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L'expression de GroEL et GroES dans les érythrocytes serait-elle une thérapie potentiellement efficace pour la drépanocytose ?

L'expression de GroEL et GroES dans les érythrocytes serait-elle une thérapie potentiellement efficace pour la drépanocytose ?


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L'expression de GroEL et GroES dans les érythrocytes serait-elle une stratégie thérapeutique potentiellement efficace pour la drépanocytose ? Pourquoi ou pourquoi pas?


  1. GroEL et GroES sont des complexes multiprotéiques de chaperonine : pas si faciles à exprimer ectopiquement
  2. Les érythrocytes n'ont pas de noyau : vous ne pouvez rien exprimer de manière stable dans les érythrocytes matures.
  3. Si votre objectif est de faire une expression génique stable (ce qui nécessiterait une intégration génomique), le mieux est de faire une thérapie génique : culture de cellules souches hématopoïétiques, Corriger la mutation par recombinaison homologue. Remettez les cellules dans la moelle osseuse.

Hydrophobie : un ancien modèle moléculaire associé aux dommages qui initie des réponses immunitaires innées

On pense actuellement que les réponses immunitaires sont déclenchées par des schémas moléculaires associés aux agents pathogènes ou par des signaux de danger/d'alarme dérivés des tissus. Ici, nous proposons que ces deux groupes de molécules pourraient ne pas être mutuellement exclusifs. Beaucoup d'entre eux pourraient faire partie d'un système d'alerte évolutif ancien dans lequel les parties hydrophobes des molécules biologiques agissent, lorsqu'elles sont exposées, en tant que modèles moléculaires universels associés aux dommages pour initier la réparation, le remodelage et l'immunité.


Application du génie génétique au développement de produits biothérapeutiques

Les progrès du génie génétique ont eu un impact profond sur l'industrie biothérapeutique et ont façonné de nombreuses méthodes et stratégies utilisées aujourd'hui pour la bioproduction et la conception thérapeutique. Des améliorations du rendement et de la qualité de la production ont été obtenues en manipulant l'expression des gènes impliqués dans la survie cellulaire, le métabolisme, la sécrétion et la glycosylation, entre autres, et les récentes percées dans les essais cliniques de thérapie génique sont très prometteuses pour l'avenir. Ici, nous passons en revue les outils actuels d'édition du génome utilisés dans le domaine et examinons les principaux domaines de recherche pour la bioproduction d'hôtes microbiens et mammifères ainsi que les progrès des thérapies génétiques et cellulaires.

Méthodes

Nous avons résumé les méthodes d'édition de gènes utilisées à la fois pour la bioproduction à base de procaryotes et d'eucaryotes et avons fourni un bref aperçu des approches cliniques pour la thérapie génique.

Résultats

Alors que les premiers progrès du génie génétique ont créé des cellules hôtes procaryotes idéales pour la bioproduction, l'avènement des nucléases programmables a considérablement élargi l'utilité des hôtes eucaryotes pour la production de glycoprotéines, permettant un contrôle plus précis de ces usines cellulaires. Ces mêmes outils ont également créé de nouvelles opportunités pour la création de thérapies basées sur la thérapie génique avec plusieurs essais cliniques en cours.

Conclusion

Le génie génétique a changé le paysage biothérapeutique et créé de nouvelles avenues pour la bioproduction et la conception thérapeutique.


Résumé—La façon dont une cellule réagit au stress est un problème central en biologie cardiovasculaire. Divers stress physiologiques (par exemple, la chaleur, l'hémodynamique, les protéines mutantes et les lésions oxydatives) produisent de multiples changements dans une cellule qui affectent finalement les structures et la fonction des protéines. Les cellules de différents phylums initient une cascade d'événements qui engagent des protéines essentielles, les chaperons moléculaires, dans les décisions de réparer ou de dégrader les protéines endommagées comme stratégie de défense pour assurer la survie. Les preuves accumulées indiquent que les chaperons moléculaires tels que la famille de choc thermique des protéines de stress (HSP) participent activement à un éventail de processus cellulaires, y compris la cytoprotection. La polyvalence de la famille HSP omniprésente est encore renforcée par les réseaux de régulation inductibles par le stress, à la fois au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel. Dans la présente revue, nous discutons de la régulation et de la fonction des chaperons HSP et de leur signification clinique dans des conditions telles que l'hypertrophie cardiaque, les lésions de la paroi vasculaire, la chirurgie cardiaque, le préconditionnement ischémique, le vieillissement et, éventuellement, des mutations dans les gènes codant pour les protéines contractiles et les canaux ioniques. .

Les stress physiologiques allant de l'ischémie myocardique aux mutations génétiques produisent des états pathologiques dans lesquels les dommages aux protéines et les structures protéiques mal repliées sont un dénominateur commun. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Comment la cellule réagit-elle ? De multiples voies endogènes sont engagées dans la restauration de l'homéostasie cellulaire, mais un mécanisme bien caractérisé qui implique le repliement des protéines est la famille de choc thermique des protéines de stress, ou HSP. 10 11 Un aperçu des mécanismes sous-jacents à la fonction HSP est fourni par 2 principaux éléments de preuve : (1) le repliement correct de nombreuses protéines dans une cellule nécessite une machinerie de repliement des protéines, les chaperons moléculaires, 12 13 et (2) les chaperons HSP réparent les dénaturés protéines ou favoriser leur dégradation après choc thermique. 14 15

Les études génétiques fournissent une preuve convaincante dans différents phylums que la surexpression des protéines de stress est un puissant moyen de cytoprotection, même dans le cœur intact. 10 16 17 18 De même, des études biochimiques ont démontré que le chaperon Hsc70 augmente le repliement productif de la mutation commune ΔF508 de CFTR. Cela suggère un rôle physiologique d'un chaperon HSP dans les maladies humaines. 19 20 Des mécanismes divergents qui produisent des protéines cellulaires anormales ou mal repliées convergent vers une voie commune, conduisant à une augmentation des niveaux de protéines de stress cytoprotectrices, qui diminuent ou neutralisent les effets délétères des stress aigus ou chroniques.

Dans cette revue, nous résumons les connaissances actuelles sur la régulation et la fonction des chaperons individuels (par exemple, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp47, Hsp27 et B-crystallin) dans le système cardiovasculaire. Outre leurs rôles bien établis dans la survie cellulaire (nécrose et apoptose), nous mettrons l'accent sur les preuves émergentes concernant les fonctions de chaperon dans l'adaptation physiologique au cours de l'hypertrophie cardiaque, du préconditionnement ischémique, des lésions de la paroi vasculaire, du stress oxydatif et du vieillissement. Bien que nous ne puissions actuellement que spéculer sur leurs rôles dans des maladies cardiaques spécifiques, nous discuterons de nombreuses opportunités potentielles pour établir si les chaperons HSP exercent un effet ou jouent un rôle physiologique direct dans l'histoire naturelle des maladies résultant de mutations de l'appareil contractile cardiaque ( ex., cardiomyopathie hypertrophique) et des canaux ioniques (par ex., syndrome du QT long) chez l'homme.

Définitions et nomenclature

Que sont les protéines de stress « de choc thermique » ?

Le terme protéine de « choc thermique » est impropre, mais reste un héritage de la découverte fortuite de Ritossa 21 selon laquelle le choc thermique produisait des bouffées chromosomiques de cellules des glandes salivaires dans Drosophile. Le stress thermique (≈5° au-dessus de la température de croissance normale) régule positivement la synthèse rapide d'une famille multigénique de protéines, appelées à l'origine protéines de choc thermique, 22 qui sont le résultat d'une réponse souvent appelée réponse au choc thermique. 10 21 Le stress thermique sublétal antérieur augmente de manière transitoire la capacité d'une cellule à résister à un défi thermique ultérieur par ailleurs mortel. Ce phénomène, ou thermotolérance, a joué un rôle clé dans le lancement de nombreuses études dans des modèles expérimentaux in vitro et in vivo dans lesquels une association similaire a été trouvée entre la réponse au choc thermique et la protection contre l'hypoxie ou l'ischémie simulée. En effet, divers stress, notamment les métaux lourds, les analogues d'acides aminés, l'inflammation et le stress oxydatif/ischémique, induisent l'expression des gènes HSP. Par conséquent, les termes « protéines de stress » ou « famille de choc thermique de protéines de stress » sont préférés, bien que beaucoup de ces protéines aient des fonctions essentielles dans des conditions non stressées. 13

Les protéines de stress appartiennent à des familles multigéniques dont la taille moléculaire varie de 10 à 150 kDa et se trouvent dans tous les principaux compartiments cellulaires. La convention consiste à nommer les protéines de stress de différentes tailles moléculaires comme suit : Hsp27, Hsp70 et Hsp90, tandis que les gènes des protéines de choc thermique sont désignés comme suit : hsp27, hsp70 et hsp90. 23 La distinction entre les membres exprimés de manière constitutive (p. dépendent de l'expression restreinte aux cellules et aux tissus.

Les conséquences cellulaires de la chaleur et du stress ischémique sont similaires

Comme l'ischémie/reperfusion expérimentale, le choc thermique est un stress qui perturbe de nombreux processus métaboliques et structures cellulaires et qui aboutit à la mort cellulaire lorsqu'un seuil critique est dépassé. 10 24 25 Le stress thermique et l'ischémie causent des dommages importants au cytosquelette, y compris l'effondrement du réseau de filaments intermédiaires filiformes en grands agrégats périnucléaires, la réorganisation du réseau cytoplasmique, la relocalisation des fibres contenant de l'actine autour du noyau et la perturbation des microtubules et de la fuseau mitotique. 26 27 Le gonflement mitochondrial, la perte des mitochondries et le découplage de la phosphorylation oxydative sont des caractéristiques similaires du choc thermique et des lésions ischémiques réversibles précoces. 28 29 30

De manière caractéristique, la synthèse générale des protéines est inhibée après un défi thermique extrême en raison de la phosphorylation de facteurs d'initiation tels que eIF2α, qui perturbe l'assemblage ribosomique et inactive les protéines de liaison à la coiffe. 31 32 33 En revanche, les gènes HSP sont efficacement exprimés après une provocation thermique, en partie en raison de l'absence d'introns dans plusieurs gènes inductibles (par exemple, hsp70). De plus, les altérations de l'épissage de l'ARNm et la stabilisation induite par la chaleur de l'ARNm sont des mécanismes adaptatifs utilisés pour traduire efficacement les protéines de stress, qui peuvent atteindre 15 à 25 % de la protéine intracellulaire totale en quelques minutes après le stress physiologique dans ces conditions. 10 34 Par coïncidence, plusieurs chaperons cytosoliques se déplacent dans le noyau, 35 où l'inhibition induite par la chaleur de l'assemblage de la chromatine de l'ADN expose une conformation sensible à la nucléase, une caractéristique pathognomonique de l'apoptose induite par la chaleur et l'ischémie. 36 Des changements moins spectaculaires sont observés dans les protéines membranaires intégrales, la bicouche lipidique et la morphologie de la surface cellulaire. L'arrêt des stimuli nocifs est suivi d'une dégradation rapide et efficace des ARNm de Hsp. 37 38 39

Comme mentionné précédemment, un stress thermique sublétal antérieur ou « préconditionnement hyperthermique » atténue profondément tous les changements cellulaires induits par la chaleur à un défi thermique sévère ultérieur. De plus, le prétraitement à la chaleur produit une « tolérance croisée » à divers types de stress physiologique. Par exemple, la protection du cœur ischémique intact après un prétraitement thermique peut durer des heures, voire des jours. 40 41 Les connaissances acquises sur les rôles physiologiques de l'expression de Hsp pendant la réponse au choc thermique ont contribué aux réflexions actuelles sur les fonctions chaperon dans les états pathologiques susceptibles d'entraîner un repliement anormal des protéines.

L'attention s'est principalement concentrée sur l'induction de chaperons HSP et les mécanismes de réparation potentiels impliqués dans l'atténuation des lésions d'ischémie/reperfusion. La figure 1 résume schématiquement bon nombre de ces concepts et illustre les multiples mécanismes bien connus impliqués dans les lésions myocardiques ischémiques, notamment le stress/dommages oxydatifs, la surcharge en calcium et les protéases activées, la libération d'enzymes protéolytiques et lysosomales, les altérations du cytosquelette et l'activation du complément.

Divers stress physiologiques induisent l'expression du gène HSP via un mécanisme commun

L'induction rapide de l'expression des protéines de stress est réalisée par des mécanismes d'activation transcriptionnelle et de traduction préférentielle. 10 42 HSF (HSF1 à HSF4) régulent la synthèse inductible des HSP pendant le développement, la croissance et l'adaptation. 42 43 44 Alors que les gènes essentiels à copie unique codent pour HSF dans Saccharomyces cerevisiae et Drosophile, 45 46 HSF multiples ont été identifiés chez les poussins, les plantes, les souris et les humains. 47 48 49 50 51 Deux HSF (HSF1 et HSF2, codant pour des protéines de 75 et 72 kDa, respectivement) ont été identifiées chez la souris. 49 Ni HSF1 ni HSF2 ne sont inductibles par la chaleur, mais HSF1 est hyperphosphorylé dans un ras-dépendante par les membres des sous-familles MAPK (ERK1, JNK/SAPK et protéine kinase p38) lors d'un stress physiologique. 52 53 Dans des conditions non stressées, l'activité de liaison à l'ADN et l'activité transcriptionnelle de vertébrés HSF1 sont sous contrôle négatif strict (examiné dans la référence 44 44 ). Cependant, il reste controversé si la répression par le chaperon Hsp70, la séquestration de la phosphorylation constitutive sur les résidus de sérine ou des régulateurs inhibiteurs inconnus sont les principaux mécanismes sous-jacents à l'activation inductible par le stress et à la désactivation rapide de HSF1. 43 54 55 56

Des études antérieures ont démontré qu'en réponse à la fois à la chaleur et à l'ischémie simulée, le ou les mécanismes d'activation de HSF1 sont similaires, voire identiques, dans les cellules myogéniques 57 et que l'épuisement de l'ATP intracellulaire joue un rôle important dans le déclenchement de la liaison HSF1-ADN. activité. 58 Dans des conditions pathologiques, on pense que les inducteurs de l'activation de HSF1, tels que les LDL oxydés et les intermédiaires azotés réactifs, augmentent les dommages aux protéines, ce qui déclenche une régulation positive de l'expression du gène HSP. 59 60 61 Cependant, l'activation transcriptionnelle de la voie HSF1 ne nécessite pas de nouvelle synthèse protéique, puisque le transactivateur préexistant (HSF1) est inactif à l'état non stressé. 43 56 57 Les stress physiologiques, tels que la chaleur et l'ischémie, induisent l'oligomérisation des monomères HSF1 en homotrimères, qui se lient ensuite à un motif spécifique à la séquence en amont, l'élément de choc thermique, dans le promoteur de tous les gènes HSP inductibles par le stress 62 63 (Figure 1I jusqu'à 1K). Nous avons récemment établi un modèle de knock-out du gène de Hsf1 et démontré dans des études in vitro l'exigence essentielle de cette voie régulatrice dans la défense cellulaire et la thermotolérance. 36 De plus, l'expression des protéines de stress a été impliquée dans la promotion de la survie des cellules tumorales 64 et la protection du cœur ischémique. 16 17 18

La surexpression des protéines de stress améliore la vitesse de récupération physiologique du cœur ischémique

Une littérature substantielle décrit l'induction de Hsp70 par l'ischémie, 57 65 66 le rôle potentiel de Hsp70 dans le préconditionnement ischémique, 40 67 et une corrélation inverse entre l'expression de Hsp70 induite par le préconditionnement ischémique ou thermique et la taille de l'infarctus dans les modèles animaux. 41 68 69 70 De plus, l'expression forcée de Hsp70 confère un effet cytoprotecteur dans les cellules en culture, y compris les myocytes cardiaques soumis à une ischémie simulée. 71 72 Plus précisément, la surexpression de la principale protéine de choc thermique de 70 kDa (Hsp70) chez les souris transgéniques améliore la fonction myocardique, 16 17 18 préserve la récupération fonctionnelle métabolique, 18 et réduit la taille de l'infarctus 73 après ischémie/reperfusion. En plus de Hsp70, Hsp27 et αB-cristalline peuvent protéger les cardiomyocytes primaires contre les dommages ischémiques. 74 Bien que les mécanismes précis soient insuffisamment compris, on pense que les protéines de stress interviennent dans la cardioprotection grâce à leurs fonctions biologiques de chaperons moléculaires.

Les protéines de stress peuvent fonctionner comme chaperons moléculaires

Les chaperons moléculaires, comme Hsp70 et αB-crystallin, sont des protéines qui facilitent le repliement, l'assemblage et le désassemblage d'autres protéines mais ne font pas partie du produit fini. 75 Comme de nombreuses protéines nécessitent des chaperons pour se replier, ces protéines sont des composants essentiels dans l'étape finale du dogme central de la biologie moléculaire : ADN↔ARN→polypeptide→protéine repliée. 11 75 Les chaperons in vitro empêchent l'agrégation d'autres protéines dans des conditions de stress et favorisent la restauration de l'activité enzymatique des substrats protéiques dénaturés ou des enzymes (par exemple, citrate synthase, -galactosidase ou luciférase) lors de l'élimination du stress. 11 13 76

La figure 2 montre schématiquement le cycle de réaction du chaperon Hsc70 en relation avec des cochaperons et des substrats moléculaires récemment identifiés dans la cellule. Par exemple, le chaperon Hsp40 joue une fonction catalytique majeure dans le chargement des substrats cibles sur le cycle de liaison/libération de Hsc70. 77 Bien que les mécanismes de ces fonctions soient encore en train d'émerger, les principales fonctions des chaperons moléculaires sont (1) de se lier de manière transitoire et de retarder le repliement des chaînes polypeptidiques naissantes jusqu'à ce que la synthèse soit terminée, (2) de maintenir les chaînes polypeptidiques dans une conformation appropriée adaptée à la translocation. à travers les membranes des organites, (3) empêchent l'agrégation des interactions intramoléculaires ou intermoléculaires, (4) désassemblent activement les vésicules recouvertes de clathrine, (5) maintiennent les complexes aporécepteurs stéroïdes dans des états compétents pour les ligands (Hsp90 et cochaperone) et (6) aident à dégrader les substances toxiques métabolites en favorisant l'ubiquination et la lyse du protéasome 78 (Figure 1L à 1P).

Le cas des chaperons moléculaires dans les maladies cardiaques

L'intérêt clinique généralisé pour les fonctions biologiques des chaperons moléculaires s'étend sur une gamme de pathologies humaines allant des maladies dégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, les prions, l'amylose, la formation de cataracte, la drépanocytose, la mucoviscidose et diverses maladies cardiaques, y compris l'ischémie myocardique. Des événements précoces qui rétablissent le reflux opportun du myocarde ischémique soit par thrombolytiques, angioplastie directe ou lyse spontanée du caillot sont essentiels pour améliorer la récupération myocardique et réduire la morbidité et la mortalité. 79 80 Néanmoins, une ischémie récurrente due à la rupture d'une plaque instable ou à une insuffisance cardiaque congestive peut compliquer l'évolution clinique d'un infarctus aigu du myocarde. Dans l'infarctus du myocarde aigu non compliqué, la récupération physiologique au niveau cellulaire commence en quelques minutes mais peut durer des semaines à des mois avant que la réparation myocardique ne soit terminée. Ainsi, les mécanismes de protection endogènes ont une pertinence clinique pour atténuer les effets de la cardiopathie ischémique.

Activités biochimiques de la voie régulatrice du HSP et des chaperons au cours de l'ischémie myocardique

Dans des travaux antérieurs entrepris pour définir le stimulus immédiat de l'activation de HSF, nous avons observé qu'une acidose intracellulaire sévère (pH 6,7) était insuffisante pour induire la liaison à l'ADN de HSF1 dans des cellules myogéniques cultivées exposées à une ischémie simulée, si les réserves d'ATP étaient préservées. 58 En revanche, une déplétion sévère en ATP (65 %) a stimulé la liaison à l'ADN de HSF1, même si le pH était maintenu dans la plage normale. 58 Dans le cœur ischémique intact, 15 minutes d'ischémie, qui produit une lésion réversible, sont associées à une réduction similaire (65 %) des réserves d'ATP à haute énergie, tandis qu'une lésion mortelle est observée avec une ischémie prolongée (>40 minutes) et une déplétion >90 % de piscines à haute énergie. 81 Le Km car la faible activité ATPase de la Hsc70 bovine est de 1 à 2 mol/L, soit 3 ordres de grandeur en dessous des concentrations millimolaires des pools de nucléotides d'adénine intracellulaire.75 Par conséquent, il est peu probable que l'activation dépendante de l'ATP de la voie de régulation HSF1 et les propriétés biochimiques des chaperons moléculaires soient affectées négativement pendant les périodes d'ischémie transitoire ou de lésion ischémique myocardique réversible.

