suturées. Quatorze jours après la transplantation tumorale, les animaux ont subi une première TEP au 18 F - FDG et ont été répartis au hasard dans un groupe témoin traité avec une solution saline ou dans un groupe traité exposé à une dose sous-cutanée de 10 mg/kg d'ifosfamide (ifos, Baxter, Deerfield, IL, USA), à 7 jours d'intervalle (aux jours 15 et 22 après transplantation tumorale). Un deuxième PET Scan au 18 F - FDG a été réalisé 7 jours après la deuxième administration d'ifos. Les animaux ont été sacrifiés une semaine après la fin du traitement. Des fragments de tumeur et de tissu normal (muscle, os et poumon) ont été collectés pour des extractions d'ARN.

2.4. Extraction d'ARN et PCR quantitative en temps réel

Les tumeurs FFPE ont été lysées pendant 24 h dans du tampon ATL (Qiagen, France) additionné de protéinase K (Qiagen) à 60°C sous agitation rotative après différents lavages avec du toluène, de l'éthanol et du tris/EDTA dans cet ordre. L'ARN total a été extrait de culots tumoraux ou cellulaires en utilisant un seul protocole d'extraction au phénol/chloroforme avec Trizol, selon les instructions du fabricant (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Cinq cents nanogrammes d'ARN total ont été soumis à la technologie PCR microfluidique réalisée par Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). En bref, l'ARN a été reverse transcrit, en utilisant des amorces de miARN en boucle spécifiques multiplexées du kit Taqman MicroRNA Reverse Transcription. La deuxième étape consiste en une PCR quantitative en temps réel sur TLDA : les produits de RT sont introduits via des microcanaux dans des puits miniatures préchargés avec des amorces et des sondes spécifiques déshydratées. Récemment, Applied biosystems a publié la deuxième version de TLDA, composée de deux cartes A et B. Des analyses ont été effectuées pour 377 miARN sur la carte A et 290 sur la carte B.

2.5. Normalisation des données PCR

Pour chaque miARN, le cycle seuil (Ct) a été calculé par le logiciel ABI 7900 Sequence Detection System (analyse Ct manuelle plaque par plaque avec un seuil à 0,25 et une ligne de base automatique). Toutes les autres manipulations de données ont été effectuées à l'aide de scripts R. Un seuil de 32 a été appliqué pour éliminer les valeurs tardives de Ct, à l'exception de l'analyse RMS. Environ 60% des miARN ont passé les critères de filtrage et ont été utilisés pour une analyse plus approfondie. Pour chaque TLDA, des contrôles de qualité ont été effectués sur les données brutes en vérifiant les contrôles internes et en utilisant des diagrammes en boîte et en nuage de points. Les échantillons présentant tout type de problèmes ont été rejetés afin qu'ils n'introduisent pas de biais lors des procédures de normalisation suivantes. Nous avons testé différentes méthodes de normalisation car le facteur de normalisation « pseudo » recommandé mammU6 tracé dans chaque carte n'était pas exprimé de manière stable dans nos différents échantillons. La normalisation avec les deux miARN les plus stables identifiés par GeNorm n'était pas optimale non plus. Enfin, une normalisation globale par la médiane a été choisie pour sa fiabilité par rapport aux expériences. Les tissus inclus dans une analyse donnée ont été traités dans leur ensemble, la procédure de normalisation étant appliquée séparément pour les deux types de cartes, A et B. La distribution des données normalisées a été vérifiée avec des box plots et des plots de corrélation. La formule suivante a été utilisée pour corriger les valeurs Ct de chaque carte :

Grâce à cette approche, la nouvelle valeur médiane partagée par tous les échantillons peut être considérée comme une sorte de « gène de ménage virtuel » parfait. Par conséquent, la méthode ΔΔCt standard peut être utilisée pour déterminer les quantités relatives (RQ) comme suit :

Pour le calcul du Ct, il était plus pertinent pour les analyses statistiques d'utiliser la moyenne de tous les ΔCt obtenus à travers les échantillons pour chaque miARN, au lieu d'utiliser le ΔCt d'un échantillon de référence

2.6. Prédictions cibles miARN

Nous avons compilé 4 bases de données pour déterminer les cibles miARN : TargetScan 5.1, MiRanda, PICTAR et les bases de données miRbase. Ces bases de données recherchent la présence de sites 8mer et 7mer conservés sur les parties 3'UTR de l'ARN messager qui correspondent à la région d'ensemencement de chaque miARN. Il prédit également l'efficacité du ciblage pour chaque site correspondant. Nous avons créé notre propre base de données qui regroupait chaque miARN avec le geneID de toutes leurs cibles protéiques, pour le rat et l'humain. Nous n'avons conservé que les couples miARN/geneID présents dans au moins deux bases de données.

2.7. Prédictions des voies de signalisation cellulaire régulées par miARN

Nous avons utilisé l'application Web « G-language microarray », qui permet la cartographie de l'ensemble de données moléculaires sur les cartes de voies « Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes » (KEGG) [24]. Nous avons d'abord saisi les protéines d'intérêt ciblées par les miARN et la somme des valeurs RQ pour tous les miARN qui régulent ces protéines, contenues entre 1 et 50, puis le logiciel génère des données KEGG pour créer des graphiques FLASH des voies de signalisation cellulaire dans lesquelles les protéines sont impliquées. L'intensité de la couleur d'une protéine mise en évidence varie avec la force de sa régulation par les miARN.

2.8. Essai de prolifération

Les cellules ont été étalées dans des plaques à 96 puits à 5000 cellules/puits et exposées à 100 nM de RAD-001, 50 ??M ifosfamide, 100 ??M méthotrexate, ou 1 ??M cisplatine ou non (NT). La croissance cellulaire a été mesurée 24, 48 et 72 h plus tard avec 20 ??Réactif luminescent L Cell Titer Glo (Promega, Madison, WI, USA) pendant 10 min. La luminescence a été enregistrée en utilisant un lecteur Microbeta (PerkinElmer, Fremont, CA, USA).

2.9. Western Blot

Les cellules en boulettes ont été remises en suspension dans du tampon de lyse (Tris 50 mM pH 7,4, NaCl 250 mM, EDTA 5 mM, NaF 50 mM, Triton X-100 0,1%, orthovanadate 1 ??M) plus des inhibiteurs de protéase pendant 30 min sur de la glace. Après une centrifugation à 14000 rpm pendant 10 min, les surnageants ont été bouillis pendant 5 min dans du tampon échantillon Laemmli (Biorad, Hercules, CA, USA). L'analyse de la teneur en protéines a été réalisée sur un gel à gradient de 4 % à 12 %. Après séparation électrophorétique, 30 ??Les protéines g ont été électrotransférées sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (Immobilon P, Millipore corp., Bedford, MA, USA). La membrane a ensuite été bloquée pendant 1 h à température ambiante avec un agent bloquant 0,2% dans du PBS/Tween 0,1%, sondée une nuit avec un anticorps primaire de lapin contre la protéine d'intérêt, et enfin révélée avec un anticorps secondaire anti-lapin conjugué HRP (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA) et le système ECL Advance (GEhealthcare, Chicago, IL, USA). L'anticorps primaire utilisé a été obtenu auprès de Cell Signaling (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) utilisé à 1/1000. Les ?? l'actine a été utilisée comme référence (Sigma).

