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7.12 : Outils du Génie Génétique - Biologie

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7.12 : Outils du génie génétique

Les 4 meilleurs outils du génie génétique

La création d'une banque génomique implique le clonage de l'ADN génomique entier. Par conséquent, une bibliothèque génomique est une collection de molécules d'ADN recombinant (plasmides, phages) de sorte que la somme totale des inserts d'ADN dans cette collection représente l'ensemble du génome de l'organisme. Selon la taille du génome, procaryote ou eucaryote, le vecteur peut être sélectionné. De cette façon, le génome entier peut être coupé en morceaux et cloné dans des vecteurs ou par technique PCR. Cela peut être appelé clonage génomique.

La fabrication de la bibliothèque génomique comprend les étapes suivantes :

1. Isolement de l'ADN chromosomique

2. La fragmentation de l'ADN est réalisée par cisaillement mécanique ou sonication ou en utilisant une endonucléase appropriée pour la digestion partielle de l'ADN (Fig. 15.1). Le cisaillement mécanique génère des extrémités franches tandis que l'endonucléase produit des extrémités cohésives. Une digestion complète est évitée car elle génère des fragments de taille trop hétérogène pour être utilisés.

3. Ligature des fragments d'ADN - La digestion partielle de l'ADN génomique est soumise à une électrophorèse sur gel d'agarose pour la séparation des fragments de la taille requise. Les fragments de taille appropriée sont élués du gel. Ces fragments sont ensuite insérés dans un vecteur approprié. Ces vecteurs sont coupés avec les mêmes enzymes de restriction. Après cela, les fragments d'ADN sont ligaturés dans un vecteur en utilisant de l'ADN ligase (Fig. 15.2). Par cette technique, des fragments d'ADN d'environ 25 kb peuvent être insérés dans des vecteurs.

4. Identification du clone souhaité - Identification de la colonie bactérienne contenant le fragment d'ADN souhaité en utilisant une sonde d'hybridation appropriée dans l'hybridation de colonie. La sonde peut être l'ARNm du gène, l'ADNc de son ARNm, un gène homologue d'un autre organisme, ou un oligonucléotide synthétique représentant la séquence d'une partie du gène/fragment d'ADN souhaité. Afin de détecter l'hybridation, la sonde doit être marquée habituellement avec un isotope radiomarqué.

Systèmes vectoriels alternatifs pour créer une bibliothèque génomique:

Pour les procaryotes (petits génomes) viables pour créer des bibliothèques de gènes dans des plasmides. Le plasmide insère normalement -5-10 kb, il suffit donc de quelques milliers de recombinants pour une bibliothèque représentative. Les eucaryotes (génomes plus gros) ont vraiment besoin de vecteurs pouvant contenir des fragments d'ADN insérés beaucoup plus gros (tableau 15.1).

Le bactériophage lambda montre une infection d'E. coli beaucoup plus efficace que celle qui peut être obtenue par transformation plasmidique. Le phage lambda se lie aux récepteurs à la surface d'E. coli et injecte de l'ADN. L'infection par lambda est beaucoup plus efficace que la transformation plasmidique – peut obtenir

10 9 plaques par microgramme d'ADN, vs

106 colonies par microgramme d'ADN plasmidique.

Au fur et à mesure que les cellules bactériennes se lysent, une plaque se forme, qui se propage à mesure que davantage de cellules s'infectent et se lysent. La plaque contient les particules virales ou virions infectieux et chacun représente un clone lambda individuel (similaire à une colonie bactérienne représentant un clone plasmidique individuel).

L'apparence est celle d'un cercle clair dans un ‘nuage’ de cellules bactériennes (la ‘pelouse’ bactérienne) (Fig. 15.3). S'ils sont incubés pendant de longues périodes, ces cercles continueront de croître (contenant de plus en plus de particules virales) et de se propager jusqu'à ce que toutes les cellules bactériennes soient éliminées. Pour prélever un seul clone lambda, la plaque est « poinçonnée » de la plaque de gélose et stockée dans une solution de maintien. Cela peut ensuite être utilisé pour infecter davantage de cellules bactériennes et pour répliquer davantage d'ADN lambda recombinant.

Vecteurs pour créer des bibliothèques avec des inserts plus grands:

Les bibliothèques de cosmides sont utilisées pour cloner des gènes avec de grands introns et pour séquencer de plus gros morceaux du génome. Les vecteurs cosmidiques sont des hybrides d'ADN plasmidique et de bactériophage lambda λ (un petit

Plasmide de 5 kb contenant l'origine plasmidique de réplication (ori), un gène de résistance aux antibiotiques tel que amp et un site de restriction approprié pour le clonage avec la séquence COS de l'ADN du phage ). En raison de la séquence COS, les recombinants cosmidiques peuvent être encapsidés dans des particules virales (permettant une transformation à haute efficacité).

Étant donné que la plupart des bibliothèques génomiques dans le vecteur cosmide, l'ADN a été rejeté, il peut être remplacé par l'ADN d'intérêt, tant qu'il ne dépasse pas la limite de 50 kb pour l'empaquetage dans la tête virale. Les tailles des inserts sont de l'ordre de 35-45 ko. Étant donné que l'ADN recombinant ne code aucune protéine lambda, les cosmides ne forment pas de particules virales (ou plaques) mais forment plutôt de grands plasmides circulaires et les colonies qui apparaissent peuvent être sélectionnées sur des plaques antibiotiques, comme d'autres transformants d'ADN plasmidique.

Les clones de cosmides peuvent être manipulés de la même manière, ce qui facilite l'isolement des plasmides. Étant donné que de nombreux gènes eucaryotes sont de l'ordre de 30 à 40 kb, la probabilité d'obtenir un clone d'ADN contenant la séquence complète du gène est considérablement augmentée lors de l'utilisation d'une bibliothèque de cosmides.

Les bibliothèques YAC sont utilisées pour cloner de très gros fragments d'ADN (de plus de 1 Mb) et sont utiles pour cloner de grands gènes (tels que le gène de la fibrose kystique de 250 kb) et pour créer des bibliothèques de grands clones chevauchants, comme pour les chromosomes individuels isolés à partir d'organismes (banques chromosomiques). Ceux-ci ont été largement utilisés pour cartographier les génomes d'organismes complexes (par exemple Homo sapiens).

Les YAC sont des chromosomes artificiels de levure et sont des hybrides d'ADN plasmidique bactérien et d'ADN de levure. Les composants requis pour la réplication/ségrégation des chromosomes naturels de levure ont été combinés avec l'ADN plasmidique d'E. coli. Les YAC sont cultivés dans la levure Saccharomomyces cerevesiae et contiennent ainsi des marqueurs sélectionnables qui conviennent au système hôte. Plutôt que la sélection d'antibiotiques, les marqueurs sélectionnables de levure permettent la croissance du transformant sur des milieux sélectifs dépourvus de nutriments spécifiques. (Les non-transformants sont incapables de se développer). Les souches de levure utilisées sont auxotrophes, c'est-à-dire qu'elles sont incapables de fabriquer un composé spécifique.

Par exemple, les mutants Trpl ne peuvent pas fabriquer de tryptophane et ne peuvent donc se développer que sur des milieux complétés par du tryptophane. Si la souche mutante est transformée avec un YAC contenant un gène Trpl intact, cela compensera le gène inactif (complément) et la cellule transfectée est capable de se développer sur des milieux dépourvus de tryptophane.

Les YAC ne sont plus aussi largement utilisés en raison de problèmes inhérents. Par exemple, les clones YAC peuvent contenir des segments non contigus du génome. Cela signifie que 2 fragments d'ADN ou plus provenant de parties distinctes du génome peuvent être intégrés dans un YAC individuel (car ils sont capables de supporter des inserts assez volumineux). Un deuxième problème est que les YAC sont instables et perdent fréquemment des parties de l'ADN pendant la propagation.

Les bibliothèques BAC sont également utilisées pour le clonage de très gros fragments d'ADN et ont été particulièrement utiles pour le séquençage de grands génomes. Les BAC sont des chromosomes artificiels bactériens et sont basés sur un grand plasmide bactérien naturel, le facteur F. Les vecteurs BAC peuvent accueillir des inserts d'ADN jusqu'à 300 kb, ce qui reste assez respectable lorsqu'il faut cloner de grands gènes ou cartographier et séquencer des génomes complexes. Les BAC présentent plusieurs avantages par rapport aux YAC, ce qui signifie qu'ils sont désormais plus largement utilisés. La plupart du génome humain a été séquencé à l'aide de clones BAC plutôt que YAC.

Outil # 2. ADNc et ADNc Lbibliothèque :

L'ADN complémentaire (ADNc) est un ADN synthétique fabriqué à partir d'ARNm à l'aide d'une enzyme spéciale appelée transcriptase inverse (ADN polymérase dépendante de l'ARN découverte par Temin et Baltimore en 1970). A l'origine, cette enzyme était isolée des rétrovirus. Cette enzyme effectue des réactions similaires à celles de l'ADN polymérase et nécessite une amorce avec un terminal 3 & 8242 OH libre. Avec l'utilisation d'un ARNm comme matrice, la transcriptase inverse synthétise une molécule d'ADN simple brin qui peut ensuite être utilisée comme matrice pour l'ADN double brin (Fig. 15.4). Parce qu'il est fabriqué à partir d'ARNm, l'ADNc est dépourvu de séquences régulatrices en amont et en aval et d'introns.

Cela signifie que l'ADNc des eucaryotes peut être traduit en protéine fonctionnelle chez les bactéries, une caractéristique importante lors de l'expression des gènes eucaryotes chez l'hôte bactérien. Une courte chaîne oligo (dT) est hybridée à la queue poly (A) du brin d'ARNm. Le segment oligo (dT) sert d'amorce pour l'action de la transcriptase inverse, qui utilise l'ARNm comme matrice pour la synthèse du brin d'ADNc. L'ADNc résultant se termine par une boucle en épingle à cheveux. Lorsque l'ARNm, issu de l'hybride ARN-ADN, a été dégradé par traitement avec NaOH ou RNase H, un court morceau d'ARN est laissé derrière. Cette boucle en épingle à cheveux devient une amorce pour l'ADN polymérase I, qui complète le brin d'ADN apparié.

La boucle est ensuite clivée par la nucléase SI (qui n'agit que sur la boucle simple brin) pour produire une molécule d'ADNc double brin. Cet ADN double brin peut être inséré dans des vecteurs de clonage plasmide, cosmide, phage lambda par ligature à extrémités franches.

Une banque d'ADNc est une population de transforants bactériens ou de lysats de phages dans laquelle chaque ARNm isolé d'un organisme ou d'un tissu est représenté par son insertion d'ADNc dans un plasmide ou un vecteur phagique. La fréquence de l'ADNc spécifique dans une telle banque dépendrait de la fréquence de l'ARNm concerné dans ce tissu.

Outil # 3. Analyse des gènes et des transcriptions de gènes:

La technologie de l'ADN recombinant implique la localisation du gène d'intérêt. Ce gène peut être soit isolé, soit synthétisé avant d'être manipulé et utilisé pour une transformation conduisant à la production de plantes et d'animaux transgéniques. Différentes techniques ont été utilisées pour l'isolement de différentes variétés de gènes comme le gène de l'ARN ribosomique, le gène pour les traits phénotypiques avec un produit génique inconnu, pour des produits protéiques spécifiques, et les gènes impliqués dans les fonctions régulatrices, par ex. gènes promoteurs, etc.

Isolement des gènes d'ARN ribosomique:

L'ARN ribosomique constitue les 80% de l'ARN total et est synthétisé sur le gène ribosomique qui a pu être isolé. L'isolement de ce gène était facile en raison de certaines caractéristiques de l'ARNr (a) les gènes ribosomiques sont présents en plusieurs copies (b) la différence entre les gènes ribosomiques et d'autres gènes, en raison de leur teneur relativement élevée en G + C dans l'ARNr. Le gène ribosomique a été isolé pour la première fois en 1965 par H. Wallace et M.L. Birnstiel dans un amphibien nommé Xenopus.