La preuve de principe indiquant un effet cardioprotecteur de la Hsp70 chez les animaux transgéniques soumis à une ischémie/reperfusion suggère que des méthodes pharmacologiques ou génétiques pour augmenter l'expression des protéines de stress dans le myocarde des patients à risque d'événements ischémiques aigus pourraient limiter les lésions ischémiques. 82 Cependant, des connaissances de base supplémentaires sont nécessaires concernant (1) leurs relations avec d'autres voies endogènes impliquées dans la protection du myocarde contre le stress/les dommages oxydatifs, (2) la spécificité fonctionnelle parmi les chaperons de la famille multigénique HSP, et (3) la contribution de cette voie pendant l'ischémie aiguë et d'autres états physiologiques qui déclenchent la réponse au choc thermique, avant l'application clinique.

Protéines de stress et voies antioxydantes pour la cardioprotection

Depuis les années 1970, l'hypothèse selon laquelle les piégeurs de radicaux libres peuvent améliorer les dommages oxydatifs au cours de l'ischémie/reperfusion a été poursuivie par les cliniciens et les chercheurs. 83 Dans les systèmes modèles allant du transgénique Drosophile chez la souris, la surexpression de la catalase, de la superoxyde dismutase ou de la glutathion peroxydase a tendance à protéger contre le stress oxydatif. 84 85 86 Le stress oxydatif, dû à l'ischémie/reperfusion, joue également un rôle central dans les lésions d'organes vitaux tels que le cerveau, les reins et le cœur. On pense que les ROS contribuent au dysfonctionnement ventriculaire, ou « étourdissement du myocarde », aux arythmies et aux dommages cellulaires progressifs ou à la mort après une lésion ischémique (Figure 1). 87 88 89 90

Des résultats discordants ont été rapportés lors de tentatives d'administration d'antioxydants pendant et après une ischémie/reperfusion myocardique. 91 92 Les antioxydants exogènes, qui sont limités aux espaces interstitiels, peuvent avoir une capacité limitée à protéger les protéines intracellulaires contre les ROS. Par exemple, le radical libre hydroxyle (·OH), considéré comme le principal agent des dommages oxydatifs, est si hautement réactif avec un substrat typique que sa demi-vie à 37°C est de 7 x 10 -10 secondes. 93 Ainsi, il est difficile d'envisager que l'administration d'antioxydants exogènes, à des concentrations physiologiquement réalisables, puisse prévenir efficacement les dommages macromoléculaires induits par ·OH. Une stratégie potentiellement plus efficace peut consister à minimiser physiologiquement la production de ·OH. En effet, la surexpression des membres de la famille HSP peut fournir une telle avenue. Plusieurs études ont rapporté que pendant la protection contre l'ischémie myocardique, la régulation à la hausse des niveaux de protéines de stress est en corrélation avec des augmentations de l'activité enzymatique de la catalase, suggérant des interactions additives ou synergiques potentielles de ces voies endogènes contre le stress oxydatif. 40 94 95 Une question importante sans réponse est de savoir si les fonctions des protéines de stress, en tant que chaperons moléculaires, complètent les fonctions uniques des enzymes antioxydantes dans la protection contre le stress/les dommages oxydatifs.

Chaperons moléculaires des compartiments cytosol/nucléaire

Le tableau montre les principales classes de HSP, les compartiments intracellulaires, leurs fonctions putatives et leur importance potentielle en biologie cardiovasculaire.

Hsp70 Chaperons

Les membres de la famille Hsp70 sont le groupe le plus étudié et le plus abondant dans les cellules eucaryotes. 96 Dans le cytosol, Hsp70 se lie aux polypeptides naissants avant leur libération du ribosome. 97 Tous les membres de la classe chaperon Hsp70 possèdent deux domaines distincts : un domaine ATPase N-terminal hautement conservé et un domaine C-terminal plus divergent, qui lie de courts peptides hydrophobes des substrats cibles 98 99 (figure 2A). La fonction chaperon Hsp70 nécessite le domaine ATPase N-terminal, qui, de manière intéressante, est structurellement similaire à l'actine du muscle squelettique du lapin malgré une faible similitude de séquence. 100

Ces relations structure/fonctionnelle de Hsp70 confèrent probablement une activité de chaperon in vivo en cardioprotection. À cet égard, pratiquement rien n'est connu sur le chaperon constitutif Hsc70, qui partage une homologie de séquence > 80 % avec Hsp70. En théorie, une régulation positive modeste de la Hsc70 constitutive pourrait favoriser un bénéfice cardioprotecteur substantiel. Cependant, la régulation à la hausse des HSP au-delà d'un seuil critique peut avoir des conséquences cellulaires délétères. 101 Des fonctions distinctes entre les membres de Hsp70 ont été signalées récemment comme existant dans des régions en dehors du domaine de liaison peptidique, suggérant des niveaux supplémentaires de complexité pour les fonctions de chaperon in vivo. 102

Hsp90 Chaperons

La figure 2 montre que le chaperon Hsp90 est un composant du cycle de réaction impliquant le complexe chaperon Hsc70 et des protéines nouvellement synthétisées. De plus, les membres de la famille Hsp90, Hsp90α et Hsp90β, qui constituent 1% à 2% des protéines cytoplasmiques solubles totales, ont les relations fonctionnelles in vivo les mieux caractérisées avec des protéines cibles, les récepteurs d'hormones stéroïdes. 103 Hsp90 avec des partenaires chaperons, Hsp70 et Hsp56, se lie directement, stabilise et maintient le complexe aporécepteur dans une conformation inactive. La liaison du ligand (par exemple, l'œstrogène) au complexe aporécepteur déclenche l'hydrolyse de l'ATP par Hsp90, qui se dissocie d'un récepteur « activé » qui peut désormais se lier au motif de reconnaissance spécifique à la séquence et induire la transcription des gènes cibles. 104 De plus, des niveaux élevés d'expression de Hsp90 déstabilisent le complexe récepteur d'œstrogène/élément sensible aux œstrogènes et régulent à la baisse l'expression du gène cible sensible aux œstrogènes, indiquant une boucle de rétroaction régulatrice. 105

Les fonctions chaperon Hsp90 sont médiées par des voies de transduction du signal impliquant diverses protéines kinases de types tyrosine et sérine-thréonine, la caséine kinase II, l'eIF-2α régulée par l'hème et diverses autres protéines cellulaires, telles que la calmoduline, l'actine et la tubuline (examiné dans la référence 106 106 ). Enfin, les chaperons Hsp90 de Saccharomyces cerevisiae sont essentiels à la survie dans toutes les conditions, soutenant leurs rôles physiologiques importants chez les eucaryotes inférieurs. 107

Chaperons cytosoliques d'intérêt particulier en biologie cardiaque et vasculaire

Contrairement aux homologues omniprésents Hsp70 et Hsp90, des membres spécifiques des petites HSP MW (HO-1 ou Hsp32, Hsp27, αB-crystallin et Hsp20 chaperons) présentent une expression tissulaire restreinte, suggérant des propriétés spécialisées potentielles dans le système cardiovasculaire.

HO inductible (Hsp32)

HO est l'enzyme limitant la vitesse de dégradation de l'hème en biliverdine (un puissant antioxydant), en fer moléculaire et en monoxyde de carbone. Trois gènes apparentés à copie unique codent pour les isoformes HO : HO-1, HO-2 et HO-3. 108 109 110 HO-1 est une véritable protéine de stress de 32 kDa (Hsp32) induite par divers stress physiologiques, notamment l'hypoxie, l'ischémie/reperfusion, l'hémine, le peroxyde d'hydrogène et plusieurs métaux lourds (sélénium, arsénite, cobalt, cadmium , et les ions stanneux). 108 109 110 La Hsp32 inductible (HO-1), l'isoforme la plus largement exprimée, est présente dans les cellules du myocarde. 111

Hsp32, comme la forme inductible de la NO synthase, médie l'inhibition plaquettaire dépendante de la guanylyl cyclase et la vasodilatation des CMLV. 112 113 114 Cependant, les forces hémodynamiques physiologiquement pertinentes (stress de cisaillement et contrainte cyclique) induisent l'expression de l'ARNm de HO-1 mais pas l'expression inductible de la NO synthase, suggérant une spécificité de cette voie de réponse au stress par rapport aux signaux physiologiques. 115 Le NO libéré de manière endogène ou administré de manière exogène induit une augmentation de 3 à 6 fois de l'expression du gène Hsp32 (HO-1) et de la production de CO dans les CMLV. expression et production de CO dans les CMLV aortiques. 115 Dans les CMLV de rat, le traitement à l'angiotensine II diminue l'expression de l'ARNm de Hsp32 (HO-1) d'une manière dépendante du calcium. 117 Cependant, l'hypertension induite par l'angiotensine II augmente l'expression de l'ARNm de Hsp32 (HO-1) dans l'aorte du rat, suggérant l'influence prépondérante des facteurs hémodynamiques in vivo. 118

Plusieurs voies régulatrices sont impliquées dans l'induction de l'expression du gène Hsp32, notamment les voies HSF1 et du facteur de transcription 1 inductible par l'hypoxie. 119 120 121 122 Bien qu'il n'y ait pas de preuve directe d'une fonction chaperon de Hsp32, sa surexpression dans plusieurs types de cellules protège contre le stress/les dommages oxydatifs. 123 124 125 En conséquence, des études visant à définir les voies régulatrices précises stimulées par les métaux lourds, l'hypoxie et le stress oxydatif pourraient fournir un nouvel aperçu des rôles biologiques de Hsp32 (HO-1) dans la modulation du stress oxydatif/des dommages pendant l'ischémie/la reperfusion, le tonus vasculaire (par exemple, l'hypertension) et l'inhibition de l'agrégation plaquettaire et/ou de la prolifération des CMLV après angioplastie par ballonnet.

Hsp25/27 Chaperon

Après sa découverte en tant qu'inhibiteur de la polymérisation de l'actine, il a été démontré que 126 chaperone Hsp 25/27 (Hsp25 chez la souris et Hsp27 chez l'homme) joue un rôle majeur dans la dynamique des filaments d'actine dans divers types cellulaires. Les stimuli physiologiques (stress oxydatif, cytokines et facteurs de croissance) augmentent considérablement la phosphorylation de la Hsp27 humaine au niveau des résidus Ser15, Ser78 et Ser83, ce qui est essentiel pour la tolérance acquise. 127 128 129 La phosphorylation de Hsp25/27 est catalysée par les MAPK (p38-MAPK, JNK ou SAPK) et ERK. 130 Dans le cœur adulte perfusé, p38-MAPK et JNK/SAPK sont activés après ischémie/reperfusion. 131 En réponse au traitement par ROS, l'activation de p38-MAPK augmente l'activité de la MAPKAP kinase 2, qui phosphoryle Hsp27. 132

Dans les cellules endothéliales humaines, l'inhibition de l'activation de p38-MAPK induite par le facteur de croissance endothélial vasculaire abolit la phosphorylation de Hsp27, la polymérisation de l'actine et la migration cellulaire, suggérant un lien possible entre Hsp27 et l'angiogenèse. 133 Ensemble, les preuves disponibles placent la p38-MAPK en tant qu'activateur en amont de la phosphorylation Hsp25/27 inductible par le stress, et cette voie sous-tend l'effet de la p38-MAPK sur la réorganisation de l'actine filamenteuse, l'accumulation de fibres de stress et le recrutement de vinculine. au niveau des sites d'adhésion focale. 134 Il sera ensuite important de déterminer si Hsp25/27 exerce des actions vasoprotectrices en réponse aux forces hémodynamiques ou aux lésions de la paroi vasculaire. Cependant, l'analyse directe nécessitera probablement un modèle de knock-out du gène Hsp27.

ΑB-Crystallin Chaperon (Hsp22)

Alors que Hsp27 est détectée dans les cellules endothéliales, les CMLV et les cardiomyocytes, le chaperon αB-cristalline est exprimé uniquement dans les cardiomyocytes. 135 Hsp27 et αB-crystallin sont des HSP de bonne foi structurellement apparentées avec une activité de chaperon in vitro mais, contrairement à Hsp70, ne sont pas des protéines de liaison à l'ATP. 136 137 138 139 L'intérêt accru pour la régulation et la fonction de la protéine cristalline αB (Hsp22), une protéine structurelle majeure du cristallin oculaire, est lié à son expression tissulaire restreinte dans les lignées myogéniques striées à haute capacité oxydative, comme le cœur et les fibres musculaires squelettiques de type I. 140 Dans les tissus non lenticulaires, l'expression postnatale de la cristalline αB augmente et atteint ses niveaux les plus élevés dans le cœur adulte (≈1 % à 3 % de la protéine soluble totale), suivie par le muscle squelettique et le rein. 140 Des études immunohistochimiques antérieures ont localisé l'expression la plus élevée de αB-cristalline dans les fibres de conduction cardiaque du cœur adulte. 141 On ignore actuellement si une altération de l'expression de la cristalline αB pourrait entraîner des anomalies du système de conduction, mais soulève une possibilité intrigante.

Bien que l'expression de la cristalline αB ait été localisée dans les bandes Z du cytosquelette, selon un schéma similaire à celui de la desmine et de l'actine, 142 études récentes suggèrent que cette interaction est beaucoup plus transitoire et dynamique par rapport aux cibles intracellulaires, en fonction des conditions physiologiques. Dans les myocytes cardiaques non stimulés, des études biochimiques indiquent que la cristalline B est hautement soluble et reste dans la fraction cytosolique. 142 et IJ Benjamin, données non publiées, 1998). La signification physiologique de la tendance de la αB-cristalline et de la Hsp25/27 à former de grands complexes hétéro-oligomères (500 à 800 kDa) à la fois in vivo et in vitro après des stress physiologiques reste un mystère. 143 144 Bien que le chaperon αB-cristalline fournisse une cytoprotection aux cardiomyocytes, 74 les mécanismes de régulation des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, la glycation et la désacétylation sur la fonction αB-cristalline attendent une analyse directe dans le système cardiovasculaire.

Protéines de stress et développement et différenciation des muscles striés

L'augmentation de l'expression du chaperon HSP à faible poids moléculaire a été décrite au cours de périodes associées à une synthèse protéique accrue, à une dégradation des protéines et à une réorganisation cellulaire, telles que la différenciation myogénique et l'embryogenèse. 145 L'expression tissulaire restreinte de la cristalline αB au cours de la myogenèse du muscle squelettique peut nécessiter la famille MyoD de facteurs de transcription basiques en hélice-boucle-hélice, qui se lient à l'activateur essentiel de la boîte E contenu dans le promoteur de la cristalline αB. 146 147 Nous avons récemment rapporté que l'expression de la cristalline αB, mais pas de Hsp27, est directement liée à l'augmentation du métabolisme oxydatif dans le muscle squelettique après une stimulation nerveuse chronique. 148 Cependant, le rôle physiologique de la régulation positive de l'expression de Hsp27, qui précède la différenciation précoce des cellules souches embryonnaires murines, reste à établir dans les lignées myogéniques. 149

On en sait beaucoup moins sur les mécanismes de régulation impliqués dans l'expression restreinte de la cristalline αB dans les myocytes cardiaques. La αB-Crystallin est abondamment exprimée au début du développement cardiaque à partir du 8,5e jour embryonnaire, suggérant un rôle soit en tant que protéine structurelle, soit en tant que chaperon moléculaire dans la stabilisation des myofibres. 150 Étant donné que les facteurs de type Myo-d sont absents dans le cœur, des études de liaison in vitro d'extraits nucléaires cardiaques ont impliqué les activités transcriptionnelles d'un facteur de stimulation en amont au niveau de l'élément E-box et du facteur de réponse sérique au niveau d'une boîte CArG inverse dans le Promoteur αB-cristalline. 151 Jusqu'à présent, une étude de développement in vivo révèle que l'expression de la αB-cristalline n'est pas affectée dans le muscle squelettique de myf5 souris null ou cœur de souris null d-HAND au jour embryonnaire 9,0 (I.J. Benjamin, données non publiées, 1998). 152 153

Autres chaperons cytosoliques/nucléaires

Plusieurs autres HSP qui existent dans le compartiment cytosolique/nucléaire présentent un intérêt potentiel en biologie cardiovasculaire. Par exemple, la protéine cytosolique de 20 kDa, p20, est abondamment exprimée dans le cœur, le squelette et les muscles lisses et se copurifie avec les chaperons αB-crystallin et Hsp27. 154 155 Bien que l'expression de p20 ne soit induite ni par la chaleur ni par un stress chimique, elle contient le « domaine α-cristallin » homologue C-terminal partagé par tous les membres des petites HSP de PM. 138 Dans les CMLV, p20 est un substrat pour les protéines kinases cAMP et cGMP, suggérant un rôle régulateur des fonctions postulées dans le maintien physiologique du tonus vasculaire et l'adaptation aux lésions de la paroi vasculaire. 156

Un quatrième membre des petites HSP (outre Hsp27, αB-crystallin et p20), une protéine de liaison à la protéine kinase de la dystrophie myotonique associe et augmente l'activité de la protéine kinase de la dystrophie et empêche sa dénaturation induite par la chaleur in vitro. 157 La protéine kinase de la dystrophie myotonique, contrairement à la Hsp27 ou à la cristalline αB, est régulée positivement dans le muscle squelettique des patients atteints de dystrophie myotonique, suggérant que cette nouvelle protéine pourrait être impliquée dans la pathogenèse de cette maladie. 157

Les membres de la famille Hsp110 présentent des fonctions de chaperon et de cytoprotection, bien que des détails sur leur expression relative dans les cellules du myocarde et leur distribution régionale dans le système cardiovasculaire attendent une caractérisation plus poussée. 158 Les autres membres de la famille Hsp110 incluent Hsp105, Apg-1 et Osp94. 159 160 161 Il existe un vif intérêt pour l'identification d'un homologue mammifère de la levure Hsp104, qui, au lieu d'empêcher l'agrégation des protéines, semble resolubiliser les agrégats de protéines insolubles. 162

Système de chaperon mitochondrial Hsp70

Tous les organismes possèdent des mécanismes dépendants de l'ATP pour le repliement et l'assemblage des protéines au sein des organites. 11 13 La translocation de protéines à travers la membrane mitochondriale nécessite un chaperon mitochondrial Hsp70 dans la matrice, où le repliement à l'état natif est terminé 13 (voir Figure 1 ).

Système de chaperonine mitochondriale

Outre les chaperons de type Hsp70, les chaperonines mitochondriales Hsp60 et Hsp10 constituent un système distinct qui fournit un environnement séquestré pour le repliement d'un sous-ensemble de protéines in vivo. 163 Ces anneaux à 7 chaînons sont disposés sous forme de structures cylindriques dans lesquelles le repliement des protéines ATP-dépendantes se produit dans leur cavité centrale. 164 Les preuves issues d'études in vitro suggèrent que les chaperons Hsp70 et les systèmes de chaperonines fonctionnent en coopération dans le repliement et l'assemblage des protéines chez les eucaryotes (examiné dans la référence 13 13 ).

Système de chaperonine cytosolique

La chaperonine TRiC est considérée comme l'équivalent fonctionnel de la chaperonine Hsp60/Hsp10 dans le cytosol eucaryote. Le complexe TRiC, qui se compose de doubles anneaux à 8 ou 9 chaînons de sous-unités ≈55 à 65 kDa, est requis pour le repliement de l'actine et de la tubuline in vivo. 165 Chaperonin TRiC nécessite des composants supplémentaires, tels que Hsp40, qui stimule l'ATPase Hsc70, pour le repliement des protéines dans le cytosol 77 166 (voir Figure 2). Les preuves disponibles suggèrent que la chaperonine TRiC fonctionne dans les étapes finales du repliement pendant la traduction d'un nombre limité de domaines polypeptidiques. 13

Implications

Les chaperons et chaperonines mitochondriales ne sont que modestement induits par le stress physiologique dans les cardiomyocytes et le cœur. 167 Cependant, la localisation des chaperons et des chaperonines mitochondriales Hsp70 sur les principaux sites de production de ROS pourrait servir à compléter les mécanismes de défense enzymatiques et non enzymatiques pour diminuer les lésions oxydatives et augmenter le taux de récupération physiologique après une lésion ischémique. 168 169 On ignore actuellement si la surexpression du chaperon mitochondrial Hsp75 ou de la chaperonine peut fournir une protection équivalente ou supérieure contre les lésions ischémiques. Une autre question importante est de savoir si les fonctions chevauchantes des chaperons Hsp70 et des systèmes de chaperonines Hsp60 ou TRiC/Hsp40 sont coordonnées pour le repliement de novo des protéines et la cytoprotection potentielle au cours de la pathogenèse des maladies cardiaques.

