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Fonction du RE dans l'examen des protéines mutées

Fonction du RE dans l'examen des protéines mutées


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Au moins dans le cas de la mucoviscidose, il arrive qu'une protéine mutante (qui pourrait réellement fonctionner !) soit retenue dans le RE parce que le RE la détecte comme mal repliée. Cela se produit-il dans chaque type de protéine mutante ?

Si oui, dois-je conclure que de tels troubles génétiques sont dus à l'absence totale d'une protéine plutôt qu'à une protéine mal repliée ? Sinon, pourquoi le RE ou tout autre élément de la cellule permettrait-il à certaines protéines mutées de faire n'importe quel travail (comme dans le cas de l'anémie falciforme, où une substitution d'acide aminé se produit) ?

Comment les scientifiques concluent-ils qu'une protéine mal repliée aurait pu faire un assez bon travail (comme dans le cas de la mucoviscidose) ?


Les protéines membranaires doivent aller au RE d'où elles sont transportées vers l'appareil de Golgi. Habituellement, ces protéines sont transloquées dans le RE alors que la traduction est toujours en cours. Il existe des chaperons (tels que la calbindine) dans le RE qui aident à la translocation et catalysent également les étapes initiales du repliement. Le RE est également impliqué dans la réponse protéique dépliée. À moins que la protéine ne soit correctement repliée, elle n'est pas transportée vers l'appareil de Golgi. Cependant, ce processus est réglementé à de nombreuses étapes et je n'ajouterai pas d'explication détaillée du mécanisme dans cette réponse.

Pour conclure ER est impliqué dans ce cas car la protéine considérée est une protéine membranaire.


Réticulum endoplasmique

Réponses au stress dans le réticulum endoplasmique

Les conditions qui inondent le RE avec un excès de protéines ou entraînent une accumulation de protéines mal repliées déclenchent la réponse protéique dépliée (EPU 20.13 ). Essentiellement, toute condition dans laquelle l'importation de protéines dépasse la capacité de repliement des protéines du RE déclenche l'UPR : mauvais repliement des protéines mutantes, inhibition de la glycosylation du RE (par exemple, par le médicament tunicamycine), inhibition de la formation de disulfure (par des agents réducteurs), ou même surproduction de protéines normales. Pour compenser ces événements, cette voie de signalisation induite par le stress régule à la hausse les gènes nécessaires à la synthèse de l'ensemble du RE, y compris sa machinerie de repliement. Chez la levure, l'UPR active plus de 300 gènes impliqués dans tous les aspects de la fonction du RE, y compris la synthèse des lipides, la translocation des protéines, le repliement des protéines, la glycosylation et la dégradation, ainsi que l'exportation et la récupération depuis l'appareil de Golgi. Les programmes de développement chez les métazoaires peuvent utiliser les mêmes contrôles génétiques pour déterminer l'abondance du RE dans les cellules différenciées, produisant, par exemple, un RE étendu dans les cellules sécrétoires telles que les cellules acineuses du plasma, du foie et du pancréas.

L'UPR dépend de trois protéines transmembranaires du RE qui détectent et répondent au stress dans le RE : ATF6 (activant le facteur de transcription 6) IRE1 (inositol nécessitant 1) et AVANTAGE/PEK (kinase du réticulum endoplasmique de type PKR/kinase pancréatique eIF2a) (figure 20.13). Chacune de ces protéines a un mécanisme différent, mais toutes initient des voies de signalisation qui régulent la production de protéines nécessaires à la fonction du RE. Cela permet aux cellules d'ajuster la capacité du RE à favoriser le repliement des protéines en fonction de la demande. Les cellules métazoaires ont les trois voies, mais la levure n'a que IRE1.

Dans des conditions normales, la concentration de BiP dans la lumière du RE dépasse la concentration de protéines dépliées, de sorte que le BiP libre est disponible pour se lier aux domaines luminaux de trois protéines transmembranaires du RE, ATF6, IRE1 et PERK (kinase du réticulum endoplasmique de type PKR). Ces interactions avec BiP retiennent ATF6 dans le RE et empêchent la dimérisation de IRE1 et PERK, les maintenant inactifs.

Si les protéines dépliées dans la lumière du RE se lient à tout le BiP, IRE1 est libre de se dimériser. Cela active l'activité endoribonucléase du domaine cytoplasmique de IRE1, lui permettant d'éliminer un petit intron de l'ARN messager (ARNm) pour XBP1, un Facteur de transcription contenant le domaine bZIP (basic leucine zipper) (voir fig. 10.14). La suppression de cet intron modifie le cadre de lecture traductionnel de XBP1 permettant à l'ARNm de coder un puissant activateur transcriptionnel des gènes des protéines ER.

De même, sans BiP libre dans la lumière du RE, PERK se dimérise et se phosphoryle facteur d'initiation de la traduction eucaryote 2 (eIF2). Cela réduit la fréquence de reconnaissance des codons AUG et ralentit le taux d'initiation de la traduction sur de nombreux ARNm. Cependant, les ARNm de nombreuses protéines impliquées dans la survie cellulaire et les fonctions du RE sont préférentiellement traduits dans ces conditions.

Les protéines dépliées accumulées libèrent BiP d'ATF6, entraînant le transport de la protéine transmembranaire du RE vers l'appareil de Golgi, où elle est clivée par les protéases S1P et S2P pour produire un fragment soluble qui est libéré dans le cytoplasme. Le fragment se déplace vers le noyau, où il active la transcription de gènes cibles, dont XBP1.

Des aspects de la voie UPR impliquant IRE1 et PERK sont également importants pour favoriser la différenciation dans les cellules eucaryotes supérieures. Par exemple, IRE1 est activé pendant la différenciation des lymphocytes B en un plasmocyte (voir Fig. 28.9), pendant laquelle le RE se dilate quintuple pour accueillir la synthèse et la sécrétion d'immunoglobulines. L'activation de la réponse immunitaire innée (voir Fig. 28.6), par exemple par un traitement aux lipopolysaccharides, active également IRE1. L'activité PERK est également requise pour la différenciation et/ou la survie des lymphocytes B.


Réticulum endoplasmique

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Réticulum endoplasmique (RE), en biologie, un système membranaire continu qui forme une série de sacs aplatis dans le cytoplasme des cellules eucaryotes et remplit de multiples fonctions, étant particulièrement important dans la synthèse, le repliement, la modification et le transport des protéines . Toutes les cellules eucaryotes contiennent un réticulum endoplasmique (RE). Dans les cellules animales, le RE constitue généralement plus de la moitié du contenu membranaire de la cellule. Des différences dans certaines caractéristiques physiques et fonctionnelles distinguent les deux types de RE, appelés RE rugueux et RE lisse.

Qu'est-ce que le réticulum endoplasmique ?

  • Le réticulum endoplasmique (RE) est un système membranaire continu qui forme une série de sacs aplatis dans le cytoplasme des cellules eucaryotes.
  • Toutes les cellules eucaryotes contiennent un RE.
  • Dans les cellules animales, le RE constitue généralement plus de la moitié du contenu membranaire de la cellule.
  • Le RE peut être classé sous deux formes fonctionnellement distinctes : le réticulum endoplasmique lisse (SER) et le réticulum endoplasmique rugueux (RER).

Quelle est la différence entre le réticulum endoplasmique lisse et rugueux?

Le RE peut être classé sous deux formes fonctionnellement distinctes : le réticulum endoplasmique lisse (SER) et le réticulum endoplasmique rugueux (RER). La distinction morphologique entre les deux est la présence de particules synthétisant les protéines, appelées ribosomes, fixées à la surface externe du RER. Les fonctions du SER, un maillage de fines vésicules membranaires tubulaires, varient considérablement d'une cellule à l'autre, un rôle important étant la synthèse des phospholipides et du cholestérol, qui sont des composants majeurs du plasma et des membranes internes. Le RER est généralement une série de sacs aplatis connectés. Il joue un rôle central dans la synthèse et l'exportation des protéines et des glycoprotéines et est mieux étudié dans les cellules sécrétoires spécialisées dans ces fonctions. Les nombreuses cellules sécrétoires du corps humain comprennent des cellules hépatiques sécrétant des protéines sériques (par exemple, l'albumine), des cellules endocrines sécrétant des hormones peptidiques (par exemple, de l'insuline), des cellules acineuses pancréatiques sécrétant des enzymes digestives et des cellules cartilagineuses sécrétant du collagène.

Quelle est la fonction du réticulum endoplasmique ?

Le réticulum endoplasmique (RE) remplit des fonctions importantes en particulier dans la synthèse, le repliement, la modification et le transport des protéines. Des différences dans certaines caractéristiques physiques et fonctionnelles distinguent les deux types de RE, appelés RE rugueux (RER) et RE lisse (SER). Les ribosomes sur RER, qui donnent au RER son aspect brut, se spécialisent dans la synthèse de protéines possédant une séquence signal qui les dirige spécifiquement vers le RE pour traitement. Les protéines synthétisées par le RER ont des destinations finales spécifiques, telles que la membrane cellulaire, l'extérieur de la cellule ou le RE lui-même. Le SER est impliqué dans la synthèse des lipides, dont le cholestérol et les phospholipides, qui sont utilisés dans la production de nouvelles membranes cellulaires. Dans les cellules du foie, le SER contribue à la détoxification des médicaments et des produits chimiques nocifs. Le réticulum sarcoplasmique est un type spécialisé de SER qui régule la concentration en ions calcium dans le cytoplasme des cellules musculaires striées.