Les différentes étapes impliquées dans l'isolement des gènes d'ARNr sont les suivantes :

1. L'ARNr est isolé des ribosomes et est rendu radiomarqué en leur permettant de se répliquer dans un milieu contenant de l'uridine tritiée.

2. L'ADN ribosomique est isolé par centrifugation en gradient de densité (la teneur élevée en G+C de l'ADNr facilite sa séparation par centrifugation du reste de l'ADN) suivie de sa dénaturation.

3. L'ADN simple brin est ensuite fixé sur du papier filtre et l'ARN marqué est ajouté au papier.

4. Maintenant, l'hybridation d'ADN et d'ARN se produit et l'excès d'ARN marqué est éliminé par lavage.

5. La radioactivité est mesurée et un hybride duplex qui, après dénaturation, donnera un ADN simple brin qui peut être rendu double brin. C'est ainsi que le gène de l'ARNr peut être isolé.

Isolement du gène de protéines spécifiques:

Ceci est possible grâce à l'utilisation d'une enzyme transcriptase inverse. Cette enzyme peut faire une copie/ADN complémentaire (ADNc) à partir d'ARN. Il est donc nécessaire que des techniques d'isolement de l'ARNm soient disponibles.

Les différentes étapes impliquées sont les suivantes :

1. Le produit protéique du gène est purifié.

2. Des anticorps sont produits contre ces produits protéiques en immunisant des animaux comme le lapin et la souris.

3. La précipitation des polysomes est effectuée qui sont engagés dans la synthèse de protéines spécifiques. Cela se fait à l'aide d'anticorps produits.

4. L'ARNm est isolé et purifié à partir des fractions de polysomes. Cet ARNm est utilisé pour synthétiser l'ADNc.

5. Ces ADNc sont ensuite insérés dans des vecteurs de clonage pour la préparation d'une banque d'ADNc. Après cela, une analyse immunologique et électrophorétique des produits de traduction des clones d'ADNc est effectuée, pour identifier le clone d'ADNc spécifique, ayant le gène d'une protéine d'intérêt spécifique.

6. Des sondes d'ADNc spécifiques sont ensuite sélectionnées pour l'identification et l'isolement du gène à partir de l'ADN génomique par criblage d'une banque génomique complète ou partielle.

Isolement de gène de produits inconnus (avec expression spécifique de tissu):

Il est facile d'isoler les produits de gènes qui sont spécifiques d'un tissu. Par exemple, les gènes des protéines de stockage ne sont exprimés que dans les graines en développement, le gène de la globine est exprimé dans les érythrocytes. De tels gènes peuvent être facilement isolés car l'ARNm extrait d'un tel tissu sera en grande partie un gène d'intérêt. D'autres ARNm peuvent être éliminés, qui peuvent être identifiés par isolement et comparaison d'ARNm du tissu où ce gène n'est pas exprimé. Ensuite, cet ARNm isolé est utilisé pour la synthèse d'ADNc à l'aide d'une enzyme transcriptase inverse. Ensuite, le processus est le même que celui décrit dans l'isolement des gènes codant pour des protéines spécifiques connues.

Isolement de gènes à l'aide de sondes ADN et ARN:

Si les sondes moléculaires spécifiques (sondes d'ADN et d'ARN) sont disponibles, elles peuvent être utilisées pour l'isolement de gènes spécifiques. Ces sondes peuvent être obtenues soit à partir d'une autre espèce végétale, soit être synthétisées artificiellement en utilisant une partie de la séquence d'acides aminés du produit protéique du gène d'intérêt. Les sondes obtenues à partir d'une espèce végétale et utilisées pour une autre espèce végétale sont appelées sondes hétérologues.

Ces sondes hétérologues se sont avérées efficaces pour identifier des clones de gènes au cours d'une hybridation de colonies ou d'une hybridation sur plaque ou lors d'un transfert de Southern. Par exemple, le gène de la chalcone synthase a été isolé d'Antirrhinum majus et de Petunia hybrida en utilisant une sonde hétérologue de parsely. Les sondes hétérologues sont généralement utilisées avec la banque d'ADNc.

Maintenant, avec notre connaissance de la synthèse de sondes d'ADNc, ces sondes peuvent être utiles dans la synthèse de sondes synthétiques. Dans cette procédure, la protéine purifiée à l'aide de l'électrophorèse sur gel bidimensionnelle est utilisée pour le micro-séquençage de 5 à 15 acides aminés consécutifs, cette information peut être utilisée pour la synthèse des oligonucléotides correspondants à l'aide de synthétiseurs d'ADN automatisés. Ces oligonucléotides peuvent ensuite être directement utilisés pour le criblage d'ADNc ou d'une banque génomique pour l'isolement du gène d'intérêt.

Outil # 4. Hybridation des colonies:

L'hybridation de colonies est le criblage d'une banque avec une sonde marquée (radioactive, bioluminescente, etc.) pour identifier une séquence spécifique d'ADN, d'ARN, d'enzyme, de protéine ou d'anticorps (Fig. 15.5).

L'hybridation a deux caractéristiques importantes :

1. Les réactions d'hybridation sont des sondes spécifiques qui se lieront uniquement aux sites qui ont des séquences complémentaires.

2. Les réactions d'hybridation se produisent en présence de grandes quantités de molécules similaires mais non identiques au site. Cela signifie qu'une sonde peut trouver une molécule cible dans un mélange de millions de molécules apparentées mais non complémentaires.

Cette spécificité permet de trouver une séquence spécifique dans un mélange complexe plein de séquences similaires. Une technique d'hybridation permet également aux scientifiques de sélectionner la molécule d'intérêt à partir de mélanges très complexes et d'étudier la molécule seule.

Méthode d'hybridation de colonies:

Les étapes suivantes sont requises :

1. Isoler et cultiver les cultures dans un milieu approprié (agar).

2. Transférer un échantillon des colonies sur une matrice solide telle qu'une membrane de nitrocellulose ou de nylon.

3. Les cellules sur la membrane sont lysées et l'ADN est ensuite dénaturé.

4. Une sonde marquée est ajoutée à la matrice et l'hybridation a lieu.

5. La matrice est rincée pour éliminer les molécules sondes non hybridées.

6. Pour les sondes radioactives, on utilise l'autoradiographie et la matrice est placée sur film radiographique.

7. Le film est observé pour les points noirs qui correspondent aux colonies qui se sont hybridées avec la sonde.

8. Comparez le film radiographique avec la plaque maîtresse pour voir quelles colonies ont eu une hybridation de sonde. Ce sont les colonies qui contenaient la séquence spécifique qui s'est réellement hybridée avec la sonde.

9. Les colonies sur la plaque maîtresse qui ont la séquence désirée peuvent ensuite être repiquées si désiré.

Avantages:

1. Vous permet de choisir une molécule d'intérêt parmi des millions.

2. Ne nécessite pas l'isolement des acides nucléiques.

3. Il est possible de cultiver et d'identifier des micro-organismes contenant la séquence hybridée.

Désavantages:

1. Prend du temps, prend du temps pour que les colonies incubent et pour que l'hybridation soit visible sur le film radiographique.

2. Lors de l'identification des micro-organismes, la procédure ne fonctionnera que si les organismes se développent et forment une colonie détectable.


Voici une liste des outils/enzymes moléculaires d'un ingénieur génétique les plus couramment utilisés dans les expériences de génie génétique :

1. Réaction en chaîne par polymérase (PCR)

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est le processus de réplication de plusieurs copies des gènes d'intérêt. La découverte d'ADN polymérases thermostables, telles que Taq La polymérase, a permis de manipuler la réplication de l'ADN en laboratoire. Il amplifie les quantités de segments d'ADN. Les amorces sont utilisées pour identifier le gène d'intérêt et les répliquer. Ces copies peuvent ensuite être séparées et purifiées par électrophorèse sur gel.

2. Enzymes de restriction (ciseaux moléculaires)

La découverte d'enzymes connues sous le nom d'endonucléases de restriction a été essentielle à l'ingénierie des protéines. Sur la base de la séquence nucléotidique, ces enzymes coupent l'ADN à des emplacements spécifiques. L'ADN coupé avec une enzyme de restriction produit de nombreux fragments plus petits de tailles variables. Ceux-ci peuvent être séparés par électrophorèse sur gel ou chromatographie.

3. Électrophorèse sur gel

Purifier l'ADN de la culture cellulaire ou le couper à l'aide d'enzymes de restriction ne serait pas d'une grande utilité si nous ne pouvions pas visualiser l'ADN. L'électrophorèse sur gel permet de visualiser la taille et le type d'ADN extrait par PCR et enzymes de restriction. Il est également utilisé pour détecter les inserts et les knockouts d'ADN.

4. ADN ligase

L'ADN ligase peut créer des liaisons covalentes entre les chaînes nucléotidiques. Ceci est fait pour créer des brins recombinants ou fermer un brin circulaire qui a été coupé par des enzymes de restriction. Les enzymes ADN polymérase I et polynucléotide kinase sont également importantes pour combler les lacunes ou phosphoryler les extrémités 5', respectivement.

5. Plasmides

Les plasmides sont de petits morceaux d'ADN circulaires qui ne font pas partie du génome bactérien mais sont capables de s'auto-répliquer. Il est utilisé comme vecteur pour transporter des gènes entre les micro-organismes. Une fois que le gène d'intérêt a été amplifié par PCR, le gène et le plasmide sont coupés par des enzymes de restriction et ligaturés ensemble. La combinaison résultante est connue sous le nom d'ADN recombinant. L'ADN viral (bactériophage) peut également être utilisé comme vecteur, tout comme les cosmides, qui sont des plasmides recombinants contenant des gènes de bactériophage.

6. Transformation/Transduction

Transformation est le processus de transfert de matériel génétique dans un vecteur, tel qu'un plasmide, dans des cellules hôtes. Les cellules hôtes sont exposées à un changement environnemental, comme l'électroporation, qui les rend « compétentes » ou temporairement perméables au vecteur. Plus le plasmide est gros, plus l'efficacité avec laquelle il est absorbé par les cellules est faible.

Les segments d'ADN plus grands sont plus facilement clonés en utilisant un bactériophage, un rétrovirus ou d'autres vecteurs viraux ou cosmides dans une méthode appelée Transduction. Les vecteurs phagiques ou viraux sont souvent utilisés en médecine régénérative mais peuvent provoquer l'insertion d'ADN dans des parties de nos chromosomes où nous ne le voulons pas, provoquant des complications et même le cancer.

7. Identification des organismes transgéniques

Toutes les cellules n'absorberont pas l'ADN pendant la transformation. Par conséquent, il est essentiel d'identifier les cellules qui subissent une transformation et celles qui ne l'ont pas fait. Généralement, les plasmides portent des gènes de résistance aux antibiotiques, et les cellules transgéniques peuvent être sélectionnées sur la base de l'expression de ces gènes et de leur capacité à se développer sur des milieux contenant cet antibiotique. Des méthodes alternatives de sélection dépendent de la présence d'autres protéines rapporteurs telles que x-gal/lacZ ou protéine de fluorescence verte, qui permettent une sélection basée respectivement sur la couleur et la fluorescence.


Applications du génie génétique [retour au sommet]

Cette section contient des informations supplémentaires qui ne sont pas directement incluses dans AS Biology. Cependant, il peut être utile pour aider à soutenir et à consolider les techniques de GE.