2.10. Tableau CGH

L'analyse des puces à ADN à base d'oligonucléotides a été réalisée à l'aide d'une puce à génome de rat entier conçue sur mesure et dotée de 244K, fabriquée par Agilent Technologies (Santa Clara, CA). Le marquage de l'ADN génomique, l'hybridation sur puce et le lavage ont été effectués comme spécifié par le fabricant (Agilent Technologies). Les résultats des appels d'aberration constitués de trois oligos consécutifs ou plus ont ensuite été affichés à l'aide d'un logiciel d'analyse CGH d'oligonucléotides personnalisé (Genespring).

2.11. Analyses statistiques

Les données RQ normalisées ont été directement entrées dans le logiciel d'analyse TIBCO Spotfire DecisionSite for Functional Genomics. Nous avons effectué un regroupement hiérarchique non supervisé pour classer les échantillons par groupes. La sélection des miARN utiles pour prédire la réponse tumorale au traitement a été réalisée statistiquement à l'aide de tests ANOVA avec P valeurs de 0,05 au moins. Les résultats ont été vérifiés par un regroupement hiérarchique supervisé.

Les données des listes de miARN d'intérêt ont ensuite été utilisées comme variables dans une analyse en composantes principales (ACP) tridimensionnelle réalisée avec le package R 2.9.0 pour démontrer leurs capacités à distinguer les types de tumeurs. L'ACP fournit une image tridimensionnelle simplifiée à notre ensemble de données multivariées de valeurs RQ de miARN. Par combinaison mathématique de valeurs en fonction de leur force, trois composantes principales sont créées qui représentent autant que possible la variabilité des données. Ainsi, les tumeurs possèdent trois nouvelles coordonnées dans un espace tridimensionnel. Selon leur localisation dans cet espace, les tumeurs forment des groupes, et leurs sous-types peuvent être prédits.

3. Résultats

3.1. Signatures miARN de lignées cellulaires d'ostéosarcome

Dans notre étude récente publiée dans International Journal of Cancer, nous avons montré que les deux cellules d'ostéosarcome Saos-2 et CRL-15-47 (15-47) imitent la réponse biologique de l'ostéosarcome humain et des tumeurs obtenues à partir d'un modèle de rat. En effet, nous avons identifié dans un modèle de rat d'ostéosarcome un panel de 61 miARN discriminant les tumeurs ayant une bonne réponse à l'ifosfamide de celles ayant une mauvaise réponse [25]. Sur la base de cette signature, nous avons réalisé une analyse en composantes principales permettant de prédire la réponse tumorale. Dans ce diagramme PCA, nous avons pu remarquer que les cellules Saos-2 étaient prédites comme sensibles à l'ifosfamide contrairement aux cellules 15-47 (Figure 3(b) [25]), selon les résultats obtenus par un test de prolifération (Figure 6(a) ) [25] et figure S1). Ceci a été confirmé par une analyse PCA réalisée avec la signature de miARN identifiée dans des tumeurs humaines (Figure S2). Nous avons donc considéré que ces deux lignées cellulaires constituaient un modèle intéressant pour étudier l'importance des miARN dans la réponse cellulaire au traitement et pour identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques.

3.2. Signatures de miARN de lignées cellulaires cancéreuses humaines

Nous avons tout d'abord effectué un profilage préliminaire de miARN sur différents modèles cellulaires afin de comparer les profils de miARN de cellules d'ostéosarcome utilisées dans notre laboratoire pour effectuer in vitro expériences, cellules Saos-2 et 15-47, avec les cellules de chondrosarcome SW-1353 (chondro) et les cellules de lymphome de Burkitt Daudi et Namalwa. Dans une étude précédente, nous avons identifié 61 miARN impliqués dans la réponse des cellules d'ostéosarcome au traitement [25]. Nous n'avons conservé ces miARN que pour réaliser un clustering hiérarchique non supervisé avec les cinq lignées cellulaires cancéreuses. Comme le montre la figure 1 (a), cette signature de miARN était représentative des deux lignées cellulaires d'ostéosarcome humain, puisque ces deux cellules se sont regroupées indépendamment mais étroitement aux cellules de chondrosarcome. Ces trois lignées cellulaires ont été classées dans un groupe distinct des deux cellules lymphomateuses Daudi et Namalwa. Cela a confirmé que chaque lignée cellulaire cancéreuse présente une signature de miARN en fonction de son origine, comme l'ont montré d'autres [15, 16].


(une)
(b)
(c)
(une)
(b)
(c) Les signatures de miARN des cellules cancéreuses étaient cohérentes avec leur origine tissulaire et leur sensibilité à l'ifosfamide. (a) Ce regroupement hiérarchique non supervisé n'a conservé que les 61 miARN qui discriminaient les cellules d'ostéosarcome en fonction de leur réponse au traitement. Les lignées cellulaires d'ostéosarcome se sont regroupées près des cellules de chondrosarcome et indépendamment des cellules de lymphome Daudi et Namalwa. Chaque ligne représente les niveaux relatifs d'expression pour chaque miARN, et chaque colonne montre les niveaux d'expression pour chaque échantillon. La couleur rouge ou verte indique une expression relativement élevée ou faible, respectivement, tandis que les carrés gris indiquent aucun miARN exprimé. (b) et (c) profils de miARN après exposition à 50 ??M ifosfamide pendant 24 h. (b) Ce regroupement hiérarchique non supervisé n'a conservé que les 61 miARN différemment exprimés dans les cellules d'ostéosarcome en fonction de leur sensibilité à l'ifos suite à une ANOVA (

). (c) Ce regroupement hiérarchique supervisé a conservé des miARN différemment exprimés dans les cellules en fonction de leur réponse au traitement suite à une ANOVA (