Quand le réticulum endoplasmique a-t-il été découvert ?

Le RE a été noté pour la première fois à la fin du XIXe siècle, lorsque des études de cellules colorées ont indiqué la présence d'un certain type de structure cytoplasmique étendue, alors connue sous le nom de gastroplasme. Le microscope électronique a rendu possible l'étude de la morphologie du RE dans les années 1940, date à laquelle il a reçu son nom actuel.

Rough ER est nommé pour son aspect rugueux, qui est dû aux ribosomes attachés à sa surface externe (cytoplasmique). Le RE rugueux est immédiatement adjacent au noyau cellulaire et sa membrane est continue avec la membrane externe de l'enveloppe nucléaire. Les ribosomes du RE brut se spécialisent dans la synthèse de protéines possédant une séquence signal qui les dirige spécifiquement vers le RE pour traitement. (Un certain nombre d'autres protéines dans une cellule, y compris celles destinées au noyau et aux mitochondries, sont ciblées pour la synthèse sur les ribosomes libres, ou celles qui ne sont pas attachées à la membrane du RE voir l'article ribosome.) Les protéines synthétisées par le RE brut ont des destinations finales spécifiques. Certaines protéines, par exemple, restent dans le RE, tandis que d'autres sont envoyées vers l'appareil de Golgi, qui se trouve à côté du RE. Les protéines sécrétées par l'appareil de Golgi sont dirigées vers les lysosomes ou vers la membrane cellulaire, d'autres encore sont destinées à la sécrétion vers l'extérieur de la cellule. Les protéines ciblées pour le transport vers l'appareil de Golgi sont transférées des ribosomes sur le RE rugueux dans la lumière du RE rugueux, qui sert de site de repliement, de modification et d'assemblage des protéines.

La proximité du RE rugueux avec le noyau cellulaire donne au RE un contrôle unique sur le traitement des protéines. Le RE rugueux est capable d'envoyer rapidement des signaux au noyau lorsque des problèmes de synthèse et de repliement des protéines surviennent et influence ainsi le taux global de traduction des protéines. Lorsque des protéines mal repliées ou dépliées s'accumulent dans la lumière du RE, un mécanisme de signalisation connu sous le nom de réponse protéique dépliée (UPR) est activé. La réponse est adaptative, de sorte que l'activation de l'UPR déclenche des réductions de la synthèse des protéines et des améliorations de la capacité de repliement des protéines du RE et de la dégradation des protéines associées au RE. Si la réponse adaptative échoue, les cellules sont dirigées vers l'apoptose (mort cellulaire programmée).


L'analyse de deux protéines vacuolaires mutées révèle une voie de dégradation dans le réticulum endoplasmique ou un compartiment apparenté de la levure

Le devenir d'une forme mutante de chacune des deux enzymes vacuolaires de levure protéinase yscA (PrA) et carboxypeptidase yscY (CPY) a été étudié. Les deux protéines mutantes sont rapidement dégradées après être entrées dans la voie de sécrétion. Le mutant PrA est supprimé dans 37 acides aminés couvrant la région du site de traitement du pro-peptide PrA. L'enzyme mutante ne montre aucune activité vers la maturation d'elle-même ou d'autres hydrolases vacuolaires, fonction de la PrA de type sauvage. Le mutant CPY porte un résidu Arg au lieu d'un résidu Gly dans une région hautement conservée, à deux positions distantes du site actif Ser. Contrairement au CPY de type sauvage, la forme mutante a été rapidement dégradée par la trypsine in vitro, indiquant une structure altérée. En utilisant des antisérums spécifiques pour les liaisons mannose de la chaîne externe -1→6 et -1→3, aucune modification glucidique spécifique de Golgi n'a pu être détectée sur l'une ou l'autre des protéines mutantes. Des études de fractionnement subcellulaire ont localisé les deux enzymes mutantes dans le réticulum endoplasmique. La cinétique de dégradation des deux protéines montre les mêmes caractéristiques, indiquant des voies de dégradation similaires. Le processus de dégradation s'est avéré indépendant d'une fonction sec18 produit du gène et a lieu avant que des modifications glucidiques spécifiques à Golgi ne se produisent. Le protéasome, l'activité protéolytique majeure du cytoplasme, n'est pas impliqué dans cet événement de dégradation. Toutes les caractéristiques de dégradation des deux protéines mutantes sont cohérentes avec un processus de dégradation au sein du réticulum endoplasmique (« dégradation du RE »).


Interactions entre RAD51 et les protéines BRCA

Malgré la dissemblance apparente dans la séquence et la structure des protéines, il existe des preuves considérables que BRCA1 et BRCA2 ont des fonctions biologiques communes. BRCA1 et BRCA2 présentent des modèles d'expression et de localisation subcellulaire similaires. Ils sont tous deux exprimés dans de nombreux tissus d'une manière dépendante du cycle cellulaire (Bertwistle et al., 1997 Blackshear et al., 1998 Connor et al., 1997b Rajan et al., 1996 Sharan et Bradley, 1997) leurs niveaux sont les plus élevés pendant la phase S, ce qui suggère des fonctions pendant la réplication de l'ADN. Les deux sont localisés dans le noyau des cellules somatiques, où ils coexistent dans des foyers subnucléaires caractéristiques qui se redistribuent à la suite de dommages à l'ADN. Dans les cellules méiotiques, les deux protéines se co-localisent dans les complexes synaptonémiques des filaments axiaux en développement (Chen et al., 1998a).

Ce modèle d'expression et de localisation est partagé avec RAD51, un homologue mammifère de la protéine bactérienne RecA, qui est essentielle dans Escherichia coli pour la réparation des cassures double brin (DSB) de l'ADN par recombinaison génétique (Kowalczykowski, 2000). En effet, il a été rapporté que BRCA1 et BRCA2 se lient à RAD51. L'interaction BRCA2-RAD51 est directe, en ce sens qu'elle peut être démontrée in vitro avec des fragments de protéines recombinantes (Chen et al., 1998b Wong et al., 1997) et dans le système à deux hybrides de levure, et semble être relativement élevée. stœchiométrie. Il a été montré qu'un motif C-terminal couvrant les résidus 3196-3232 de BRCA2 murin médie la liaison de la protéine aux 98 premiers résidus de RAD51 dans des essais à deux hybrides sur levure (Sharan et al., 1997). Cependant, une région analogue du BRCA2 humain qui est identique à 95 % à la séquence murine, ne se lie pas à RAD51 (Wong et al., 1997 Aihara et al., 1999).

L'interaction de RAD51 avec BRCA2 humain est médiée principalement, sinon exclusivement, par les huit répétitions BRC (Wong et al., 1997). Chaque répétition, à l'exception de BRC5 et BRC6, peut se lier individuellement à RAD51 dans des tests à deux hybrides, ainsi qu'in vitro lorsqu'elle est exprimée en tant que protéine de fusion GST. Leurs capacités relatives de liaison à RAD51 varient considérablement (Chen et al., 1999), BRC4 étant environ quatre fois plus actif que BRC1 dans les essais à deux hybrides. La mutagenèse par PCR définit un consensus de liaison d'environ 30 résidus présents à la fois dans BRC1 et BRC4. Fait intéressant, malgré la conservation de ce motif central, différents résidus semblent être importants dans BRC1 et BRC4 pour la liaison de RAD51. Ceci, et la grande différence dans l'affinité pour RAD51, indique que le mode d'interaction de BRC1 ou BRC4 avec RAD51 pourrait être tout à fait distinct.

Une région englobant les résidus 758-1064 dans BRCA1 a été signalée pour la première fois comme étant impliquée dans son interaction avec RAD51 (Scully et al., 1997). Cependant, il reste difficile de savoir si les deux protéines peuvent se lier directement. La co-immunoprécipitation à partir d'extraits cellulaires révèle une interaction de faible stoechiométrie, qui n'a pas encore été démontrée dans les tests de levure à deux hybrides ou in vitro avec des protéines recombinantes.

BRCA1 et BRCA2 co-localisent dans les cellules mitotiques et méiotiques (Chen et al., 1998a) et s'associent physiquement à travers une région dans BRCA1 (résidus 1314-1863) distincte de celle rapportée se lier à RAD51. Encore une fois, l'interaction peut ne pas être directe, et elle semble impliquer une petite fraction (peut-être 2 à 5 %) du pool cellulaire total de chaque protéine. De plus, les efforts récents pour caractériser le complexe protéique associé à BRCA1 par purification biochimique et spectroscopie de masse ne rapportent pas la présence de quantités appréciables de RAD51 ou de BRCA2 (Wang et al., 2000).

Ainsi, parmi les interactions physiques rapportées entre BRCA1, BRCA2 et RAD51, l'interaction BRCA2-RAD51 semble être la mieux établie. Aussi alléchantes que puissent être les preuves existantes, il reste à démontrer fermement que BRCA1 fonctionne avec BRCA2 et RAD51 dans un complexe multimoléculaire, et la signification fonctionnelle de leurs interactions rapportées doit encore être définie de manière rigoureuse.