Nous avons maintenant examiné quelques-unes des nombreuses techniques utilisées par les ingénieurs génétiques. Que peut-on faire avec ces techniques ? Les applications les plus nombreuses sont de loin les outils de recherche, et les techniques ci-dessus aident les généticiens à comprendre des systèmes génétiques complexes. Malgré tout le battage médiatique, le génie génétique a encore très peu d'applications commerciales réussies, bien que celles-ci augmentent chaque année. Les applications à ce jour peuvent utilement être considérées en trois groupes.

utiliser des organismes génétiquement modifiés (généralement des microbes) pour produire des produits chimiques, généralement pour des applications médicales ou industrielles.

utiliser la technologie génétique pour modifier les caractéristiques des organismes (généralement des animaux de ferme ou des cultures)

utiliser la technologie génétique sur des humains pour traiter une maladie

Produits génétiques [retour au sommet]

Le type de génie génétique le plus important et le plus réussi est la production de produits génétiques. Ces produits ont une valeur médicale, agricole ou commerciale. Ce tableau montre quelques exemples de produits génétiquement modifiés qui sont déjà disponibles.

hormone humaine utilisée pour traiter le diabète

hormone de croissance humaine, utilisée pour traiter le nanisme

hormone de croissance bovine, utilisée pour augmenter le rendement laitier des vaches

facteur de coagulation du sang humain, utilisé pour traiter les hémophiles

agent anticoagulant utilisé en chirurgie

antibiotique, utilisé pour tuer les bactéries

antigène de l'hépatite B, pour la vaccination

enzyme utilisée pour traiter la fibrose kystique et l'emphysème

enzyme utilisée pour traiter la maladie de Pompe

enzyme utilisée dans la fabrication du fromage

enzyme utilisée dans la production de papier

Les produits sont principalement des protéines, qui sont produites directement lorsqu'un gène est exprimé, mais il peut également s'agir de produits non protéiques produits par des enzymes génétiquement modifiées. L'idée de base est de transférer un gène (souvent humain) à un autre organisme hôte (généralement un microbe) afin qu'il produise le produit génique rapidement, à moindre coût et de manière éthique. Il est également possible de fabriquer des « protéines de conception » en modifiant les séquences de gènes, mais bien qu'il s'agisse d'un outil de recherche utile, il n'y a pas encore d'applications commerciales.

Étant donné que le produit final n'est qu'un produit chimique, en principe, n'importe quel type d'organisme peut être utilisé pour le produire. Les bactéries sont de loin le groupe d'organismes hôtes le plus couramment utilisé pour fabriquer des produits géniques, car elles peuvent se développer rapidement et le produit peut être purifié à partir de leurs cellules. Malheureusement, les bactéries ne peuvent pas toujours fabriquer des protéines humaines, et récemment des animaux et même des plantes ont également été utilisés pour fabriquer des produits génétiques. Dans aucun des cas, il n'est approprié d'extraire le produit de leurs cellules, de sorte que chez les animaux, le produit doit être sécrété dans le lait ou l'urine, tandis que chez les plantes, le produit doit être sécrété par les racines. Ce tableau montre certains des avantages et des inconvénients de l'utilisation de différents organismes pour la production de produits géniques modifiés par génie génétique.

Pas de noyau donc ADN facile à modifier ont des plasmides petit génome génétique bien comprise asexuée donc peut être cloné petit et croissance rapide facile à cultiver commercialement dans des fermenteurs utilisera des glucides bon marché peu de problèmes éthiques.

Impossible d'épisser les introns pas de modification post-traductionnelle petite taille des gènes

Peuvent épisser les introns peuvent faire des modifications post-traductionnelles peuvent accepter de grands gènes

N'ayant pas de plasmides (sauf la levure) souvent diploïdes, il peut donc être nécessaire d'insérer deux copies de gènes, contrôle de l'expression mal compris.

Asexué donc peut être cloné haploïde, donc un seul exemplaire nécessaire peut être cultivé en cuve

Ne peut pas toujours fabriquer des produits génétiques d'animaux

Photosynthétique donc ne nécessite pas beaucoup d'alimentation peut être cloné à partir de cellules individuelles, les produits peuvent être sécrétés par les racines ou dans la sève.

Les parois cellulaires difficiles à pénétrer par le vecteur à croissance lente doivent être cultivées dans des champs multicellulaires

Les produits les plus susceptibles d'être capables de fabriquer des protéines humaines peuvent être sécrétés dans le lait ou l'urine

Croissance lente multicellulaire

Nous allons regarder quelques exemples en détail

Insuline humaine [retour au sommet]

L'insuline est une petite hormone protéique produite par le pancréas pour réguler la concentration de sucre dans le sang. Dans la maladie diabète insulino-dépendant les cellules du pancréas ne produisent pas assez d'insuline, provoquant des symptômes de dépérissement et éventuellement la mort. La maladie peut être traitée avec succès par injection d'insuline extraite du pancréas de vaches et de porcs abattus. Cependant, l'insuline de ces espèces a une séquence d'acides aminés légèrement différente de celle de l'insuline humaine, ce qui peut entraîner un rejet immunitaire et des effets secondaires.

Le gène de l'insuline humaine a été isolé, cloné et séquencé dans les années 1970, et il est ainsi devenu possible d'insérer ce gène dans des bactéries, qui pourraient alors produire de l'insuline humaine en grande quantité. Malheureusement, ce n'était pas si simple. Chez l'homme, les cellules pancréatiques fabriquent d'abord pro-insuline, qui subit ensuite une modification post-traductionnelle pour produire l'insuline finale et fonctionnelle. Les cellules bactériennes ne peuvent pas effectuer de modification post-traductionnelle. Finalement, un gène d'ADNc synthétique a été fabriqué et inséré dans la bactérie E. coli, qui a fait de la pro-insuline, et la conversion post-traductionnelle en insuline a été effectuée chimiquement. Cette technique a été développée par Eli Lilly and Company en 1982 et le produit, « humulin », est devenu le premier produit génétiquement modifié approuvé pour un usage médical.

Dans les années 1990, la procédure a été améliorée en utilisant la levure Saccharomyces cerevisiae à la place de E. coli. La levure, en tant qu'eucaryote, est capable de modifications post-traductionnelles, ce qui simplifie la production d'insuline humaine. Cependant, une autre société a développé une méthode de conversion de l'insuline porcine en insuline humaine en modifiant chimiquement quelques acides aminés, et cela s'avère moins cher que les méthodes de génie génétique. Tout cela montre que les ingénieurs génétiques ont encore beaucoup à apprendre.

Hormone de croissance humaine (HGH) [retour au sommet]

HGH est une hormone protéique sécrétée par l'hypophyse, qui stimule la croissance des tissus. La faible production de HGH dans l'enfance entraîne nanisme hypophysaire. Cela peut être traité avec de l'HGH extraite d'humains morts, mais comme le traitement a provoqué des effets secondaires, tels que la maladie de Creutzfeldt-Jacod (MCJ), le traitement a été retiré. Le gène HGH a été cloné et un gène d'ADNc artificiel a été inséré dans E. coli. Une séquence signal a été ajoutée qui non seulement provoque la traduction du gène, mais également la sécrétion de la protéine par la cellule, ce qui rend la purification beaucoup plus facile. Cette HGH génétiquement modifiée est produite par Genentech et peut restaurer avec succès une taille normale chez les enfants présentant une déficience en HGH.

Somatotrophine bovine (BST) [retour au sommet]

C'est une hormone de croissance produite par le bétail. Le gène a été cloné dans des bactéries par la société Monsanto, qui peut produire de grandes quantités de BST. aux États-Unis, les bovins reçoivent souvent des injections de BST toutes les 2 semaines, ce qui entraîne une augmentation de 10 % de la masse des bovins de boucherie et une augmentation de 25 % de la production laitière des vaches laitières. La BST a été testée au Royaume-Uni en 1985, mais elle n'a pas été approuvée et son utilisation est actuellement interdite dans l'UE. Cela est dû en partie aux préoccupations du public et en partie au fait qu'il existe déjà une surproduction de lait et de bœuf dans l'UE, une production plus importante n'est donc pas nécessaire.

Rennin [retour au sommet]

La rennine est une enzyme utilisée dans la fabrication du fromage. Elle est produite dans l'estomac des mammifères juvéniles (y compris l'homme) et elle aide à la digestion de la césine protéique du lait en la solidifiant pour qu'elle reste plus longtemps dans l'estomac. Traditionnellement, l'industrie fromagère a utilisé de la présure obtenue à partir de l'estomac de jeunes veaux lors de leur abattage pour la viande de veau, mais il existe des objections morales et pratiques à cette source. Maintenant, un gène d'ADNc artificiel pour la rénine a été fabriqué à partir d'ARNm extrait de cellules d'estomac de veau, et ce gène a été inséré dans une variété de microbes tels que la bactérie E. coli et le champignon Aspergillus niger. La présure extraite de ces microbes a eu beaucoup de succès et 90 % de tous les fromages à pâte dure au Royaume-Uni sont fabriqués à partir de présure microbienne. Parfois (mais pas toujours) ces produits sont étiquetés comme « fromage végétarien ».

AAT (une -1-antitrypsine) [retour au sommet]

L'AAT est une protéine humaine fabriquée dans le foie et présente dans le sang. Comme son nom l'indique, il s'agit d'un inhibiteur des enzymes protéases comme la trypsine et l'élastase. Il existe une mutation rare du gène AAT (une substitution de base unique) qui rend l'AAT inactive, et donc les enzymes protéases ne sont pas inhibées. L'effet le plus notable de ceci dans les poumons, où élastase digère le tissu élastique des alvéoles, conduisant à la maladie pulmonaire emphysème. Cette condition peut être traitée en inhalant un aérosol contenant de l'AAT afin qu'il atteigne les alvéoles et y inhibe l'élastase.

L'AAT pour ce traitement peut être extraite des dons de sang, mais seulement en très petites quantités. Le gène de l'AAT a été trouvé et cloné, mais l'AAT ne peut pas être produite dans les bactéries car l'AAT est glycoprotéine, ce qui signifie qu'il doit avoir des sucres ajoutés par modification post-traductionnelle. Ce type de modification ne peut être effectué que par des animaux, et l'AAT est maintenant produite par des moutons génétiquement modifiés. Afin de rendre l'AAT facile à extraire, le gène a été couplé à un promoteur de la protéine du lait b-lactoglubuline. Comme ce promoteur n'est activé que dans les cellules de la glande mammaire, le gène AAT ne sera exprimé que dans les cellules de la glande mammaire et sera donc sécrété dans le lait de brebis. Cela le rend très facile à récolter et à purifier sans nuire aux moutons. La première brebis transgénique à produire de l'AAT s'appelait Tracy, et elle a été produite par PPL Pharmaceuticals à Édimbourg en 1993. C'est ainsi que Tracy wa s fait :

Une brebis reçoit un médicament de fertilité pour stimuler sa production d'ovules, et plusieurs ovules matures sont prélevés dans ses ovaires.

Les œufs sont fécondés in vitro.

Un plasmide est prepar contenant le gène de l'AAT humaine et la séquence promotrice de la b-lactoglobuline. Des centaines de copies de ce plasmide sont microinjectées dans le noyau des zygotes fécondés. Seuls quelques-uns des zygotes seront transformés, mais à ce stade, vous ne pouvez pas dire lesquels.

Les zygotes se divisent in vitro jusqu'à ce que les embryons soient au stade de 16 cellules.

Les embryons de 16 cellules sont implantés dans l'utérus de brebis mères porteuses. Seules quelques implantations permettent une grossesse réussie.

Testez tous les descendants des mères porteuses pour la production d'AAT dans leur lait. C'est la seule façon de découvrir si le zygote a pris le gène AAT pour qu'il puisse s'exprimer. Environ 1 œuf sur 20 réussit.

Recueillez le lait des brebis transgéniques pour le reste de leur vie. Leur lait contient environ 35 g d'AAT par litre de lait. Elevez-vous également à partir d'eux afin de constituer un troupeau de moutons transgéniques.

Purifiez l'AAT, qui vaut environ 50 000 £ par mg.