3.3. Les profils de miARN en réponse aux agents chimiothérapeutiques étaient spécifiques aux cellules

Ensuite, nous avons évalué si les profils de miARN étaient spécifiquement modifiés en réponse à la chimiothérapie. Nous avons choisi d'exposer les cellules d'ostéosarcome et de lymphome à l'ifosfamide, un agent chimiothérapeutique alkylant actuellement utilisé pour l'ostéosarcome pédiatrique. Un essai de prolifération basé sur la mesure de l'ATP a montré que la seule lignée cellulaire Saos-2 était modérément sensible à 50 ??M ifosfamide après 48 h d'exposition (inhibition de la prolifération d'environ 30%) (Figure S1). Sur la base de cette observation, nous avons décidé d'exposer ces cellules à 50 ??M ifosfamide pendant 24 h pour réaliser le profilage des miARN. Sur la base du panel de 61 miARN identifiés dans notre étude précédente [25], les cellules d'ostéosarcome étaient nettement différentes des cellules de lymphome, confirmant que les profils de miARN étaient spécifiques aux cellules, comme le montre le regroupement hiérarchique non supervisé de la figure 1 (b). Nous avons pu remarquer que les cellules Saos-2 présentent une signature miARN unique dans laquelle la majorité des miARN étaient surexprimés (en rouge sur la figure 1(b)). Un regroupement hiérarchique supervisé réalisé suite à une ANOVA entre les cellules sensibles Saos-2 versus les cellules résistantes a révélé qu'elles se regroupaient efficacement en fonction de leur sensibilité à l'ifos : Saos-2 d'une part, indépendamment à 15-47 cellules et les deux cellules de lymphome (Figure 1(c)). Nous avons confirmé cette observation avec l'autre agent chimiothérapeutique ciplatine. Comme précédemment, les cellules ont été classées selon leur sensibilité au CDDP sur le clustering hiérarchique supervisé de la figure S3A (ANOVA) : les cellules 15-47 et Namalwa, sensibles au CDDP sur la base du test de prolifération de la figure S3B, regroupées, indépendamment de Daudi et les cellules Saos-2 réfractaires à ce traitement.

3.4. Les profils de miARN des cellules d'ostéosarcome étaient spécifiques à chaque agent chimiothérapeutique

Ainsi, étant donné que les signatures de miARN des cellules non traitées et traitées étaient spécifiques du cancer, nous avons évalué si chaque médicament chimiothérapeutique induisait un profil de miARN différent dans une même cellule.Comme suggéré précédemment pour les cellules d'ostéosarcome, l'exposition au cisplatine et à l'ifosfamide a entraîné des profils de miARN assez différents. Après une analyse statistique avec une ANOVA, nous n'avons trouvé que deux miARN discriminants communs aux deux signatures de miARN induites par ifos et CDDP dans les deux lignées cellulaires (Figure S3). Dans ce contexte, nous testons un troisième agent cytotoxique actuellement administré dans la pathologie des ostéosarcomes, le méthotrexate. Comme le montre le regroupement hiérarchique non supervisé de la figure 2, ne conservant que les 61 miARN d'intérêt pour la réponse à l'ostéosarcome, comme expliqué ci-dessus, la signature des miARN dans les deux cellules d'ostéosarcome Saos-2 et 15-47 différait fortement de celles observées pour ifsofamide et cisplatine . Il est important de noter qu'une majorité de ces miARN étaient surexprimés dans les deux lignées cellulaires en réponse au MTX. Cela était pertinent avec leur sensibilité au MTX, comme le montre le test de prolifération de la figure 2 (b). Bref, il semble que les miARN discriminants étaient généralement surexprimés dans les cellules après exposition à un agent cytotoxique auquel ils étaient sensibles, comme cela a également été montré pour l'ifosfamide dans les cellules Saos-2 (Figure 1(b)). Cela a également confirmé que les miARN prédisant la réponse cellulaire à un traitement différaient selon le médicament.


(une)
(b)
(une)
(b) Les profils d'expression des miARN des cellules d'ostéosarcome étaient spécifiques à chaque agent chimiothérapeutique. (a) Ce regroupement hiérarchique non supervisé a conservé les miARN identifiés comme discriminants pour la réponse de l'ifosfamide après avoir supprimé les miARN dont l'expression dépend des types cellulaires. Chaque ligne représente les niveaux relatifs d'expression pour chaque miARN, et chaque colonne montre les niveaux d'expression pour chaque échantillon. La couleur rouge ou verte indique une expression relativement élevée ou faible, respectivement, tandis que les carrés gris indiquent aucun miARN exprimé. (b) La croissance cellulaire a été mesurée par le test Cell Titer GloLuminescent comme décrit dans la section 2.6 24, 48 et 72 h après l'exposition à 100 ??M méthotrexate. Les résultats ont été représentés par le % moyen de prolifération normalisé par rapport aux cellules non traitées de deux expériences indépendantes réalisées en double.

(une)
(b)
(une)
(b) L'inhibition de mTOR par RAD-001 dans le chondrosarcome a entraîné une inhibition de la prolifération cellulaire. (a) La croissance cellulaire a été mesurée par le test Cell Titer GloLuminescent comme décrit dans la section 2.6 24, 48 et 72 h après exposition à 100 nM de RAD-001. Les résultats ont été représentés par le % moyen de prolifération normalisé par rapport aux cellules non traitées de deux expériences indépendantes réalisées en double. Un test de Fisher a été réalisé, NS correspond à « non significatif ». (b) Analyse Western blot des effets de RAD-001 sur la voie mTOR dans le chondrosarcome et 15-47 cellules d'ostéosarcome exposées ou non (NT) à la doxorubicine (dox). 30 ??Des extraits de protéines g ont été analysés par Western blot avec des anticorps 1/1000 contre des acteurs de la voie mTOR (forme phosphorylée ou non) (Cell signalisation, Beverly MA).

Sur la base de ces préliminaires in vitro résultats, nous pourrions suggérer que les profils de miARN, en raison de leur spécificité médicamenteuse, pourraient être un outil puissant pour prédire une réponse des cellules cancéreuses à un traitement. L'ostéosarcome étant actuellement résistant aux traitements conventionnels, la prédiction de sa réponse à un agent pourrait être un progrès pour cette pathologie.

3.5. Réponse des cellules d'ostéo- et de chondrosarcome à l'inhibiteur mTOR RAD-001

Comme le soulignent ces données précédentes, nous avons pu classer et prédire la réponse des cellules d'ostéosarcome à la chimiothérapie. Nos algorithmes n'étaient pas seulement intéressants pour les agents chimiothérapeutiques, mais aussi prometteurs pour identifier de nouvelles thérapies ciblées pour faire face à la résistance à l'ostéosarcome. Ainsi, nous avons testé un médicament puissant pour le traitement du sarcome squelettique, qui inhibe la protéine pro-oncogène mTOR, appelée RAD-001 (Everolimus, Novartis). mTOR est souvent activé de manière aberrante dans les cancers et, en particulier dans le chondrosarcome [26] et l'ostéosarcome [27]. La signalisation mTOR a été décrite comme impliquée dans le développement tumoral, les métastases et la résistance aux médicaments [28, 29] ainsi, le ciblage mTOR inhibe avec succès la croissance tumorale et les rend sensibles aux traitements conventionnels [30, 31]. RAD-001, agissant de manière similaire à la rapamycine par l'inhibition des complexes mTORC1, est actuellement testé dans divers essais cliniques pour le carcinome rénal (programme RECORD), les tumeurs papillaires avancées (RAPTOR), les tumeurs neuroendocrines métastatiques (RAMSETE) ou le sein cancers (BOLERO).