Dégradation associée au RE : contrôle de la qualité des protéines et au-delà

A. Ruggiano et O. Foresti ont contribué à parts égales à cet article.

Annamaria Ruggiano, Ombretta Foresti, Pedro Carvalho Dégradation associée à l'ER : contrôle de la qualité des protéines et au-delà. J Cell Biol 17 mars 2014 204 (6) : 869-879. doi : https://doi.org/10.1083/jcb.201312042

Même avec l'aide de nombreux facteurs cellulaires, une fraction importante des protéines nouvellement synthétisées se retrouve mal repliée. Les cellules ont développé des systèmes de contrôle de la qualité des protéines pour s'assurer que ces espèces potentiellement toxiques sont détectées et éliminées. La mieux caractérisée de ces voies, la dégradation des protéines associées au RE (ERAD), surveille le repliement des protéines membranaires et sécrétoires dont la biogenèse a lieu dans le réticulum endoplasmique (RE). Il existe également de plus en plus de preuves qu'ERAD contrôle d'autres fonctions liées au RE par le biais de la dégradation régulée de certaines protéines du RE replié, soulignant davantage le rôle d'ERAD dans l'homéostasie cellulaire.

Les protéines membranaires et sécrétées nouvellement synthétisées pénètrent dans le RE à l'état déplié via un canal conducteur de protéines appelé translocon (Rapoport, 2007). Dans le RE, une myriade de chaperons et d'enzymes modificatrices facilitent leur intégration et leur repliement membranaire. Dans de nombreux cas, le repliement implique des modifications post-traductionnelles, telles que la glycosylation ou la formation de liaisons disulfure (Braakman et Hebert, 2013). A ce stade, de nombreuses protéines sont également assemblées en complexes multi-sous-unités avec des stoechiométries définies. Lorsque les protéines nouvellement synthétisées atteignent une conformation native, elles quittent le RE pour remplir leur fonction ailleurs, le long de la voie de sécrétion ou à l'extérieur de la cellule.

Malgré toutes les ressources dédiées au repliement des protéines, une fraction importante des polypeptides nouvellement synthétisés entrant dans le RE ne parvient pas à acquérir une conformation native (Hartl et Hayer-Hartl, 2009). Le degré de mauvais repliement de ces protéines varie considérablement et peut avoir plusieurs causes telles que des mutations, des quantités sous-stoechiométriques d'un partenaire de liaison ou simplement un manque de disponibilité du chaperon. Dans la plupart des cas, les molécules mal repliées sont retenues dans le RE et finissent par devenir des substrats de la dégradation des protéines associées au RE (ERAD), un ensemble de mécanismes de contrôle de la qualité qui éliminent le RE de ces espèces potentiellement nocives. L'inactivation de l'ERAD entraîne l'accumulation de protéines mal repliées dans la lumière et la membrane du RE, une condition connue sous le nom de stress du RE qui est commune à plusieurs maladies (Walter et Ron, 2011). Pour cette raison, ERAD joue un rôle clé dans l'homéostasie du RE chez les eucaryotes. L'ablation génétique d'un certain nombre de composants d'ERAD conduit à une létalité embryonnaire chez la souris, soulignant également l'importance de ce processus dans l'homéostasie cellulaire et organique (Yagishita et al., 2005 Francisco et al., 2010 Eura et al., 2012). Il reste à déterminer si cette fonction essentielle d'ERAD au cours du développement de la souris est due à son rôle dans la dégradation des protéines mal repliées.

Certaines protéines repliées et parfaitement actives sont également ciblées par ERAD. Cependant, leur dégradation est très régulée et ne se produit qu'en présence d'un signal spécifique. Le substrat régulé le mieux caractérisé est la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl acétyl-coenzyme-A réductase (HMGR), une enzyme clé dans la biosynthèse des stérols (Gil et al., 1985 Hampton et al., 1996 Bays et al., 2001a Song et al., 2005). Tant chez la levure que chez les mammifères, la dégradation des HMGR par ERAD fait partie d'un système de rétro-inhibition critique pour l'homéostasie des stérols. Fait intéressant, une autre enzyme de la voie de biosynthèse des stérols, la squalène monooxygénase (Erg1 chez la levure et SQLE chez les mammifères), a récemment été identifiée comme un substrat ERAD régulé (Foresti et al., 2013). La dégradation d'Erg1/SQLE par ERAD s'inscrit à nouveau dans un système de rétro-inhibition pour empêcher l'accumulation de métabolites intermédiaires des stérols, toxiques pour les cellules (Foresti et al., 2013). Des preuves récentes montrent que la régulation de la synthèse des stérols et autres métabolites dérivés des stérols par ERAD est également présente dans les plantes (Doblas et al., 2013 Pollier et al., 2013). Ce rôle évolutif conservé d'ERAD dans la régulation des stérols pourrait avoir été l'une de ses fonctions primordiales.

La machinerie ERAD est également exploitée par certains virus pour dégrader les protéines de l'hôte échappant ainsi à la surveillance immunitaire. Des exemples bien caractérisés sont la dégradation de la chaîne lourde du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (MHC I) nouvellement synthétisée (Wiertz et al., 1996a) ou des molécules CD4 par le cytomégalovirus humain ou le virus de l'immunodéficience (HIV Fujita et al., 1997 Schubert et al. ., 1998), respectivement. De plus, certaines toxines bactériennes, telles que le choléra, et des virus, comme le virus simien 40 (SV40), voyagent rétrogradement vers le RE par la voie sécrétoire. Au RE, ces toxines et virus exploitent les composants ERAD pour atteindre le cytosol, où ils finiront par agir (Tsai et al., 2001 Schelhaas et al., 2007 Bernardi et al., 2008).

Enfin, les composants ERAD sont également impliqués dans le renouvellement de plusieurs protéines solubles dans le cytoplasme et le noyau des cellules (Swanson et al., 2001 Ravid et al., 2006 Yamasaki et al., 2007). La plupart de ces cas, cependant, n'impliquent qu'un sous-ensemble des étapes et des composants ERAD. En somme, bien qu'un répertoire complet de substrats ne soit pas disponible, il est clair que les protéines mal repliées ne sont pas les clients exclusifs d'ERAD.

ERAD, liant le contrôle qualité du RE à la dégradation des protéines cytoplasmiques

Les premières preuves du contrôle de la qualité des protéines aux urgences provenaient d'observations selon lesquelles des sous-unités non assemblées du récepteur des cellules T étaient rapidement dégradées dans les cellules (Lippincott-Schwartz et al., 1988). Cette dégradation s'est produite indépendamment des protéases lysosomales, conduisant à la proposition que le RE lui-même abriterait une activité protéolytique non caractérisée envers les protéines mal repliées. Ensuite, une étude marquante chez la levure a montré que la dégradation d'une protéine membranaire du RE mal repliée de courte durée était bloquée dans les cellules dépourvues d'Ubc6, un composant de la machinerie de conjugaison de l'ubiquitine (Sommer et Jentsch, 1993). Le système ubiquitine médie la fixation covalente de l'ubiquitine, une petite protéine de 76 acides aminés, aux protéines cibles dans le cytoplasme par l'action séquentielle des enzymes d'activation (E1), de conjugaison (E2) et de ligase (E3) (Pickart, 2001) . Les protéines modifiées par l'ubiquitine sont alors reconnues et dégradées par le protéasome. L'implication du système ubiquitine-protéasome dans le contrôle de la qualité des protéines du RE a été confirmée par des études sur la dégradation du régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR) mutant et sauvage, une grande protéine membranaire avec un processus de repliement compliqué (Jensen et al., 1995 Ward et al., 1995). L'inhibition de la fonction du protéasome a conduit à l'accumulation de molécules CFTR et, fait intéressant, une fraction significative de celles-ci a été détectée sous forme de conjugués d'ubiquitine (Jensen et al., 1995 Ward et al., 1995). Peu de temps après, il est devenu clair qu'un mécanisme similaire pourrait également expliquer la dégradation de protéines mal repliées luminales telles que CPY*, une version mutante de la carboxypeptidase Y vacuolaire de levure et un prototype de substrat ERAD (Hiller et al., 1996). Ensemble, ces articles ont démontré que les protéines aberrantes de la lumière et de la membrane du RE sont dégradées dans le cytoplasme où résident les composants du système ubiquitine-protéasome.