Nouveaux phénotypes [retour au sommet]

Cela signifie modifier les caractéristiques des organismes par génie génétique. Les organismes sont généralement des cultures ou des animaux de ferme d'importance commerciale, et l'objectif est d'améliorer leur qualité d'une manière ou d'une autre. Cela peut être vu comme une version high-tech de élevage sélectif, qui a été utilisé par les humains pour modifier et améliorer leurs cultures et leurs animaux depuis au moins 10 000 ans. Néanmoins, les OGM se sont avérés être un développement très controversé. Nous n'avons pas besoin de les étudier en détail, mais ce tableau donne une idée de ce qui est fait.

Le gène de la protéine d'enveloppe du virus a été cloné et inséré dans des plants de tabac, de pomme de terre et de tomate. La protéine d'enveloppe semble « immuniser » les plantes, qui sont beaucoup plus résistantes aux attaques virales.

Cultures résistantes aux herbicides

Microbes de nettoyage de l'environnement

Thérapie génique [retour au sommet]

C'est peut-être le type de génie génétique le plus important et le plus controversé. C'est aussi la moins développée. L'idée de la thérapie génique est de modifier génétiquement les humains afin de traiter une maladie. Cela pourrait représenter la première opportunité de guérir des maladies incurables. Notez que cela est très différent de l'utilisation de microbes génétiquement modifiés pour produire un médicament, un vaccin ou une hormone pour traiter une maladie par des moyens conventionnels. La thérapie génique consiste à modifier le génotype d'un tissu ou même d'un être humain entier.

Fibrose kystique [retour au sommet]

La mucoviscidose (FK) est la maladie génétique la plus courante au Royaume-Uni, touchant environ 1 personne sur 2500. Elle est causée par une mutation du gène de la protéine appelée CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator). Le gène est situé sur le chromosome 7, et il existe en fait plus de 300 mutations différentes connues, bien que la mutation la plus courante soit une délétion de trois bases, éliminant un acide aminé sur 1480 acides aminés dans la protéine. CFTR est une protéine du canal ionique chlorure présente dans la membrane cellulaire des cellules tissulaires épithéliales (doublure), et la mutation arrête le fonctionnement de la protéine, de sorte que les ions chlorure ne peuvent pas traverser la membrane cellulaire.

Les ions chlorure s'accumulent à l'intérieur de ces cellules, ce qui provoque l'entrée d'ions sodium pour équilibrer la charge, et la concentration accrue de ces deux ions à l'intérieur des cellules épithéliales diminue le potentiel osmotique. L'eau est donc retenue à l'intérieur des cellules, ce qui signifie que le mucus sécrété par ces cellules est plus sec et plus collant que la normale. Ce mucus collant bloque les tubes dans lesquels il est sécrété, tels que l'intestin grêle, le canal pancréatique, le canal cholédoque, le canal spermatique, les bronchioles et les alvéoles.

Ces blocages entraînent les symptômes de la mucoviscidose : essoufflement, infections pulmonaires telles que bronchite et pneumonie, mauvaise digestion et absorption, et infertilité. Parmi ces symptômes, les effets pulmonaires sont les plus graves, causant 95 % des décès. La mucoviscidose est toujours mortelle, bien que l'espérance de vie soit passée d'un an à environ 20 ans grâce aux traitements modernes. Ces traitements comprennent la physiothérapie plusieurs fois par jour pour déloger le mucus des poumons, des antibiotiques pour combattre les infections, des médicaments à base de DNAse pour détacher le mucus, des enzymes pour aider à la digestion des aliments et même une greffe cœur-poumon.

Compte tenu de ces traitements compliqués (et finalement infructueux), la mucoviscidose est un bon candidat pour la thérapie génique et a été l'une des premières maladies à être combattue de cette manière. Le gène du CFTR a été identifié en 1989 et un clone d'ADNc a été créé peu après. L'idée est de délivrer des copies de ce bon gène aux cellules épithéliales du poumon, où elles peuvent être incorporées dans l'ADN nucléaire et fabriquer des canaux chlorure CFTR fonctionnels. Si environ 10 % des cellules pouvaient être corrigées, cela guérirait la maladie.

Deux modes de délivrance sont à l'essai : les liposomes et les adénovirus, tous deux délivrés avec un inhalateur aérosol, comme ceux utilisés par les asthmatiques. Des essais cliniques sont actuellement en cours, mais aucune thérapie n'a encore fait la preuve de son efficacité.

SCID [retour au sommet]

La maladie d'immunodéficience combinée sévère (SCID) est une maladie génétique rare qui affecte le système immunitaire. Elle est causée par une mutation dans le gène de l'enzyme adénosine désaminase (ADA). Sans cette enzyme, les globules blancs ne peuvent pas être fabriqués, de sorte que les personnes atteintes n'ont presque aucun système immunitaire efficace et contracteraient rapidement une infection mortelle à moins qu'elles ne passent leur vie dans un isolement stérile (le SCID est également connu sous le nom de « syndrome du bébé dans une bulle »). La thérapie génique a été tentée avec quelques enfants aux États-Unis et au Royaume-Uni en prélevant chirurgicalement des cellules de la moelle osseuse (qui fabriquent les globules blancs dans le corps) du patient, en les transfectant avec un virus génétiquement modifié contenant le gène ADA, puis en retournant les cellules transformées au patient. L'espoir est que ces cellules transformées se multiplient dans la moelle osseuse et produisent des globules blancs. Les essais sont toujours en cours, le succès est donc inconnu.

L'avenir de la thérapie génique [retour au sommet]

La thérapie génique n'en est qu'à ses balbutiements et reste un domaine de recherche plutôt que d'application. Personne n'a encore été guéri par la thérapie génique, mais le potentiel reste alléchant. La thérapie génique ne doit même pas se limiter au traitement des maladies génétiques, mais pourrait également aider à traiter les infections et les maladies environnementales :

La thérapie de la lignée germinale serait très efficace, mais elle est aussi potentiellement dangereuse (puisque les effets à long terme des altérations génétiques ne sont pas connus), contraire à l'éthique (puisqu'elle pourrait facilement conduire à l'eugénisme) et immorale (puisqu'elle pourrait impliquer de modifier et de détruire des humains). embryons). Il est actuellement illégal au Royaume-Uni et dans la plupart des autres pays, et les recherches actuelles se concentrent uniquement sur la thérapie cellulaire somatique. Tous les essais de thérapie génique au Royaume-Uni doivent être approuvés par le Comité consultatif sur la thérapie génique (GTAC), un organisme gouvernemental qui examine les motifs médicaux et éthiques d'un essai. La modification de la lignée germinale est autorisée chez les animaux et constitue en effet la base de la production d'OGM.


TECHNOLOGIES ÉMERGENTES DU GÉNIE GÉNÉTIQUE

En plus des technologies discutées ci-dessus, de nouvelles approches de génie génétique ont été développées et sont affinées et améliorées. Bien qu'ils n'aient pas encore été appliqués aux produits commerciaux, ils ont une valeur pratique pour les futures cultures génétiquement modifiées. Les technologies comprennent l'édition du génome, des composants d'ADN synthétiques et des chromosomes artificiels, ainsi que des modifications épigénétiques ciblées.

Édition du génome

L'édition du génome utilise des nucléases dirigées vers le site (SSN de nucléases spécifiques à une séquence) pour muter des séquences d'ADN ciblées dans un organisme. En utilisant les systèmes SSN, les scientifiques peuvent supprimer, ajouter ou modifier des bases spécifiques à un locus désigné. Les SSN clivent l'ADN à des sites spécifiques et laissent une seule cassure (appelée entaille) ou une cassure double brin. La cassure de l'ADN peut être réparée de deux manières (Figure 7-1) :

  • Grâce au processus de jonction des extrémités non homologues natives des cellules (NHEJ), qui conduit à une mutation sur le site.
  • Si une molécule d'ADN de donneur est fournie en même temps que l'ADN est modifié par les nucléases, par le biais de la cellule, sa propre machine de réparation d'ADN native, connue sous le nom de réparation dirigée par homologie (HDR), incorpore la molécule du donneur au site de clivage.

Quatre classes principales de SSN sont utilisées dans l'édition du génome végétal (revue dans Voytas et Gao, 2014) : les méganucléases, les nucléases à doigt de zinc (ZFN), les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN) et les répétitions palindromiques en cluster régulièrement espacées (CRISPR) /Système de nucléase Cas9 (Figure 7-2).Le domaine des technologies et des applications d'édition du génome a explosé, en particulier depuis l'avènement du système CRISPR/Cas9, et le comité s'attend à ce que des découvertes supplémentaires facilitent l'édition du génome au cours de la prochaine décennie.

Les méganucléases se produisent naturellement dans les bactéries, les archées et les eucaryotes et ont été les premiers SSN examinés pour l'édition du génome. Les méganucléases sont des protéines uniques qui reconnaissent une séquence dans l'ADN d'au moins 12 nucléotides et clivent l'ADN cible, laissant une cassure double brin qui peut être réparée par NHEJ ou HDR en utilisant une molécule donneuse (examiné dans Silva et al. , 2011). L'édition du génome médiée par les méganucléases a été démontrée chez le maïs (Zea mays) et du tabac (Nicotiana spp.) (revue dans Baltes et Voytas, 2014). Il est difficile de modifier la spécificité de la séquence cible des méganucléases, elles ne sont donc pas largement utilisées pour l'édition du génome.

Les protéines contenant des doigts et des domaines de zinc se lient à l'ADN et sont largement répandues dans la nature, fonctionnant souvent comme des facteurs de transcription (protéines qui régulent l'expression des gènes en se liant directement ou indirectement aux séquences d'ADN régulatrices généralement trouvées dans les régions promotrices des gènes 3 ). Les domaines à doigt de zinc peuvent être manipulés pour lier des séquences spécifiques d'ADN lorsqu'ils sont fusionnés au domaine de nucléase coupant l'ADN de la protéine FokI, un ZFN est la molécule hybride résultante. Une paire de fonctions ZFN en tandem

3 Des exemples de génie génétique utilisant des facteurs de transcription sont donnés au chapitre 8.

ILLUSTRATION 7-1 Conséquences du clivage de l'ADN par les technologies d'édition du génome dans la cellule.
SOURCE : Sander et Joung (2014).
REMARQUE : Après le clivage de l'ADN double brin par des nucléases spécifiques à la séquence telles que les méganucléases, les doigts de zinc, les effecteurs de type activateur de transcription et les répétitions palindromiques régulièrement espacées en cluster/Cas9 (représentées par l'éclair), la rupture double brin dans le La molécule d'ADN peut être réparée par des mécanismes natifs de jonction d'extrémité non homologue (NHEJ) de la cellule, ce qui conduit à une séquence d'ADN altérée avec soit une délétion (ligne rouge pointillée) soit une insertion (ligne verte continue). Si une matrice d'ADN de donneur est fournie (voir fragment d'ADN bleu), les mécanismes de réparation dirigée par homologie (HDR) au sein de la cellule inséreront la molécule du donneur dans le locus, ce qui conduit à un gène modifié ou à une région cible (région bleue avec un insertion ou modification précise).

pour couper l'ADN au site cible souhaité (examiné dans Urnov et al., 2010). Comme pour les méganucléases, les ZFN sont utilisées pour introduire des mutations via NHEJ et HDR. Les ZFN ont été utilisées dans l'ingénierie de nombreuses espèces végétales (examinées dans Baltes et Voytas, 2014). Les ZFN ont été le premier outil d'édition du génome de concepteur largement utilisé en biologie.