Chaperons moléculaires aux urgences

Protéines régulées par le glucose

L'analyse des chaperons du RE peut être d'un intérêt clinique particulier, car le RE fonctionne pour dégrader ou réparer les protéines endommagées après une ischémie myocardique ou après que des protéines mutantes (par exemple, CFTR ou thyroglobuline) ne se replient pas correctement. 11 170 171 L'anoxie, la privation de glucose et les ionophores de calcium induisent des membres de la classe de protéines de stress régulées par le glucose se liant au Ca 2+, Grp170, Grp94 et Grp78/BiP. 11 172 Des changements variables dans l'expression de la protéine Grp78 ont été rapportés après une ischémie.173 174 Bien que la « culpabilité par association » avec les chaperons cytosoliques soit le rôle présumé de la fonction Grp chaperon dans la surveillance des protéines et le contrôle qualité, des études supplémentaires sur leur expression sont nécessaires dans les états physiopathologiques associés à l'expression, à la glycosylation post-traductionnelle et à la sécrétion de protéines anormales via la voie ER-Golgi.

Hsp47 Chaperons

La glycoprotéine de liaison au collagène de 47 kDa Hsp47 est un membre de la superfamille des serpines (inhibiteur de la protéase à sérine) et est fortement induite par le stress thermique ou les états physiopathologiques (par exemple, la fibrose hépatique) associés à une synthèse accrue de collagène. 175 Hsp47 réside dans le RE et contient le signal de rétention du RE C-terminal Arg-Asp-Glu-Leu. 176 Hsp47 se lie transitoirement aux types de collagène I à IV et avidement aux substrats de collagène dénaturé, ainsi, son rôle dans le traitement et le transport du procollagène semble fermement établi. 177 Les études futures doivent maintenant aborder la pertinence biologique et clinique probable de l'expression de Hsp47 au début et à la progression des états physiopathologiques, tels que l'infarctus du myocarde, les cardiomyopathies idiopathiques et hypertrophiques et l'hypertension, dans laquelle la fibrose myocardique est en évidence. 178

Défis actuels et orientations futures

La récupération physiologique du cœur ischémique commence en quelques minutes, mais le taux de réparation ischémique cellulaire, qui peut durer de quelques jours à plusieurs semaines, est essentiel pour la réduction de la morbidité et de la mortalité cardiovasculaires ultérieures. L'idée que les protéines de stress peuvent accélérer la récupération physiologique d'une lésion myocardique réversible est basée sur des preuves expérimentales indiquant que plusieurs « signaux » immédiats peuvent activer la réponse au choc thermique et, ainsi, évoquer les mécanismes de protection endogènes des Hsp. Les événements cliniques majeurs tels que l'angor instable, l'occlusion récurrente après un traitement thrombolytique et l'exacerbation aiguë de l'angor chronique sont des inducteurs physiologiques potentiels des protéines de stress cytoprotectrices. La prochaine étape logique serait d'envisager la possibilité que des membres apparentés de la famille des protéines de stress multigénique confèrent des avantages fonctionnels similaires ou supplémentaires. Parce que l'ischémie et d'autres perturbations physiologiques perturbent les relations structure-fonction normales des protéines intracellulaires, les futures études doivent établir si les chaperons moléculaires, seuls ou en combinaison, atténuent les dommages ischémiques en accélérant la récupération physiologique de la cellule myocardique dans l'organisme intact.

Modèles expérimentaux pour la recherche sur les protéines de stress

Modèles transgéniques de surexpression de Hsp70 (gain de fonction) et hsf1-les souris déficientes (perte de fonction), et leur caractérisation ultérieure, commencent à éclairer leurs rôles physiologiques in vivo. 16 17 18 36 Une direction passionnante de ces efforts pourrait conduire à des approches intégrées des rôles physiologiques de systèmes entiers ou de réseaux de régulation dans des modèles animaux génétiquement modifiés de maladies humaines. Cependant, la richesse des connaissances existantes sur les études physiologiques chez les animaux plus gros que la souris ne doit pas être négligée. Des études visant à définir le rôle de l'expression de HSP dans l'étourdissement du myocarde à l'aide d'animaux conscients pourraient justifier le développement de modèles transgéniques de rat et de lapin. Les limitations potentielles de telles stratégies incluent des coûts considérablement plus élevés dus aux périodes de gestation plus longues, un temps plus long pour atteindre la maturité sexuelle et des portées plus petites de ces espèces plus grandes. Cependant, les chercheurs ayant une expertise en biologie moléculaire et en physiologie moléculaire qui entreprennent des projets collaboratifs augmentent les chances de succès, tout en évitant la duplication des efforts.

L'expression inductible par le stress des gènes HSP affecte-t-elle la taille de l'infarctus, l'arythmogenèse et le remodelage myocardique après un infarctus aigu du myocarde ?

Des études antérieures ont démontré qu'un prétraitement (24 heures) avec un stress thermique atténue la libération de radicaux libres dans le cœur de rat isolé 95 et réduit le nombre d'arythmies, une caractéristique fonctionnelle majeure des lésions d'ischémie/reperfusion (examiné dans la référence 92 92). Ensemble, ces études corrèlent les interactions potentielles entre ces voies protectrices mais sont insuffisantes pour établir une relation de cause à effet. Le développement d'un modèle de souris knockout pour le gène HSF1 fournit une approche expérimentale puissante pour déterminer si une déficience dans la synthèse de HSP induite par le stress, lors de perturbations physiologiques telles que l'ischémie myocardique, affecte le résultat des lésions post-infarctus et les mécanismes de réparation dans l'organisme intact. Les résultats de ces études peuvent aider à établir la causalité, à élucider les mécanismes potentiels par lesquels la synthèse des HSP est liée à l'ischémie myocardique et à évaluer la participation des protéines de stress au cours du préconditionnement ischémique précoce et tardif. La caractérisation en temps opportun de plusieurs modèles knock-out, actuellement en cours de développement dans des laboratoires du monde entier, devrait continuer à favoriser des collaborations fructueuses entre les chercheurs. 179 De nouveaux progrès devraient accélérer le flux de nouvelles connaissances dans des domaines connexes tels que la fibrose post-ischémique réactive et réparatrice, 180 l'inflammation postreperfusion, 181 et l'étourdissement du myocarde. 89 182

Expression des protéines de stress et mécanismes du préconditionnement ischémique

Le préconditionnement ischémique est la manœuvre expérimentale la plus puissante qui protège de manière reproductible le cœur contre une provocation ischémique ultérieure. 183 Cependant, il existe une controverse sur les rôles précis des protéines de stress dans ce phénomène bien caractérisé. 184 Plusieurs mécanismes impliquant la protéine kinase C, les récepteurs de l'adénosine et leurs relations avec les voies de transduction du signal ont été impliqués dans le préconditionnement ischémique. 185 Des preuves suffisantes indiquent un manque de corrélation entre l'expression inductible par le stress (par exemple, Hsp70) et le préconditionnement précoce, qui est de courte durée et dure entre 1 et 3 heures, selon le modèle et l'espèce. 186

La famille chaperon des protéines de stress est-elle peu susceptible d'avoir une pertinence physiologique dans le préconditionnement précoce ?

À notre avis, les études dans ce domaine ont soit rejeté prématurément, soit accordé une attention insuffisante à l'importance potentielle des petites Hsp de MW, telles que la cristalline αB et la Hsp27. Ces chaperons semblent susceptibles d'être des candidats à la « première ligne de défense » contre le stress non létal. On ignore actuellement si l'oligomérisation de petites Hsp de MW contribue à la stabilité mécanique ou au rôle supposé du cytosquelette dans la protection ischémique du myocyte cardiaque. 187 188 Les modèles de knock-out du gène αB-crystallin et Hsp27, actuellement en cours de développement, pourraient répondre directement à cette hypothèse.

De même, des études sont nécessaires pour étudier la corrélation entre le préconditionnement tardif et l'expression des protéines de stress. Vingt-quatre heures après un stress ischémique initial, plusieurs études ont rapporté des augmentations de la synthèse de Hsp60 et Hsp70 chez le lapin, 41 Hsp70 chez le porc, 182 et manganèse-SOD chez le chien 189 190 et une tolérance ischémique retardée ou un préconditionnement tardif. Par conséquent, une question fondamentale est de savoir s'il existe une relation directe entre l'expression des protéines de stress et le préconditionnement tardif. 191 192 193 Une évaluation plus détaillée du rôle spécifique de chaque Hsp dans la cardioprotection est également requise. Des tentatives pour déterminer le mécanisme du canal potassique cardioprotecteur sensible à l'ATP par l'utilisation d'inhibiteurs ont trouvé un manque de corrélation avec l'expression de la protéine de stress Hsp70. 194 Cependant, les approches utilisant des inhibiteurs spécifiques sont inadéquates pour établir la spécificité, à un certain degré de certitude, au-delà des protéines à l'étude. 195

Chaperons moléculaires et voies de mort cellulaire

Les protéines de stress sont des candidats idéaux pour jouer des rôles régulateurs clés dans les voies de survie et de mort cellulaires impliquant des dommages à l'ADN et la synthèse, la réparation et la dégradation des protéines. Les manœuvres qui augmentent l'expression de Hsp70 après un choc thermique, l'exposition au butyrate de sodium et la surexpression constitutive ou régulée inhibent l'apoptose dans divers types de cellules. 196 197 198 Le proto-oncogène c-myc potentialise l'apoptose induite par le choc thermique 199 200 en revanche, la surexpression de Bcl-2 augmente la survie cellulaire induite par la thermotolérance. 201 L'expression tissu-spécifique de Hsp70-2 empêche l'apoptose dans certaines cellules mitotiques grâce à un mécanisme impliquant le contrôle du cycle cellulaire. La fonction chaperon de 202 Hsp70 dans la régulation de l'apoptose peut se situer au niveau de la transduction du signal, car elle a été impliquée dans la voie de la kinase activée par le stress. 203

Des études récentes dans notre laboratoire utilisant hsf1-les cellules cultivées déficientes ont établi le rôle des Hsp inductibles par le stress pour rendre les cellules thermotolérantes à l'apoptose induite par la chaleur. 36 La présente étude fournit un modèle génétique pour examiner les relations interdépendantes potentielles entre les Hsp inductibles par le stress et les mécanismes impliqués dans les voies de survie et/ou de mort cellulaire. Le stress thermique sublétal protège les mitochondries contre le stress oxydatif et prévient la mort cellulaire par apoptose. 204 Compte tenu de leurs emplacements stratégiques dans tous les principaux organites, il est tentant de spéculer que plusieurs Hsp peuvent combattre le stress/dommages oxydatifs en repliant les répresseurs endommagés de la voie de mort cellulaire ou en empêchant leur dégradation. Alternativement, réprimer la libération d'activateurs suicidaires tels que le cytochrome c pourrait se produire par le biais d'interactions avec des chaperons et des chaperonines mitochondriales (Figure 1 ).

De plus, les résultats de plusieurs études récentes ont impliqué le petit MW Hsp25/27 dans les voies de survie cellulaire impliquant la différenciation cellulaire et le stress/dommages oxydatifs. Des études antérieures ont démontré que la surexpression de Hsp25/27, comme la protéine anti-apoptotique Bcl-2, augmente les niveaux de glutathion antioxydant et la résistance à l'apoptose médiée par Fas/APO-1, bien que cela ne se produise pas directement. 205 Le retrait des cellules souches embryonnaires de souris du cycle cellulaire induit une régulation à la hausse de l'ARNm Hsp25/27, qui s'accompagne d'une diminution de la phosphorylation et d'une augmentation de l'oligomérisation de la protéine Hsp25/27. 149 La réduction antisens de Hsp25/27 inverse ces changements par la prolongation du cycle cellulaire, la réduction des niveaux de glutathion et l'accélération vers l'apoptose. Ensemble, ces découvertes provocatrices suggèrent que pendant la prolifération et la différenciation des cellules du myocarde, le chaperon Hsp25/27, et d'autres, peuvent réduire le stress/dommages oxydatifs et prévenir l'apoptose grâce à un nouveau mécanisme redox-dépendant. 206

L'expression inductible par le stress des gènes HSP affecte-t-elle l'histoire naturelle des maladies cardiovasculaires chroniques, y compris le vieillissement ?

De nombreuses études ont corrélé l'induction de l'expression de Hsp et la surcharge de pression par cerclage aortique, l'hypertension aiguë, l'exposition à des agents vasoactifs ou l'hypertrophie ventriculaire gauche et l'expression du facteur de croissance dans plusieurs types cellulaires. 207 208 209 Des diminutions de l'expression des gènes HSP et de l'activité de liaison à l'ADN de HSF1 se produisent au cours du processus de vieillissement dans le myocarde des rongeurs. 210 De plus en plus de preuves suggèrent que le stress/les dommages oxydatifs peuvent être un facteur causal majeur dans le processus de vieillissement. 211 Le niveau de stress oxydatif et la sensibilité des tissus au stress oxydatif induit expérimentalement semblent augmenter au cours du processus de vieillissement. On ignore actuellement si les quantités accrues de dommages oxydatifs moléculaires, observées au cours du processus de vieillissement, sont causalement associées à une diminution de l'activité de HSF1 et, par implication, l'expression du gène Hsp. La disponibilité de modèles transgéniques et de gènes knock-out permettra à de futures études d'établir le rôle de l'expression génique du choc thermique induite par le stress au cours du vieillissement normal ou de l'adaptation physiologique aux facteurs de risque cardiaques associés à la maladie.

Chaperons moléculaires dans les états de maladie cardiaque causés par l'expression de protéines mutantes

Des niveaux élevés de protéines mal repliées ou dénaturées, ainsi que la micro-injection de protéines anormales, sont de puissants inducteurs de l'expression du gène HSP. 14 59 Des études récentes indiquant que le chaperon Hsc70 interagit indirectement avec le CFTR hébergeant la mutation de repliement commune ΔF508 appuient cette notion générale de leur rôle biologique dans les maladies humaines. 20

Du point de vue de la biologie chaperon, les maladies cardiaques qui résultent de mutations dans les gènes codant pour des composants de l'appareil contractile ou des protéines des canaux ioniques sont essentiellement des problèmes de protéines anormales. De multiples mutations de protéines sarcomériques ont été impliquées dans la pathogenèse de la cardiomyopathie hypertrophique familiale, y compris les chaînes lourdes et légères de la myosine, les sous-unités de la troponine I et T, la protéine C liant la myosine et la tropomyosine (référence 6 6 et revue dans la référence 7 7 ). Alors que le chaperon Hsp27 joue un rôle dans la polymérisation de l'actine et que la chaperonine TRiC est impliquée dans le repliement de l'actine et de la tubuline, le rôle physiologique des systèmes chaperon et chaperonine dans le repliement et l'assemblage des structures sarcomères, dans des conditions normales ou en cas de maladie, reste un mystère. En théorie, les chaperons peuvent influencer la réparation ou la dégradation des protéines sarcomères mutantes, ce qui, en fin de compte, affecte les relations structure-fonction et le phénotype de la maladie. 212 Des analyses in vitro sont d'abord nécessaires pour déterminer si la fonction chaperon peut affecter le repliement productif des protéines causé par les mutations pertinentes, ce qui peut être validé dans des modèles animaux appropriés. 18 213

Chaperons moléculaires en biologie vasculaire

De nombreuses opportunités existent pour disséquer les fonctions de chaperon lors de la synthèse et de la sécrétion de peptides et protéines actifs biologiques, de la prolifération cellulaire, de la signalisation intracellulaire et du réarrangement du cytosquelette. Les résultats de telles études peuvent identifier les cibles protéiques HSP spécifiques et la spécificité parmi les divers types de cellules dans la promotion des effets protecteurs vasculaires des œstrogènes. 214 215 Les rôles essentiels de Hsp90 et des cochaperons dans la biologie des récepteurs stéroïdiens suggèrent que les chaperons HSP jouent un rôle cliniquement significatif dans les effets de l'hormonothérapie substitutive chez les femmes ménopausées. 216 217 Des études épidémiologiques ont montré que le bénéfice protecteur contre les maladies coronariennes chez les femmes préménopausées est aboli dans les années postménopausées. 218 219 220 Les actions protectrices potentielles de l'œstrogène ont été attribuées à ses propriétés antioxydantes et vasoprotectrices, à la diminution des lipides sanguins et des lipoprotéines, et à ses effets directs sur la paroi vasculaire. 221 Il sera important de définir si l'expression de Hsp inductible par le stress chez les souris génétiquement modifiées joue un rôle dans la réponse vasculaire aux blessures chez les animaux mâles et femelles. 215

Chaperon moléculaire et maladies immunologiques

Contrairement à leurs rôles cytoprotecteurs bien établis, certaines protéines de stress ont été impliquées dans la pathogenèse des maladies cardiovasculaires. Par exemple, des taux sériques élevés d'anticorps contre l'homologue bactérien de la Hsp60 de mammifère ont été démontrés chez des patients atteints de cardiomyopathie et de diabète, chez des individus asymptomatiques présentant une sténose carotidienne et dans des lésions athéroscléreuses chez le lapin et l'homme (examiné dans la référence 222 222). Une hypothèse est que la maladie auto-immune résulte d'une réactivité croisée de peptides immunogènes, qui sont dérivés de chaperons bactériens et mitochondriaux et de Hsp60 (chaperonine) et sont reconnus par les lymphocytes T γ/δ activés. 223 224 Réponses immunitaires humorales et marqueurs séropositifs contre la famille Hsp70 (notamment ER Grp78 et Hsc70) du parasite protozoaire Trypanosoma cruzi ont été impliqués dans la pathogenèse de la maladie de Chagas, 224A la cause la plus fréquente d'insuffisance cardiaque congestive en Amérique latine (voir Tableau ). Bien que ces études corrélatives aient des limites inhérentes, les futures recherches visant à établir la causalité pourraient ouvrir des voies pour développer des vaccins ou d'autres thérapies innovantes pour le traitement et la prévention.

Applications thérapeutiques potentielles des chaperons moléculaires

Les stratégies qui pourraient augmenter le taux de récupération physiologique après un étourdissement post-infarctus et un dysfonctionnement ventriculaire restent des objectifs importants dans la prise en charge des patients atteints d'infarctus aigu du myocarde. Étant donné que les manœuvres utilisant l'hyperthermie tissulaire ou corporelle totale sont lourdes et peu pratiques chez l'homme conscient, les stratégies pharmacologiques qui augmentent l'expression des protéines de stress pour une protection isotherme ont un intérêt potentiel contre les lésions ischémiques du cœur, des reins et du cerveau. Les inhibiteurs du protéasome, qui élèvent de manière transitoire le niveau de protéines dépliées à l'intérieur des cellules, constituent une approche potentielle. 225 Des approches alternatives peuvent impliquer le développement de petites molécules et de peptides 226 226A qui imitent les actions in vivo des chaperons avec des avantages thérapeutiques.

Points de vue

Le rôle des protéines de stress dans la cardioprotection a été reconnu comme l'une des directions futures les plus importantes de la recherche sur les cardiopathies ischémiques. 227 Étant donné que le nombre de personnes touchées est si important, une intervention thérapeutique qui contribue à un petit changement dans la morbidité et la mortalité post-infarctus du myocarde, par exemple, peut avoir des effets dramatiques sur les résultats cliniques globaux. Les possibilités d'aborder les rôles physiologiques des chaperons cytoprotecteurs dans les maladies cardiaques doivent être élargies pour inclure leurs rôles probables dans les maladies chroniques (athérosclérose, hypertension, diabète, troubles génétiques et cardiopathie valvulaire) qui convergent par des voies communes, entraînant une insuffisance cardiaque et mort subite. Des alliances stratégiques entre équipes de recherche pourraient forger de nouvelles directions et accélérer les progrès dans ce domaine prometteur, qui, à terme, pourrait réussir à exploiter des voies endogènes pour améliorer la santé physiologique et réduire l'attrition physiologique associée aux maladies cardiovasculaires.