Complexes d'ubiquitine ligase : les hubs d'ERAD

Des études génétiques et biochimiques ultérieures, principalement dans des levures bourgeonnantes mais aussi dans des cellules de mammifères, ont identifié de nombreux composants ERAD et ont conduit à une compréhension générale de l'organisation de la voie. Une réalisation importante a été que le modèle « taille unique » ne s'applique pas à ERAD et que cette voie englobe plusieurs branches avec une spécificité distincte pour différentes classes de protéines mal repliées (Taxis et al., 2003 Vashist et Ng, 2004 Carvalho et al., 2006 Bernasconi et al., 2010 Christianson et al., 2012). Cependant, quelle que soit la branche, la même séquence d'événements conduit à la dégradation de tous les substrats ERAD (Fig. 1 A). La première étape est la reconnaissance d'un substrat dans l'environnement surpeuplé du RE. Ensuite, le substrat est transporté à travers la bicouche lipidique du RE dans le cytoplasme, une étape connue sous le nom de rétrotranslocation. Du côté cytosolique de la membrane du RE, le substrat est ubiquitiné par une ubiquitine ligase associée à la membrane (ou E3 ligase). Par la suite, le substrat ubiquitiné est extrait de la membrane de manière dépendante de l'ATP et libéré dans le cytoplasme pour être dégradé par le protéasome. L'exécution de ces étapes est coordonnée par un complexe protéique intégré à la membrane nommé d'après la ligase E3 à son noyau. Les ligases E3 canoniques impliquées dans ERAD sont elles-mêmes des protéines membranaires multispaniques, dans lesquelles le domaine RING (vraiment intéressant nouveau gène) responsable de l'activité ligase se trouve dans le cytoplasme. Ces complexes de ligase E3 sont mieux caractérisés dans la levure (Fig. 1 B et Tableau 1) où Doa10 (Swanson et al., 2001) et Hrd1 (Bordallo et al., 1998 Bays et al., 2001a) s'assemblent dans le Doa10 et le Des complexes Hrd1, respectivement, chacun responsable de la dégradation d'une classe de substrats ERAD (Carvalho et al., 2006).

Sur la base de l'analyse de quelques substrats modèles, la spécificité du complexe E3 ligase semble être déterminée par la localisation de la lésion mal repliée sur un substrat par rapport à la membrane du RE : des protéines avec des domaines mal repliés du côté cytoplasmique de la membrane (ERAD-C substrats) sont dégradés via les protéines complexes Doa10 avec des domaines mal repliés luminaux (substrats ERAD-L) ou intramembranaires (substrats ERAD-M) sont ciblés vers le complexe Hrd1 (Fig. 1 B et Tableau 1 Taxis et al., 2003 Vashist and Ng , 2004 Carvalho et al., 2006). Les facteurs impliqués dans la reconnaissance du substrat sont uniques au complexe de ligase E3 et déterminent probablement la spécificité du substrat de chaque branche ERAD. D'autre part, les composants qui agissent aux étapes tardives de l'ERAD, tels que le complexe Cdc48 ATPase (p97 chez les mammifères) requis pour l'extraction membranaire de substrats ubiquitinés (Bays et al., 2001b Ye et al., 2001 Jarosch et al. , 2002 Rabinovich et al., 2002), sont communs aux deux complexes de ligase E3.

Dans les cellules de mammifères, les ligases E3 les mieux étudiées sont Hrd1 et Gp78 (tableau 1). Ils sont tous deux homologues à la levure Hrd1 mais assemblent des complexes de ligase E3 distincts qui ciblent de préférence des substrats différents (Schulze et al., 2005 Mueller et al., 2008 Bernasconi et al., 2010 Christianson et al., 2012 Burr et al., 2013) . Plusieurs autres ligases E3 ont été impliquées dans ERAD dans les cellules de mammifères (telles que Rma1/Rnf5, Trc8, Rfp2, Rnf170 et Rnf185), mais elles sont encore mal caractérisées. Seuls quelques substrats sont connus pour chaque ligase et une préférence pour des classes de substrats ERAD particulières a été difficile à déduire (Claessen et al., 2012).

Comment les substrats ERAD sont-ils reconnus ?

Reconnaissance des protéines mal repliées.

L'engagement de dégradation par ERAD se produit au niveau de la reconnaissance du substrat, par conséquent, cette étape doit être étroitement contrôlée. Une détection inefficace des protéines mal repliées conduit à leur accumulation, affectant finalement la fonction cellulaire (Travers et al., 2000 Jonikas et al., 2009). D'un autre côté, ERAD hyperactif aurait probablement son coût, avec la dégradation de quantités importantes d'intermédiaires de repliement. Pour cette raison, la reconnaissance du substrat par ERAD doit être finement équilibrée. Il s'agit d'une tâche complexe compte tenu de l'environnement du RE, dans lequel un spectre complet d'espèces protéiques coexiste, des molécules dépliées nouvellement synthétisées aux protéines entièrement repliées.

Les intermédiaires de repliement et les protéines mal repliées terminales partagent des similitudes structurelles, par exemple l'exposition de plaques hydrophobes qui sont normalement cachées une fois que les protéines acquièrent la structure native. Ces molécules sont maintenues dans un état soluble en se liant à des chaperons tels que le ER Hsp70 (Kar2 chez la levure et BiP chez les mammifères), qui sont essentiels pour le repliement des polypeptides nouvellement synthétisés ainsi que pour l'élimination des protéines mal repliées. Cependant, les chaperons ne semblent pas à eux seuls déterminer le sort de leurs clients. Au lieu de cela, les facteurs de reconnaissance qui font partie des complexes de ligase E3 jouent un rôle majeur dans la sélection du substrat ERAD. Par exemple, la reconnaissance des substrats ERAD-L nécessite les composants luminaux du complexe Hrd1 Hrd3, Kar2 et, dans le cas des substrats glycosylés, la lectine Yos9 (Plemper et al., 1997, 1999 Bhamidipati et al., 2005 Kim et al. al., 2005 Szathmary et al., 2005 Carvalho et al., 2006 Denic et al., 2006 Gauss et al., 2006a). La levure derlin Der1, une protéine membranaire du complexe Hrd1, pourrait également être impliquée dans la reconnaissance du substrat ERAD-L (Gauss et al., 2006b Stanley et al., 2011). De plus, certains substrats d'ERAD-M semblent être reconnus directement par la ligase E3 Hrd1 (Sato et al., 2009). Cependant, les caractéristiques reconnues sur les protéines mal repliées par ces facteurs ERAD sont largement inconnues.

Une exception informative est la reconnaissance des glycoprotéines liées à l'azote mal repliées dans la lumière dans Saccharomyces cerevisiae (Fig. 2A). Lorsqu'elles pénètrent dans la lumière du RE, les protéines sont souvent modifiées au niveau des résidus asparagine (dans le contexte de la séquence N-X-S/T) avec une fraction glycane ramifiée bien définie composée de trois glucose, neuf mannose et deux N-résidus d'acétylglucosamine, Glc3–Man9–GlcNAc2 (Fig. 2 A Braakman et Hebert, 2013). Ce glycane lié à N est ensuite coupé par plusieurs enzymes. Les premières enzymes de traitement des glycanes telles que les glucosidases conduisent à la liaison de lectines qui facilitent le repliement des protéines nouvellement synthétisées. En revanche, les enzymes à action tardive, telles que la mannosidase Htm1, déclenchent la liaison d'une lectine différente qui engage la protéine dans ERAD (Jakob et al., 2001 Quan et al., 2008 Clerc et al., 2009). Cette différence dans la cinétique des enzymes de coupe des glycanes offre une opportunité aux protéines nouvellement synthétisées d'acquérir la conformation native et le trafic au-delà du RE (Fig. 2 A). Une longue résidence au RE, révélatrice de problèmes de repliement, entraîne le traitement des glycoprotéines mal repliées par Htm1, qui génère une marque biochimique (α1,6-linked mannose) décodée par la lectine Yos9, un facteur de reconnaissance du substrat ERAD (Quan et al. , 2008 Clerc et al., 2009).

La levure Htm1 et son homologue mammifère EDEM sont en complexe avec des oxydoréductases (Pdi1 chez la levure, Erdj5 chez les mammifères), nécessaires à la stabilité de Htm1 et également à la réduction des liaisons disulfure dans les protéines mal repliées, ce qui pourrait affecter les étapes ERAD ultérieures (Ushioda et al. , 2008 Clerc et al., 2009). The binding of Yos9 to the α1,6-linked mannose is not sufficient to trigger the degradation of the misfolded protein. This processed glycan must be located in an unstructured polypeptide segment that is bound by Hrd3 (Xie et al., 2009). The delivery of substrates to Hrd3 might be facilitated by the luminal chaperone Kar2 that is essential for ERAD (Plemper et al., 1997 Denic et al., 2006 Xie et al., 2009). The dual recognition of a specific N-linked glycan by Yos9 and an unstructured segment by Hrd3 likely enhances the stringency of ERAD substrate recognition, perhaps by a kinetic proofreading mechanism (Fig. 2 A Denic et al., 2006).

The recognition mechanism of misfolded luminal N-linked glycoproteins is likely similar in mammalian cells because the yeast components are largely conserved in higher eukaryotes (Table 1). However, the situation might be more complicated. For example, OS-9 and XTP3-B, the mammalian homologues of Yos9, use their glycan-binding domain not only to interact with glycans in the misfolded protein but also with Sel1, the mammalian version of Hrd3, which is itself a glycoprotein (Christianson et al., 2008). Whether the interactions with Sel1 and the substrates occur sequentially or correspond to different pools of OS-9/XTP3-B is unclear. In either case, using the same domain to interact with a component and a substrate offers OS-9/XTP3-B an additional mechanism to regulate recognition of N-glycosylated ERAD substrates.