Des effecteurs de type activateur de transcription (TALE) ont été découverts dans le pathogène végétal bactérien Xanthomonas et pourrait être conçu pour se lier à pratiquement n'importe quelle séquence d'ADN. Leur facilité de conception pour des séquences d'ADN cibles spécifiques a révolutionné l'édition du génome. Dans la nature, Xanthomonas espèces sécrètent des TALE dans les cellules végétales pour activer la pathogénicité. Les TALE se lient aux promoteurs des gènes végétaux pour supprimer la résistance de la plante à l'agent pathogène. Les bactéries codent les TALE grâce à un simple code ou chiffre qui a été

FIGURE 7-2 Technologies d'édition du génome : méganucléases, nucléases à doigt de zinc (ZFN), nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN) et répétitions palindromiques régulièrement espacées en cluster (CRISPR)/Cas.
SOURCE : Baltes et Voytas (2014).

exploité pour concevoir des protéines avec une spécificité de site personnalisée dans n'importe quel génome cible (Boch et al., 2009 Moscou et Bogdanove, 2009). Comme les ZFN, les TALE peuvent être fusionnés avec le domaine nucléase de FokI et sont alors appelés TALEN. Les TALEN sont utilisés par paires comme les ZFN pour affecter les mutations ciblées. Les TALEN ont été utilisés pour éditer les génomes de plusieurs plantes, dont le riz (Oryza spp.), maïs, blé (Triticum spp.), et le soja (Glycine max) (revue dans Baltes et Voytas, 2014).

CRISPR était l'outil d'édition du génome le plus récemment développé lors de la rédaction du rapport du comité. Les bactéries hébergent CRISPR en tant que mécanisme de défense inné contre les virus et les plasmides qui utilisent des nucléases guidées par l'ARN pour cibler le clivage de séquences d'ADN étrangères. Au moment de la rédaction du rapport du comité, le système CRISPR/Cas utilisé dans l'édition du génome était principalement le type II CRISPR/Cas9, de Streptocoque pyogène, dans lequel des séquences d'ADN étranger sont incorporées entre des séquences répétées au locus CRISPR, puis transcrites en une molécule d'ARN connue sous le nom de crRNA (examiné par Sander et Joung, 2014). Le crRNA s'hybride ensuite avec un deuxième ARN, le tracrRNA, et le complexe se lie à la nucléase Cas9. Le crRNA guide le complexe vers l'ADN cible et, dans le cas de l'immunité innée chez les bactéries, se lie à la séquence complémentaire de l'ADN cible qui est ensuite clivé par la nucléase Cas9. Les scientifiques ont disséqué le système inné CRISPR/Cas9 et l'ont repensé de telle sorte qu'un seul ARN, l'ARN guide, soit nécessaire pour le clivage médié par Cas9 d'une séquence cible dans un génome. Les exigences de conception de l'ARN guide sont limitées à une séquence unique d'environ 20 nucléotides dans le génome (pour éviter les effets hors cible) et sont restreintes à proximité de la séquence de motifs adjacente au protospacer, qui est spécifique au système CRISPR/Cas. Les applications plus récentes de CRISPR incluent l'utilisation de deux ARN guides uniques avec une nucléase modifiée qui "supprime" un brin de l'ADN, offrant une plus grande spécificité pour les suppressions ciblées. La facilité de conception, la spécificité de l'ARN guide et la simplicité du système CRISPR/Cas9 ont permis de démontrer rapidement l'utilité de cette méthode d'édition des génomes des plantes et autres organismes (revue dans Baltes et Voytas, 2014). L'édition du génome, en particulier CRISPR, évolue rapidement. Au moment de la rédaction du rapport du comité, des endonucléases non-Cas9 (par exemple, Cpf1) avaient été récemment décrites pour l'édition du génome CRISPR (Zetsche et al., 2015).

Lorsque le comité a rédigé son rapport, les applications des SSN dans l'édition du génome avaient été principalement utilisées pour introduire des mutations au locus cible via NHEJ pour produire des knock-outs de gènes. Comme le montre la figure 7-1, les nucléases peuvent également être utilisées pour le remplacement de séquence via HDR (ou potentiellement NHEJ) si un ADN donneur est co-introduit dans la cellule. Plusieurs types de molécules donneuses peuvent être utilisés. Premièrement, un allèle alternatif du locus cible peut être introduit de telle manière que le gène modifié code pour une protéine qui confère un caractère nouveau ou amélioré. Par exemple, la modification d'un seul nucléotide spécifique dans le gène de l'acétolactate synthase (ALS) peut conférer une résistance aux herbicides qui utilisent l'inhibition de l'ALS comme mode d'action (Jander et al., 2003). Deuxièmement, la recombinaison homologue peut être utilisée pour introduire une nouvelle séquence à ce locus. Cette &ldquoinsertion de génome de précision&rdquo par ingénierie d'un site d'atterrissage éliminerait l'insertion semi-aléatoire de transgènes dans Agrobactérie-méthodes de transformation médiées et médiées par des canons à gènes. Il permettrait également de combiner des éléments modifiés ou

des gènes édités à un seul locus, appelés « zones d'atterrissage » dans le génome plutôt que de manière aléatoire dans le génome, il serait donc plus facile d'ajouter de nouveaux traits à une culture génétiquement modifiée qui sont physiquement liés dans le génome (Ainley et al., 2013 ). Cette stratégie permettrait également l'élimination des gènes insérés lorsque cela est souhaité.

L'édition du génome via CRISPR et d'autres techniques pourrait être effectuée dans les plantes via l'expression transitoire de transgènes (Clasen et al., 2016) ou sans ADN exogène du tout (Woo et al., 2015) entraînant des plantes génétiquement modifiées dépourvues du transgène. Clasen et al. (2016) ont utilisé une paire TALEN génétiquement codée pour produire des mutations spécifiques dans les protoplastes de la pomme de terre. Les plants de pomme de terre récupérés des protoplastes avec des allèles ciblés mutés contenaient un nouveau caractère de qualité, et sept des 18 lignées GE ne contenaient aucune construction transgénique TALEN dans le génome de la pomme de terre. Woo et al. (2015) ont utilisé une protéine Cas9 traduite in vitro couplée pour guider l'ARN pour muter des gènes dans Arabidopsis, tabac, laitue et protoplastes de riz, à partir desquels des plantes mutées ont été récupérées. Ainsi, il apparaît que l'édition du génome peut être effectuée dans les cultures sans laisser d'empreinte d'ADN transgénique dans le génome. En l'absence de mutations hors cible, ce qui est évident d'après le séquençage ciblé en profondeur dans l'expérience sur la pomme de terre (Woo et al., 2015), les réactifs d'édition du génome 4 qui ne laissent pas de transgène dans le génome sembleraient être un outil précieux. approche d'amélioration des cultures.

Les exemples ci-dessus se concentrent sur l'utilisation de SSN pour cliver l'ADN et introduire des changements permanents dans la séquence de l'ADN double brin via NHEJ ou HDR. Cependant, il existe d'autres applications par lesquelles des protéines qui se lient à l'ADN d'une manière spécifique à une séquence peuvent être exploitées pour modifier les gènes et l'activité des gènes. Ils comprennent la fusion des caractéristiques de liaison à l'ADN des protéines à doigt de zinc (ZFP) ou des TALE pour activer des domaines afin de produire des activateurs transcriptionnels synthétiques. Sans fusions d'activateurs, les ZFP ou les TALE peuvent être utilisés comme répresseurs transcriptionnels. Les caractéristiques de conception des ZFP et des TALE permettent la production de facteurs de transcription synthétiques (TF) pour réguler l'expression de pratiquement n'importe quel gène cible (Figure 7-3). En effet, les TALE-TFs ont été utilisés en tandem pour produire une activation génétique additive dans des plantes transgéniques (Liu et al., 2014). Pour le système CRISPR/Cas9, une suite de molécules peut être fusionnée avec une nucléase Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) pour permettre un large éventail de modifications de la régulation des gènes, collectivement connues sous le nom d'interférence CRISPR (revue dans Doudna et Charpentier, 2014 Figure 7- 3). L'application la plus simple est peut-être la fusion du dCas9 à un activateur transcriptionnel ou à un répresseur transcriptionnel lorsqu'il est introduit dans une cellule avec un ARN guide, l'activateur ou le répresseur transcriptionnel peut modifier le nombre de transcrits

4 Les nucléases qui ont été personnalisées pour cibler une séquence spécifique sont appelées réactifs.

du gène cible d'une manière similaire aux ZFP et aux TALE. Les gènes dCas9 pourraient potentiellement être fusionnés avec des gènes de modification de la chromatine et guidés vers une région cible par l'ARN guide pour modifier l'état épigénétique d'un locus et ainsi affecter la transcription (Doudna et Charpentier, 2014).

CONSTATATION : L'exploitation des processus biologiques inhérents et les protéines à doigt de zinc de liaison à l'ADN (ZFN), la transcription dirigée par les agents pathogènes des gènes de l'hôte (TALE) et la dégradation ciblée des séquences d'ADN (CRISPR/Cas) et mdashnow permettent une manipulation précise et polyvalente de l'ADN dans les plantes.

Chromosomes artificiels et synthétiques

Une connaissance accrue des processus biologiques et des outils avancés de biologie moléculaire facilitera non seulement l'ingénierie de plusieurs gènes dans les plantes, mais rendra également possible l'insertion de voies ou de processus biochimiques complets et nouveaux. Les constructions d'ADN utilisées en génie génétique des plantes étaient de petite taille (moins de 20 à 40 kilobases) et ont utilisé des techniques traditionnelles de clonage moléculaire qui sont lentes et laborieuses. Cependant, de nouvelles méthodes peu coûteuses de synthèse de molécules d'ADN et de leur assemblage en molécules d'ADN plus grandes ont été développées. Les méthodes permettent une construction rapide et facile de voies multigéniques sur une seule molécule d'ADN (pour une revue, voir Ellis et al., 2011). La faisabilité des techniques a été démontrée par la synthèse d'un génome bactérien entier (Gibson et al., 2010) et la création d'un chromosome synthétique de levure (Annaluru et al., 2014). Les chercheurs aimeraient pouvoir introduire des dizaines à des centaines de gènes dans les plantes. Une méthode envisagée pour réaliser de telles avancées serait l'utilisation de minichromosomes artificiels ou de chromosomes synthétiques. Un minichromosome artificiel est un chromosome ajouté au composé naturel de la plante des chromosomes du noyau. Un chromosome synthétique (Annaluru et al., 2014) est une synthèse totale d'ADN pour remplacer un chromosome naturel ou même un génome d'organite entier, tel que le génome du plastome.

Des chromosomes et génomes artificiels ou synthétiques permettraient l'assemblage d'un grand nombre de gènes dans une molécule auto-répliquante. Chez les eucaryotes, les chromosomes sont des molécules d'ADN linéaires avec les séquences appropriées pour la réplication (origines de réplication), l'intégrité (télomères) et la ségrégation dans les cellules en division (centromères). L'utilisation de chromosomes artificiels ou synthétiques permettrait l'introduction de gènes dans les plantes d'une manière qui n'a pas le potentiel de perturber les gènes sur les chromosomes végétaux indigènes aux sites d'insertion.

Aucun chromosome ou génome synthétique n'a été créé dans les plantes, mais les méthodes utilisées pour fabriquer un chromosome synthétique de levure (Annaluru et

FIGURE 7-3 Utilisations alternatives des technologies d'édition du génome.
SOURCE : Illustration fournie par C. R. Buell.
REMARQUE : A, un effecteur de type doigt de zinc ou activateur de transcription (TALE) (bleu) peut être fusionné à un activateur transcriptionnel (vert) pour augmenter la transcription d'un gène d'intérêt. B, Un doigt de zinc ou TALE (bleu) peut être fusionné à un répresseur transcriptionnel (rouge) pour supprimer la transcription d'un gène d'intérêt. C, Une nucléase Cas9 catalytiquement inactive (violet) peut être fusionnée à un activateur transcriptionnel (vert) et, en présence d'un ARN guide (orange et jaune), guider le complexe vers le promoteur d'un gène d'intérêt et augmenter la transcription de le gène cible. D, A catalytiquement

FIGURE 7-3 A continué

la nucléase Cas9 inactive (violet) peut être fusionnée à un répresseur transcriptionnel (rouge) et, en présence d'un ARN guide (orange et jaune), guider le complexe vers le promoteur d'un gène d'intérêt et diminuer la transcription du gène cible. E, Une nucléase Cas9 catalytiquement inactive (violet) peut être fusionnée à une enzyme de méthylation de l'ADN et, en présence d'un ARN guide (orange et jaune), guider le complexe vers le promoteur d'un gène d'intérêt, en ciblant ce gène pour la méthylation et, par conséquent, la suppression de la transcription.

al., 2014) devraient être transférables aux plantes. Le chromosome III de levure, qui compte 316 617 bases, a été remplacé par un chromosome synthétisé en laboratoire de 272 871 bases. Le génome du chloroplaste, qui est de la moitié à un tiers de la taille du chromosome III de la levure, pourrait de manière prévisible être synthétisé et inséré dans une plante, telle que le tabac, qui se prête déjà à la transformation du plastome. Le coût de la synthèse d'ADN continue de diminuer, de sorte que le développement expérimental dans ce domaine serait économiquement réalisable.