Abréviations et acronymes sélectionnés

CFTR=régulateur de conductance transmembranaire de mucoviscidose
urgence=réticulum endoplasmique
ERK=kinase réactive extracellulaire
Grp=protéine liée au glucose
HO=hème oxygénase
Hsc=choc thermique apparenté
HSF=facteur de transcription de choc thermique
HSP=famille de choc thermique de protéines de stress
Hsp=protéine de choc thermique
JNK=c-Jun N-terminal kinase
MAPK=protéine kinase activée par un mitogène
MAPKAP=Protéine kinase activée par MAPK
MW=masse moléculaire
ROS=les espèces réactives de l'oxygène
SAPK=protéine kinase activée par le stress
TRic=Complexe en anneau TCP-1
VSMC=cellule musculaire lisse vasculaire

Figure 1. Un résumé des principaux signaux physiopathologiques qui activent la synthèse des HSP (à gauche de la ligne continue verticale) et les fonctions potentielles des HSP (à droite de la ligne continue verticale). Les lésions cellulaires se manifestent par une génération accrue de ROS, la disponibilité de fer redox-actif, la peroxydation des lipides membranaires et des dommages aux protéines, entre autres. 92 Les sources extracellulaires de ROS (A) pourraient être des cellules endothéliales, des CMLV et même des myocytes dans les tissus environnants. Le transport d'électrons mitochondriaux d'oxygène moléculaire (B) pourrait être la principale source intracellulaire de génération de ROS.Le calcium libre intracellulaire (C), qui augmente de 10 fois dans les 10 minutes suivant la reperfusion, 228 229 a été impliqué dans l'activation des protéases (D), qui, à leur tour, sont censées contribuer aux lésions myocardiques intracellulaires. 230 231 232 Les lésions du cytosquelette (E) sont un événement précoce de lésion ischémique, qui provoque un dysfonctionnement ventriculaire ou un « étourdissement myocardique » lorsque la lésion est réversible. 87 Les lésions myocardiques pourraient également résulter du recrutement de leucocytes polymorphonucléaires (PMN) par de multiples mécanismes dans le territoire ischémique et par la libération de radicaux libres dérivés de l'oxygène (A), d'enzymes lysosomales cytotoxiques (F), de protéases extracellulaires (G) et de complément activation (H) (examiné dans la référence 233). On pense que divers signaux physiologiques activent le HSF1 inductible par le stress (I), qui se lie à l'élément de choc thermique spécifique à la séquence (HSE) (J), contenu dans les promoteurs de tous les HSP (K). Bien que le mécanisme précis de la protection ischémique médiée par Hsp70 soit mal compris, il est largement attribué à la propriété biologique des « chaperons moléculaires », qui sont proposés pour aider à l'assemblage ou à la réparation de protéines nouvellement synthétisées ou endommagées. 11 234 235 En termes physiologiques, les fonctions potentielles des chaperons moléculaires dans le cœur ischémique sont les suivantes : repliement des protéines des polypeptides nouvellement synthétisés essentiels au maintien du métabolisme oxydatif après une lésion des myocytes (L), protection des mitochondries contre les ROS et les cytokines telles que le TNFα 204 236 et translocation de protéines nouvellement synthétisées pendant la réparation des organites (M), réparation des protéines structurelles critiques après des altérations cytosquelettiques induites par l'ischémie (N), 237 recyclage des vésicules membranaires (Hsc70) (O), transport de sous-produits toxiques potentiels pour la dégradation par le protéasome (P), 78 238 239 suppression des cytokines pro-inflammatoires telles que la pro-interleukine-1β (Q), 204 236 240 suppression de la NADPH oxydase et de l'explosion oxydative par la réponse au choc thermique (R), 241 protection par la production de NO à partir de la synthèse inductible de l'expression de HSP (S), 61 242 243 244 245 246 prévention de l'apoptose soit par le chaperon mitochondrial Hsp60 liaison du cytochrome c et/ou Hsp70 liaison de cibles cytosoliques (T), 36 204 réparation du canal ionique (U), synthèse de collagène par le chaperon Hsp47 pour la fibrose réparatrice (V), 180 et modulation de la lésion ischémique à médiation immunitaire (W). 241

Figure 2. Un schéma proposé pour le cycle de réaction du complexe chaperon Hsc70 dans le repliement d'un substrat hypothétique dans la cellule. À partir du bas de la figure, le chaperon Hsc70 (A) se compose d'une ATPase N-terminale et d'un domaine C-terminal pour la liaison au substrat cible. Hsp40 (B), l'homologue eucaryote de DnaJ, se lie d'abord aux protéines dépliées (UP) (C), puis se lie à Hsc70.ADP, ou se lie au complexe Hsc70.ADP.UP (D), qui a un faible hors tarif pour les UP. Plusieurs destins différents pour le complexe Hsc70.ADP.UP sont envisagés, chacun dépendant du remplacement de Hsp40 par différents partenaires accessoires, en particulier Hip (protéine interagissant avec Hsc70), Hop (protéine organisant Hsc70/Hsp90) et Hap (protéine accessoire Hsc70). 166 247 248 Après la libération de Hsp40, Hip se lie au domaine ATPase de Hsc70 (E), stimule son activité, puis reste lié pour stabiliser le complexe ADP-Hsc70-substrat, suggérant qu'il pourrait jouer un rôle dans le transport des substrats dans les cellules (F). 166 Hop sert de lieur physique entre Hsc70 et Hsp90 (G), vraisemblablement pour faciliter le transfert d'UP entre ces chaperons. Que Hop modifie ou non l'activité ATPase de Hsc70 est controversé. 249 La fonction de Hup, qui stimule la libération d'UPs de Hsc70 (H) et convertit les oligomères de Hsc70 en monomères (I), reste à établir. L'énergie transférée de l'hydrolyse de l'ATP, l'étape limitante du cycle chaperon eucaryote, est utilisée dans des cycles successifs pour aider au repliement et empêcher l'agrégation et la dégradation. À cette fin, deux protéines apparentées, BAG-1 (non illustrées) et Hap (J), qui se lient au domaine Hsc70 ATPase, inhibent également la liaison de Hsp70 au substrat protéique déplié in vitro, suggérant que ces protéines peuvent jouer un rôle dans le maintien contrôle de la qualité en orientant les interactions non productives vers la dégradation 250 (illustration aimablement fournie par LE Hightower, Université du Connecticut, Storrs).

Tableau 1. Principales classes de HSP en biologie cardiovasculaire

mHsp75 indique Hsp75 HIF-1 mitochondrial, facteur de transcription 1 inductible par l'hypoxie et MKBP, protéine kinase de la dystrophie myotonique.

Le Dr Benjamin a été soutenu par la Fondation américaine pour la recherche médicale, les National Institutes of Health et un prix de chercheur établi de l'American Heart Association. Nous remercions R. S. Williams, R. Meidell, A. Davis, P. Thomas et R. Sohal pour leurs commentaires critiques concernant notre manuscrit.


Résumé—La façon dont une cellule réagit au stress est un problème central en biologie cardiovasculaire. Divers stress physiologiques (par exemple, la chaleur, l'hémodynamique, les protéines mutantes et les lésions oxydatives) produisent de multiples changements dans une cellule qui affectent finalement les structures et la fonction des protéines. Les cellules de différents phylums initient une cascade d'événements qui engagent des protéines essentielles, les chaperons moléculaires, dans les décisions de réparer ou de dégrader les protéines endommagées comme stratégie de défense pour assurer la survie. Les preuves accumulées indiquent que les chaperons moléculaires tels que la famille de choc thermique des protéines de stress (HSP) participent activement à un éventail de processus cellulaires, y compris la cytoprotection. La polyvalence de la famille HSP omniprésente est encore renforcée par les réseaux de régulation inductibles par le stress, à la fois au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel. Dans la présente revue, nous discutons de la régulation et de la fonction des chaperons HSP et de leur signification clinique dans des conditions telles que l'hypertrophie cardiaque, les lésions de la paroi vasculaire, la chirurgie cardiaque, le préconditionnement ischémique, le vieillissement et, éventuellement, des mutations dans les gènes codant pour les protéines contractiles et les canaux ioniques. .

Les stress physiologiques allant de l'ischémie myocardique aux mutations génétiques produisent des états pathologiques dans lesquels les dommages aux protéines et les structures protéiques mal repliées sont un dénominateur commun. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Comment la cellule réagit-elle ? De multiples voies endogènes sont engagées dans la restauration de l'homéostasie cellulaire, mais un mécanisme bien caractérisé qui implique le repliement des protéines est la famille de choc thermique des protéines de stress, ou HSP. 10 11 Un aperçu des mécanismes sous-jacents à la fonction HSP est fourni par 2 principaux éléments de preuve : (1) le repliement correct de nombreuses protéines dans une cellule nécessite une machinerie de repliement des protéines, les chaperons moléculaires, 12 13 et (2) les chaperons HSP réparent les dénaturés protéines ou favoriser leur dégradation après choc thermique. 14 15

Les études génétiques fournissent une preuve convaincante dans différents phylums que la surexpression des protéines de stress est un puissant moyen de cytoprotection, même dans le cœur intact. 10 16 17 18 De même, des études biochimiques ont démontré que le chaperon Hsc70 augmente le repliement productif de la mutation commune ΔF508 de CFTR. Cela suggère un rôle physiologique d'un chaperon HSP dans les maladies humaines. 19 20 Des mécanismes divergents qui produisent des protéines cellulaires anormales ou mal repliées convergent vers une voie commune, conduisant à une augmentation des niveaux de protéines de stress cytoprotectrices, qui diminuent ou neutralisent les effets délétères des stress aigus ou chroniques.

Dans cette revue, nous résumons les connaissances actuelles sur la régulation et la fonction des chaperons individuels (par exemple, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp47, Hsp27 et B-crystallin) dans le système cardiovasculaire. Outre leurs rôles bien établis dans la survie cellulaire (nécrose et apoptose), nous mettrons l'accent sur les preuves émergentes concernant les fonctions de chaperon dans l'adaptation physiologique au cours de l'hypertrophie cardiaque, du préconditionnement ischémique, des lésions de la paroi vasculaire, du stress oxydatif et du vieillissement. Bien que nous ne puissions actuellement que spéculer sur leurs rôles dans des maladies cardiaques spécifiques, nous discuterons de nombreuses opportunités potentielles pour établir si les chaperons HSP exercent un effet ou jouent un rôle physiologique direct dans l'histoire naturelle des maladies résultant de mutations de l'appareil contractile cardiaque ( ex., cardiomyopathie hypertrophique) et des canaux ioniques (par ex., syndrome du QT long) chez l'homme.

Définitions et nomenclature

Que sont les protéines de stress « de choc thermique » ?

Le terme protéine de « choc thermique » est impropre, mais reste un héritage de la découverte fortuite de Ritossa 21 selon laquelle le choc thermique produisait des bouffées chromosomiques de cellules des glandes salivaires dans Drosophile. Le stress thermique (≈5° au-dessus de la température de croissance normale) régule positivement la synthèse rapide d'une famille multigénique de protéines, appelées à l'origine protéines de choc thermique, 22 qui sont le résultat d'une réponse souvent appelée réponse au choc thermique. 10 21 Le stress thermique sublétal antérieur augmente de manière transitoire la capacité d'une cellule à résister à un défi thermique ultérieur par ailleurs mortel. Ce phénomène, ou thermotolérance, a joué un rôle clé dans le lancement de nombreuses études dans des modèles expérimentaux in vitro et in vivo dans lesquels une association similaire a été trouvée entre la réponse au choc thermique et la protection contre l'hypoxie ou l'ischémie simulée. En effet, divers stress, notamment les métaux lourds, les analogues d'acides aminés, l'inflammation et le stress oxydatif/ischémique, induisent l'expression des gènes HSP. Par conséquent, les termes « protéines de stress » ou « famille de choc thermique de protéines de stress » sont préférés, bien que beaucoup de ces protéines aient des fonctions essentielles dans des conditions non stressées. 13

Les protéines de stress appartiennent à des familles multigéniques dont la taille moléculaire varie de 10 à 150 kDa et se trouvent dans tous les principaux compartiments cellulaires. La convention consiste à nommer les protéines de stress de différentes tailles moléculaires comme suit : Hsp27, Hsp70 et Hsp90, tandis que les gènes des protéines de choc thermique sont désignés comme suit : hsp27, hsp70 et hsp90. 23 La distinction entre les membres exprimés de manière constitutive (p. dépendent de l'expression restreinte aux cellules et aux tissus.

Les conséquences cellulaires de la chaleur et du stress ischémique sont similaires

Comme l'ischémie/reperfusion expérimentale, le choc thermique est un stress qui perturbe de nombreux processus métaboliques et structures cellulaires et qui aboutit à la mort cellulaire lorsqu'un seuil critique est dépassé. 10 24 25 Le stress thermique et l'ischémie causent des dommages importants au cytosquelette, y compris l'effondrement du réseau de filaments intermédiaires filiformes en grands agrégats périnucléaires, la réorganisation du réseau cytoplasmique, la relocalisation des fibres contenant de l'actine autour du noyau et la perturbation des microtubules et de la fuseau mitotique. 26 27 Le gonflement mitochondrial, la perte des mitochondries et le découplage de la phosphorylation oxydative sont des caractéristiques similaires du choc thermique et des lésions ischémiques réversibles précoces. 28 29 30

De manière caractéristique, la synthèse générale des protéines est inhibée après un défi thermique extrême en raison de la phosphorylation de facteurs d'initiation tels que eIF2α, qui perturbe l'assemblage ribosomique et inactive les protéines de liaison à la coiffe. 31 32 33 En revanche, les gènes HSP sont efficacement exprimés après une provocation thermique, en partie en raison de l'absence d'introns dans plusieurs gènes inductibles (par exemple, hsp70). De plus, les altérations de l'épissage de l'ARNm et la stabilisation induite par la chaleur de l'ARNm sont des mécanismes adaptatifs utilisés pour traduire efficacement les protéines de stress, qui peuvent atteindre 15 à 25 % de la protéine intracellulaire totale en quelques minutes après le stress physiologique dans ces conditions. 10 34 Par coïncidence, plusieurs chaperons cytosoliques se déplacent dans le noyau, 35 où l'inhibition induite par la chaleur de l'assemblage de la chromatine de l'ADN expose une conformation sensible à la nucléase, une caractéristique pathognomonique de l'apoptose induite par la chaleur et l'ischémie. 36 Des changements moins spectaculaires sont observés dans les protéines membranaires intégrales, la bicouche lipidique et la morphologie de la surface cellulaire. L'arrêt des stimuli nocifs est suivi d'une dégradation rapide et efficace des ARNm de Hsp. 37 38 39

Comme mentionné précédemment, un stress thermique sublétal antérieur ou « préconditionnement hyperthermique » atténue profondément tous les changements cellulaires induits par la chaleur à un défi thermique sévère ultérieur. De plus, le prétraitement à la chaleur produit une « tolérance croisée » à divers types de stress physiologique. Par exemple, la protection du cœur ischémique intact après un prétraitement thermique peut durer des heures, voire des jours. 40 41 Les connaissances acquises sur les rôles physiologiques de l'expression de Hsp pendant la réponse au choc thermique ont contribué aux réflexions actuelles sur les fonctions chaperon dans les états pathologiques susceptibles d'entraîner un repliement anormal des protéines.

L'attention s'est principalement concentrée sur l'induction de chaperons HSP et les mécanismes de réparation potentiels impliqués dans l'atténuation des lésions d'ischémie/reperfusion. La figure 1 résume schématiquement bon nombre de ces concepts et illustre les multiples mécanismes bien connus impliqués dans les lésions myocardiques ischémiques, notamment le stress/dommages oxydatifs, la surcharge en calcium et les protéases activées, la libération d'enzymes protéolytiques et lysosomales, les altérations du cytosquelette et l'activation du complément.

Divers stress physiologiques induisent l'expression du gène HSP via un mécanisme commun

L'induction rapide de l'expression des protéines de stress est réalisée par des mécanismes d'activation transcriptionnelle et de traduction préférentielle. 10 42 HSF (HSF1 à HSF4) régulent la synthèse inductible des HSP pendant le développement, la croissance et l'adaptation. 42 43 44 Alors que les gènes essentiels à copie unique codent pour HSF dans Saccharomyces cerevisiae et Drosophile, 45 46 HSF multiples ont été identifiés chez les poussins, les plantes, les souris et les humains. 47 48 49 50 51 Deux HSF (HSF1 et HSF2, codant pour des protéines de 75 et 72 kDa, respectivement) ont été identifiées chez la souris. 49 Ni HSF1 ni HSF2 ne sont inductibles par la chaleur, mais HSF1 est hyperphosphorylé dans un ras-dépendante par les membres des sous-familles MAPK (ERK1, JNK/SAPK et protéine kinase p38) lors d'un stress physiologique. 52 53 Dans des conditions non stressées, l'activité de liaison à l'ADN et l'activité transcriptionnelle de vertébrés HSF1 sont sous contrôle négatif strict (examiné dans la référence 44 44 ). Cependant, il reste controversé si la répression par le chaperon Hsp70, la séquestration de la phosphorylation constitutive sur les résidus de sérine ou des régulateurs inhibiteurs inconnus sont les principaux mécanismes sous-jacents à l'activation inductible par le stress et à la désactivation rapide de HSF1. 43 54 55 56

Des études antérieures ont démontré qu'en réponse à la fois à la chaleur et à l'ischémie simulée, le ou les mécanismes d'activation de HSF1 sont similaires, voire identiques, dans les cellules myogéniques 57 et que l'épuisement de l'ATP intracellulaire joue un rôle important dans le déclenchement de la liaison HSF1-ADN. activité. 58 Dans des conditions pathologiques, on pense que les inducteurs de l'activation de HSF1, tels que les LDL oxydés et les intermédiaires azotés réactifs, augmentent les dommages aux protéines, ce qui déclenche une régulation positive de l'expression du gène HSP. 59 60 61 Cependant, l'activation transcriptionnelle de la voie HSF1 ne nécessite pas de nouvelle synthèse protéique, puisque le transactivateur préexistant (HSF1) est inactif à l'état non stressé. 43 56 57 Les stress physiologiques, tels que la chaleur et l'ischémie, induisent l'oligomérisation des monomères HSF1 en homotrimères, qui se lient ensuite à un motif spécifique à la séquence en amont, l'élément de choc thermique, dans le promoteur de tous les gènes HSP inductibles par le stress 62 63 (Figure 1I jusqu'à 1K). Nous avons récemment établi un modèle de knock-out du gène de Hsf1 et démontré dans des études in vitro l'exigence essentielle de cette voie régulatrice dans la défense cellulaire et la thermotolérance. 36 De plus, l'expression des protéines de stress a été impliquée dans la promotion de la survie des cellules tumorales 64 et la protection du cœur ischémique. 16 17 18

La surexpression des protéines de stress améliore la vitesse de récupération physiologique du cœur ischémique

Une littérature substantielle décrit l'induction de Hsp70 par l'ischémie, 57 65 66 le rôle potentiel de Hsp70 dans le préconditionnement ischémique, 40 67 et une corrélation inverse entre l'expression de Hsp70 induite par le préconditionnement ischémique ou thermique et la taille de l'infarctus dans les modèles animaux. 41 68 69 70 De plus, l'expression forcée de Hsp70 confère un effet cytoprotecteur dans les cellules en culture, y compris les myocytes cardiaques soumis à une ischémie simulée. 71 72 Plus précisément, la surexpression de la principale protéine de choc thermique de 70 kDa (Hsp70) chez les souris transgéniques améliore la fonction myocardique, 16 17 18 préserve la récupération fonctionnelle métabolique, 18 et réduit la taille de l'infarctus 73 après ischémie/reperfusion. En plus de Hsp70, Hsp27 et αB-cristalline peuvent protéger les cardiomyocytes primaires contre les dommages ischémiques. 74 Bien que les mécanismes précis soient insuffisamment compris, on pense que les protéines de stress interviennent dans la cardioprotection grâce à leurs fonctions biologiques de chaperons moléculaires.

Les protéines de stress peuvent fonctionner comme chaperons moléculaires

Les chaperons moléculaires, comme Hsp70 et αB-crystallin, sont des protéines qui facilitent le repliement, l'assemblage et le désassemblage d'autres protéines mais ne font pas partie du produit fini. 75 Comme de nombreuses protéines nécessitent des chaperons pour se replier, ces protéines sont des composants essentiels dans l'étape finale du dogme central de la biologie moléculaire : ADN↔ARN→polypeptide→protéine repliée. 11 75 Les chaperons in vitro empêchent l'agrégation d'autres protéines dans des conditions de stress et favorisent la restauration de l'activité enzymatique des substrats protéiques dénaturés ou des enzymes (par exemple, citrate synthase, -galactosidase ou luciférase) lors de l'élimination du stress. 11 13 76

La figure 2 montre schématiquement le cycle de réaction du chaperon Hsc70 en relation avec des cochaperons et des substrats moléculaires récemment identifiés dans la cellule. Par exemple, le chaperon Hsp40 joue une fonction catalytique majeure dans le chargement des substrats cibles sur le cycle de liaison/libération de Hsc70. 77 Bien que les mécanismes de ces fonctions soient encore en train d'émerger, les principales fonctions des chaperons moléculaires sont (1) de se lier de manière transitoire et de retarder le repliement des chaînes polypeptidiques naissantes jusqu'à ce que la synthèse soit terminée, (2) de maintenir les chaînes polypeptidiques dans une conformation appropriée adaptée à la translocation. à travers les membranes des organites, (3) empêchent l'agrégation des interactions intramoléculaires ou intermoléculaires, (4) désassemblent activement les vésicules recouvertes de clathrine, (5) maintiennent les complexes aporécepteurs stéroïdes dans des états compétents pour les ligands (Hsp90 et cochaperone) et (6) aident à dégrader les substances toxiques métabolites en favorisant l'ubiquination et la lyse du protéasome 78 (Figure 1L à 1P).

Le cas des chaperons moléculaires dans les maladies cardiaques

L'intérêt clinique généralisé pour les fonctions biologiques des chaperons moléculaires s'étend sur une gamme de pathologies humaines allant des maladies dégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, les prions, l'amylose, la formation de cataracte, la drépanocytose, la mucoviscidose et diverses maladies cardiaques, y compris l'ischémie myocardique. Des événements précoces qui rétablissent le reflux opportun du myocarde ischémique soit par thrombolytiques, angioplastie directe ou lyse spontanée du caillot sont essentiels pour améliorer la récupération myocardique et réduire la morbidité et la mortalité. 79 80 Néanmoins, une ischémie récurrente due à la rupture d'une plaque instable ou à une insuffisance cardiaque congestive peut compliquer l'évolution clinique d'un infarctus aigu du myocarde. Dans l'infarctus du myocarde aigu non compliqué, la récupération physiologique au niveau cellulaire commence en quelques minutes mais peut durer des semaines à des mois avant que la réparation myocardique ne soit terminée. Ainsi, les mécanismes de protection endogènes ont une pertinence clinique pour atténuer les effets de la cardiopathie ischémique.