Recent work in yeast suggests that a different type of glycosylation, O-mannosylation, plays an important role in removing certain luminal proteins from futile folding cycles and thus favoring their degradation by ERAD after prolonged residency in the ER (Goder and Melero, 2011 Xu et al., 2013). The enzymes involved in protein O-mannosylation physically associate with ERAD machinery, but how O-mannosylated proteins are captured by the ERAD components is still unclear (Goder and Melero, 2011). Therefore, O-mannosylation is another appealing mechanism for generating an irreversible biochemical mark on proteins displaying folding problems.

A common feature between ERAD substrate recognition by N-glycan trimming and O-mannosylating enzymes is that both appear to be slow processes, requiring substrates to stay for relatively prolonged periods in the ER. Whether other mechanisms involved in recognition of misfolded proteins by ERAD also require a lag period in the ER is not known. Nevertheless, it is curious that newly synthesized proteins were shown to be protected from degradation for a period of time, even under conditions that favor their misfolding (Vabulas and Hartl, 2005). Therefore, recognition of misfolded proteins might have evolved as an intrinsically slow process, perhaps to spare some folding intermediates from prematurely engaging in ERAD.

Adaptor-mediated substrate recognition.

The degradation of specific folded proteins by ERAD is mediated by the same general machinery, but the recognition of these substrates involves distinct factors. A simple mechanism to target a native protein to ERAD is by a substrate-specific adaptor. For example, the human cytomegalovirus encodes ER membrane adaptor proteins, US2 and US11, which bind independently to newly synthesized MHC I molecules and deliver them to ERAD components for degradation. As a consequence, infected cells display less MHC I complex at their surface and escape detection by the immune system (Wiertz et al., 1996a). Despite this common outcome, the two viral proteins interact differently with ERAD components. US11 uses its transmembrane domain to recruit MHC I into a complex which contains Derlin-1 as well as Sel1L, the p97 ATPase complex and its membrane adaptor UBXD8 (Lilley and Ploegh, 2004 Ye et al., 2004 Mueller et al., 2008). Intriguingly, the E3 ligase required for US11-mediated MHC I degradation is not known and both Hrd1 and Gp78 E3 ligases, which are found in complex with Derlin-1, appear to be dispensable. US2, on the other hand, delivers its substrate to the ERAD ligase complex containing the E3 Trc8 and SPP, the signal peptide peptidase (Fig. 2 B Loureiro et al., 2006 Stagg et al., 2009). The precise function of SPP in ERAD is not known and it is not even clear whether it involves its proteolytic activity. Despite these differences, both US2 and US11 act as adaptors to deliver a specific ERAD substrate, MHC I heavy chain, to the E3 ligase complexes that promote its degradation.

A similar mechanism targets CD4 for degradation in cells expressing the HIV-encoded ER membrane protein Vpu. In this case, Vpu works not only as the substrate adaptor for CD4 but also as a scaffold to recruit a cytosolic E3 ligase complex, SCF βTrCP , required for CD4 ubiquitination (Fujita et al., 1997 Schubert et al., 1998). In vitro reconstitution of Vpu-mediated CD4 ubiquitination revealed that the specificity of adaptor-mediated substrate selection can be further increased at the level of substrate ubiquitination, which can be counteracted by the activity of de-ubiquitinating enzymes (Zhang et al., 2013). The balance between these activities helps discriminating small differences in adaptor–substrate affinity. Whether this mechanism aids the selection of other ERAD substrates is not known yet.

The strategy of using a substrate-specific adaptor is not exclusive to viral encoded proteins. Both in Drosophile and in mammalian cells, the derlin-related iRhom proteins function as adaptors in the ERAD-mediated degradation of EGFR ligands as they traffic through the ER (Zettl et al., 2011). Elegant genetic experiments in flies showed that this mode of regulated ERAD was important to control sleeping behavior that requires EGFR signaling (Zettl et al., 2011). It is likely that more substrate-specific adaptors will be identified as our knowledge of the mechanisms of regulated ERAD expands.

Signal-mediated substrate recognition.

A substrate-specific adaptor also functions in the regulated ERAD of HMGR, a key enzyme of the sterol biosynthetic pathway. In this case the adaptor, either Insig-1 or Insig-2, does not bind constitutively to HMGR (Song et al., 2005). Instead, the interaction only occurs in the presence of 24,25-dihydrolanosterol, an intermediate metabolite in sterol biosynthesis. Under low sterols levels HMGR is a stable protein, actively producing sterol precursors (Fig. 2 C). On the other hand, high sterol synthesis leads to a rise in 24,25-dihydrolanosterol concentration, which favors the binding of HMGR to one of the Insig proteins, its delivery to an E3 ligase complex, and consequently its degradation by the proteasome (Fig. 2 C). Whereas Gp78 and the Trc8 were originally implicated in HMGR regulated ERAD, recent data suggest that additional E3 ligases might also be involved (Song et al., 2005 Lee et al., 2010 Jo et al., 2011 Tsai et al., 2012). Degradation of HMGR by ERAD results in reduced flux through the sterol biosynthetic pathway and reestablishment of membrane lipid homeostasis.

Interestingly, Insig-1 (but not Insig-2) is itself subjected to reciprocal sterol-regulated ERAD (Lee et al., 2006). Depletion of cellular sterols stimulates Insig-1 ubiquitination by the E3 Gp78 ligase complex. Conversely, if sterol levels are high Insig-1 binds to SCAP, another key ER membrane protein required for sterol homeostasis, leading to a much longer Insig-1 half-life. These data illustrate the complex interplay between the opposing effects of sterols on the stability of the HMGR enzyme and one of its adaptors for regulated degradation by ERAD.

In yeast, sterol homeostasis also involves negative feedback of an HMGR homologue, Hmg2 (Hampton et al., 1996). Like in mammals, degradation of yeast Hmg2 is controlled by the Insig-like proteins Nsg1 and Nsg2 and requires the E3 ligase Hrd1 (Bays et al., 2001a Gardner et al., 2001 Flury et al., 2005). In fact, Hrd1 was originally identified in a genetic screen for mutants defective in HMGR degradation (HRD genes Hampton et al., 1996). The binding of Hmg2 to Nsg1 is also modulated by sterol levels (Theesfeld and Hampton, 2013). However, in contrast to mammalian cells, the binding of Nsg1 promotes Hmg2 stability, indicating that the recognition of this substrate is mechanistically different in the two systems (Flury et al., 2005 Theesfeld and Hampton, 2013). Based on limited proteolysis experiments, it has been proposed that Nsg1 and Nsg2 work as Hmg2-specific chaperones and that in their absence Hmg2 presents sufficient conformation instability to engage in ERAD as a misfolded protein (Flury et al., 2005 Shearer and Hampton, 2005). This degradation is further accelerated by high concentrations of an early sterol-intermediate metabolite, geranylgeranyl pyrophosphate (Theesfeld and Hampton, 2013). Therefore, a change in the affinity to a binding partner is another strategy to target a protein for ERAD in a signal-dependent manner.

Squalene monooxygenase (SQLE), another enzyme of the sterol biosynthetic pathway, is also targeted by regulated ERAD both in yeast and in mammals (Foresti et al., 2013). SQLE degradation requires the yeast Doa10 E3 ligase complex or its mammalian homologue Teb4, indicating that two independent branches of ERAD control distinct steps in sterol biosynthesis (Foresti et al., 2013). Although the mechanism for the recognition of SQLE by ERAD machinery is still not known, it is clear that Insigs are dispensable for this recognition, both in mammals and in yeast (Gill et al., 2011 Foresti et al., 2013). In mammals, the N-terminal domain of SQLE is necessary and sufficient for cholesterol-dependent degradation (Gill et al., 2011). Whether this domain binds directly to cholesterol or interacts with an ERAD-specific adaptor is not known. The mechanism for SQLE recognition by ERAD in yeast is likely to be different because this N-terminal domain is only conserved among certain animals.

Based on these few examples, it is clear that signal-mediated ERAD depends on the ability of cells to sense the concentration of some lipids in their membranes and on specific adaptors to selectively degrade key enzymes. Our knowledge on the mechanisms by which other classes of regulated ERAD substrates are recognized will grow as more of these are identified.

Shipping out the trash: Substrate retrotranslocation and cytoplasmic events in ERAD

After being selected, ERAD substrates are retrotranslocated across the ER membrane back into the cytoplasm. In the case of misfolded luminal proteins the complete polypeptide needs to be retrotranslocated, whereas for membrane substrates this step requires the transport of only certain domains. As a consequence, ubiquitination of luminal substrates only occurs at late stages of retrotranslocation, once a portion of the substrate has been exposed to the cytoplasm. In contrast, ubiquitination of most, but not all (Burr et al., 2013), membrane substrates is coupled to their retrotranslocation.