La recherche sur les minichromosomes artificiels pour les plantes a généralement suivi deux approches (revue dans Gaeta et al., 2012 Birchler, 2015). Dans l'approche &ldquobottom-up&rdquo, les éléments clés d'un chromosome&mdash tels que le centromère, le télomère, l'origine de réplication et les gènes d'intérêt&mdapart assemblés, ce qui donne un minichromosome de novo. Bien que des progrès aient été réalisés avec cette approche, des caractéristiques supplémentaires, telles que la modification épigénétique des nucléotides de l'ADN, peuvent affecter l'expression des gènes (voir ci-dessous) et la capacité du minichromosome à se répliquer dans une cellule et ont empêché l'approche d'être utilisée en routine. L'approche &ldquotop-down&rdquo utilise essentiellement des chromosomes existants&mdash se rapprochant de l'approche de chromosome de levure synthétique&mdashpour construire un chromosome artificiel avec un modèle existant. Cette approche a entraîné la transmission du minichromosome par méiose, mais pas aussi efficacement que celle des chromosomes natifs. Aucune des deux approches n'a abouti à des minichromosomes pratiquement déployables. Ainsi, l'utilisation d'une approche synthétique pour remplacer systématiquement l'ADN, analogue à l'approche du projet levure, pourrait être possible à l'avenir (Birchler, 2015). Il est également possible que les approches ascendantes ou descendantes actuelles fonctionnent dans les cultures à propagation clonale, telles que la pomme de terre, étant donné que la méiose n'est pas nécessaire (Birchler, 2015).

Avec une solide base de connaissances sur les gènes sous-jacents à la biochimie végétale, des constructions précises peuvent être synthétisées in vitro et introduites dans une espèce hétérologue par Agrobactérie-transformation médiée ou médiée par un canon à gènes ou insertion ciblée par nucléase sur un seul site sélectionné. Par exemple, l'absinthe douce (Artemisia annua) produit de l'artémisinine, un composé antipaludique. Avec cinq gènes de levure et de A. annua, le tabac a été conçu pour synthétiser l'artémisinine (Farhi et al., 2011). Bien que le rendement en artémisinine du tabac ait été inférieur à celui de A. annua, cette étude de preuve de concept a démontré la faisabilité de l'ingénierie de voies biosynthétiques hétérologues chez les plantes. Avec un affinement supplémentaire des promoteurs, une meilleure compréhension de la compartimentation, du transport et du flux des métabolites dans les cellules et les tissus, et le développement de vecteurs tels que des chromosomes artificiels capables de transférer de grands segments d'ADN aux cellules végétales, le génie génétique des plantes pour des caractères complexes, tels que les ou de nouvelles voies biochimiques, et pour des tests physiologiques spécialisés

et les processus de développement, tels que la photosynthèse C4, peuvent être possibles (voir le chapitre 8 pour plus de détails).

Modifications épigénétiques ciblées

Comme indiqué plus haut dans ce chapitre, des changements héréditaires relativement stables dans l'expression de gènes spécifiques peuvent résulter de changements dans l'épigénome. Les changements dans la méthylation de l'ADN en particulier sont les plus susceptibles d'entraîner des changements héréditaires dans l'expression des gènes chez les plantes. À mesure que la compréhension de la biochimie des systèmes qui modifient les schémas de méthylation de l'ADN augmente, la capacité de cibler des gènes spécifiques pour des modifications épigénétiques augmente également. Un tel ciblage impliquerait l'expression des protéines et peut-être aussi des acides nucléiques spécifiques (par exemple, un ARN guide) qui dirigeraient la méthylation de l'ADN vers un locus spécifique. Le système de ciblage pourrait être supprimé une fois la modification épigénétique accomplie, par exemple, en utilisant la sélection végétale conventionnelle pour séparer le système de ciblage.

Sur la question clé de la sécurité, changer les modifications épigénétiques de gènes végétaux particuliers ne présente aucun problème fondamental, les génomes des plantes regorgent de modifications épigénétiques, et l'ADN modifié épigénétiquement est présent dans l'environnement et consommé par les humains depuis des milliers d'années. Ainsi, le problème de sécurité est le même que celui impliqué dans toute technique, qu'il s'agisse de génie génétique ou de génie non génétique, qui entraîne une augmentation ou une diminution de l'expression de gènes spécifiques dans une plante et des altérations de caractères spécifiques.

Il convient de noter qu'en plus des approches ciblées, il existe plusieurs façons de modifier de manière large et aléatoire l'épigénome d'une plante, comme la surexpression d'une enzyme qui modifie la méthylation de l'ADN. Bien entendu, les approches larges et aléatoires de la modification du génome d'une plante ne sont pas nouvelles : la mutagenèse est une approche large et aléatoire de la modification du génome. L'utilité d'approches larges et aléatoires de la modification du génome ou de l'épigénome est que si la biochimie ou la génétique d'un processus n'est pas suffisamment comprise pour permettre une approche ciblée, qu'il s'agisse d'une approche de génie génétique ou non génétique (comme la sélection assistée par marqueurs)&mdasha approche aléatoire pourrait produire un résultat souhaitable.Comme indiqué ci-dessus, les approches larges et aléatoires entraîneront des changements plus inconnus que les approches ciblées.

La cohérence est généralement une caractéristique souhaitable des nouvelles variétés de plantes. Étant donné que les changements épigénétiques peuvent revenir à l'état initial à des fréquences variées, la modification épigénétique pourrait ne pas être une approche idéale pour produire de nouvelles variétés végétales. Cependant, si une nouvelle variété végétale dérivée d'un changement épigénétique est supérieure à des alternatives stables, le potentiel d'un certain degré de réversion peut ne pas être un obstacle à la commercialisation.


La sénescence des feuilles déclenchée par l'âge et induite par l'obscurité nécessite les facteurs de transcription bHLH PIF3, 4 et 5

La sénescence des feuilles peut être déclenchée et favorisée par un grand nombre de facteurs développementaux et environnementaux. De nombreuses preuves ont suggéré une implication des phytochromes dans la régulation de la sénescence des feuilles, mais les voies de signalisation et les mécanismes physiologiques associés sont mal compris. Dans cette étude, nous avons initialement identifié les facteurs interagissant avec les phytochromes (PIF) 3, 4 et 5 comme médiateurs putatifs de la sénescence des feuilles. Des mutations des gènes PIF ont entraîné une augmentation significative de la longévité des feuilles dans la sénescence déclenchée par l'âge et induite par l'obscurité, tandis que les surexpressions de ces gènes ont accéléré la sénescence déclenchée par l'âge et induite par l'obscurité chez Arabidopsis. De manière cohérente, la perte de fonction de PIF4 a atténué les changements transcriptionnels induits par l'obscurité associés à la détérioration des chloroplastes et à la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). Les tests ChIP-PCR et Dual-Luciferase ont démontré que PIF4 peut activer le gène régulateur de dégradation de la chlorophylle NYE1 et réprimer le gène de maintien d'activité des chloroplastes GLK2 en se liant à leurs régions promotrices. Enfin, la biosynthèse de l'éthylène induite par l'obscurité et la sénescence induite par l'éthylène ont toutes deux été atténuées dans pif4, suggérant l'implication de PIF4 à la fois dans la biosynthèse de l'éthylène et dans la voie de signalisation. Notre étude fournit des preuves que les PIF3, 4 et 5 sont de nouveaux médiateurs positifs de la sénescence et permet de mieux comprendre le mécanisme de signalisation lumineuse impliqué dans la régulation de la sénescence des feuilles.

Mots clés: GLK2 NYE1/SGR1 chloroplaste détérioration éthylène. facteur d'interaction avec le phytochrome (PIF) de la sénescence des feuilles.

© L'auteur 2014. Publié par Oxford University Press pour le compte du CSPB et de l'IPPE, SIBS, CAS.

Les figures

Les PIF3, 4 et 5 favorisent la sénescence des feuilles déclenchée par l'âge et induite par l'obscurité. (UNE) Phénotypes de…

Analyse du transcriptome de pif4 Mutante.…

Analyse du transcriptome de pif4 Mutante. (UNE) Représentations en boîte de 791 sénescences régulées à la hausse et…

PIF4 régule négativement l'activité des chloroplastes.…

PIF4 régule négativement l'activité des chloroplastes. (UNE) Expressions relatives de NYE1 , GLK1 ,…

PIF4 régule à la fois la biosynthèse de l'éthylène…

PIF4 régule à la fois la biosynthèse de l'éthylène et la signalisation. (UNE) Expressions relatives de ACS2 ,…


Top 4 des applications du génie génétique

Les points suivants mettent en évidence les quatre principales applications du génie génétique. Les applications sont : 1. Application en agriculture 2. Application en médecine 3. Production d'énergie 4. Application aux industries.

Génie génétique : application n° 1. Application en agriculture:

Une application importante de la technologie de l'ADN recombinant consiste à modifier le génotype des plantes cultivées pour les rendre plus productives, nutritives, riches en protéines, résistantes aux maladies et moins consommatrices d'engrais. La technologie de l'ADN recombinant et les techniques de culture tissulaire peuvent produire des céréales, des légumineuses et des cultures maraîchères à haut rendement.

Certaines plantes ont été génétiquement programmées pour produire des grains riches en protéines qui pourraient résister à la chaleur, à l'humidité et aux maladies.

Certaines plantes peuvent même développer leurs propres engrais, certaines ont été génétiquement transformées pour fabriquer leurs propres insecticides. Grâce au génie génétique, certaines variétés ont été produites qui pourraient fixer directement l'azote atmosphérique et donc il n'y a aucune dépendance aux engrais.

Les scientifiques ont mis au point des graines de pomme de terre, de tabac, de coton, de maïs, de fraise, de colza transgéniques résistantes aux insectes ravageurs et à certains désherbants.

Bactérie, Bacillus thurenginesis produit une protéine qui est toxique pour les insectes. En utilisant les techniques du génie génétique, le gène codant pour cette protéine toxique appelée gène Bt a été isolé d'une bactérie et modifié dans des plants de tomate et de tabac. De telles plantes transgéniques ont montré la nécessité de vers de corne de tabac et de vers de fruits de tomate. Ces génotypes sont en attente de publication aux États-Unis.

Il existe certains désherbants génétiquement évolués qui ne sont pas spécifiques aux mauvaises herbes uniquement, mais qui tuent également les cultures utiles. Le glyphosate est un désherbant couramment utilisé qui inhibe simplement une enzyme essentielle particulière dans les mauvaises herbes et autres plantes cultivées. Un gène cible du glyphosate est présent dans la bactérie salmonella typhimurium. Un mutant de S. typhimurium est résistant au glyphosate.

Le gène mutant a été cloné sur E. coli puis recloné sur Agrobacterium tumifaciens par l'intermédiaire de son plasmide Ti. L'infection de plantes avec le plasmide Ti contenant le gène de résistance au glyphosate a donné des cultures telles que le coton, le maïs tabac, qui sont toutes résistantes au glyphosate.