Ainsi, nous avons effectué in vitro expériences sur des cellules de chondrosarcome et d'ostéosarcome avec 100 nM de RAD-001. La prolifération des cellules Saos-2 et chondrosarcome a été réduite de 40 % suite à une exposition à RAD-001 pendant 72 h contrairement à une croissance cellulaire de 15-47 (Figure 3(a)). En parallèle, nous avons réalisé un Western blot avec RAD-001 sur des cellules de chondrosarcome et d'ostéosarcome concernant les acteurs majeurs des voies de signalisation cellulaire mTOR. Cela a révélé que la voie mTOR était inhibée par RAD-001 dans les cellules de chondrosarcome contrairement aux cellules 15-47, en particulier eIF4G et p70 S6 kinase dont le niveau de phosphorylation était diminué (Figure 3(b)).

Ainsi, nous avons analysé si les signatures miARN de ces cellules étaient différentes et pouvaient expliquer leur réponse différentielle à RAD-001. Nous avons effectué un regroupement hiérarchique supervisé entre les cellules Saos-2, chondrosarcome et 15-47 non traitées suite à une ANOVA avec . Ce regroupement a révélé que 16 miARN discriminaient les cellules chondrosarcome et Saos-2 d'une part et les cellules 15-47 d'autre part (Figure 4). À l'exception du miR-146, du Saos-2 et du chondrosarcome surexprimé ces miARN contributifs.


Les profils d'expression des miARN des cellules d'ostéosarcome et de chondrosarcome correspondaient à leur sensibilité à l'inhibiteur de mTOR RAD-001. Ce clustering hiérarchique n'a conservé que des miARN différemment exprimés dans les tumeurs en fonction de leur réponse au traitement suite à une ANOVA (

Par la suite, comme nous l'avons expliqué dans notre étude précédente sur l'ostéosarcome [25], le profilage des miARN constitue un outil puissant pour identifier les voies de signalisation cellulaire ciblées par les miARN à travers un in silico approcher. Dans notre cas, nous avons cherché si ces miARN montrés comme exprimés différemment dans les cellules selon leur réponse à RAD-001 ciblent potentiellement la voie de signalisation mTOR. Nous avons créé une base de données, comme décrit dans la section 2.6, qui détermine les cibles prédites pour ces miARN décrits dans la miRbase. Ensuite, nous avons résumé les valeurs RQ pour chaque miARN dans les cellules Saos-2 et chondrosarcome sensibles à RAD-001 et concaténées avec le geneID de leurs cibles protéiques. Nous avons finalement inséré ces données dans l'application Web de microarray en langage G, qui connecte des cibles de miARN en fonction de leur implication dans des voies KEGG similaires, la voie mTOR dans ce cas. Comme le montre la figure 5, la voie mTOR est ciblée par ces miARN et en particulier ses protéines en aval impliquées dans les processus de signalisation et d'autophagie du VEGF, en particulier RICTOR, ATG1 et HIF-1a. Ainsi, les cellules Saos-2 et chondrosarcome surexprimaient des miARN qui inhibent potentiellement la signalisation mTOR. L'inhibition de ces miARN par l'utilisation de l'acide nucléique verrouillé (LNA) et la mesure qPCR de RICTOR, ATG1 et HIF1a pourrait confirmer ce concept.


Les miARN discriminants interfèrent avec la voie mTOR. Les protéines de couleur jaune, orange et rouge représentent les cibles des miARN, un carré jaune représente une répression faible, tandis que le rouge représente la répression maximale. Les carrés verts n'ont pas été ciblés.

(une)
(b)
(c)
(ré)
(e)
(F)
(une)
(b)
(c)
(ré)
(e)
(F) Analyse CGH de six tumeurs d'un modèle de rat d'ostéosarcome. Ici, nous représentons six chromosomes parmi les vingt + chromosomes X présents dans le génome du rat. Toutes les analyses ont été réalisées avec le même échantillon osseux non traité comme référence.

En résumé, les miARN constituent de puissants biomarqueurs pour déterminer la susceptibilité à un traitement et pourraient être très utiles pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques comme alternative à la chimiothérapie des chondrosarcomes et ostéosarcomes souvent réfractaires à ce traitement. Dans les étapes suivantes, nous avons évalué si ces observations étaient pertinentes in vivo, avec un modèle d'ostéosarcome de rat et avec des échantillons de patients.

3.6. La signature prédictive de miARN d'un modèle d'ostéosarcome de rat n'était probablement pas liée aux aberrations de l'ADN

Comme décrit dans d'autres études réalisées par des membres de notre équipe [21, 22, 25], nous possédons un modèle d'ostéosarcome de rat mimant la pathologie humaine concernant l'agressivité, la chimiorésistance et l'apparition de métastases pulmonaires (voir Section 2.6). Le traitement des animaux par l'ifosfamide aboutit à deux groupes, les bons versus les mauvais ou modérés répondeurs, dans une proportion plus proche de celle observée chez les patients. Par profilage de miARN, nous avons pu distinguer les tumeurs sensibles à l'ifosfamide de celles réfractaires à ce médicament et surtout prédire la réponse de tumeurs non traitées avec dix miARN grâce à l'utilisation d'algorithmes statistiques créés dans notre laboratoire [25]. Suite à ces données intéressantes, nous aimerions confirmer que cette signature de miARN était spécifique de la réponse tumorale au traitement et non liée à différents fonds génétiques tumoraux. Nous avons ainsi réalisé une analyse en puce CGH avec les mêmes tumeurs utilisées pour le profilage des miARN. Nous avons analysé deux tumeurs de chaque type, non traitées, traitées à l'ifosfamide et bon répondeur, ou traitées à l'ifosfamide et mauvais répondeur, par rapport au même échantillon osseux non traité, le tissu de référence dans l'analyse CGH. La majorité des aberrations chromosomiques observées dans la puce CGH étaient communes aux tumeurs non traitées et aux tumeurs traitées, quelle que soit leur réponse au traitement (Figure 6). Les quelques anomalies différentes étaient essentiellement liées à des spécificités biologiques tumorales individuelles.

Nous avons compilé toutes les anomalies et vérifié dans notre base de données « faites maison » si un miARN, identifié comme discriminant de la réponse tumorale, était localisé dans ces régions d'ADN. Fait intéressant, ce in silico l'analyse a également révélé que ni miARN ni gène n'étaient présents dans les quelques aberrations différentielles observées dans ces tumeurs, en particulier dans le chromosome 4 (Figure S4), suggérant que les différents profils de miARN étaient plutôt liés à la réponse tumorale au traitement et non dus à des réarrangements chromosomiques. Bien que nous ne puissions pas exclure que certaines protéines agissant en trans puissent être dérégulées en conséquence de ces aberrations, cela suggérait que toutes les tumeurs étaient homogènes et qu'une augmentation de certains miARN dans les tumeurs sensibles était due à leur régulation positive et non à une amplification génétique.

Il semble que le diagnostic moléculaire basé sur le profilage des miARN met en évidence le comportement tumoral, c'est-à-dire en réponse à un traitement, et donc un phénotype plutôt qu'un génotype contrairement à la puce CGH. Ces deux techniques moléculaires pourraient être un couple de choix pour améliorer la prise en charge des patients atteints de pathologies actuellement difficilement diagnostiques.