In analogy to the transport of newly synthesized proteins into the ER or mitochondria, it has been postulated that retrotranslocation occurs through a protein-conducting channel. However, the identity of the retrotranslocation channel has been at the center of an intense debate that is almost as old as the research in this field. Over the years, several channel candidates have been proposed but it has been difficult to gather definitive evidence in support of any of them. The Sec61 translocon used for protein import into the ER was the first proposed retrotranslocation channel (Wiertz et al., 1996b). Sec61 was found to interact with ERAD substrates both in yeast and in mammalian cells as well as with the yeast proteasome (Wiertz et al., 1996b Kalies et al., 2005 Scott and Schekman, 2008). However, the significance of these associations is not clear. Recent work showed that proteins engaging the Sec61 translocon aberrantly or persistently in their way into the ER become substrates of the Hrd1 ligase complex, which might explain the interaction between Sec61 and some ERAD substrates (Rubenstein et al., 2012). In addition, certain yeast sec61 mutants displayed defects in degrading model ERAD substrates, even under conditions in which general “forward” translocation appeared not to be dramatically affected (Pilon et al., 1997 Plemper et al., 1997 Willer et al., 2008). It remains to be determined whether this phenotype is caused by a specific impairment in retrotranslocation.

The E3 ligase complexes interact with ERAD substrates immediately before and after their retrotranslocation, indicating this step occurs in their immediate vicinity. Therefore, multispanning membrane proteins within the E3 ligase complexes have also been seen as good candidates to mediate retrotranslocation (Ye et al., 2001 Lilley and Ploegh, 2004 Kreft et al., 2006 Horn et al., 2009 Carvalho et al., 2010 Mehnert et al., 2014). These include the E3 ligases themselves as well as proteins of the Derlin family (Der1 in yeast), which are essential for the degradation of all luminal ERAD substrates but whose function has remained elusive. In vitro experiments using mammalian-derived microsomes loaded with the yeast ERAD substrate mutant pro-α-factor indicate that Derlin might be involved in retrotranslocation (Wahlman et al., 2007). In this simplified system, in which synthesis and retrotranslocation were uncoupled, the substrate cross-linked to Derlin but not to Sec61. Moreover, its retrotranslocation was blocked by anti-Derlin antibodies whereas antibodies directed to Sec61 had no effect (Wahlman et al., 2007). It should be noted that mutant pro-α-factor is a noncanonical substrate because its retrotranslocation does not require ubiquitination. Interactions between the yeast Der1 and the prototype ERAD-L substrate CPY* were also detected by site-specific photocrosslinking in yeast (Carvalho et al., 2010 Stanley et al., 2011 Mehnert et al., 2014). These cross-links were seen even in cells lacking the substrate recognition factors Hrd3 and Yos9, and were increased if conserved polar residues in the membrane domain of Der1 were mutated. An interpretation of these results is that Der1 mediates the transfer of substrates from the recognition factors Hrd3/Yos9 to the Hrd1 ligase inside the membrane (Mehnert et al., 2014).

A compelling piece of evidence for a function during substrate retrotranslocation was reported for the E3 ligase Hrd1 (Fig. 3 Carvalho et al., 2010). Although commonly working in the context of the Hrd1 complex, overexpressed Hrd1 can mediate the degradation of ERAD-L substrates even in the absence of its membrane partners Hrd3, Der1, and Usa1 (Plemper et al., 1999 Denic et al., 2006 Carvalho et al., 2010). Under these conditions Hrd1 selectivity for misfolded proteins is lost, suggesting that the other subunits of the complex are critical to control Hrd1 activity and substrate specificity (Denic et al., 2006). Hrd1 interacts with a sizeable region of a modified version of CPY* during the early stages of retrotranslocation, as assayed by site-specific photocrosslinking (Carvalho et al., 2010). Importantly, the interaction likely occurs inside of the ER bilayer because it is lost if substrate recognition is blocked or if the transmembrane segments of Hrd1 are mutated. Hrd1 contains only six transmembrane segments therefore, ERAD-L substrate retrotranslocation requires Hrd1 oligomerization, which normally is facilitated by Usa1 but can occur spontaneously upon Hrd1 overexpression (Horn et al., 2009 Carvalho et al., 2010). All these data make a strong case for a direct role of Hrd1 in the retrotranslocation of ERAD-L substrates, but the possibility that it works with some partner(s), such as Der1, Sec61, or other unknown factors cannot be excluded at this point. Moreover, it is not known whether this is a unique feature of Hrd1 or whether the membrane domains of other E3 ligases also participate in the retrotranslocation of other classes of ERAD substrates.

In most of these cross-linking experiments the retrotranslocation of CPY* was dampened by fusing it to a very tightly folded domain, indicating that ERAD-L substrates need to be unfolded before this step (Bhamidipati et al., 2005 Carvalho et al., 2010). Whether unfolding is also a prerequisite for the retrotranslocation of other classes of ERAD substrates is not settled yet (Fiebiger et al., 2002 Tirosh et al., 2003).

At the cytoplasmic side of the ER membrane, substrates are ubiquitinated, a modification that allows their recognition by the Cdc48/p97 ATPase complex composed of a homohexamer of Cdc48/p97 and by the cofactors Ufd1 and Npl4 (Bays et al., 2001b Ye et al., 2001, 2003 Jarosch et al., 2002 Rabinovich et al., 2002). The recruitment of this ATPase complex to the ER membrane is facilitated by ubiquitin regulatory X (UBX) domain–containing proteins, Ubx2 in yeast and UBXD8 in mammals (Neuber et al., 2005 Schuberth and Buchberger, 2005 Mueller et al., 2008). The ATPase activity of the Cdc48/p97 complex provides the driving force to move ubiquitinated substrates out of the membrane into the cytosol (Ye et al., 2003). Although the role of Cdc48/p97 in this process is well established, the mechanism that couples ATP hydrolysis to membrane extraction of the substrate is still not understood. In addition to the Cdc48/p97 complex, the ATPase subunits of the proteasome regulatory particle were also shown to play a role in retrotranslocation of some ERAD substrates (Lipson et al., 2008). The driving force for the retrotranslocation of the few non-ubiquitinated substrates, like the cholera toxin or pro-α-factor, is not known (Kothe et al., 2005 Moore et al., 2013).

The Cdc48/p97 complex also serves as a platform for other ubiquitin-modifying enzymes such as de-ubiquitinating enzymes (DUBs Rumpf and Jentsch, 2006 Jentsch and Rumpf, 2007 Ernst et al., 2009). Although the role of some of these Cdc48/p97-binding factors is not clear yet, it was shown that interfering with the DUBs YOD1 and ataxin-3 affected substrate retrotranslocation (Wang et al., 2006 Ernst et al., 2009). The requirement for DUB activity during retrotranslocation suggests that the process involves cycles of ubiquitination and de-ubiquitination. In some cases these cycles might be important to increase the specificity of substrate recognition, as was shown for the Vpu-mediated degradation of CD4 (Zhang et al., 2013). Interestingly, the retrotranslocation of some noncanonical substrates like cholera toxin, which are not ubiquitinated, is also affected by manipulation of both E3 ligase and DUB activities (Hassink et al., 2006 Bernardi et al., 2013). These results suggest that retrotranslocation requires the ubiquitination of some factors other than the substrates. Future studies should test some obvious candidates such as the components of the E3 ligase complexes themselves.

There is some recent evidence that the yeast Cdc48 complex might be acting also much earlier, during the initial stages of retrotranslocation of an ERAD-L substrate, before it is exposed to the cytoplasm (Fig. 3). Using a cross-linking strategy, it was shown that the interaction between Hrd1 and an early retrotranslocation intermediate was lost in mutants of the Cdc48 complex (Carvalho et al., 2010). Interestingly, a similar defect was detected in Hrd1 mutants impaired for E3 ligase activity (Carvalho et al., 2010). Based on these observations it was proposed that in early stages of ERAD-L substrate retrotranslocation, Hrd1 induces the ubiquitination of an ERAD component, perhaps Hrd1 itself. This ubiquitination signals the recruitment of the Cdc48 complex, which upon ATP hydrolysis would induce changes in the conformation or in the oligomeric status of Hrd1, resulting in substrate retrotranslocation. This model is consistent with the well-established role of Cdc48/p97 in the disassembly and remodeling of protein complexes (Jentsch and Rumpf, 2007). Once the substrate emerges on the cytosolic side and is ubiquitinated by Hrd1, the ATPase complex binds to it and promotes the final stages of its retrotranslocation. Although many aspects of this model still wait for experimental support, it would provide a unifying role for the Cdc48/p97 ATPase as the driving force for substrate retrotranslocation in ERAD (Fig. 3).

After being released from the membrane, substrates are kept soluble and transferred to the proteasome by cytosolic chaperones such as the BAG6 complex (Claessen and Ploegh, 2011 Wang et al., 2011 Xu et al., 2012) or shuttle factors like Rad23 and Dsk2 (Medicherla et al., 2004). The long journey of ERAD substrates ends with their degradation by the proteasome.

Conclusions and future perspectives

In recent years there has been tremendous progress in understanding ERAD. The identification of most of the components involved in this process and how these are pieced together and organized in the different ERAD branches were important achievements. A major challenge for the future is to reveal the mechanistic aspects of the pathway. Such developments should, for example, help in discerning the basis by which misfolded proteins are recognized in each of the different ERAD branches.

The mechanisms of substrate retrotranslocation and the roles played by the different components, such as the E3 ligases and the Cdc48/p97 complex, will certainly be another interesting area to follow. However, progress on these topics might require the development of new approaches, such as in vitro systems with purified components recapitulating individual ERAD steps.