Activités biochimiques de la voie régulatrice du HSP et des chaperons au cours de l'ischémie myocardique

Dans des travaux antérieurs entrepris pour définir le stimulus immédiat de l'activation de HSF, nous avons observé qu'une acidose intracellulaire sévère (pH 6,7) était insuffisante pour induire la liaison à l'ADN de HSF1 dans des cellules myogéniques cultivées exposées à une ischémie simulée, si les réserves d'ATP étaient préservées. 58 En revanche, une déplétion sévère en ATP (65 %) a stimulé la liaison à l'ADN de HSF1, même si le pH était maintenu dans la plage normale. 58 Dans le cœur ischémique intact, 15 minutes d'ischémie, qui produit une lésion réversible, sont associées à une réduction similaire (65 %) des réserves d'ATP à haute énergie, tandis qu'une lésion mortelle est observée avec une ischémie prolongée (>40 minutes) et une déplétion >90 % de piscines à haute énergie. 81 Le Km car la faible activité ATPase de la Hsc70 bovine est de 1 à 2 mol/L, soit 3 ordres de grandeur en dessous des concentrations millimolaires des pools de nucléotides d'adénine intracellulaire. 75 Par conséquent, il est peu probable que l'activation dépendante de l'ATP de la voie de régulation HSF1 et les propriétés biochimiques des chaperons moléculaires soient affectées négativement pendant les périodes d'ischémie transitoire ou de lésion ischémique myocardique réversible.

La preuve de principe indiquant un effet cardioprotecteur de la Hsp70 chez les animaux transgéniques soumis à une ischémie/reperfusion suggère que des méthodes pharmacologiques ou génétiques pour augmenter l'expression des protéines de stress dans le myocarde des patients à risque d'événements ischémiques aigus pourraient limiter les lésions ischémiques. 82 Cependant, des connaissances de base supplémentaires sont nécessaires concernant (1) leurs relations avec d'autres voies endogènes impliquées dans la protection du myocarde contre le stress/les dommages oxydatifs, (2) la spécificité fonctionnelle parmi les chaperons de la famille multigénique HSP, et (3) la contribution de cette voie pendant l'ischémie aiguë et d'autres états physiologiques qui déclenchent la réponse au choc thermique, avant l'application clinique.

Protéines de stress et voies antioxydantes pour la cardioprotection

Depuis les années 1970, l'hypothèse selon laquelle les piégeurs de radicaux libres peuvent améliorer les dommages oxydatifs au cours de l'ischémie/reperfusion a été poursuivie par les cliniciens et les chercheurs. 83 Dans les systèmes modèles allant du transgénique Drosophile chez la souris, la surexpression de la catalase, de la superoxyde dismutase ou de la glutathion peroxydase a tendance à protéger contre le stress oxydatif. 84 85 86 Le stress oxydatif, dû à l'ischémie/reperfusion, joue également un rôle central dans les lésions d'organes vitaux tels que le cerveau, les reins et le cœur. On pense que les ROS contribuent au dysfonctionnement ventriculaire, ou « étourdissement du myocarde », aux arythmies et aux dommages cellulaires progressifs ou à la mort après une lésion ischémique (Figure 1). 87 88 89 90

Des résultats discordants ont été rapportés lors de tentatives d'administration d'antioxydants pendant et après une ischémie/reperfusion myocardique. 91 92 Les antioxydants exogènes, qui sont limités aux espaces interstitiels, peuvent avoir une capacité limitée à protéger les protéines intracellulaires contre les ROS. Par exemple, le radical libre hydroxyle (·OH), considéré comme le principal agent des dommages oxydatifs, est si hautement réactif avec un substrat typique que sa demi-vie à 37°C est de 7 x 10 -10 secondes. 93 Ainsi, il est difficile d'envisager que l'administration d'antioxydants exogènes, à des concentrations physiologiquement réalisables, puisse prévenir efficacement les dommages macromoléculaires induits par ·OH. Une stratégie potentiellement plus efficace peut consister à minimiser physiologiquement la production de ·OH. En effet, la surexpression des membres de la famille HSP peut fournir une telle avenue. Plusieurs études ont rapporté que pendant la protection contre l'ischémie myocardique, la régulation à la hausse des niveaux de protéines de stress est en corrélation avec des augmentations de l'activité enzymatique de la catalase, suggérant des interactions additives ou synergiques potentielles de ces voies endogènes contre le stress oxydatif. 40 94 95 Une question importante sans réponse est de savoir si les fonctions des protéines de stress, en tant que chaperons moléculaires, complètent les fonctions uniques des enzymes antioxydantes dans la protection contre le stress/les dommages oxydatifs.

Chaperons moléculaires des compartiments cytosol/nucléaire

Le tableau montre les principales classes de HSP, les compartiments intracellulaires, leurs fonctions putatives et leur importance potentielle en biologie cardiovasculaire.

Hsp70 Chaperons

Les membres de la famille Hsp70 sont le groupe le plus étudié et le plus abondant dans les cellules eucaryotes. 96 Dans le cytosol, Hsp70 se lie aux polypeptides naissants avant leur libération du ribosome. 97 Tous les membres de la classe chaperon Hsp70 possèdent deux domaines distincts : un domaine ATPase N-terminal hautement conservé et un domaine C-terminal plus divergent, qui lie de courts peptides hydrophobes des substrats cibles 98 99 (figure 2A). La fonction chaperon Hsp70 nécessite le domaine ATPase N-terminal, qui, de manière intéressante, est structurellement similaire à l'actine du muscle squelettique du lapin malgré une faible similitude de séquence. 100

Ces relations structure/fonctionnelle de Hsp70 confèrent probablement une activité de chaperon in vivo en cardioprotection. À cet égard, pratiquement rien n'est connu sur le chaperon constitutif Hsc70, qui partage une homologie de séquence > 80 % avec Hsp70. En théorie, une régulation positive modeste de la Hsc70 constitutive pourrait favoriser un bénéfice cardioprotecteur substantiel. Cependant, la régulation à la hausse des HSP au-delà d'un seuil critique peut avoir des conséquences cellulaires délétères. 101 Des fonctions distinctes entre les membres de Hsp70 ont été signalées récemment comme existant dans des régions en dehors du domaine de liaison peptidique, suggérant des niveaux supplémentaires de complexité pour les fonctions de chaperon in vivo. 102

Hsp90 Chaperons

La figure 2 montre que le chaperon Hsp90 est un composant du cycle de réaction impliquant le complexe chaperon Hsc70 et des protéines nouvellement synthétisées. De plus, les membres de la famille Hsp90, Hsp90α et Hsp90β, qui constituent 1% à 2% des protéines cytoplasmiques solubles totales, ont les relations fonctionnelles in vivo les mieux caractérisées avec des protéines cibles, les récepteurs d'hormones stéroïdes. 103 Hsp90 avec des partenaires chaperons, Hsp70 et Hsp56, se lie directement, stabilise et maintient le complexe aporécepteur dans une conformation inactive. La liaison du ligand (par exemple, l'œstrogène) au complexe aporécepteur déclenche l'hydrolyse de l'ATP par Hsp90, qui se dissocie d'un récepteur « activé » qui peut désormais se lier au motif de reconnaissance spécifique à la séquence et induire la transcription des gènes cibles. 104 De plus, des niveaux élevés d'expression de Hsp90 déstabilisent le complexe récepteur d'œstrogène/élément sensible aux œstrogènes et régulent à la baisse l'expression du gène cible sensible aux œstrogènes, indiquant une boucle de rétroaction régulatrice. 105

Les fonctions chaperon Hsp90 sont médiées par des voies de transduction du signal impliquant diverses protéines kinases de types tyrosine et sérine-thréonine, la caséine kinase II, l'eIF-2α régulée par l'hème et diverses autres protéines cellulaires, telles que la calmoduline, l'actine et la tubuline (examiné dans la référence 106 106 ). Enfin, les chaperons Hsp90 de Saccharomyces cerevisiae sont essentiels à la survie dans toutes les conditions, soutenant leurs rôles physiologiques importants chez les eucaryotes inférieurs. 107

Chaperons cytosoliques d'intérêt particulier en biologie cardiaque et vasculaire

Contrairement aux homologues omniprésents Hsp70 et Hsp90, des membres spécifiques des petites HSP MW (HO-1 ou Hsp32, Hsp27, αB-crystallin et Hsp20 chaperons) présentent une expression tissulaire restreinte, suggérant des propriétés spécialisées potentielles dans le système cardiovasculaire.

HO inductible (Hsp32)

HO est l'enzyme limitant la vitesse de dégradation de l'hème en biliverdine (un puissant antioxydant), en fer moléculaire et en monoxyde de carbone. Trois gènes apparentés à copie unique codent pour les isoformes HO : HO-1, HO-2 et HO-3. 108 109 110 HO-1 est une véritable protéine de stress de 32 kDa (Hsp32) induite par divers stress physiologiques, notamment l'hypoxie, l'ischémie/reperfusion, l'hémine, le peroxyde d'hydrogène et plusieurs métaux lourds (sélénium, arsénite, cobalt, cadmium , et les ions stanneux). 108 109 110 La Hsp32 inductible (HO-1), l'isoforme la plus largement exprimée, est présente dans les cellules du myocarde. 111

Hsp32, comme la forme inductible de la NO synthase, médie l'inhibition plaquettaire dépendante de la guanylyl cyclase et la vasodilatation des CMLV. 112 113 114 Cependant, les forces hémodynamiques physiologiquement pertinentes (stress de cisaillement et contrainte cyclique) induisent l'expression de l'ARNm de HO-1 mais pas l'expression inductible de la NO synthase, suggérant une spécificité de cette voie de réponse au stress par rapport aux signaux physiologiques. 115 Le NO libéré de manière endogène ou administré de manière exogène induit une augmentation de 3 à 6 fois de l'expression du gène Hsp32 (HO-1) et de la production de CO dans les CMLV. expression et production de CO dans les CMLV aortiques. 115 Dans les CMLV de rat, le traitement à l'angiotensine II diminue l'expression de l'ARNm de Hsp32 (HO-1) d'une manière dépendante du calcium. 117 Cependant, l'hypertension induite par l'angiotensine II augmente l'expression de l'ARNm de Hsp32 (HO-1) dans l'aorte du rat, suggérant l'influence prépondérante des facteurs hémodynamiques in vivo. 118

Plusieurs voies régulatrices sont impliquées dans l'induction de l'expression du gène Hsp32, notamment les voies HSF1 et du facteur de transcription 1 inductible par l'hypoxie. 119 120 121 122 Bien qu'il n'y ait pas de preuve directe d'une fonction chaperon de Hsp32, sa surexpression dans plusieurs types de cellules protège contre le stress/les dommages oxydatifs. 123 124 125 En conséquence, des études visant à définir les voies régulatrices précises stimulées par les métaux lourds, l'hypoxie et le stress oxydatif pourraient fournir un nouvel aperçu des rôles biologiques de Hsp32 (HO-1) dans la modulation du stress oxydatif/des dommages pendant l'ischémie/la reperfusion, le tonus vasculaire (par exemple, l'hypertension) et l'inhibition de l'agrégation plaquettaire et/ou de la prolifération des CMLV après angioplastie par ballonnet.

Hsp25/27 Chaperon

Après sa découverte en tant qu'inhibiteur de la polymérisation de l'actine, il a été démontré que 126 chaperone Hsp 25/27 (Hsp25 chez la souris et Hsp27 chez l'homme) joue un rôle majeur dans la dynamique des filaments d'actine dans divers types cellulaires. Les stimuli physiologiques (stress oxydatif, cytokines et facteurs de croissance) augmentent considérablement la phosphorylation de la Hsp27 humaine au niveau des résidus Ser15, Ser78 et Ser83, ce qui est essentiel pour la tolérance acquise. 127 128 129 La phosphorylation de Hsp25/27 est catalysée par les MAPK (p38-MAPK, JNK ou SAPK) et ERK. 130 Dans le cœur adulte perfusé, p38-MAPK et JNK/SAPK sont activés après ischémie/reperfusion. 131 En réponse au traitement par ROS, l'activation de p38-MAPK augmente l'activité de la MAPKAP kinase 2, qui phosphoryle Hsp27. 132

Dans les cellules endothéliales humaines, l'inhibition de l'activation de p38-MAPK induite par le facteur de croissance endothélial vasculaire abolit la phosphorylation de Hsp27, la polymérisation de l'actine et la migration cellulaire, suggérant un lien possible entre Hsp27 et l'angiogenèse. 133 Ensemble, les preuves disponibles placent la p38-MAPK en tant qu'activateur en amont de la phosphorylation Hsp25/27 inductible par le stress, et cette voie sous-tend l'effet de la p38-MAPK sur la réorganisation de l'actine filamenteuse, l'accumulation de fibres de stress et le recrutement de vinculine. au niveau des sites d'adhésion focale. 134 Il sera ensuite important de déterminer si Hsp25/27 exerce des actions vasoprotectrices en réponse aux forces hémodynamiques ou aux lésions de la paroi vasculaire. Cependant, l'analyse directe nécessitera probablement un modèle de knock-out du gène Hsp27.

ΑB-Crystallin Chaperon (Hsp22)

Alors que Hsp27 est détectée dans les cellules endothéliales, les CMLV et les cardiomyocytes, le chaperon αB-cristalline est exprimé uniquement dans les cardiomyocytes. 135 Hsp27 et αB-crystallin sont des HSP de bonne foi structurellement apparentées avec une activité de chaperon in vitro mais, contrairement à Hsp70, ne sont pas des protéines de liaison à l'ATP. 136 137 138 139 L'intérêt accru pour la régulation et la fonction de la protéine cristalline αB (Hsp22), une protéine structurelle majeure du cristallin oculaire, est lié à son expression tissulaire restreinte dans les lignées myogéniques striées à haute capacité oxydative, comme le cœur et les fibres musculaires squelettiques de type I. 140 Dans les tissus non lenticulaires, l'expression postnatale de la cristalline αB augmente et atteint ses niveaux les plus élevés dans le cœur adulte (≈1 % à 3 % de la protéine soluble totale), suivie par le muscle squelettique et le rein. 140 Des études immunohistochimiques antérieures ont localisé l'expression la plus élevée de αB-cristalline dans les fibres de conduction cardiaque du cœur adulte. 141 On ignore actuellement si une altération de l'expression de la cristalline αB pourrait entraîner des anomalies du système de conduction, mais soulève une possibilité intrigante.

Bien que l'expression de la cristalline αB ait été localisée dans les bandes Z du cytosquelette, selon un schéma similaire à celui de la desmine et de l'actine, 142 études récentes suggèrent que cette interaction est beaucoup plus transitoire et dynamique par rapport aux cibles intracellulaires, en fonction des conditions physiologiques. Dans les myocytes cardiaques non stimulés, des études biochimiques indiquent que la cristalline B est hautement soluble et reste dans la fraction cytosolique. 142 et IJ Benjamin, données non publiées, 1998). La signification physiologique de la tendance de la αB-cristalline et de la Hsp25/27 à former de grands complexes hétéro-oligomères (500 à 800 kDa) à la fois in vivo et in vitro après des stress physiologiques reste un mystère. 143 144 Bien que le chaperon αB-cristalline fournisse une cytoprotection aux cardiomyocytes, 74 les mécanismes de régulation des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, la glycation et la désacétylation sur la fonction αB-cristalline attendent une analyse directe dans le système cardiovasculaire.

Protéines de stress et développement et différenciation des muscles striés

L'augmentation de l'expression du chaperon HSP à faible poids moléculaire a été décrite au cours de périodes associées à une synthèse protéique accrue, à une dégradation des protéines et à une réorganisation cellulaire, telles que la différenciation myogénique et l'embryogenèse. 145 L'expression tissulaire restreinte de la cristalline αB au cours de la myogenèse du muscle squelettique peut nécessiter la famille MyoD de facteurs de transcription basiques en hélice-boucle-hélice, qui se lient à l'activateur essentiel de la boîte E contenu dans le promoteur de la cristalline αB. 146 147 Nous avons récemment rapporté que l'expression de la cristalline αB, mais pas de Hsp27, est directement liée à l'augmentation du métabolisme oxydatif dans le muscle squelettique après une stimulation nerveuse chronique. 148 Cependant, le rôle physiologique de la régulation positive de l'expression de Hsp27, qui précède la différenciation précoce des cellules souches embryonnaires murines, reste à établir dans les lignées myogéniques. 149

On en sait beaucoup moins sur les mécanismes de régulation impliqués dans l'expression restreinte de la cristalline αB dans les myocytes cardiaques. La αB-Crystallin est abondamment exprimée au début du développement cardiaque à partir du 8,5e jour embryonnaire, suggérant un rôle soit en tant que protéine structurelle, soit en tant que chaperon moléculaire dans la stabilisation des myofibres. 150 Étant donné que les facteurs de type Myo-d sont absents dans le cœur, des études de liaison in vitro d'extraits nucléaires cardiaques ont impliqué les activités transcriptionnelles d'un facteur de stimulation en amont au niveau de l'élément E-box et du facteur de réponse sérique au niveau d'une boîte CArG inverse dans le Promoteur αB-cristalline. 151 Jusqu'à présent, une étude de développement in vivo révèle que l'expression de la αB-cristalline n'est pas affectée dans le muscle squelettique de myf5 souris null ou cœur de souris null d-HAND au jour embryonnaire 9,0 (I.J. Benjamin, données non publiées, 1998). 152 153

Autres chaperons cytosoliques/nucléaires

Plusieurs autres HSP qui existent dans le compartiment cytosolique/nucléaire présentent un intérêt potentiel en biologie cardiovasculaire. Par exemple, la protéine cytosolique de 20 kDa, p20, est abondamment exprimée dans le cœur, le squelette et les muscles lisses et se copurifie avec les chaperons αB-crystallin et Hsp27. 154 155 Bien que l'expression de p20 ne soit induite ni par la chaleur ni par un stress chimique, elle contient le « domaine α-cristallin » homologue C-terminal partagé par tous les membres des petites HSP de PM. 138 Dans les CMLV, p20 est un substrat pour les protéines kinases cAMP et cGMP, suggérant un rôle régulateur des fonctions postulées dans le maintien physiologique du tonus vasculaire et l'adaptation aux lésions de la paroi vasculaire. 156

Un quatrième membre des petites HSP (outre Hsp27, αB-crystallin et p20), une protéine de liaison à la protéine kinase de la dystrophie myotonique associe et augmente l'activité de la protéine kinase de la dystrophie et empêche sa dénaturation induite par la chaleur in vitro. 157 La protéine kinase de la dystrophie myotonique, contrairement à la Hsp27 ou à la cristalline αB, est régulée positivement dans le muscle squelettique des patients atteints de dystrophie myotonique, suggérant que cette nouvelle protéine pourrait être impliquée dans la pathogenèse de cette maladie. 157

Les membres de la famille Hsp110 présentent des fonctions de chaperon et de cytoprotection, bien que des détails sur leur expression relative dans les cellules du myocarde et leur distribution régionale dans le système cardiovasculaire attendent une caractérisation plus poussée. 158 Les autres membres de la famille Hsp110 incluent Hsp105, Apg-1 et Osp94. 159 160 161 Il existe un vif intérêt pour l'identification d'un homologue mammifère de la levure Hsp104, qui, au lieu d'empêcher l'agrégation des protéines, semble resolubiliser les agrégats de protéines insolubles. 162

Système de chaperon mitochondrial Hsp70

Tous les organismes possèdent des mécanismes dépendants de l'ATP pour le repliement et l'assemblage des protéines au sein des organites. 11 13 La translocation de protéines à travers la membrane mitochondriale nécessite un chaperon mitochondrial Hsp70 dans la matrice, où le repliement à l'état natif est terminé 13 (voir Figure 1 ).

Système de chaperonine mitochondriale

Outre les chaperons de type Hsp70, les chaperonines mitochondriales Hsp60 et Hsp10 constituent un système distinct qui fournit un environnement séquestré pour le repliement d'un sous-ensemble de protéines in vivo. 163 Ces anneaux à 7 chaînons sont disposés sous forme de structures cylindriques dans lesquelles le repliement des protéines ATP-dépendantes se produit dans leur cavité centrale. 164 Les preuves issues d'études in vitro suggèrent que les chaperons Hsp70 et les systèmes de chaperonines fonctionnent en coopération dans le repliement et l'assemblage des protéines chez les eucaryotes (examiné dans la référence 13 13 ).