3.7. Les profils de miARN de rhabdomyosarcome étaient corrélés à leurs sous-types histologiques

Enfin, pour corroborer l'idée précédente considérant que le profilage des miARN pourrait être très utile pour les diagnostics incertains, nous avons effectué le profilage des miARN d'échantillons de rhabdomyosarcome. En fait, nous avons récemment montré que le profilage des miARN était fiable pour le diagnostic d'ostéosarcome sur 29 biopsies de patients en paraffine fixée au formol (FFPE) [25]. Sur la base du niveau d'expression d'un panel de cinq miARN, nous avons réussi à séparer les bons répondeurs des mauvais répondeurs au traitement. Nous avons donc évalué si notre plate-forme TLDA était également compétitive pour le diagnostic RMS. Nous avons obtenu dix-sept tumeurs dont des patients RMS alvéolaires, (Pax3+) (3 patients) ou Pax7+ (2), des patients RMS embryonnaires (6) et aRMS de fusion négative (6). Toutes ces tumeurs ont été diagnostiquées par immunohistochimie, FISH et qPCR, qui ont été validées par un anatomopathologiste référent (Tableau S5). Un clustering hiérarchique supervisé sur des tumeurs de rhabdomyosarcome suite à une ANOVA avec un P valeur entre les quatre types de RMS, a révélé que les tumeurs se regroupaient selon leurs altérations moléculaires Pax3/FOXO1, Pax7/FOXO1 ou pas de translocation, sur la base du niveau d'expression de 10 miARN (Figure 7(a)). Les tumeurs (Pax+), en particulier celles (Pax3+) surexprimaient tous ces miARN. Ensuite, nous avons effectué une analyse statistique avec ces dix miARN basée sur l'Analyse en Composantes Principales, une méthode qui permet d'étudier la variabilité entre un ensemble de variables. Cela consiste à attribuer un nouveau système de trois coordonnées à chaque miARN contributif par une procédure mathématique. Ensuite, les valeurs RQ de chaque miARN sont ajustées pour chaque tumeur par les nouveaux coefficients obtenus précédemment et additionnés. Ainsi, un diagramme PCA en 3 dimensions a été réalisé avec les trois nouvelles coordonnées pour chaque tumeur (Figure 7(b)). Grâce à cette représentation mathématique, nous avons pu distinguer (Pax+) de la fusion négative aRMS et eRMS. eRMS constitue également un groupe indépendant avec une valeur élevée du composant 2 (représenté dans l'axe des y sur la figure 7(b)). Les aRMS négatives à la fusion constituent un groupe à part même si certains échantillons étaient difficiles à classer en fonction de leur diagnostic incertain. Même si le nombre d'échantillons était faible pour chaque sous-ensemble, une analyse statistique a montré une P valeur entre (Pax3+) et (Pax7+) et entre (Pax+) et (Pax−) tumeurs, 0,05 et 0,0005 respectivement (Figure S6).


(une)
(b)
(une)
(b) Les signatures de miARN de rhabdomyosarcome étaient cohérentes avec leurs altérations moléculaires. (a) Ce regroupement hiérarchique supervisé n'a conservé que des miARN différemment exprimés dans les différents sous-types de RMS à la suite d'une ANOVA (

Nous avons montré que le profilage des miARN était un outil puissant pour discriminer les aRMS négatifs par fusion des RMS embryonnaires. Les miARN pourraient être des biomarqueurs utiles pour améliorer le diagnostic de ce type de RMS, car les aRMS à fusion négative sont actuellement moléculairement indiscernables de l'eRMS [7].

4. Discussion

Des signatures de miARN sont observées pour de nombreux types de cancers, à savoir les sarcomes [19], les cancers du sein et de la prostate [18, 32]. Ces signatures constituent des outils puissants de diagnostic et de pronostic des leucémies lymphoïdes chroniques [33], des adénocarcinomes du colon [34] ou des cancers du poumon [35]. Ici, nous avons montré que les lignées cellulaires d'ostéosarcome exprimaient également des modèles de miARN différents de ceux des cellules de chondrosarcome et de lymphome (Figure 1 (a)) et qui nous permettent de discriminer la réponse cellulaire au traitement chimiothérapeutique (Figures 1 (b), 2 et S3) . De plus, les signatures de miARN d'ostéosarcome étaient spécifiques à la cellule et au médicament (Figure 2 (a)). Cette spécificité médicamenteuse de l'ostéosarcome a également été observée par Song et al. avec des xénogreffes tumorales d'ostéosarcome U2-OS, dans lesquelles différents miARN ont été dérégulés en réponse aux agents chimiothérapeutiques doxorubicine, cisplatine et ifosfamide, seuls 3 miARN ont été couramment trouvés dérégulés en réponse à tous les médicaments [36]. De par leur spécificité, les miARN constituent des biomarqueurs prometteurs pour anticiper la réponse tumorale à un traitement d'intérêt. Comme nous l'avons récemment montré, grâce au profilage des miARN, nous avons pu prédire la réponse tumorale de l'ostéosarcome à la chimiothérapie pour les tumeurs du rat ainsi que pour les biopsies FFPE des patients [25]. Ici, nous avons montré que les profils de miARN des cellules d'ostéosarcome étaient conformes à leur réponse à l'inhibiteur de mTOR, RAD-001 (figures 3 et 4). Les miARN dérégulés en réponse à ce médicament dans les cellules sensibles, ciblaient efficacement la voie mTOR, en particulier les protéines en aval eIF4G et p70 S6 kinase (Figure 3(b)), et potentiellement RICTOR, ATG1 et HIF1a, qui pourraient être validées par qPCR analyse (figure 5).

En bref, les miARN sont apparus très utiles pour l'identification de nouvelles approches thérapeutiques passionnantes via le ciblage de certaines cibles protéiques miARN ou de certains miARN impliqués dans le développement tumoral eux-mêmes. À l'avenir, nous aimerions confirmer l'implication de ces miARN dans la réponse au traitement in vitro par l'utilisation d'imitateurs de miARN ou inversement d'acide nucléique verrouillé (LNA) contre ces miARN. Comme mentionné dans cette étude, nous possédons une intéressante in vitro modèle d'ostéosarcome, sur lequel nous avons pu tester la fonctionnalité des miARN en présence des différents médicaments utilisés dans ce travail. Suite à la validation de l'implication des miARN in vitro, nous testerions également ces imitateurs ou LNA in vivo dans le modèle d'ostéosarcome de rat. Cette approche a été utilisée avec succès dans le rhabdomyosarcome grâce à l'expression conditionnelle de miR-206 chez la souris [37] et pourrait devenir une puissante stratégie thérapeutique [38].