In early days, ERAD was perceived as a process mainly dedicated to ER protein quality control. The picture now emerging places ERAD closer to other ubiquitination systems in the cytoplasm and nucleus, which control the turnover of specific proteins to achieve a certain physiological state. Therefore, another major challenge for the coming years is the detailed characterization of the roles of ERAD beyond quality control. Although the central role of ERAD in sterol homeostasis is unequivocal, it will be important to clarify whether ERAD has a more general role in the regulated degradation of folded ER proteins and in that way modulates other ER-related functions. A systematic and rigorous identification of regulated ERAD substrates should help in addressing these issues. Uncovering the intersections of ERAD with other cellular pathways will provide important insights into the mechanisms of ER and cellular homeostasis.


Résumé

Hepatitis C virus plays a significant role in the development of hepatocellular carcinoma (HCC) globally. The pathogenic mechanisms of hepatocellular carcinoma with HCV infection are generally linked with inflammation, cytokines, fibrosis, cellular signaling pathways, and liver cell proliferation modulating pathways. HCV encoded proteins (Core, NS3, NS4, NS5A) interact with a broad range of hepatocytes derived factors to modulate an array of activities such as cell signaling, DNA repair, transcription and translational regulation, cell propagation, apoptosis, membrane topology. These four viral proteins are also implicated to show a strong conversion potential in tissue culture. Furthermore, Core and NS5A also trigger the accretion of the β-catenin pathway as a common target to contribute viral induced transformation. There is a strong association between HCV variants within Core, NS4, and NS5A and host single nucleotide polymorphisms (SNPs) with the HCC pathogenesis. Identification of such viral mutants and host SNPs is very critical to determine the risk of HCC and response to antiviral therapy. In this review, we highlight the association of key variants, mutated proteins, and host SNPs in development of HCV induced HCC. How such viral mutants may modulate the interaction with cellular host machinery is also discussed.


Caractéristiques structurelles caractéristiques

The RHD consists of two hydrophobic regions, each 28-36 amino acids long, which are thought to be membrane-embedded regions, separated by a hydrophilic loop of 60-70 amino acids, and followed by a carboxy-terminal tail about 50 amino acids long (Figure 2a). Although much amino-acid identity has been lost over the course of evolution, the overall structure of the RHD has been preserved from plants to yeasts to humans. This suggests that three-dimensional protein structure is of greater importance than individual residues for RHD function. The RHD hydrophobic regions are unusually long for transmembrane domains: each spans approximately 30-35 amino acids, whereas most transmembrane domains are about 20 amino acids in length. This raises the interesting question of whether this longer length has significance for reticulon function. The topology of these hydrophobic regions within membranes is so far only partially defined.

The structure and membrane topology of reticulons. (une) Structure of reticulon proteins. Numbers refer to the exons that encode the protein regions. Black ovals represent hydrophobic regions. GenBank accession numbers are as in Figure 1. (b) Possible topologies of reticulon proteins in membranes. Although eight or more conformations are possible, only those for which evidence exists are depicted. Different topologies in different cell types and different membranes may enable reticulons to carry out diverse roles in the cell.

Reticulon topology

The RHD loop region has been detected both on the surface of cells and intracellularly, and it has been suggested that the RHD hydrophobic regions might either span the ER membrane or plasma membrane completely or might double back on themselves to form a hairpin (Figure 2b). Antibodies against the amino-terminal domain of RTN4 bind to the surface of chick oligodendrocytes in live spinal cord explants [8] and cultured oligodendrocytes interact specifically with both amino-terminal domain-specific antibodies and antibodies directed against the RTN4 66-amino-acid loop (66-loop) [16]. These findings suggest that the amino terminus and the 66-loop project into extracellular space, and therefore that the first RHD hydrophobic region must double back on itself in the membrane. However, other data suggest that the amino-terminal domain is intracellular. Antibodies against the 66-loop region of RTN4 detect small amounts of this epitope on the surface of live COS-7 cells, but antibodies against c-Myc tags fused to either the amino or the carboxy terminus do not bind to live cells [8].

More recent data from non-neuronal cells in which RTN4 is overexpressed strongly support a third model, in which most of both the amino-terminal domain and the 66-loop are cytoplasmic. In COS cells treated with maleimide polyethylene glycol, cysteines in the amino-terminal domain and the loop regions of ER-associated RTN4 were found to be modified by the reagent after detergent disruption of the plasma membrane but not the ER membrane [6]. Cysteines in the carboxy-terminal region were only partially modified. All these results suggest that mammalian reticulons might have different topologies in the ER and plasma membranes such multiple conformations may enable them to carry out multiple roles in the cell. Another protein with multiple membrane topologies is the mammalian prion protein (PrP) overexpression of a certain transmembrane form of the prion protein, Ctm PrP, causes neurodegenerative disease distinct from that caused by the natural pathogenic prion form PrP Sc [19, 20]. Another possibility is that reticulons assume different topologies in different cell types: the reticulon amino-terminal region has been detected only in the cytoplasm in COS-7 cells, but has been found on both the surface and in the cytoplasm of oligodendrocytes. Again, this may reflect the diverse roles of reticulon proteins in different cell types.

Reticulon tertiary structure

The solution structure of the RHD loop of RTN4, known as Nogo66, has recently been probed by circular dichroism (CD) and nuclear magnetic resonance (NMR). Nogo66 is soluble in pure water and consists of three alpha helices, two short flanking one long, spanning residues 6-15, 21-40 and 45-53, followed by the unstructured residues 55-60 [21, 22]. The Nogo66 loop is involved in several RTN4-specific signaling cascades, including interaction with the Nogo receptor (NogoR) to inhibit neurite outgrowth [23], and with the cell adhesion molecule contactin-associated protein (Caspr) [24] to mediate the localization of potassium channels at axonal paranodes. The human RTN1 and RTN3 66-loops share 71% and 63% identity with the RTN4 loop mouse RTN1 and RTN3 identity with human RTN4 is 67% and 59%. Despite this high degree of identity, the RTN1 66-loop does not bind to NogoR, and the function of the 66-loops in RTN1 and RTN3 is unknown in both mammals and lower organisms.

As mentioned above, the amino-terminal regions of different reticulons are highly divergent in sequence. The amino-terminal domains of the human RTN4 isoforms appear to be highly unstructured, even under physiological conditions. In silico analysis and measurements by CD and NMR of the human isoforms RTN4A and RTN4B reveal a high degree of disorganization, with only short alpha helices and beta sheets that exist transiently [25]. Recent studies have shown that intrinsically unstructured proteins (IUPs) are more likely to form multiprotein complexes than are proteins with stable tertiary structure [26], are better able to 'moonlight' - carry out alternative functions [25] - and may fold upon binding to their partners [27]. It has been shown that up to 33% of eukaryotic proteins contain long disordered regions, compared with 2% of archeal proteins [25]. The characterization of RTN4 as an intrinsically unstructured/disordered protein may explain its involvement in many physiological processes, as explained below.


VII. Peroxisomal solute transporters

A number of metabolic pathways span peroxisomes and other subcellular compartments metabolites and cofactors must therefore move across the peroxisomal membrane, and at least some of these movements should rely on membrane transporters. To date, several peroxisomal membrane proteins have been identified to specifically transport β-oxidation substrates (i.e. fatty acids, OPDA, CA and IBA) and large cofactors (i.e. ATP, NAD + and CoA (Charton et al., 2019 )).

The Arabidopsis full-size ABC transporter PXA1/CTS/PED3 can cleave acyl-CoA and import free FAs into the peroxisomal matrix. PXA1 also interacts with long-chain acyl-CoA synthetases LACS6 and LACS7, which reactivate free FA to acyl-CoA to feed into β-oxidation (De Marcos Lousa et al., 2013 ). In addition, PXA1 transports precursors for the biosynthesis of IAA, JA, BA and the benzenoid moiety of ubiquinone (Figs 5 & 6, 5 & 6) (Block et al., 2014 Li et al., 2016 ). PXA1 is also important in acetate metabolism, as a loss-of-function PXA1 mutant named acn2 (acetate non-utilizing 2) is compromised in metabolizing acetate in seedlings (Hooks et al., 2007 ). PXA1 interacts with CGI-58, a regulator of lipid metabolism and signaling (Park et al., 2013 ). Consistent with its broad function, PXA1 knockout mutants have defects in lateral root development, seed dormancy and germination, fertilization and leaf necrosis (Li et al., 2016 ).

Besides transporters, Acyl-CoA-binding proteins (ACBPs) can also mediate lipid transfer across membranes (Xiao & Chye, 2011 ). Arabidopsis ACBPs have not been found in the peroxisome, but rice ACBP6 is peroxisomal and its overexpression partially recovers the β-oxidation defects of pxa1, suggesting that rice ACBP6 can contribute to the import of FA into peroxisomes for degradation (Meng et al., 2014 ). Whether this divergence in ACBP function between Arabidopsis and rice is due to different metabolic features of monocot and dicot species remains to be determined.