Système de chaperonine cytosolique

La chaperonine TRiC est considérée comme l'équivalent fonctionnel de la chaperonine Hsp60/Hsp10 dans le cytosol eucaryote. Le complexe TRiC, qui se compose de doubles anneaux à 8 ou 9 chaînons de sous-unités ≈55 à 65 kDa, est requis pour le repliement de l'actine et de la tubuline in vivo. 165 Chaperonin TRiC nécessite des composants supplémentaires, tels que Hsp40, qui stimule l'ATPase Hsc70, pour le repliement des protéines dans le cytosol 77 166 (voir Figure 2). Les preuves disponibles suggèrent que la chaperonine TRiC fonctionne dans les étapes finales du repliement pendant la traduction d'un nombre limité de domaines polypeptidiques. 13

Implications

Les chaperons et chaperonines mitochondriales ne sont que modestement induits par le stress physiologique dans les cardiomyocytes et le cœur. 167 Cependant, la localisation des chaperons et des chaperonines mitochondriales Hsp70 sur les principaux sites de production de ROS pourrait servir à compléter les mécanismes de défense enzymatiques et non enzymatiques pour diminuer les lésions oxydatives et augmenter le taux de récupération physiologique après une lésion ischémique. 168 169 On ignore actuellement si la surexpression du chaperon mitochondrial Hsp75 ou de la chaperonine peut fournir une protection équivalente ou supérieure contre les lésions ischémiques. Une autre question importante est de savoir si les fonctions chevauchantes des chaperons Hsp70 et des systèmes de chaperonines Hsp60 ou TRiC/Hsp40 sont coordonnées pour le repliement de novo des protéines et la cytoprotection potentielle au cours de la pathogenèse des maladies cardiaques.

Chaperons moléculaires aux urgences

Protéines régulées par le glucose

L'analyse des chaperons du RE peut être d'un intérêt clinique particulier, car le RE fonctionne pour dégrader ou réparer les protéines endommagées après une ischémie myocardique ou après que des protéines mutantes (par exemple, CFTR ou thyroglobuline) ne se replient pas correctement. 11 170 171 L'anoxie, la privation de glucose et les ionophores de calcium induisent des membres de la classe de protéines de stress régulées par le glucose se liant au Ca 2+, Grp170, Grp94 et Grp78/BiP. 11 172 Des changements variables dans l'expression de la protéine Grp78 ont été rapportés après une ischémie. 173 174 Bien que la « culpabilité par association » avec les chaperons cytosoliques soit le rôle présumé de la fonction Grp chaperon dans la surveillance des protéines et le contrôle qualité, des études supplémentaires sur leur expression sont nécessaires dans les états physiopathologiques associés à l'expression, à la glycosylation post-traductionnelle et à la sécrétion de protéines anormales via la voie ER-Golgi.

Hsp47 Chaperons

La glycoprotéine de liaison au collagène de 47 kDa Hsp47 est un membre de la superfamille des serpines (inhibiteur de la protéase à sérine) et est fortement induite par le stress thermique ou les états physiopathologiques (par exemple, la fibrose hépatique) associés à une synthèse accrue de collagène. 175 Hsp47 réside dans le RE et contient le signal de rétention du RE C-terminal Arg-Asp-Glu-Leu. 176 Hsp47 se lie transitoirement aux types de collagène I à IV et avidement aux substrats de collagène dénaturé, ainsi, son rôle dans le traitement et le transport du procollagène semble fermement établi. 177 Les études futures doivent maintenant aborder la pertinence biologique et clinique probable de l'expression de Hsp47 au début et à la progression des états physiopathologiques, tels que l'infarctus du myocarde, les cardiomyopathies idiopathiques et hypertrophiques et l'hypertension, dans laquelle la fibrose myocardique est en évidence. 178

Défis actuels et orientations futures

La récupération physiologique du cœur ischémique commence en quelques minutes, mais le taux de réparation ischémique cellulaire, qui peut durer de quelques jours à plusieurs semaines, est essentiel pour la réduction de la morbidité et de la mortalité cardiovasculaires ultérieures. L'idée que les protéines de stress peuvent accélérer la récupération physiologique d'une lésion myocardique réversible est basée sur des preuves expérimentales indiquant que plusieurs « signaux » immédiats peuvent activer la réponse au choc thermique et, ainsi, évoquer les mécanismes de protection endogènes des Hsp. Les événements cliniques majeurs tels que l'angor instable, l'occlusion récurrente après un traitement thrombolytique et l'exacerbation aiguë de l'angor chronique sont des inducteurs physiologiques potentiels des protéines de stress cytoprotectrices. La prochaine étape logique serait d'envisager la possibilité que des membres apparentés de la famille des protéines de stress multigénique confèrent des avantages fonctionnels similaires ou supplémentaires. Parce que l'ischémie et d'autres perturbations physiologiques perturbent les relations structure-fonction normales des protéines intracellulaires, les futures études doivent établir si les chaperons moléculaires, seuls ou en combinaison, atténuent les dommages ischémiques en accélérant la récupération physiologique de la cellule myocardique dans l'organisme intact.

Modèles expérimentaux pour la recherche sur les protéines de stress

Modèles transgéniques de surexpression de Hsp70 (gain de fonction) et hsf1-les souris déficientes (perte de fonction), et leur caractérisation ultérieure, commencent à éclairer leurs rôles physiologiques in vivo. 16 17 18 36 Une direction passionnante de ces efforts pourrait conduire à des approches intégrées des rôles physiologiques de systèmes entiers ou de réseaux de régulation dans des modèles animaux génétiquement modifiés de maladies humaines. Cependant, la richesse des connaissances existantes sur les études physiologiques chez les animaux plus gros que la souris ne doit pas être négligée. Des études visant à définir le rôle de l'expression de HSP dans l'étourdissement du myocarde à l'aide d'animaux conscients pourraient justifier le développement de modèles transgéniques de rat et de lapin. Les limitations potentielles de telles stratégies incluent des coûts considérablement plus élevés dus aux périodes de gestation plus longues, un temps plus long pour atteindre la maturité sexuelle et des portées plus petites de ces espèces plus grandes. Cependant, les chercheurs ayant une expertise en biologie moléculaire et en physiologie moléculaire qui entreprennent des projets collaboratifs augmentent les chances de succès, tout en évitant la duplication des efforts.

L'expression inductible par le stress des gènes HSP affecte-t-elle la taille de l'infarctus, l'arythmogenèse et le remodelage myocardique après un infarctus aigu du myocarde ?

Des études antérieures ont démontré qu'un prétraitement (24 heures) avec un stress thermique atténue la libération de radicaux libres dans le cœur de rat isolé 95 et réduit le nombre d'arythmies, une caractéristique fonctionnelle majeure des lésions d'ischémie/reperfusion (examiné dans la référence 92 92). Ensemble, ces études corrèlent les interactions potentielles entre ces voies protectrices mais sont insuffisantes pour établir une relation de cause à effet. Le développement d'un modèle de souris knockout pour le gène HSF1 fournit une approche expérimentale puissante pour déterminer si une déficience dans la synthèse de HSP induite par le stress, lors de perturbations physiologiques telles que l'ischémie myocardique, affecte le résultat des lésions post-infarctus et les mécanismes de réparation dans l'organisme intact. Les résultats de ces études peuvent aider à établir la causalité, à élucider les mécanismes potentiels par lesquels la synthèse des HSP est liée à l'ischémie myocardique et à évaluer la participation des protéines de stress au cours du préconditionnement ischémique précoce et tardif. La caractérisation en temps opportun de plusieurs modèles knock-out, actuellement en cours de développement dans des laboratoires du monde entier, devrait continuer à favoriser des collaborations fructueuses entre les chercheurs. 179 De nouveaux progrès devraient accélérer le flux de nouvelles connaissances dans des domaines connexes tels que la fibrose post-ischémique réactive et réparatrice, 180 l'inflammation postreperfusion, 181 et l'étourdissement du myocarde. 89 182

Expression des protéines de stress et mécanismes du préconditionnement ischémique

Le préconditionnement ischémique est la manœuvre expérimentale la plus puissante qui protège de manière reproductible le cœur contre une provocation ischémique ultérieure. 183 Cependant, il existe une controverse sur les rôles précis des protéines de stress dans ce phénomène bien caractérisé. 184 Plusieurs mécanismes impliquant la protéine kinase C, les récepteurs de l'adénosine et leurs relations avec les voies de transduction du signal ont été impliqués dans le préconditionnement ischémique. 185 Des preuves suffisantes indiquent un manque de corrélation entre l'expression inductible par le stress (par exemple, Hsp70) et le préconditionnement précoce, qui est de courte durée et dure entre 1 et 3 heures, selon le modèle et l'espèce. 186

La famille chaperon des protéines de stress est-elle peu susceptible d'avoir une pertinence physiologique dans le préconditionnement précoce ?

À notre avis, les études dans ce domaine ont soit rejeté prématurément, soit accordé une attention insuffisante à l'importance potentielle des petites Hsp de MW, telles que la cristalline αB et la Hsp27. Ces chaperons semblent susceptibles d'être des candidats à la « première ligne de défense » contre le stress non létal. On ignore actuellement si l'oligomérisation de petites Hsp de MW contribue à la stabilité mécanique ou au rôle supposé du cytosquelette dans la protection ischémique du myocyte cardiaque. 187 188 Les modèles de knock-out du gène αB-crystallin et Hsp27, actuellement en cours de développement, pourraient répondre directement à cette hypothèse.

De même, des études sont nécessaires pour étudier la corrélation entre le préconditionnement tardif et l'expression des protéines de stress. Vingt-quatre heures après un stress ischémique initial, plusieurs études ont rapporté des augmentations de la synthèse de Hsp60 et Hsp70 chez le lapin, 41 Hsp70 chez le porc, 182 et manganèse-SOD chez le chien 189 190 et une tolérance ischémique retardée ou un préconditionnement tardif. Par conséquent, une question fondamentale est de savoir s'il existe une relation directe entre l'expression des protéines de stress et le préconditionnement tardif. 191 192 193 Une évaluation plus détaillée du rôle spécifique de chaque Hsp dans la cardioprotection est également requise. Des tentatives pour déterminer le mécanisme du canal potassique cardioprotecteur sensible à l'ATP par l'utilisation d'inhibiteurs ont trouvé un manque de corrélation avec l'expression de la protéine de stress Hsp70. 194 Cependant, les approches utilisant des inhibiteurs spécifiques sont inadéquates pour établir la spécificité, à un certain degré de certitude, au-delà des protéines à l'étude. 195

Chaperons moléculaires et voies de mort cellulaire

Les protéines de stress sont des candidats idéaux pour jouer des rôles régulateurs clés dans les voies de survie et de mort cellulaires impliquant des dommages à l'ADN et la synthèse, la réparation et la dégradation des protéines. Les manœuvres qui augmentent l'expression de Hsp70 après un choc thermique, l'exposition au butyrate de sodium et la surexpression constitutive ou régulée inhibent l'apoptose dans divers types de cellules. 196 197 198 Le proto-oncogène c-myc potentialise l'apoptose induite par le choc thermique 199 200 en revanche, la surexpression de Bcl-2 augmente la survie cellulaire induite par la thermotolérance. 201 L'expression tissu-spécifique de Hsp70-2 empêche l'apoptose dans certaines cellules mitotiques grâce à un mécanisme impliquant le contrôle du cycle cellulaire. La fonction chaperon de 202 Hsp70 dans la régulation de l'apoptose peut se situer au niveau de la transduction du signal, car elle a été impliquée dans la voie de la kinase activée par le stress. 203

Des études récentes dans notre laboratoire utilisant hsf1-les cellules cultivées déficientes ont établi le rôle des Hsp inductibles par le stress pour rendre les cellules thermotolérantes à l'apoptose induite par la chaleur. 36 La présente étude fournit un modèle génétique pour examiner les relations interdépendantes potentielles entre les Hsp inductibles par le stress et les mécanismes impliqués dans les voies de survie et/ou de mort cellulaire. Le stress thermique sublétal protège les mitochondries contre le stress oxydatif et prévient la mort cellulaire par apoptose. 204 Compte tenu de leurs emplacements stratégiques dans tous les principaux organites, il est tentant de spéculer que plusieurs Hsp peuvent combattre le stress/dommages oxydatifs en repliant les répresseurs endommagés de la voie de mort cellulaire ou en empêchant leur dégradation. Alternativement, réprimer la libération d'activateurs suicidaires tels que le cytochrome c pourrait se produire par le biais d'interactions avec des chaperons et des chaperonines mitochondriales (Figure 1 ).

De plus, les résultats de plusieurs études récentes ont impliqué le petit MW Hsp25/27 dans les voies de survie cellulaire impliquant la différenciation cellulaire et le stress/dommages oxydatifs. Des études antérieures ont démontré que la surexpression de Hsp25/27, comme la protéine anti-apoptotique Bcl-2, augmente les niveaux de glutathion antioxydant et la résistance à l'apoptose médiée par Fas/APO-1, bien que cela ne se produise pas directement. 205 Le retrait des cellules souches embryonnaires de souris du cycle cellulaire induit une régulation à la hausse de l'ARNm Hsp25/27, qui s'accompagne d'une diminution de la phosphorylation et d'une augmentation de l'oligomérisation de la protéine Hsp25/27. 149 La réduction antisens de Hsp25/27 inverse ces changements par la prolongation du cycle cellulaire, la réduction des niveaux de glutathion et l'accélération vers l'apoptose. Ensemble, ces découvertes provocatrices suggèrent que pendant la prolifération et la différenciation des cellules du myocarde, le chaperon Hsp25/27, et d'autres, peuvent réduire le stress/dommages oxydatifs et prévenir l'apoptose grâce à un nouveau mécanisme redox-dépendant. 206

L'expression inductible par le stress des gènes HSP affecte-t-elle l'histoire naturelle des maladies cardiovasculaires chroniques, y compris le vieillissement ?

De nombreuses études ont corrélé l'induction de l'expression de Hsp et la surcharge de pression par cerclage aortique, l'hypertension aiguë, l'exposition à des agents vasoactifs ou l'hypertrophie ventriculaire gauche et l'expression du facteur de croissance dans plusieurs types cellulaires. 207 208 209 Des diminutions de l'expression des gènes HSP et de l'activité de liaison à l'ADN de HSF1 se produisent au cours du processus de vieillissement dans le myocarde des rongeurs. 210 De plus en plus de preuves suggèrent que le stress/les dommages oxydatifs peuvent être un facteur causal majeur dans le processus de vieillissement. 211 Le niveau de stress oxydatif et la sensibilité des tissus au stress oxydatif induit expérimentalement semblent augmenter au cours du processus de vieillissement. On ignore actuellement si les quantités accrues de dommages oxydatifs moléculaires, observées au cours du processus de vieillissement, sont causalement associées à une diminution de l'activité de HSF1 et, par implication, l'expression du gène Hsp. La disponibilité de modèles transgéniques et de gènes knock-out permettra à de futures études d'établir le rôle de l'expression génique du choc thermique induite par le stress au cours du vieillissement normal ou de l'adaptation physiologique aux facteurs de risque cardiaques associés à la maladie.

Chaperons moléculaires dans les états de maladie cardiaque causés par l'expression de protéines mutantes

Des niveaux élevés de protéines mal repliées ou dénaturées, ainsi que la micro-injection de protéines anormales, sont de puissants inducteurs de l'expression du gène HSP. 14 59 Des études récentes indiquant que le chaperon Hsc70 interagit indirectement avec le CFTR hébergeant la mutation de repliement commune ΔF508 appuient cette notion générale de leur rôle biologique dans les maladies humaines. 20

Du point de vue de la biologie chaperon, les maladies cardiaques qui résultent de mutations dans les gènes codant pour des composants de l'appareil contractile ou des protéines des canaux ioniques sont essentiellement des problèmes de protéines anormales. De multiples mutations de protéines sarcomériques ont été impliquées dans la pathogenèse de la cardiomyopathie hypertrophique familiale, y compris les chaînes lourdes et légères de la myosine, les sous-unités de la troponine I et T, la protéine C liant la myosine et la tropomyosine (référence 6 6 et revue dans la référence 7 7 ). Alors que le chaperon Hsp27 joue un rôle dans la polymérisation de l'actine et que la chaperonine TRiC est impliquée dans le repliement de l'actine et de la tubuline, le rôle physiologique des systèmes chaperon et chaperonine dans le repliement et l'assemblage des structures sarcomères, dans des conditions normales ou en cas de maladie, reste un mystère. En théorie, les chaperons peuvent influencer la réparation ou la dégradation des protéines sarcomères mutantes, ce qui, en fin de compte, affecte les relations structure-fonction et le phénotype de la maladie. 212 Des analyses in vitro sont d'abord nécessaires pour déterminer si la fonction chaperon peut affecter le repliement productif des protéines causé par les mutations pertinentes, ce qui peut être validé dans des modèles animaux appropriés. 18 213

Chaperons moléculaires en biologie vasculaire

De nombreuses opportunités existent pour disséquer les fonctions de chaperon lors de la synthèse et de la sécrétion de peptides et protéines actifs biologiques, de la prolifération cellulaire, de la signalisation intracellulaire et du réarrangement du cytosquelette. Les résultats de telles études peuvent identifier les cibles protéiques HSP spécifiques et la spécificité parmi les divers types de cellules dans la promotion des effets protecteurs vasculaires des œstrogènes. 214 215 Les rôles essentiels de Hsp90 et des cochaperons dans la biologie des récepteurs stéroïdiens suggèrent que les chaperons HSP jouent un rôle cliniquement significatif dans les effets de l'hormonothérapie substitutive chez les femmes ménopausées. 216 217 Des études épidémiologiques ont montré que le bénéfice protecteur contre les maladies coronariennes chez les femmes préménopausées est aboli dans les années postménopausées. 218 219 220 Les actions protectrices potentielles de l'œstrogène ont été attribuées à ses propriétés antioxydantes et vasoprotectrices, à la diminution des lipides sanguins et des lipoprotéines, et à ses effets directs sur la paroi vasculaire. 221 Il sera important de définir si l'expression de Hsp inductible par le stress chez les souris génétiquement modifiées joue un rôle dans la réponse vasculaire aux blessures chez les animaux mâles et femelles. 215

Chaperon moléculaire et maladies immunologiques

Contrairement à leurs rôles cytoprotecteurs bien établis, certaines protéines de stress ont été impliquées dans la pathogenèse des maladies cardiovasculaires. Par exemple, des taux sériques élevés d'anticorps contre l'homologue bactérien de la Hsp60 de mammifère ont été démontrés chez des patients atteints de cardiomyopathie et de diabète, chez des individus asymptomatiques présentant une sténose carotidienne et dans des lésions athéroscléreuses chez le lapin et l'homme (examiné dans la référence 222 222). Une hypothèse est que la maladie auto-immune résulte d'une réactivité croisée de peptides immunogènes, qui sont dérivés de chaperons bactériens et mitochondriaux et de Hsp60 (chaperonine) et sont reconnus par les lymphocytes T γ/δ activés. 223 224 Réponses immunitaires humorales et marqueurs séropositifs contre la famille Hsp70 (notamment ER Grp78 et Hsc70) du parasite protozoaire Trypanosoma cruzi ont été impliqués dans la pathogenèse de la maladie de Chagas, 224A la cause la plus fréquente d'insuffisance cardiaque congestive en Amérique latine (voir Tableau ). Bien que ces études corrélatives aient des limites inhérentes, les futures recherches visant à établir la causalité pourraient ouvrir des voies pour développer des vaccins ou d'autres thérapies innovantes pour le traitement et la prévention.

Applications thérapeutiques potentielles des chaperons moléculaires

Les stratégies qui pourraient augmenter le taux de récupération physiologique après un étourdissement post-infarctus et un dysfonctionnement ventriculaire restent des objectifs importants dans la prise en charge des patients atteints d'infarctus aigu du myocarde. Étant donné que les manœuvres utilisant l'hyperthermie tissulaire ou corporelle totale sont lourdes et peu pratiques chez l'homme conscient, les stratégies pharmacologiques qui augmentent l'expression des protéines de stress pour une protection isotherme ont un intérêt potentiel contre les lésions ischémiques du cœur, des reins et du cerveau. Les inhibiteurs du protéasome, qui élèvent de manière transitoire le niveau de protéines dépliées à l'intérieur des cellules, constituent une approche potentielle. 225 Des approches alternatives peuvent impliquer le développement de petites molécules et de peptides 226 226A qui imitent les actions in vivo des chaperons avec des avantages thérapeutiques.

Points de vue

Le rôle des protéines de stress dans la cardioprotection a été reconnu comme l'une des directions futures les plus importantes de la recherche sur les cardiopathies ischémiques.227 Étant donné que le nombre de personnes touchées est si important, une intervention thérapeutique qui contribue à un petit changement dans la morbidité et la mortalité post-infarctus du myocarde, par exemple, peut avoir des effets dramatiques sur les résultats cliniques globaux. Les possibilités d'aborder les rôles physiologiques des chaperons cytoprotecteurs dans les maladies cardiaques doivent être élargies pour inclure leurs rôles probables dans les maladies chroniques (athérosclérose, hypertension, diabète, troubles génétiques et cardiopathie valvulaire) qui convergent par des voies communes, entraînant une insuffisance cardiaque et mort subite. Des alliances stratégiques entre équipes de recherche pourraient forger de nouvelles directions et accélérer les progrès dans ce domaine prometteur, qui, à terme, pourrait réussir à exploiter des voies endogènes pour améliorer la santé physiologique et réduire l'attrition physiologique associée aux maladies cardiovasculaires.