Cela permet de pulvériser les champs cultivés avec du glyphosate qui ne tuera que les mauvaises herbes et les cultures génétiquement modifiées avec des gènes résistants ne seront pas affectées.

Récemment, Calogene, une société de biotechnologie, a isolé un gène bactérien qui détoxifie les effets secondaires des herbicides. Des plants de tabac transgéniques résistants au virus de la mosaïque T MV et des tomates i résistantes au virus de la mosaïque dorée ont été développés en transférant les gènes de la protéine d'enveloppe du virus à des plantes sensibles. Ceux-ci doivent encore être publiés.

La technologie de transfert de gènes peut également jouer un rôle important dans la production d'une nouvelle variété améliorée d'arbres à bois.

Plusieurs espèces de micro-organismes ont été produites qui peuvent dégrader les produits chimiques toxiques et pourraient être utilisées pour tuer les agents pathogènes nuisibles et les insectes nuisibles.

Pour utiliser des techniques de génie génétique pour le transfert de gènes étrangers dans des cellules végétales hôtes, un certain nombre de gènes ont déjà été clonés et des bibliothèques complètes d'ADN et d'ADN mt de pois sont maintenant connues.

Certains des gènes clonés comprennent :

(i) Gènes pour la phaséoline du haricot vert,

(ii) Peu d'hémoglobine de jambe de phaséoline pour le soja,

(iii) Gènes pour la petite sous-unité RUBP carboxylase du pois, et i gènes pour la protéine de stockage dans certaines céréales.

Des efforts sont déployés pour améliorer plusieurs cultures agricoles à l'aide de diverses techniques de génie génétique, notamment :

(i) Transfert de gènes fixateurs d'azote (gènes nif) des légumineuses aux céréales.

(ii) Transfert de résistance contre les agents pathogènes et les ravageurs des plantes sauvages aux plantes cultivées.

(iii) Amélioration de la qualité et de la quantité des protéines des graines.

(iv) Transfert de gènes de protéines animales aux plantes cultivées.

(v) Élimination des gènes indésirables de sensibilité à différentes maladies des lignées mâles stériles cytoplasmiques dans des cultures comme le maïs, où la stérilité et la sensibilité mâles cytoplasmiques sont localisées dans le plasmide mitochondrial.

(vi) Amélioration de l'efficacité photosynthétique par le réassemblage des gènes nucléaires et chloroplastiques et par la conversion éventuelle de C3 plantes en C4 les plantes.

(vii) Développement de lignées cellulaires susceptibles de produire des aliments nutritifs dans des bioréacteurs.

Génie génétique : application n° 2. Application à la médecine:

Le génie génétique a gagné en importance au cours des dernières années et il le deviendra encore plus au cours du siècle actuel à mesure que les maladies génétiques deviennent plus répandues et que la superficie agricole est réduite. Le génie génétique joue un rôle important dans la production de médicaments.

Les micro-organismes et les substances à base de plantes sont maintenant manipulés pour produire une grande quantité de médicaments, de vaccins, d'enzymes et d'hormones utiles à faible coût. Le génie génétique est concerné par l'étude (modèle de transmission des maladies chez l'homme et collection de gènes humains qui pourraient fournir une carte complète de la transmission des individus sains.

La thérapie génique par laquelle des gènes sains peuvent être insérés directement dans une personne dont les gènes fonctionnent mal est peut-être l'aspect le plus révolutionnaire et le plus prometteur du génie génétique. L'utilisation de la thérapie génique a été approuvée dans plus de 400 essais cliniques pour des maladies telles que l'emphysème des fibres kystiques, la dystrophie musculaire, le déficit en adénosine désaminase.

La thérapie génique pourrait un jour être exploitée pour guérir des maladies humaines héréditaires telles que l'hémophilie et la mucoviscidose, qui sont causées par des gènes manquants ou défectueux. Dans un type de thérapie génique, de nouveaux gènes fonctionnels sont insérés par des virus génétiquement modifiés dans les cellules de personnes incapables de produire certaines hormones ou protéines pour les fonctions normales du corps.

L'introduction de nouveaux gènes dans un organisme grâce à la technologie de l'ADN recombinant modifie essentiellement la composition des protéines et enfin les caractéristiques corporelles.

La technologie de l'ADN recombinant est également utilisée dans la production de vaccins contre les maladies. Un vaccin contient une forme d'organisme infectieux qui ne provoque pas de maladie grave mais qui fait que le système immunitaire du corps forme des anticorps protecteurs contre l'organisme infectieux. Les vaccins sont préparés en isolant un antigène ou une protéine présent à la surface de particules virales.

Lorsqu'une personne est vaccinée contre une maladie virale, les antigènes produisent des anticorps qui agissent contre les protéines virales et les inactivent. Grâce à la technologie de l'ADN recombinant, les scientifiques ont pu transférer les gènes de certaines protéines de la gaine virale au virus de la vaccine qui a été utilisé contre la variole.

Les vaccins produits par clonage de gènes sont exempts de contamination et sûrs car ils ne contiennent que des protéines d'enveloppe contre lesquelles des anticorps sont fabriqués. Quelques vaccins sont produits par clonage de gènes, par exemple des vaccins contre l'hépatite virale, la grippe, le virus de l'herpès simplex, la fièvre aphteuse induite par le virus chez les animaux.

Jusqu'à récemment, l'hormone insuline n'était extraite qu'en quantités limitées du pancréas des vaches et des porcs. Le processus était non seulement coûteux, mais l'hormone provoquait parfois des réactions allergiques chez certains patients diabétiques.

La production commerciale d'insuline a commencé en 1982 grâce à la technologie de l'ADN biogénétique ou recombinant et l'utilisation médicale de l'insuline hormonale a été approuvée par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis en 1982.

Le gène de l'insuline humaine a été cloné en grande quantité dans la bactérie E. coli qui pourrait être utilisée pour la synthèse de l'insuline. L'insuline génétiquement modifiée est disponible dans le commerce sous forme d'humiline.

Les lymphokines sont des protéines qui régulent le système immunitaire dans le corps humain, l'interféron en est un exemple. L'interféron est utilisé pour lutter contre les maladies virales telles que l'hépatite, l'herpès, le rhume ainsi que le cancer. De tels médicaments peuvent être fabriqués dans des cellules bactériennes en grandes quantités.

Les lymphokines peuvent également être utiles pour les patients atteints du SIDA. L'interleukine-II génétiquement modifiée, une substance qui stimule la multiplication des lymphocytes, est également disponible et est actuellement testée sur des patients atteints du SIDA.

Une hormone polypeptidique de quatorze acides aminés synthétisée par l'hypothalamus n'a été obtenue qu'en petite quantité à partir de cadavres humains. La somatostatine utilisée comme médicament pour certaines anomalies liées à la croissance semble être spécifique à l'espèce et le polypeptide obtenu à partir d'autres mammifères n'a aucun effet sur l'homme, d'où son extraction de l'hypothalamus de cadavres.

La technique du génie génétique a aidé à la synthèse chimique du gène qui est joint à l'ADN plasmidique pBR 322 et cloné dans une bactérie. La bactérie transformée est convertie en usine de synthèse de somatostatine. Le déficit en ADA (adénosine désaminase) est une maladie semblable au déficit immunitaire combiné qui a tué le bubble boy David en 1984.

Les enfants atteints d'un déficit en ADA meurent avant l'âge de deux ans. Les cellules de la moelle osseuse de l'enfant après avoir été retirées du corps ont été envahies par un virus inoffensif dans lequel l'ADA a été inséré.

L'érythropoïétine, une hormone génétiquement modifiée, est utilisée pour stimuler la production de globules rouges chez les personnes souffrant d'anémie sévère.

Production de facteurs de coagulation sanguine:

Normalement, la crise cardiaque est causée lorsque les artères coronaires sont bloquées par le cholestérol ou un caillot sanguin. le plasminogène est une substance présente dans les caillots sanguins. L'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) génétiquement modifié dissout les caillots sanguins chez les personnes qui ont subi une crise cardiaque. La protéine activatrice du plasminogène est produite par une société de technologie génétique qui est si puissante et spécifique qu'elle peut même arrêter une crise cardiaque en cours.

Le cancer est une maladie redoutée. Les anticorps clonés à partir d'une source unique et ciblés pour un antigène spécifique (anticorps monoclonaux) se sont révélés très utiles dans le traitement du cancer. Les anticorps monoclonaux ont été ciblés avec des éléments radioactifs ou des cytotoxines comme la ricine de graines de ricin pour les rendre plus mortels. De tels anticorps recherchent les cellules cancéreuses et les tuent spécifiquement avec leur radioactivité ou leur toxine.

Génie génétique : application n° 3. Production d'énergie:

La technologie de l'ADN recombinant a une portée considérable dans la production d'énergie. Grâce à cette technologie Ii, il est désormais possible de concevoir des cultures énergétiques ou des biocarburants qui se développent rapidement pour produire une énorme biomasse utilisée comme carburant ou pouvant être transformée en huiles, alcools, diesel ou autres produits énergétiques.

Les déchets de ceux-ci peuvent être transformés en méthane. Les ingénieurs en génétique essaient de transférer le gène de la cellulase à des organismes appropriés qui peuvent être utilisés pour convertir des déchets comme la sciure de bois et les tiges de maïs d'abord en sucre, puis en alcool.

Génie génétique : application n° 4. Application aux industries:

Des bactéries génétiquement conçues sont utilisées pour générer des produits chimiques industriels. Une variété de produits chimiques organiques peut être synthétisée à grande échelle à l'aide de micro-organismes génétiquement modifiés. Le glucose peut être synthétisé à partir du saccharose à l'aide d'enzymes obtenues à partir d'organismes génétiquement modifiés.

De nos jours, avec l'aide du génie génétique, des souches de bactéries et de cyanobactéries ont été développées qui peuvent synthétiser de l'ammoniac à grande échelle qui peut être utilisé dans la fabrication d'engrais à des coûts beaucoup moins chers. Des microbes sont en cours de développement qui aideront à la conversion de la cellulose en sucre et du sucre en éthanol.

La technologie de l'ADN recombinant peut également être utilisée pour surveiller la dégradation des déchets, des produits pétroliers, du naphtalène et d'autres déchets industriels.

Par exemple, la bactérie pseudomonas fluorescens génétiquement modifiée par transfert d'une enzyme produisant de la lumière appelée luciférase trouvée dans la bactérie vibrio fischeri, produit une lumière proportionnelle à la quantité de son activité de dégradation du naphtalène, ce qui permet de surveiller l'efficacité du processus.

Le maïs et le soja sont fortement endommagés par le ver-gris noir. Pseudomonas fluorescens se trouve en association avec le maïs et le soja. Bacillus thuringiensis contient un gène pathogène pour le ravageur. Le ravageur est, au fil des ans, non seulement devenu dangereux pour les cultures, mais il a développé une résistance à un certain nombre de pesticides.

Lorsque le gène de B. thuringiensis (Bt) a été cloné dans la fluorescence de pseudomonas et inoculé dans le sol, il a été découvert que des pseudomonas fluorescens génétiquement modifiés pouvaient causer la mort des vers gris.


Une boîte à outils CRISPR-dCas pour le génie génétique et la biologie synthétique

Le contrôle programmable de l'expression des gènes est essentiel pour comprendre la fonction des gènes, concevoir des comportements cellulaires et développer des thérapies. Au-delà des applications d'édition de gènes permises par les nucléases CRISPR-Cas9 et CRISPR-Cas12a, l'invention des molécules Cas mortes pour la nucléase (dCas9 et dCas12a) offre une plate-forme pour le contrôle précis de la fonction du génome sans édition de gènes. Divers outils dCas ont été développés, qui constituent une boîte à outils complète permettant d'interroger la fonction des gènes et de moduler les comportements cellulaires. Cette revue résume les applications actuelles des outils dCas pour la régulation de la transcription, le génie épigénétique, l'imagerie du génome, les criblages génétiques et l'immunoprécipitation de la chromatine. Nous mettons également en évidence les avantages et les défis existants des outils dCas actuels en génie génétique et en biologie synthétique, et offrons des perspectives sur les orientations et applications futures.