Outre l'identification de nouvelles cibles, les miARN constituent également une alternative intéressante aux technologies moléculaires conventionnelles utilisées en routine pour le diagnostic du cancer. En effet, les ostéosarcomes présentent des altérations caryotypiques complexes qui les rendent difficiles à diagnostiquer avec les méthodes diagnostiques actuelles, comme le CGH array [39]. Avec le modèle d'ostéosarcome de rat, nous avons confirmé que les tumeurs présentaient de nombreuses aberrations chromosomiques longues (Figure 6). Ces anomalies étaient généralement communes à toutes les tumeurs, quelle que soit leur sensibilité au traitement et ni les miARN d'intérêt ni les gènes n'étaient localisés dans ces régions (Figure S4). Même si certaines protéines impliquées dans la régulation de l'expression des miARN (facteurs agissant en trans ou facteurs de régulation épigénétique) pouvaient être dérégulées suite à ces mutations, les profils de miARN observés dans les tumeurs de rat pourraient être corrélés aux effets des médicaments cytotoxiques sur la machinerie des miARN et non aux réarrangements d'ADN en amont. Même si les miARN pouvaient être soumis à des régulations épigénétiques comme la méthylation ou l'acétylation, cela ne concerne que 5 à 10 % des miARN, et on pourrait considérer que ce processus est mineur pour la signature des miARN des tumeurs d'ostéosarcome et des cellules à base de 61miARN [40, 41] . Avec enthousiasme, notre travail est le premier à suggérer que les signatures de miARN n'étaient pas corrélées aux amplifications d'ADN, comme cela a été observé pour le neuroblastome [42] ou dans la leucémie de lignée mixte [43]. Bien que notre cohorte n'ait pas été pleinement satisfaisante, il est apparu que le profilage des miARN pouvait prédire la réponse tumorale au traitement en reflétant les spécificités biologiques de la tumeur et non les caractéristiques génotypiques. Ce travail met également en évidence la mesure des miARN comme partenaire intéressant de la puce CGH dans le cas de pathologies à caryotypes instables. De la même manière, Selvarajah et al. a été le premier à proposer une combinaison de CGH array et de FISH en interphase pour mieux comprendre la pathogenèse de l'ostéosarcome [44].

Les profils de miARN n'étaient pas seulement liés aux propriétés phénotypiques de l'ostéosarcome, mais également aux sous-types histologiques du rhabdomyosarcome. Par profilage des miARN, nous avons pu discriminer les différents sous-types de rhabdomyosarcome : Pax3+ ou Pax7+ ou fusion négatif, classiquement difficiles à diagnostiquer par analyse histologique (Figure 7(a)). Ce modèle de miARN était unique puisque tous les miARN identifiés comme discriminants ne sont pas ou peu décrits dans la littérature. De manière très intéressante, sur la base de leurs profils de miARN, nos algorithmes nous permettent de discriminer le RMS embryonnaire de l'aRMS négatif de fusion (Figure 7 (b)). Il était en accord avec les travaux de Wachtel et al. l'identification de différents profils d'expression liés à l'aRMS (Pax+), à l'aRMS à fusion négative et à l'eRMS [45].

Dans l'ensemble, il semble que la mesure des miARN soit avantageuse pour les sarcomes à caryotype complexe, car les RMS fusion négative, de la même manière que l'ostéosarcome, sont caractérisés par un caryotype complexe lié à un déséquilibre allélique, une perte d'hétérozygotie et des profils d'expression génique hétérogènes. Bien que la classification moléculaire des RMS fusion négative soit toujours controversée, notre travail corrobore l'étude de Davicioni et al. suggérant que Pax/FOXO1 dicte une signature d'expression spécifique dans le RMS par le profilage d'expression de microarray d'oligonucléotides [46].Inversement, cela diffère des travaux récents de Williamson suggérant que le rhabdomyosarcome alvéolaire à fusion négative est difficile à distinguer du rhabdomyosarcome embryonnaire concernant les caractéristiques de survie des patients, les profils d'expression génique et les puces CGH [7]. En fait, nos travaux et les leurs n'étaient pas totalement contradictoires, puisqu'ils portaient uniquement sur l'analyse génomique. Comme suggéré pour l'ostéosarcome, les modèles de miARN reflètent les propriétés phénotypiques de la tumeur plutôt que sa génétique et pourraient être une alternative prometteuse pour le diagnostic du RMS afin de dépasser les limites actuelles de l'analyse moléculaire combinée à l'histopathologie traditionnelle.

Ainsi, il semble que le profilage des miARN pourrait être très utile pour le diagnostic de l'ostéosarcome et du rhabdomyosarcome. Ici, nous avons montré qu'à partir de dix miARN, nous avons pu séparer les différents sous-types de RMS. Nous avons précédemment suggéré qu'un panel de cinq miARN était statistiquement suffisant pour distinguer la réponse puissante des patients atteints d'ostéosarcome au traitement [25]. La technologie TLDA présente de nombreux avantages, notamment son besoin d'une faible quantité d'ARN total et l'analyse possible d'échantillons FFPE, comme cela a été précédemment montré par d'autres [47-49]. Cette méthode est particulièrement utile pour détecter les miARN circulants dans le sérum des patients, un domaine émergent ces deux dernières années [50, 51]. Un outil de diagnostic moléculaire basé sur le sang grâce au profilage des miARN à partir du sérum du patient pourrait constituer une avancée majeure pour l'ostéosarcome, nécessitant une biopsie pour son diagnostic, ce qui pourrait entraîner une amputation secondaire.

Au total, ces résultats prometteurs ouvrent la voie à un nouvel outil de diagnostic basé sur les miARN pour l'ostéosarcome ainsi que le rhabdomyosarcome, qui pourrait améliorer la survie des patients dans les deux cas grâce à la prédiction de la réponse des patients à la chimiothérapie et à l'identification précise des sous-types de RMS, respectivement.

Abréviations

CDDP :Cisplatine
Chondro :Cellules de chondrosarcome
Ct :Cycle de seuil
Dox :Doxorubicine
FFPE :Paraffine fixée au formol incluse
ifos :Ifosfamide
KEGG :Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes
LNA :Acide nucléique verrouillé
NT:Non traité
APC :Analyse des composants principaux
RAD :RAD-001
RMS :Rhabdomyosarcome
RQ :Quantité relative
RT-qPCR :PCR quantitative en temps réel
TLDA :Matrice basse densité Taqman
15-47:Cellules d'ostéosarcome humain CRL-15-47.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Ligue Nationale contre le Cancer (bourses du département de l'Ain), l'Institut National du Cancer et le Consortium Conticanet. Les auteurs remercient Imaxio, qui a réalisé l'analyse CGH.