Abréviations et acronymes sélectionnés

CFTR=régulateur de conductance transmembranaire de mucoviscidose
urgence=réticulum endoplasmique
ERK=kinase réactive extracellulaire
Grp=protéine liée au glucose
HO=hème oxygénase
Hsc=choc thermique apparenté
HSF=facteur de transcription de choc thermique
HSP=famille de choc thermique de protéines de stress
Hsp=protéine de choc thermique
JNK=c-Jun N-terminal kinase
MAPK=protéine kinase activée par un mitogène
MAPKAP=Protéine kinase activée par MAPK
MW=masse moléculaire
ROS=les espèces réactives de l'oxygène
SAPK=protéine kinase activée par le stress
TRic=Complexe en anneau TCP-1
VSMC=cellule musculaire lisse vasculaire

Figure 1. Un résumé des principaux signaux physiopathologiques qui activent la synthèse des HSP (à gauche de la ligne continue verticale) et les fonctions potentielles des HSP (à droite de la ligne continue verticale). Les lésions cellulaires se manifestent par une génération accrue de ROS, la disponibilité de fer redox-actif, la peroxydation des lipides membranaires et des dommages aux protéines, entre autres. 92 Les sources extracellulaires de ROS (A) pourraient être des cellules endothéliales, des CMLV et même des myocytes dans les tissus environnants. Le transport d'électrons mitochondriaux d'oxygène moléculaire (B) pourrait être la principale source intracellulaire de génération de ROS. Le calcium libre intracellulaire (C), qui augmente de 10 fois dans les 10 minutes suivant la reperfusion, 228 229 a été impliqué dans l'activation des protéases (D), qui, à leur tour, sont censées contribuer aux lésions myocardiques intracellulaires. 230 231 232 Les lésions du cytosquelette (E) sont un événement précoce de lésion ischémique, qui provoque un dysfonctionnement ventriculaire ou un « étourdissement myocardique » lorsque la lésion est réversible. 87 Les lésions myocardiques pourraient également résulter du recrutement de leucocytes polymorphonucléaires (PMN) par de multiples mécanismes dans le territoire ischémique et par la libération de radicaux libres dérivés de l'oxygène (A), d'enzymes lysosomales cytotoxiques (F), de protéases extracellulaires (G) et de complément activation (H) (examiné dans la référence 233). On pense que divers signaux physiologiques activent le HSF1 inductible par le stress (I), qui se lie à l'élément de choc thermique spécifique à la séquence (HSE) (J), contenu dans les promoteurs de tous les HSP (K). Bien que le mécanisme précis de la protection ischémique médiée par Hsp70 soit mal compris, il est largement attribué à la propriété biologique des « chaperons moléculaires », qui sont proposés pour aider à l'assemblage ou à la réparation de protéines nouvellement synthétisées ou endommagées. 11 234 235 En termes physiologiques, les fonctions potentielles des chaperons moléculaires dans le cœur ischémique sont les suivantes : repliement des protéines des polypeptides nouvellement synthétisés essentiels au maintien du métabolisme oxydatif après une lésion des myocytes (L), protection des mitochondries contre les ROS et les cytokines telles que le TNFα 204 236 et translocation de protéines nouvellement synthétisées pendant la réparation des organites (M), réparation des protéines structurelles critiques après des altérations cytosquelettiques induites par l'ischémie (N), 237 recyclage des vésicules membranaires (Hsc70) (O), transport de sous-produits toxiques potentiels pour la dégradation par le protéasome (P), 78 238 239 suppression des cytokines pro-inflammatoires telles que la pro-interleukine-1β (Q), 204 236 240 suppression de la NADPH oxydase et de l'explosion oxydative par la réponse au choc thermique (R), 241 protection par la production de NO à partir de la synthèse inductible de l'expression de HSP (S), 61 242 243 244 245 246 prévention de l'apoptose soit par le chaperon mitochondrial Hsp60 liaison du cytochrome c et/ou Hsp70 liaison de cibles cytosoliques (T), 36 204 réparation du canal ionique (U), synthèse de collagène par le chaperon Hsp47 pour la fibrose réparatrice (V), 180 et modulation de la lésion ischémique à médiation immunitaire (W). 241

Figure 2. Un schéma proposé pour le cycle de réaction du complexe chaperon Hsc70 dans le repliement d'un substrat hypothétique dans la cellule. À partir du bas de la figure, le chaperon Hsc70 (A) se compose d'une ATPase N-terminale et d'un domaine C-terminal pour la liaison au substrat cible. Hsp40 (B), l'homologue eucaryote de DnaJ, se lie d'abord aux protéines dépliées (UP) (C), puis se lie à Hsc70.ADP, ou se lie au complexe Hsc70.ADP.UP (D), qui a un faible hors tarif pour les UP. Plusieurs destins différents pour le complexe Hsc70.ADP.UP sont envisagés, chacun dépendant du remplacement de Hsp40 par différents partenaires accessoires, en particulier Hip (protéine interagissant avec Hsc70), Hop (protéine organisant Hsc70/Hsp90) et Hap (protéine accessoire Hsc70). 166 247 248 Après la libération de Hsp40, Hip se lie au domaine ATPase de Hsc70 (E), stimule son activité, puis reste lié pour stabiliser le complexe ADP-Hsc70-substrat, suggérant qu'il pourrait jouer un rôle dans le transport des substrats dans les cellules (F). 166 Hop sert de lieur physique entre Hsc70 et Hsp90 (G), vraisemblablement pour faciliter le transfert d'UP entre ces chaperons. Que Hop modifie ou non l'activité ATPase de Hsc70 est controversé. 249 La fonction de Hup, qui stimule la libération d'UPs de Hsc70 (H) et convertit les oligomères de Hsc70 en monomères (I), reste à établir. L'énergie transférée de l'hydrolyse de l'ATP, l'étape limitante du cycle chaperon eucaryote, est utilisée dans des cycles successifs pour aider au repliement et empêcher l'agrégation et la dégradation. À cette fin, deux protéines apparentées, BAG-1 (non illustrées) et Hap (J), qui se lient au domaine Hsc70 ATPase, inhibent également la liaison de Hsp70 au substrat protéique déplié in vitro, suggérant que ces protéines peuvent jouer un rôle dans le maintien contrôle de la qualité en orientant les interactions non productives vers la dégradation 250 (illustration aimablement fournie par LE Hightower, Université du Connecticut, Storrs).

Tableau 1. Principales classes de HSP en biologie cardiovasculaire

mHsp75 indique Hsp75 HIF-1 mitochondrial, facteur de transcription 1 inductible par l'hypoxie et MKBP, protéine kinase de la dystrophie myotonique.

Le Dr Benjamin a été soutenu par la Fondation américaine pour la recherche médicale, les National Institutes of Health et un prix de chercheur établi de l'American Heart Association. Nous remercions R. S. Williams, R. Meidell, A. Davis, P. Thomas et R. Sohal pour leurs commentaires critiques concernant notre manuscrit.


Publications

Ces dernières années ont vu une amélioration spectaculaire de la méthodologie de conception de protéines. Néanmoins, la plupart des méthodes nécessitent l'intervention d'experts, ce qui limite leur adoption à grande échelle. En revanche, l'algorithme PROSS pour améliorer la stabilité des protéines et les niveaux d'expression hétérologues a été appliqué avec succès à une gamme d'enzymes et de protéines de liaison difficiles. Ici, nous comparons l'application de PROSS en tant qu'outil autonome pour les scientifiques des protéines n'ayant pas ou peu d'expérience en modélisation. Douze laboratoires du Partenariat de production et de purification de protéines en Europe (P4EU) ont défié l'algorithme PROSS avec 14 cibles protéiques indépendantes sans le soutien des développeurs de PROSS. Pour chaque cible, jusqu'à six modèles ont été évalués pour les niveaux d'expression et, dans certains cas, pour la stabilité thermique et l'activité. Dans neuf cibles, les conceptions présentaient des niveaux d'expression hétérologues accrus dans des systèmes d'expression procaryotes et/ou eucaryotes dans des conditions expérimentales adaptées à chaque protéine cible. De plus, nous avons observé une stabilité thermique accrue dans neuf des dix cibles testées. Dans deux exemples principaux, le facteur de cellules souches humaines (hSCF) et le domaine humain de type cadhérine (CLD12) du récepteur RET, les protéines de type sauvage n'étaient pas exprimables en tant que protéines solubles dans E. coli, mais les conceptions PROSS présentaient des niveaux d'expression élevés dans les cellules E. coli et HEK293, respectivement, et une stabilité thermique améliorée. Nous concluons que PROSS peut améliorer la stabilité et l'expressibilité dans divers cas, et que l'amélioration nécessite généralement des conditions d'expression spécifiques à la cible. Cette étude démontre les forces des efforts déployés à l'échelle de la communauté pour sonder la généralité des nouvelles méthodes et recommande des domaines de recherche future pour faire progresser des algorithmes pratiques utiles pour la science des protéines.

Les sites fonctionnels de nombreuses familles de protéines sont dominés par diverses régions du squelette qui manquent de structure secondaire (boucles) mais se replient de manière stable dans leur état fonctionnellement compétent. Néanmoins, la conception de régions de boucles structurées à partir de zéro, en particulier dans des sites fonctionnels, s'est heurtée à de grandes difficultés. Nous avons donc développé une approche, appelée AbDesign, pour exploiter la modularité naturelle de nombreuses familles de protéines et assembler informatiquement un grand nombre de nouveaux squelettes en combinant des fragments modulaires naturels. Cette stratégie a produit de grandes protéines atomiquement précises et très efficaces, y compris des anticorps et des enzymes présentant des dizaines de mutations de n'importe quelle protéine naturelle. L'espace de conformation du squelette combinatoire auquel AbDesign peut accéder, même pour une famille d'homologues de taille modeste, peut dépasser la diversité dans l'ensemble de la PDB, offrant le niveau de contrôle inférieur au positionnement des groupes de sites actifs qui est nécessaire pour obtenir protéines hautement actives. Ce manuscrit décrit comment implémenter le pipeline à l'aide d'un code disponible gratuitement sur https://github.com/Fleishman-Lab/AbDesign_for_enzymes .

Notre capacité à concevoir des activités biomoléculaires nouvelles ou améliorées dépend de la compréhension des relations séquence-fonction dans les protéines. La grande taille et la complexité des plis de la plupart des protéines, cependant, obscurcissent ces relations, et les méthodes d'optimisation des protéines continuent de s'appuyer sur des itérations expérimentales laborieuses. Récemment, une meilleure compréhension des rôles des effets de seuil de stabilité et de l'épistasie biomoléculaire dans les protéines a conduit au développement de méthodes hybrides qui combinent l'analyse phylogénétique avec des calculs de conception atomistique. Ces méthodes permettent une optimisation fiable et même en une seule étape de la stabilité, de l'expressibilité et de l'activité des protéines dans les protéines qui ont été considérées en dehors de la portée de la conception informatique. De plus, la reconstruction de séquence ancestrale produit des informations sur les chaînons manquants dans l'évolution des enzymes et des liants qui peuvent être utilisés dans la conception de protéines. Grâce à la combinaison de calculs phylogénétiques et atomistiques, l'objectif de longue date des méthodes de calcul générales qui peuvent être universellement appliquées pour étudier et optimiser les protéines semble enfin à portée de main.

De nombreux agents pathogènes humains utilisent des récepteurs à la surface de la cellule hôte pour se fixer et envahir les cellules. Souvent, l'affinité de l'interaction hôte-agent pathogène est faible, ce qui présente des opportunités de bloquer l'invasion à l'aide d'un imitateur soluble de haute affinité de la protéine hôte. L'homologue 5 de la protéine liant les réticulocytes de Plasmodium falciparum (RH5) constitue un candidat intéressant pour le mimétisme : il est hautement conservé et son affinité modérée de liaison au récepteur humain basigine (K
D ≥1 M) est une étape essentielle dans l'invasion des érythrocytes par ce parasite du paludisme. Nous avons utilisé l'analyse mutationnelle profonde d'un fragment soluble de basigine humaine pour caractériser systématiquement les mutations ponctuelles qui améliorent l'affinité de la basigine pour RH5, puis nous avons utilisé Rosetta pour concevoir une variante dans l'espace de séquence des mutations améliorant l'affinité. La conception résultante à sept mutations présentait une affinité 1900 fois plus élevée (K
D environ 1 nM) pour RH5 avec un taux de liaison très lent (0,23 h
-1) et réduit la concentration efficace d'inhibition de la croissance de Plasmodium d'au moins 10 fois par rapport à la basigine humaine. La conception fournit un point de départ favorable pour concevoir des améliorations à la vitesse qui sont susceptibles d'être essentielles pour atteindre une inhibition de la croissance thérapeutiquement efficace.

La stabilisation de la glycoprotéine d'enveloppe métastable (Env) du VIH-1 est supposée améliorer l'induction d'anticorps largement neutralisants. Nous avons amélioré le rendement d'expression et la stabilité de la glycoprotéine d'enveloppe du VIH-1 BG505SOSIP.664 gp140 au moyen d'une séquence automatisée précédemment décrite et d'une approche de thermostabilisation computationnelle guidée par la structure, PROSS. Cela combine des informations de conservation de séquence avec une évaluation informatique de la stabilisation des mutants, tirant ainsi parti de la vaste variation de séquence naturelle présente dans HIV-1 Env. PROSS est utilisé pour concevoir trois variantes de gp140 avec 17 à 45 mutations par rapport à la construction parentale. On a observé expérimentalement que l'un des modèles présentait une amélioration du rendement par quatre et un incrément de 4 °C de la thermostabilité. De plus, les immunogènes conçus ont des profils d'antigénicité similaires à ceux de la version native du lieur flexible de type sauvage, BG505SOSIP.664 gp140 (NFL Wt) aux principaux épitopes ciblés par des anticorps largement neutralisants. PROSS élimine le processus laborieux de criblage de nombreuses variantes pour la stabilité et la fonctionnalité, fournissant une preuve de principe de la méthode de stabilisation et d'amélioration du rendement sans compromettre l'antigénicité pour les candidats vaccins complexes et hautement glycosylés de nouvelle génération.

Les anticorps développés pour la recherche et les applications cliniques peuvent présenter une stabilité, une expressibilité ou une affinité sous-optimales. Les stratégies d'optimisation existantes se concentrent sur les mutations de surface, tandis que la maturation d'affinité naturelle introduit également des mutations dans le noyau de l'anticorps, améliorant simultanément la stabilité et l'affinité. Pour cartographier systématiquement la tolérance mutationnelle d'un fragment variable d'anticorps (Fv), nous avons effectué un affichage de levure et appliqué un balayage mutationnel profond à un anticorps anti-lysozyme et avons constaté que de nombreuses mutations améliorant l'affinité se regroupaient à l'interface variable chaîne légère-lourde, dans le noyau d'anticorps. La conception de Rosetta combinait des mutations améliorantes, produisant un variant avec une affinité dix fois plus élevée et une stabilité considérablement améliorée. Pour rendre cette approche largement accessible, nous avons développé AbLIFT, un serveur Web automatisé qui conçoit des mutations de cœur multipoint pour améliorer les contacts entre des chaînes légères et lourdes Fv spécifiques (http://AbLIFT.weizmann.ac.il). Nous avons appliqué AbLIFT à deux anticorps indépendants ciblant les antigènes humains VEGF et QSOX1. Étonnamment, les conceptions ont amélioré la stabilité, l'affinité et les rendements d'expression. Les résultats fournissent une preuve de principe pour contourner les cycles laborieux d'ingénierie des anticorps grâce à une conception automatisée d'affinité et de stabilité de calcul.

La conception de protéines membranaires est un domaine de recherche passionnant et de plus en plus fructueux qui a conduit à des jalons, notamment la conception de protéines intégrales membranaires stables et précises basées sur des motifs enroulés. La conception de protéines topologiquement plus complexes, telles que la plupart des récepteurs, canaux et transporteurs, exige cependant une fonction énergétique qui équilibre les contributions des contacts intra-protéiques et des interactions protéine-membrane. Les progrès récents dans les fonctions énergétiques de tous les atomes solubles dans l'eau ont augmenté la précision des repères de prédiction de structure. La membrane plasmique, cependant, impose différentes contraintes physiques sur la solvatation des protéines. Pour comprendre ces contraintes, nous avons récemment développé un écran expérimental à haut débit, appelé dsTβL, et déduit des énergies d'insertion apparentes pour chaque acide aminé à des dizaines de positions à travers la membrane plasmique bactérienne. Ici, nous exprimons ces profils en termes d'énergie de lipophilie dans Rosetta et démontrons que la nouvelle fonction énergétique surpasse les précédentes dans les références de modélisation et de conception. Les simulations Rosetta ab initio à partir d'une chaîne étendue récapitulent les deux tiers des structures déterminées expérimentalement d'homo-oligomères couvrant la membrane avec une déviation quadratique moyenne de <2,5Å dans les cinq modèles les plus prédits (disponible en ligne : http:// tmhop.weizmann.ac.il). De plus, dans deux références de conception de séquences, la fonction énergétique améliore la discrimination des mutations ponctuelles stabilisantes et récapitule les séquences naturelles de protéines membranaires de structure connue, recommandant ainsi cette nouvelle fonction énergétique pour la modélisation et la conception de protéines membranaires.

Les méthodes de prédiction de structure d'anticorps reposent sur une homologie de séquence avec des structures déterminées expérimentalement. Les modèles résultants peuvent être précis mais sont souvent soumis à des contraintes stéréochimiques, ce qui limite leur utilité dans les workflows de modélisation et de conception. Nous présentons le serveur Web AbPredict 2, qui, au lieu d'utiliser l'homologie de séquence, effectue une recherche basée sur Monte Carlo pour des combinaisons à faible énergie de conformations de squelette pour produire des structures d'anticorps précises et non contraintes.

Le repliement des protéines à leur conformation fonctionnelle est primordial pour la vie. Bien que 75 % du protéome soit constitué de protéines multidomaines, notre connaissance du repliement repose principalement sur des études menées sur des protéines à domaine unique et à repliement rapide. Néanmoins, la complexité des paysages de repliement présentés par les protéines multi-domaines a fait l'objet d'un examen approfondi ces dernières années. Nous étudions la protéine adénylate kinase à trois domaines d'E. coli (AK), dont il a été démontré qu'elle se replie à travers une série de voies impliquant plusieurs états intermédiaires. Nous utilisons une méthode de conception de protéines pour manipuler le paysage de repliement de l'AK et la spectroscopie FRET à molécule unique pour étudier les effets sur le processus de repliement. Les mutations introduites dans le domaine de liaison NMP (NMPbind) de la protéine ont des effets inattendus sur le paysage de repliement. Ainsi, alors que les mutations stabilisatrices au cœur du domaine NMPbind conservent les principales voies de repliement de l'AK de type sauvage, une mutation déstabilisante à l'interface entre les domaines NMPbind et CORE provoque une répartition significative du flux entre les voies de repliement. Nos résultats démontrent la plasticité exceptionnelle du paysage de pliage de l'AK et révèlent comment des mutations spécifiques dans la structure primaire se traduisent par des changements dans la dynamique de pliage. La combinaison des méthodologies introduites dans ce travail devrait s'avérer utile pour approfondir notre compréhension du processus de repliement des protéines multi-domaines.

La caractérisation des protéines surexprimées est essentielle pour évaluer leur qualité et fournir des données pour la reconception et l'optimisation itératives. Ce processus est généralement effectué suivant des procédures de purification qui nécessitent un coût important en temps et en main-d'œuvre. Par conséquent, l'évaluation de la qualité des protéines recombinantes sans purification préalable offre un avantage majeur.Nous rapportons ici une méthode de spectrométrie de masse native qui permet la caractérisation des protéines surproduites directement à partir des milieux de culture. Des propriétés telles que la solubilité, le poids moléculaire, le repliement, l'état d'assemblage, la structure globale, les modifications post-traductionnelles et la liaison aux biomolécules pertinentes sont immédiatement révélées. Nous montrons l'applicabilité de la méthode pour la caractérisation en profondeur des protéines recombinantes sécrétées à partir de systèmes eucaryotes tels que la levure, les insectes et les cellules humaines. Cette méthode, qui peut être facilement étendue à l'analyse à haut débit, réduit considérablement l'intervalle de temps entre la production et la caractérisation des protéines, et est particulièrement adaptée pour caractériser les protéines modifiées et mutées, et optimiser le rendement et la qualité des protéines surexprimées.