Mots clés: CRISPRi/a dCas9 ingénierie de l'épigénome régulation génétique criblage génétique.


Nouvelles applications des outils de biologie synthétique pour l'ingénierie métabolique des cyanobactéries

Les cyanobactéries sont des micro-organismes prometteurs pour les biotechnologies durables, mais pour libérer leur potentiel, il faut une réingénierie radicale et l'application de techniques de biologie synthétique de pointe. Ces dernières années, les dispositifs et stratégies disponibles pour modifier les cyanobactéries se sont multipliés, notamment les avancées dans la conception de promoteurs génétiques, de sites de liaison aux ribosomes, de riboswitches, de protéines rapporteurs, de systèmes de vecteurs modulaires et de systèmes de sélection sans marqueur. Grâce à ces nouvelles boîtes à outils, les cyanobactéries ont été conçues avec succès pour exprimer des voies hétérologues pour la production d'une grande variété de composés précieux. Les souches cyanobactériennes susceptibles d'être utilisées dans des applications réelles nécessiteront le raffinement des circuits génétiques utilisés pour exprimer les voies hétérologues et le développement de modèles précis qui prédisent comment ces voies peuvent être mieux intégrées dans le réseau métabolique cellulaire plus large. Ici, nous passons en revue les progrès qui ont été réalisés pour traduire les outils de biologie synthétique en organismes modèles cyanobactériens et résumons les expériences et in silico stratégies qui ont été employées pour augmenter leur potentiel de bioproduction. Malgré les progrès de la biologie synthétique et de l'ingénierie métabolique au cours des dernières années, il est clair que des améliorations supplémentaires sont nécessaires pour que les cyanobactéries soient compétitives avec les micro-organismes hétérotrophes pour la bioproduction de composés à valeur ajoutée.

Mots clés: cyanobactéries génome modèles à l'échelle ingénierie métabolique photosynthèse biologie synthétique.

Les figures

Mécanismes de régulation des promoteurs inductibles…

Mécanismes de régulation des promoteurs inductibles récemment introduits dans les cyanobactéries. (UNE) Expression génique inductible par l'arabinose…

CRISPR- cas technologies utilisées pour…

CRISPR- cas technologies utilisées pour l'édition du génome du génome cyanobactérien. (UNE) CRISPR- cas…

Représentation schématique des stratégies d'ingénierie…

Représentation schématique des stratégies d'ingénierie qui augmentent l'activité photosynthétique des cyanobactéries. Utilisation de l'ATP…

Développement de GSM cyanobactériens. De bonne heure…

Développement de GSM cyanobactériens. Les premiers GSM cyanobactériens ont été développés sur la base de données biochimiques…


L'évolution du génie génétique

Structure cristalline de dessin animé de la technologie d'édition de gènes TALEN. (Crédit : Gersbach Lab). Crédit : Université Duke

Charles Gersbach, professeur agrégé de génie biomédical de la famille Rooney à l'Université Duke, dirige un laboratoire axé sur le développement et l'application d'outils d'ingénierie génomique, notamment la technologie basée sur CRISPR. CRISPR-Cas est un système de défense bactérienne qui permet aux bactéries d'utiliser des molécules d'ARN et des protéines associées à CRISPR (Cas) pour cibler et détruire l'ADN des virus envahissants. La découverte de cette technique a déclenché une révolution de l'édition du génome alors que les chercheurs ont exploré comment l'outil pourrait être utilisé pour cibler et éditer spécifiquement l'ADN dans les cellules humaines.Dans les années qui ont suivi sa découverte, Gersbach et son laboratoire ont utilisé cette technologie pour étudier des maladies génétiques comme la dystrophie musculaire de Duchenne, contrôler avec précision l'expression des gènes et même développer des outils qui peuvent rendre CRISPR plus précis.

Comment le génie génétique est-il devenu votre domaine de recherche ?

Je savais que je voulais suivre un cheminement de carrière universitaire où je pourrais aider à faire progresser la médecine régénérative et les thérapies géniques et cellulaires. Je voulais travailler sur quelque chose qui pourrait affecter de nombreux domaines différents de la bio-ingénierie, et j'ai réalisé que l'expression des gènes était un élément central d'une variété de recherches.

Il y avait différentes ailes dans le bâtiment où j'ai travaillé pendant mes études supérieures, chacune se concentrant sur la médecine régénérative liée à un système organique particulier. Dans différentes parties du bâtiment, vous pourriez regarder des affiches pour la recherche cardiovasculaire ou la recherche musculo-squelettique, ou des trucs concernant le diabète ou le travail neurologique. Tous ces sujets impliquaient essentiellement d'essayer d'amener les cellules à faire quelque chose d'intéressant. À titre d'exemple très simplifié, si nous voulons que les cellules se comportent comme des cellules cartilagineuses, nous les frappons essentiellement en utilisant une force mécanique et espérons qu'elles activent les gènes du cartilage, et si nous voulons que les cellules se comportent comme des neurones, nous les électrocutons et espérons que met en marche les gènes neuronaux. Dans tous ces cas, vous appliquez des stimuli externes et espérez que les bons gènes soient exprimés en interne. Si l'objectif dans tous ces domaines est d'activer et de désactiver les bons gènes, j'étais curieux de savoir s'il existait une technologie meilleure ou plus directe pour programmer l'expression des gènes.

CRISPR est une technologie relativement nouvelle. Comment cela a-t-il fini par être au centre du travail de votre laboratoire chez Duke ?

Le premier article décrivant l'utilisation de CRISPR dans des cellules humaines a été publié en 2013, nous travaillions donc avec des technologies qui l'ont précédé. Le premier était des protéines à doigt de zinc modifiées, qui pourraient être utilisées pour modifier une région spécifique du génome. À l'époque, les gens utilisaient des doigts de zinc pour fabriquer des facteurs de transcription capables d'activer et de désactiver les gènes et de réguler l'expression des gènes, mais la technologie était vraiment difficile à utiliser, elle n'avait donc pas vraiment décollé, et il n'y avait que quelques laboratoires dans le monde qui travaillaient avec. Je pensais que si je m'entraînais avec l'un d'eux, le monde serait mon huître, alors je me suis entraîné à San Diego pendant trois ans et j'ai utilisé cette expertise comme argument pour démarrer un laboratoire à Duke en 2009.

Deux ans après avoir commencé chez Duke, une nouvelle technologie est sortie, appelée TALENs, qui était un autre outil qui pouvait fabriquer des protéines pour cibler des séquences spécifiques dans le génome. C'était beaucoup plus facile à utiliser que les doigts de zinc, mais avant qu'il n'ait eu la chance de décoller, CRISPR est arrivé.

CRISPR est super facile à utiliser, donc mon vieux rêve que j'allais être l'une des seules personnes au monde à savoir comment faire ce genre de choses s'est concrétisé. À l'époque, je me disais : « Super, je suis totalement obsolète depuis seulement quatre ans dans ma carrière universitaire. » Sauf que nous avions accumulé beaucoup d'expertise et de modèles de systèmes pour utiliser ces outils, et j'ai eu la chance d'avoir des étudiants et des boursiers vraiment brillants et travaillants dans le laboratoire, nous avons donc pu récupérer rapidement les réactifs CRISPR et utiliser eux pour notre propre travail. Le 3 janvier 2013, les deux premiers articles utilisant CRISPR dans des cellules humaines ont été publiés en ligne dans Science, et trois semaines plus tard, nous avions déjà obtenu les plasmides et effectué des expériences basées sur CRISPR dans notre propre laboratoire qui fonctionnaient. Notre premier article CRISPR est arrivé six mois plus tard.

Pourquoi avez-vous choisi de vous concentrer sur l'utilisation de CRISPR pour étudier la dystrophie musculaire de Duchenne ?

Le premier projet que mon laboratoire a lancé en 2009 était l'édition de gènes pour la dystrophie musculaire de Duchenne à l'aide de la technologie du doigt de zinc. La DMD est la maladie génétique héréditaire la plus courante, mais en 2009, il n'y avait vraiment aucune thérapie ou option disponible pour aider les personnes atteintes de la maladie, qui provoque une dégénérescence progressive de leurs muscles. J'étais aussi un tout nouveau professeur assistant, donc je voulais faire quelque chose qui avait deux longueurs d'avance sur ce que tout le monde regardait, mais cela devait être un objectif suffisamment tangible pour que nous puissions faire des progrès clairs, et l'édition de gènes pour les muscles la dystrophie correspondait à ces critères.

Auparavant, les gens avaient cherché des moyens de modifier les cellules souches et de les remettre dans le muscle, mais le remplacement de toutes les cellules musculaires du corps n'est pas vraiment faisable. Ils avaient également modifié des virus pour transmettre des gènes au muscle, mais le gène qui est muté dans ce cas est également l'un des plus gros gènes du génome humain, il ne rentre donc pas dans les vecteurs de thérapie génique typiques. Au lieu de cela, l'idée de réparer la copie du gène qui est déjà dans le génome, plutôt que d'essayer de le délivrer, semblait être une opportunité attrayante. Nous avons donc travaillé sur cette approche et utilisé des doigts de zinc et des TALEN jusqu'à ce que l'édition de gènes basée sur CRISPR soit découverte et que nous ayons vu à quel point c'était facile à utiliser.

Notre travail avec la dystrophie musculaire de Duchenne se poursuit. Plus récemment, nous avons publié un article dans Médecine naturelle qui a montré qu'un seul traitement systémique pouvait corriger la mutation DMD pendant plus d'un an chez la souris.

Quelles sont les choses que vous ne pouvez pas faire aujourd'hui avec CRISPR et que vous voulez pouvoir faire ?

Je pense qu'il serait utile de faire de l'édition de gènes sans couper le génome. La solution à ce problème peut impliquer une nouvelle version de CRISPR, ou elle peut impliquer quelque chose de complètement différent. Mais nous en apprenons chaque jour davantage sur ces systèmes : il y a dix ans, il fallait deux ans pour faire un projet impliquant l'édition de gènes, et maintenant vous pouvez le faire en une semaine ou deux. Il existe de nombreuses saveurs de CRISPR, où Cas9 est la protéine la plus couramment utilisée, mais les chercheurs ont découvert des dizaines d'autres types de Cas9 et même d'autres protéines et complexes CRISPR, notamment Cas12, Cas13, Cas14, Cas3 et même Cascade, et chacun des ces systèmes se prêtent à un usage unique.

En ce qui concerne CRISPR, qu'est-ce qui vous passionne le plus ?

Les tout premiers essais cliniques de CRISPR chez l'homme ont débuté cette année. Nous assistons aux premiers essais pour le cancer, la drépanocytose et les formes rares et héréditaires de cécité. Et nous aurons les résultats de ces essais dans un an ou deux, donc c'est super excitant et certainement près du haut de la liste.

Je pense également que nous en sommes maintenant à un stade où CRISPR a été pleinement intégré au processus de développement de médicaments. Pas seulement CRISPR en tant que thérapie, mais CRISPR pour créer des systèmes modèles et des lignées cellulaires pour aider à concevoir de meilleurs médicaments. Je pense que CRISPR aura un impact considérable sur la médecine d'une manière qui va au-delà de l'utilisation directe de CRISPR comme thérapie. En fait, nous avons créé une entreprise, Element Genomics, pour le faire en facilitant le développement de médicaments avec ces outils, sans nécessairement utiliser CRISPR comme thérapie. C'est subtil, donc les gens n'apprécient pas nécessairement que des choses comme CRISPR fonctionnent en arrière-plan pour faire avancer la recherche biologique pour aider à trouver de nouveaux médicaments.


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