Les références

  1. L. B. Rozeman, A. M. Cleton-Jansen et P. C. W. Hogendoorn, « Pathologie des tumeurs primitives malignes des os et du cartilage », Orthopédie internationale, vol. 30, non. 6, pp. 437-444, 2006. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  2. S. Ferrari et E. Palmerini, « La chimiothérapie combinée adjuvante et néoadjuvante pour le sarcome ostéogénique », Opinion actuelle en oncologie, vol. 19, non. 4, pp. 341–346, 2007. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  3. A. J. Chou et R. Gorlick, « Résistance à la chimiothérapie dans l'ostéosarcome : défis actuels et orientations futures » Examen d'experts de la thérapie anticancéreuse, vol. 6, non. 7, pp. 1075-1085, 2006. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  4. F. G. Barr, N. Galili, J. Holick, J. A. Biegel, G. Rovera et B. S. Emanuell, « Réarrangement du gène de la boîte appariée PAX3 dans le rhabdomyosarcome alvéolaire à tumeur solide pédiatrique » Génétique de la nature, vol. 3, non. 2, pp. 113–117, 1993. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  5. R. J. Davis, C. M. D'Cruz, M. A. Lovell, J. A. Biegel et F. G. Barr, « Fusion of PAX7 to FKHR by the variant t(113)(p36q14) translocation in alveolar rhabdomyosarcoma » Recherche contre le cancer, vol. 54, non. 11, pp. 2869-2872, 1994. Voir sur : Google Scholar
  6. P. H. B. Sorensen, J. C. Lynch, S. J. Qualman et al., « Les fusions de gènes PAX3-FKHR et PAX7-FKHR sont des indicateurs pronostiques dans le rhabdomyosarcome alvéolaire : un rapport du Children's Oncology Group », Journal d'oncologie clinique, vol. 20, non. 11, pp. 2672–2679, 2002. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  7. D. Williamson, E. Missiaglia, A. de Reyniès et al., « Le rhabdomyosarcome alvéolaire à gène de fusion négatif est cliniquement et moléculairement indiscernable du rhabdomyosarcome embryonnaire » Journal d'oncologie clinique, vol. 28, non. 13, pp. 2151–2158, 2010. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  8. A. Esquela-Kerscher et F. J. Slack, "Oncomirs—microRNAs with a role in cancer," Nature Avis Cancer, vol. 6, non. 4, pp. 259-269, 2006. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  9. G. Hutvágner et P. D. Zamore, "Un microARN dans un complexe enzymatique ARNi à rotation multiple", Science, vol. 297, non. 5589, pp. 2056-2060, 2002. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  10. Y. Lee, C. Ahn, J. Han et al., "La RNase III nucléaire Drosha initie le traitement des microARN," La nature, vol. 425, non. 6956, pp. 415–419, 2003. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  11. J. G. Doench et P. A. Sharp, « Spécificité de la sélection de cibles de microARN dans la répression traductionnelle » Gènes et développement, vol. 18, non. 5, pp. 504-511, 2004. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  12. Z. Li, M. Q. Hassan, M. Jafferji et al., « Les fonctions biologiques de miR-29b contribuent à la régulation positive de la différenciation des ostéoblastes » Journal de chimie biologique, vol. 284, non. 23, pp. 15676–15684, 2009. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  13. T. Sugatani et K. A. Hruska, "Le microARN-223 est un facteur clé dans la différenciation des ostéoclastes," Journal de biochimie cellulaire, vol. 101, non. 4, pp. 996–999, 2007. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  14. K. Chen et N. Rajewsky, « Sélection naturelle sur les sites de liaison de microARN humains déduits des données SNP », Génétique de la nature, vol. 38, non. 12, pp. 1452–1456, 2006. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  15. J. Lu, G. Getz, E. A. Miska et al., "Les profils d'expression de microARN classent les cancers humains," La nature, vol. 435, non. 7043, pp. 834-838, 2005. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  16. S. Volinia, G. A. Calin, C. G. Liu et al., "Une signature d'expression de microARN des tumeurs solides humaines définit les cibles des gènes du cancer", Actes de l'Académie nationale des sciences des États-Unis d'Amérique, vol. 103, non. 7, pp. 2257–2261, 2006. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  17. G. A. Calin, M. Ferracin, A. Cimmino et al., "Une signature de microARN associée au pronostic et à la progression de la leucémie lymphoïde chronique", Journal de médecine de la Nouvelle-Angleterre, vol. 353, non. 17, pp. 1793-1801, 2005. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  18. A. Israël, R. Sharan, E. Ruppin et E. Galun, « Activité accrue des microARN dans les cancers humains » PLoS Un, vol. 4, non. 6, numéro d'article e6045, 2009. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  19. S. Subramanian, W. O. Lui, C. H. Lee et al., « Signature d'expression de microARN des sarcomes humains », Oncogène, vol. 27, non. 14, pp. 2015-2026, 2008. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  20. J. C. Wittig, J. Bickels, D. Priebat et al., « Ostéosarcome : une approche multidisciplinaire du diagnostic et du traitement », Médecin de famille américain, vol. 65, non. 6, pp. 1123-1136, 2002. Voir sur : Google Scholar
  21. A. Dutour, D. Leclers, J. Monteil et al., « L'imagerie non invasive est en corrélation avec les caractéristiques histologiques et moléculaires d'un modèle d'ostéosarcome : application pour la détection précoce et le suivi du phénotype MDR » Recherche anticancéreuse, vol. 27, non. 6B, pp. 4171-4178, 2007. Voir sur : Google Scholar
  22. A. Dutour, J. Monteil, F. Paraf et al., « Endostatin cDNA/cationic liposome complexes as a prometteur therapy to prevent lung metastases in osteosarcome: study in a human-like rat orthotopic tumor », Thérapie moléculaire, vol. 11, non. 2, pp. 311-319, 2005. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  23. M. Allouche, H. G. Delbruck et B. Klein, « Tumeurs osseuses malignes induites par une injection locale de 144Cérium radioactif colloïdal chez le rat comme modèle pour les ostéosarcomes humains » Journal international du cancer, vol. 26, non. 6, pp. 777-782, 1980. Voir sur : Google Scholar
  24. K. Arakawa, N. Kono, Y. Yamada, H. Mori et M. Tomita, « Outil de visualisation des voies basé sur KEGG pour les données omics complexes » Biologie In Silico, vol. 5, non. 4, pp. 419-423, 2005. Voir sur : Google Scholar
  25. A. Gougelet, D. Pissaloux, A. Besse et al., « Profils de miARN dans l'ostéosarcome en tant qu'outil prédictif de la réponse au traitement chimiothérapeutique de l'ifosfamide » Journal international du cancer. Dans la presse. Voir sur : Google Scholar
  26. R. E. Brown, « Portrait morphoprotéomique de la voie mTOR dans le chondrosarcome mésenchymateux », Annales des sciences cliniques et de laboratoire, vol. 34, non. 4, pp. 397-399, 2004. Voir sur : Google Scholar