Arabidopsis PNC (PNC1 and PNC2) and PXN proteins are peroxisomal ATP and NAD + carriers, respectively. PNC1 and PNC2 can catalyze the counter-exchange of ATP with ADP or AMP and complement yeast mutants deficient in peroxisomal ATP import. Les pnc mutants are impaired in β–oxidation, suggesting that the proteins are essential for supplying peroxisomes with ATP (Linka et al., 2008 ). PXN can transport many substrates in vitro, including NAD + , NADH, AMP, ADP, CoA and acetyl-CoA (Agrimi et al., 2012 Bernhardt et al., 2012 ), and contributes to optimal fatty acid degradation during seedling establishment, and photorespiration under fluctuating and high light conditions (Bernhardt et al., 2012 J. Li et al., 2019a ). However, exogenously expressed AtPXN in yeast strains can import NAD + into peroxisomes in exchange for AMP but cannot transport CoA or mediate NAD + /NADH exchange (van Roermund et al., 2016 ).

Non-selective peroxisomal membrane channels may allow the passage of small solutes, such as organic acids. Yeast Pex11 has a pore-forming function, but whether plant PEX11s also possess this function has not been reported (Mindthoff et al., 2016 ). Several additional peroxisomal membrane proteins, such as PMP22 (peroxisomal membrane protein of 22 kDa), CDC (Ca 2+ -dependent carrier) and SMP2 (short membrane protein 2), also have potential pore-forming activities (summarized in Pan & Hu, 2018a ).


Function of ER in reviewing mutated proteins - Biology

Cells: The Basic Unit of Life

Cell Theory: All known living things are made up of cells. All cells come from preexisting cells by division. The cell is structural and functional unit of all living things.

Cell Structural Overview: The major parts of a cell are the nucleus, cytoplasm, and cell membrane.

  • The nucleus contains a nucleolus and is separated from the cytoplasm by the nuclear envelope.
  • The nucleus contains the cell’s DNA, a type of nucleic acid.
  • The nucleolus is like a “tiny nucleus” inside the actual nucleus. It contains RNA, a type of nucleic acid.
  • The nucleus communicates through holes in the envelope called nuclear pores.
  • The nucleus decides what the cell needs and uses DNA to print out instructions for the rest of the cell to produce that need.

Chromosomes :

  • Hold the cell’s DNA in the nucleus.
  • The nucleus contains genetic information in the form of DNA (the universal genetic code).
  • The DNA does not hang around loosely in the nucleus. The DNA is packaged with proteins and wound up.
  • Recall that the role of nucleic acids is to carry genetic information, which is inherited by an organism’s offspring.
  • These wound up DNAprotein structures are called chromosomes.


Cytoplasmic Organelles: Are compartmentalized structures that perform a specialized function within a cell.

Golgi apparatus: ships packages around the cell.

  • The golgi is made up of flattened, folded sacs.
  • Packages (e.g. containing proteins) are carried to the golgi in vesicles.
  • The golgi receives an incoming vesicle, tags the package, and sends the vesicle to its final destination.
  • Lysosomes contain an environment made to destroy waste.
  • Vesicles carry the waste (bacteria, old organelles, etc.) into the lysosome.
    Once inside, the waste is destroyed and its parts recycled.
  • Smooth ER is NOT attached to the nucleus and DOES NOT have attached ribosomes (thus smooth).
  • Smooth ER synthesizes carbohydrates (sugars) and lipids (fats).

Mitochondria: produce energy to power the cell.

  • The mitochondria convert carbohydrates (sugar) taken from food into ATP.
  • The mitochondria are unique in that it has two protective shells.
  • The ribosome reads the DNA strand instructions to make proteins for the cell to use in its normal activities.
  • The units clasp around a strand of nucleic acid instructions from the nucleus.
    Each ribosome is made of two protein subunits.

Rough endoplasmic reticulum: The two types of ER make different building blocks for the cell.

  • Rough ER is found attached to the outside of the nucleus. It appears rough because of the ribosomes on its surface.
  • Rough ER helps the attached ribosomes in finishing protein synthesis.
  • Plasma Membrane, the cell’s membrane is made of phospholipids, which have carbohydrate heads and lipid tails.
  • Embedded proteins are anchored to the cell membrane.
  • Exterior of the plasma membrane touches water polar heads touch water on the inside of the cell and water on the outside of the cell.
  • Interior Blocks Passage However, water and other molecules cannot pass through to either side because of the nonpolar tails.
  • Provides a stabilized environment, which protects and maintains the cell’s internal environment, separate from the environment outside.
  • Proteins embedded into the membrane send and receive signals to communicate with other cells.

Three types of passive transport are osmosis, diffusion, and facilitated diffusion. Osmosis is the natural movement of water from a high concentration of water to a lower concentration of water. Diffusion is the natural movement of molecules from a higher concentration to a lower concentration. Facilitated Diffusion is the natural movement of molecules from a higher concentration to a lower concentration with the help of a transporter protein embedded on the cell membrane.

Transport actif requires energy to occur. Active transport is “forced” movement of molecules from a lower concentration to a higher concentration. The most common type of active transport is a pump. Pumps are proteins embedded in the cell membrane, which use ATP energy to work.

Different Cell Types: Prokaryote and Eukaryote.

  • Prokaryotic: Bacteria and other microscopic organisms are made up of prokaryotic cells. Prokaryotic cells do not have any complex organelles (not even a nucleus). However, prokaryotes do have ribosomes.
  • Eukaryotic: Two types of eukaryotic cells are plant and animal cells.

The cell contains a nucleus, which contains the genetic material necessary for reproduction. Within the cytoplasm of the cell are the organelles the cell requires to reproduce, energy production, and removal of waste.

Key concepts about how cells obtain and import the necessary nutrients for survival along with the energy requirements of these processes will be presented.

Fonctionnalités spécifiques du didacticiel :

  • Detailed description of the function of each organelle within cells is discussed.
  • The role of the nucleus as a command center will be covered along with the location of the cellular DNA within chromosomes.
  • Carte conceptuelle montrant les interconnexions des nouveaux concepts de ce didacticiel et de ceux présentés précédemment.
  • Les diapositives de définition présentent les termes selon les besoins.
  • Visual representation of concepts.
  • Des exemples sont donnés tout au long pour illustrer comment les concepts s'appliquent.
  • Un résumé concis est donné à la fin du tutoriel.

The definition of a cell: The smallest unit of an organism that can live independently.
The nucleus of the cell:

  • Noyau
  • Nucléole
  • Nuclear envelope
  • Chromsomes
  • Appareil de Golgi
  • Lysosome
  • Smooth endoplasmic reticulum
  • Mitochondria
  • Noyau
  • Ribosomes
  • Rough endoplasmic reticulum
  • Provides a stable internal cell
  • Transport across the cell
  • Prokaryotic vs. Eukaryotic
  • Cell Levels of Organization.

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Kinase

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Kinase, an enzyme that adds phosphate groups (PO4 3− ) to other molecules. A large number of kinases exist—the human genome contains at least 500 kinase-encoding genes. Included among these enzymes’ targets for phosphate group addition ( phosphorylation) are proteins, lipids, and nucleic acids.

For protein targets, kinases can phosphorylate the amino acids serine, threonine, and tyrosine. The reversible phosphorylation of proteins, by the antagonistic (opposing) action of kinases and phosphatases, is an important component of cell signaling because the phosphorylated and unphosphorylated states of the target protein can have different levels of activity. Edwin Gerhard Krebs and Edmond H. Fischer received the Nobel Prize for Physiology or Medicine in 1992 for their work in establishing this paradigm.

Phosphorylation of lipid molecules by kinases is important for controlling the molecular composition of membranes in cells, which helps to specify the physical and chemical properties of the different membranes. Inositol, a compound similar in structure to a carbohydrate, is phosphorylated by kinases to create a diverse array of phosphoinositol and phosphoinositide lipids. These molecules then function as second messengers to propagate signaling information throughout the cell.

Nucleotides, the fundamental units of RNA (ribonucleic acid) and DNA (deoxyribonucleic acid), contain a phosphate molecule attached to a nucleoside, a compound made up of a ribose moiety and a purine or pyrimidine base. In polymers of RNA and DNA, the backbone is composed of repeating phospho-ribose units. Kinases attach the phosphate to the nucleoside, creating a nucleotide monophosphate. For example, an enzyme called nucleoside phosphorylase serves this role when cells switch to synthesizing nucleotides from recycled purines instead of from new starting materials. Mutations in the gene encoding nucleoside phosphorylase can cause a severe form of immune deficiency.

Metabolism of dietary sugars ( glycolysis) involves several different steps of phosphorylation by distinct kinases. These phosphate groups are ultimately used to form the high-energy compound known as ATP (adenosine triphosphate).

Inhibitors of kinases can be important treatments for human diseases in which hyperactive processes need to be dampened. For example, one form of human leukemia, CML ( chronic myelogenous leukemia), is caused by excess activity of the Abelson tyrosine kinase. Imatinib (Gleevec) is a chemical that binds to the active site of this kinase, thereby blocking the enzyme’s ability to phosphorylate targets. Imatinib has been useful in the initial treatment of CML however, in many cases the kinase enzyme mutates, rendering the drug ineffective.


Voir la vidéo: Proteiinit rakenne (Décembre 2022).