  27. Q. Zhou, Z. Deng, Y. Zhu, H. Long, S. Zhang et J. Zhao, « La voie de transduction du signal mTOR/p70S6K contribue à la progression de l'ostéosarcome et au pronostic des patients » Oncologie médicale, vol. 27, non. 4, pp. 1239-1245, 2010. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  28. B. H. Jiang et L. Z. Liu, « Rôle de mTOR dans la résistance aux médicaments anticancéreux : perspectives pour l'amélioration du traitement médicamenteux », Mises à jour sur la résistance aux médicaments, vol. 11, non. 3, pp. 63-76, 2008. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  29. X. Wan, A. Mendoza, C. Khanna et L. J. Helman, "La rapamycine inhibe le comportement métastatique médié par l'ezrine dans un modèle murin d'ostéosarcome," Recherche contre le cancer, vol. 65, non. 6, pp. 2406–2411, 2005. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  30. I. Beuvink, A. Boulay, S. Fumagalli et al., « L'inhibiteur de mTOR RAD001 sensibilise les cellules tumorales à l'apoptose induite par l'ADN endommagé par l'inhibition de la traduction de p21 » Cellule, vol. 120, non. 6, pp. 747-759, 2005. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  31. S. Mabuchi, D. A. Altomare, D. C. Connolly et al., « RAD001 (Everolimus) retarde l'apparition et la progression de la tumeur dans un modèle murin transgénique de cancer de l'ovaire » Recherche contre le cancer, vol. 67, non. 6, pp. 2408–2413, 2007. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  32. S. Ambs, R. L. Prueitt, M. Yi et al., "Le profilage génomique du microARN et de l'ARN messager révèle une expression de microARN dérégulée dans le cancer de la prostate," Recherche contre le cancer, vol. 68, non. 15, pp. 6162-6170, 2008. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  33. G. A. Calin, M. Ferracin, A. Cimmino et al., "Une signature de microARN associée au pronostic et à la progression de la leucémie lymphoïde chronique", Journal de médecine de la Nouvelle-Angleterre, vol. 353, non. 17, pp. 1793-1801, 2005. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  34. A. J. Schetter, S. Y. Leung, J. J. Sohn et al., « Profils d'expression de microARN associés au pronostic et aux résultats thérapeutiques dans l'adénocarcinome du côlon » Journal de l'Association médicale américaine, vol. 299, non. 4, pp. 425–436, 2008. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  35. S. L. Yu, H. Y. Chen, G. C. Chang et al., "La signature de microARN prédit la survie et la rechute dans le cancer du poumon", Cellule cancéreuse, vol. 13, non. 1, pp. 48-57, 2008. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  36. B. Song, Y. Wang, Y. Xi et al., "Mécanisme de chimiorésistance médié par miR-140 dans les cellules humaines d'ostéosarcome et de cancer du côlon," Oncogène, vol. 28, non. 46, pp. 4065-4074, 2009. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  37. R. Taulli, F. Bersani, V. Foglizzo et al., « Le microARN spécifique du muscle miR-206 bloque la croissance du rhabdomyosarcome humain chez les souris xénogreffées en favorisant la différenciation myogénique » Journal d'investigation clinique, vol. 119, non. 8, pp. 2366–2378, 2009. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  38. R. N. Veedu et J. Wengel, « Acides nucléiques verrouillés : analogues d'acides nucléiques prometteurs pour des applications thérapeutiques », Chimie et biodiversité, vol. 7, non. 3, pp. 536-542, 2010. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  39. J. A. Fletcher, M. C. Gebhardt et H. P. Kozakewich, « Aberrations cytogénétiques dans les ostéosarcomes : délétions non aléatoires, anneaux et chromosomes à double minute », Génétique du cancer et cytogénétique, vol. 77, non. 1, pp. 81-88, 1994. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  40. L. Han, P. D. Witmer, E. Casey, D. Valle et S. Sukumar, « La méthylation de l'ADN régule l'expression des microARN » Biologie et thérapie du cancer, vol. 6, non. 8, pp. 1284-1288, 2007. Voir sur : Google Scholar
  41. Y. Saito et P. A. Jones, « Activation épigénétique des microARN suppresseurs de tumeurs dans les cellules cancéreuses humaines », Cycle cellulaire, vol. 5, non. 19, pp. 2220-2222, 2006. Voir sur : Google Scholar
  42. I. Bray, K. Bryan, S. Prenter et al., "Désrégulation généralisée des MiARN par amplification MYCN et déséquilibres chromosomiques dans le neuroblastome: association de l'expression des miARN avec la survie," PLoS Un, vol. 4, non. 11, numéro d'article e7850, 2009. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  43. S. Mi, Z. Li, P. Chen et al., « Surexpression et fonction aberrantes du cluster miR-17-92 dans la leucémie aiguë réarrangée par MLL », Actes de l'Académie nationale des sciences des États-Unis d'Amérique, vol. 107, non. 8, pp. 3710–3715, 2010. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  44. S. Selvarajah, M. Yoshimoto, O. Ludkovski et al., « Signatures génomiques de l'instabilité chromosomique et de la progression de l'ostéosarcome détectées par la matrice haute résolution CGH et l'interphase FISH » Recherche en cytogénétique et en génome, vol. 122, non. 1, pp. 5-15, 2008. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  45. M. Wachtel, M. Dettling, E. Koscielniak et al., « Les signatures d'expression génique identifient les sous-types de rhabdomyosarcome et détectent une nouvelle translocation t(22)(q35p23) fusionnant PAX3 à NCOA1 » Recherche contre le cancer, vol. 64, non. 16, pp. 5539–5545, 2004. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  46. E. Davicioni, F. G. Finckenstein, V. Shahbazian, J. D. Buckley, T. J. Triche et M. J. Anderson, « Identification d'une signature d'expression du gène PAX-FKHR qui définit les classes moléculaires et détermine le pronostic des rhabdomyosarcomes alvéolaires » Recherche contre le cancer, vol. 66, non. 14, pp. 6936–6946, 2006. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  47. A. B. Hui, W. Shi, P. C. Boutros et al., « Profilage global robuste de micro-ARN avec des tissus de cancer du sein fixés au formol et inclus en paraffine » Enquête en laboratoire, vol. 89, non. 5, pp. 597–606, 2009. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  48. K. R. M. Leite, J. M. S. Canavez, S. T. Reis et al., « Analyse des miARN du cancer de la prostate par PCR quantitative en temps réel : comparaison entre les tissus enrobés de paraffine fixée au formol et les tissus frais congelés » Oncologie urologique : séminaires et investigations originales. Dans la presse. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  49. A. Liu, M. T. Tetzlaff, P. VanBelle et al., "Le profilage d'expression de microARN surpasse le profilage d'expression d'ARNm dans les tissus inclus en paraffine fixés au formol," Journal international de pathologie clinique et expérimentale, vol. 2, non. 6, pp. 519-527, 2009. Voir sur : Google Scholar
  50. X. Chen, Y. Ba, L. Ma et al., « Caractérisation des microARN dans le sérum : une nouvelle classe de biomarqueurs pour le diagnostic du cancer et d'autres maladies » Recherche cellulaire, vol. 18, non. 10, pp. 997–1006, 2008. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  51. P. S. Mitchell, R. K. Parkin, E. M. Kroh et al., « Les microARN circulants en tant que marqueurs sanguins stables pour la détection du cancer » Actes de l'Académie nationale des sciences des États-Unis d'Amérique, vol. 105, non. 30, pp. 10513–10518, 2008. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar

Droits d'auteur

Copyright © 2011 Angélique Gougelet et al. Il s'agit d'un article en libre accès distribué sous la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur n'importe quel support, à condition que l'œuvre originale soit correctement citée.


Voir la vidéo: Qué es el micro-RNA? (Décembre 2022).