Les réseaux de protéines dans tous les organismes comprennent des paires d'interaction homologues. Dans ces réseaux, certaines protéines sont spécifiques, interagissant avec un ou quelques partenaires de liaison, tandis que d'autres sont multispécifiques et se lient à une gamme de cibles. Nous décrivons un algorithme qui part d'une paire en interaction et conçoit des dizaines de nouvelles paires avec diverses conformations de squelette au site de liaison ainsi que de nouvelles orientations et séquences de liaison. Appliqué à une paire bactérienne de haute affinité, l'algorithme en résulte 18 nouvelles, avec des affinités apparentées allant de pico- à micromolaire. Trois paires présentent un changement de spécificité de 3 à 5 ordres de grandeur par rapport au type sauvage, tandis que d'autres sont multispécifiques, formant collectivement un réseau d'interaction protéique. L'analyse cristallographique confirme la précision de la conception, y compris dans les nouvelles épines dorsales et les interactions polaires. Les réseaux d'interaction polaire préorganisés sont responsables d'une spécificité élevée, définissant ainsi des principes de conception qui peuvent être appliqués pour programmer des réseaux d'interaction cellulaire synthétiques d'affinité et de spécificité souhaitées.

La photorespiration recycle le 2-phosphoglycolate, produit d'oxygénation de la ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase ( Rubisco), dans le cycle de Calvin. Cependant, la photorespiration naturelle limite la productivité agricole en dissipant de l'énergie et en libérant du CO2. Plusieurs contournements de la photorespiration ont déjà été suggérés, mais étaient limités aux enzymes et voies existantes qui libèrent du CO2. Ici, nous exploitons la puissance de l'ingénierie enzymatique et métabolique pour établir des voies synthétiques qui contournent la photorespiration sans libération de CO2. En définissant des règles de réaction spécifiques, nous avons systématiquement identifié des voies prometteuses qui assimilent le 2-phosphoglycolate dans le cycle de Calvin sans perte de carbone. Nous avons ensuite développé un modèle cinétique-stoechiométrique qui indique que les shunts synthétiques identifiés pourraient potentiellement améliorer le taux de fixation du carbone dans toute la plage physiologique d'irradiation et de CO2, même si la plupart de leurs enzymes fonctionnent à un dixième de l'activité de carboxylation maximale de Rubisco. La réduction du glycolate en glycolaldéhyde est essentielle pour plusieurs des shunts synthétiques, mais on ne sait pas qu'elle se produit naturellement. Nous avons donc utilisé une conception informatique et une évolution dirigée pour établir cette activité dans deux réactions séquentielles. Une acétyl-CoA synthétase a été conçue pour une plus grande stabilité et une synthèse de glycolyl-CoA. Une propionyl-CoA réductase a été conçue pour une plus grande sélectivité pour le glycolyl-CoA et pour l'utilisation de NADPH par rapport au NAD(+), favorisant ainsi la réduction par rapport à l'oxydation. Le module de réduction du glycolate modifié a ensuite été associé à une condensation en aval et à une assimilation du glycolaldéhyde en ribulose 1,5-bisphosphate, fournissant ainsi la preuve de principe d'une voie de photorespiration conservant le carbone.

Des améliorations substantielles de l'activité enzymatique nécessitent de multiples mutations à des positions spatialement proximales dans le site actif. De telles mutations, cependant, présentent souvent des effets épistatiques (non additifs) imprévisibles sur l'activité. Nous décrivons ici FuncLib, une méthode automatisée de conception de mutations multipoints sur des sites actifs d'enzymes à l'aide d'une analyse phylogénétique et de calculs de conception Rosetta. Nous avons appliqué FuncLib à deux enzymes non apparentées, une phosphotriestérase et une acétyl-CoA synthétase. Tous les modèles étaient actifs et la plupart présentaient des profils d'activité qui différaient significativement du type sauvage et les uns des autres. Plusieurs dizaines de conceptions avec seulement 3 à 6 mutations du site actif ont montré des efficacités 10 à 4 000 fois plus élevées avec une gamme de substrats alternatifs, y compris l'hydrolyse des agents neurotoxiques organophosphorés soman et cyclosarine et la synthèse de butyryl-CoA. FuncLib est implémenté en tant que serveur Web (http://FuncLib.weizmann.ac.il) il contourne les cribles expérimentaux itératifs à haut débit et ouvre la voie à la conception de répertoires catalytiques très efficaces et diversifiés.

Une méthode puissante pour déterminer le couplage énergétique entre les acides aminés est l'analyse du cycle de double mutant. Dans cette méthode, deux résidus sont mutés séparément et en combinaison et les effets énergétiques des mutations sont déterminés. Un écart de l'effet de la double mutation par rapport à la somme des effets des mutations simples indique que les deux résidus interagissent directement ou indirectement. Ici, nous montrons que l'analyse du cycle de double mutant par spectrométrie de masse native peut être effectuée pour les interactions dans des extraits de cellules d'Escherichia coli bruts, évitant ainsi le besoin de purification des protéines et générant des isothermes de liaison. Nos résultats indiquent que les forces des liaisons hydrogène intermoléculaires ne sont pas affectées par les conditions plus encombrées dans les lysats cellulaires.

Les anticorps monoclonaux anti-glucides (mAb) sont très prometteurs en tant que thérapie et diagnostic du cancer. Cependant, leur spécificité peut être mitigée et une caractérisation détaillée est problématique, car les complexes anticorps-glycane sont difficiles à cristalliser. Ici, nous avons développé une approche généralisable utilisant des techniques à haut débit pour caractériser la structure et la spécificité de ces mAb, et l'avons appliquée au mAb TKH2 développé contre l'antigène glucidique associé à la tumeur sialyl-Tn (STn). La spécificité de mAb a été définie par des valeurs KD apparentes déterminées par un criblage quantitatif de microarray de glycane. Les résidus clés dans le site de combinaison d'anticorps ont été identifiés par mutagenèse dirigée, et la surface de contact glycane-antigène a été définie en utilisant la RMN de différence de transfert de saturation (STD-RMN). Ces caractéristiques ont ensuite été utilisées comme métriques pour sélectionner le modèle 3D optimal du complexe anticorps-glycane, parmi des milliers d'options plausibles générées par l'amarrage automatisé et la simulation de la dynamique moléculaire. La spécificité de STn a été encore validée par le criblage informatique du modèle 3D d'anticorps sélectionné contre le sialyl-Tn-glycome humain. Cette approche computationnelle-expérimentale permettrait la conception rationnelle d'anticorps puissants ciblant les glucides.

La conception automatisée d'enzymes avec des propriétés catalytiques de type sauvage est un objectif de longue date mais insaisissable. Ici, nous présentons une méthode générale automatisée pour la conception d'enzymes par assemblage de squelette combinatoire. À partir d'un ensemble de structures enzymatiques homologues mais structurellement diverses, la méthode assemble de nouvelles combinaisons de squelette et utilise Rosetta pour optimiser la séquence d'acides aminés, tout en conservant les résidus catalytiques clés. Nous appliquons cette méthode à deux familles d'enzymes non apparentées avec des plis en tonneau TIM, les glycoside hydrolase 10 (GH10) xylanases et les lactonases de type phosphotriesterase (PLL), en concevant respectivement 43 et 34 protéines. Vingt et un modèles GH10 et sept PLL sont actifs, y compris des modèles dérivés de modèles avec une identité de séquence de <25 %. De plus, quatre conceptions sont aussi actives que les enzymes naturelles dans ces familles. La précision atomique dans une conception GH10 à haute activité est confirmée par l'analyse cristallographique. Ainsi, l'assemblage et la conception du squelette combinatoire peuvent être utilisés pour générer des enzymes stables, actives et structurellement diverses avec une sélectivité ou une activité modifiée.

Les protéines sont de plus en plus utilisées dans la recherche biomédicale fondamentale et appliquée. Cependant, de nombreuses protéines ne sont que marginalement stables et peuvent être exprimées en quantités limitées, ce qui entrave la recherche et les applications. La recherche a révélé les principes et mécanismes thermodynamiques, cellulaires et évolutifs qui sous-tendent la stabilité marginale. Avec cette compréhension croissante, les méthodes de conception de la stabilité computationnelle ont progressé au cours des deux dernières décennies à partir de méthodes qui n'abordaient de manière sélective que certains aspects de la stabilité marginale. Les méthodes actuelles sont plus générales et, en combinant l'analyse phylogénétique avec la conception atomistique, ont montré des améliorations drastiques de la solubilité, de la stabilité thermique et de la résistance à l'agrégation tout en maintenant l'activité moléculaire primaire de la protéine. La conception de la stabilité ouvre la voie à une ingénierie rationnelle d'enzymes, de thérapies et de vaccins améliorés et à l'application de la méthodologie de conception de protéines à de grandes protéines et à des activités moléculaires qui se sont révélées difficiles dans le passé.

Le système de chaperonine GroE dans Escherichia coli comprend GroEL et GroES et facilite le repliement des protéines ATP-dépendantes in vivo et in vitro Les protéines avec des séquences et des structures très similaires peuvent différer dans leur dépendance à GroEL pour un repliement efficace. Une source potentielle mais non vérifiée de dépendance à GroEL est la frustration, dans laquelle toutes les interactions à l'état natif ne sont pas optimisées énergétiquement, potentialisant ainsi un repliement lent et un repliement incorrect. Ici, nous avons choisi la protéine fluorescente verte améliorée comme système modèle et l'avons soumise à une mutagenèse aléatoire, suivie d'un dépistage des variantes dont le repliement in vivo augmente ou diminue la dépendance à GroEL. Nous avons confirmé la dépendance GroEL altérée de ces variantes avec des tests de repliement in vitro. De manière frappante, les mutations aux positions prédites comme étant hautement frustrées se sont avérées corrélées avec une diminution de la dépendance à GroEL. À l'inverse, les mutations aux positions avec une faible frustration se sont avérées corrélées à une dépendance accrue à GroEL. Un support supplémentaire pour cette découverte a été obtenu en montrant que le repliement d'une variante de protéine fluorescente verte améliorée conçue par ordinateur pour réduire la frustration est en effet moins dépendant de GroEL. Nos résultats indiquent que les changements dans la frustration locale affectent également la partition in vivo entre le repliement spontané et le repliement induit par les chaperonines. Par conséquent, la conception de séquences peu frustrées peut réduire la dépendance aux chaperonines et améliorer les niveaux d'expression des protéines.

Les protéines naturelles doivent à la fois se replier dans une conformation stable et exercer leur fonction moléculaire. À ce jour, la conception informatique a produit avec succès des protéines stables et atomiquement précises en utilisant des replis dits « idéaux » riches en structures secondaires régulières et presque dépourvus de boucles et d'éléments déstabilisants, tels que des cavités. Cependant, la fonction moléculaire, telle que la liaison et la catalyse, exige souvent des caractéristiques non idéales, notamment des boucles grandes et irrégulières et des réseaux d'interaction polaire enfouis, qui sont restés difficiles pour la conception des plis. Grâce à cinq cycles de conception/d'expérimentation, nous avons appris les principes de conception de fragments variables d'anticorps stables et fonctionnels (Fv). Plus précisément, nous (i) avons utilisé des contraintes de conception de séquences dérivées d'alignements de séquences multiples d'anticorps et (ii) pendant la conception du squelette, nous avons maintenu les interactions stabilisantes observées dans les anticorps naturels entre le cadre et les boucles des régions déterminant la complémentarité (CDR) 1 et 2 Les Fv conçus liaient leurs ligands avec des affinités midnanomolaires et étaient aussi stables que les anticorps naturels, malgré des mutations >30 provenant de lignées germinales d'anticorps de mammifères. De plus, l'analyse cristallographique a démontré une précision atomique dans tout le cadre et dans quatre des six CDR dans un design et une précision atomique dans l'ensemble Fv dans un autre. Les principes que nous avons appris sont généraux et peuvent être mis en œuvre pour concevoir d'autres plis non idéaux, générant des anticorps et des enzymes stables, spécifiques et précis.

Alors que de puissants anticorps monoclonaux contre la ricine ont été introduits au fil des ans, la question de savoir si l'augmentation de l'affinité des anticorps permet une meilleure neutralisation de la toxine n'a pas encore été entièrement abordée. Le but de cette étude était de caractériser la contribution de l'affinité des anticorps au potentiel de neutralisation de la ricine de l'anticorps. L'anticorps monoclonal cHD23 qui cible la sous-unité B de la toxine et interfère avec sa liaison aux récepteurs membranaires, a été isolé. Afin de créer des clones d'anticorps avec une affinité améliorée envers la ricine, une bibliothèque de présentation de scFv-phage contenant des versions mutées des régions variables de cHD23 a été construite et des clones avec une liaison améliorée de la ricine ont été isolés. La modélisation structurelle de ces mutants suggère que les mutations insérées peuvent augmenter la flexibilité conformationnelle de l'anticorps, améliorant ainsi sa capacité à se lier à la ricine. Bien qu'il ait été constaté que les clones sélectionnés présentaient une neutralisation améliorée de la ricine, la corrélation entre les valeurs K-D et la puissance n'était que mineure (r = 0,55). Cependant, une corrélation positive (r = 0,84) existe entre les valeurs de taux off (k(off)) des clones matures par affinité et leur capacité à neutraliser la ricine. Comme les membranes cellulaires présentent des quantités excessivement grandes de sites potentiels de liaison de surface pour la ricine, il est suggéré que les anticorps avec des valeurs de taux de coupure améliorées bloquent la capacité de la toxine à se lier aux récepteurs cibles, d'une manière très efficace. Actuellement, la thérapie à base d'anticorps est le traitement le plus efficace pour l'intoxication à la ricine et il est prévu que les résultats de cette étude fourniront des informations utiles et une stratégie possible pour concevoir une thérapie améliorée à base d'anticorps pour la toxine.

La régulation allostérique sous-tend la capacité des cellules vivantes à détecter les changements dans les concentrations de nutriments et de molécules de signalisation, mais la capacité de concevoir par ordinateur une régulation allostérique en protéines non allostériques a été insaisissable. La conception du site allostérique est compliquée par la nécessité de coder les stabilités relatives des conformations actives et inactives de la même protéine en présence et en l'absence à la fois de ligand et d'effecteur. Pour relever ce défi, nous avons utilisé Rosetta pour concevoir l'épine dorsale de la région flexible de détermination de la complémentarité des chaînes lourdes 3 (HCDR3), et utilisé la correspondance géométrique et l'optimisation de la séquence pour placer un site de coordination Zn2+ dans un anticorps liant la fluorescéine. Nous avons prédit qu'en raison de la flexibilité de HCDR3, la poche de liaison à la fluorescéine se configurerait correctement uniquement lors de l'application de Zn2+. Nous avons constaté que la régulation par le Zn2+ était réversible et sensible à l'identité de l'ion divalent, et se faisait au prix d'une stabilité réduite des anticorps et d'une affinité de liaison à la fluorescéine. La fluorescéine s'est liée à une affinité d'un ordre de grandeur plus élevée en présence de Zn2+ qu'en son absence, et l'augmentation de l'affinité de la fluorescéine était presque entièrement due à un taux d'activation de la fluorescéine plus rapide, ce qui suggère que le Zn2+ a préorganisé l'anticorps pour la liaison de la fluorescéine. L'analyse des mutations a démontré l'extrême sensibilité de la régulation du Zn2+ sur les détails atomiques dans et autour du site de coordination métallique. L'anticorps conçu pourrait servir à étudier comment la régulation allostérique a évolué à partir de protéines de liaison non allostériques et suggère un moyen de concevoir des capteurs moléculaires pour des cibles environnementales et biomédicales.

L'amélioration de l'efficacité catalytique initialement faible d'une enzyme avec un nouveau substrat cible d'un ordre de grandeur ou deux peut nécessiter seulement quelques cycles de mutagenèse et de criblage ou de sélection. Cependant, les cycles d'optimisation suivants ont tendance à produire des degrés d'amélioration décroissants (rendements décroissants) conduisant finalement à un plateau d'optimisation. Notre objectif était d'optimiser l'efficacité catalytique de la phosphotriestérase bactérienne (PTE) vis-à-vis des agents neurotoxiques de type V. Auparavant, nous avons amélioré l'efficacité catalytique du PTE de type sauvage vers l'agent neurotoxique VX de 500 fois, à une efficacité catalytique (k(cat)/KM) de 5 x 10(6)M(-1) min(-1 ). Cependant, une détoxification efficace in vivo exige une enzyme avec une efficacité catalytique de > 10(7) M-1 min(-1). Ici, après huit cycles supplémentaires d'évolution dirigée et la conception informatique d'une variante stabilisée, nous avons développé des variantes PTE qui détoxifient VX avec ak(cat)/KM >= 5 x 10(7)M(-1) min(-1) et russe VX (RVX) avec ak(cat)/KM >= 10(7) M-1 min(-1). Ces améliorations finales de 10 fois ont été les plus longues et les plus laborieuses, car la plupart des bibliothèques ont donné des améliorations mineures ou inexistantes. Stabiliser l'enzyme en évolution et éviter les compromis d'activité avec différents substrats nous ont permis d'obtenir d'autres améliorations au-delà du plateau d'optimisation et de faire évoluer des variantes PTE qui ont été globalement améliorées de > 5 000 fois avec VX et de > 17 000 fois avec RVX. Les variantes résultantes hydrolysent également les agents neurotoxiques de type G avec une efficacité élevée (GA, GB à k(cat)/KM > 5 x 10(7) M-1 min(-1)) et peuvent ainsi servir de candidats pour le nerf à large spectre. prophylaxie par agent et traitement post-exposition utilisant de faibles doses d'enzymes.

Le reconditionnement des noyaux de protéines est un test standard du logiciel de modélisation des protéines. Une étude récente de six progiciels de modélisation différents a montré qu'ils réussissent mieux à prédire les conformations des chaînes latérales du noyau par rapport aux résidus de surface. Tous les logiciels de modélisation testés ont des fonctions énergétiques à plusieurs composants, comprenant généralement des contributions de la solvatation, de l'électrostatique, des liaisons hydrogène et des interactions Lennard-Jones en plus des termes statistiques basés sur les structures protéiques observées. Nous avons étudié dans quelle mesure une fonction énergétique simplifiée qui inclut uniquement des contraintes stéréochimiques et des interactions répulsives de sphère dure peut correctement reconditionner les noyaux de protéines. Pour le reconditionnement à résidu unique et collectif, le modèle de sphère dure récapitule avec précision les conformations de chaînes latérales observées pour Ile, Leu, Phe, Thr, Trp, Tyr et Val. Ce résultat montre qu'il n'y a pas de conformations de chaînes latérales alternatives, stériquement autorisées pour les résidus de noyau. L'analyse du même ensemble de noyaux de protéines à l'aide de la suite logicielle Rosetta a révélé que le modèle de sphère dure et Rosetta fonctionnent aussi bien sur Ile, Leu, Phe, Thr et Val, le modèle de sphère dure fonctionne mieux sur Trp et Tyr et Rosetta fonctionne mieux sur Ser. Nous concluons que la haute précision de prédiction des noyaux de protéines obtenue par le logiciel de modélisation des protéines et notre approche simplifiée de la sphère dure reflète la haute densité des noyaux de protéines et la dominance de la répulsion stérique.

De nombreux candidats vaccins prometteurs contre les virus, les bactéries et les parasites pathogènes sont instables et ne peuvent pas être produits à moindre coût pour une utilisation clinique. Par exemple, l'homologue 5 de la protéine liant les réticulocytes de Plasmodium falciparum (PfRH5) est essentiel pour l'invasion des érythrocytes, est hautement conservé parmi les isolats de terrain et produit des anticorps qui neutralisent in vitro et protègent dans un modèle animal, ce qui en fait un candidat vaccin antipaludique de premier plan.Cependant, le RH5 fonctionnel n'est exprimable que dans les systèmes eucaryotes et présente une tolérance modérée à la température, ce qui limite son utilité dans les pays chauds et à faible revenu où sévit le paludisme. Les approches actuelles de la stabilisation des immunogènes impliquent l'application itérative d'une conception rationnelle ou semi-rationnelle, la mutagenèse aléatoire et la caractérisation biochimique. En règle générale, chaque cycle d'optimisation entraîne une amélioration mineure de la stabilité et plusieurs cycles sont nécessaires. En revanche, nous avons développé une stratégie de conception en une étape utilisant une analyse phylogénétique et des calculs atomistiques de Rosetta pour concevoir des variantes de PfRH5 avec un emballage et une polarité de surface améliorés. Pour démontrer la robustesse de cette approche, nous avons testé trois modèles PfRH5, qui ont tous montré une stabilité améliorée par rapport au type sauvage. Le meilleur, portant 18 mutations par rapport à PfRH5, exprimé sous une forme repliée dans les bactéries à >1 mg de protéine par L de culture, et avait une tolérance thermique 10-15 degrés C plus élevée que le type sauvage, tout en conservant également la liaison au ligand et des propriétés immunogènes indiscernables de type sauvage, prouvant sa valeur en tant qu'immunogène pour une future génération de vaccins contre le stade sanguin du paludisme. Nous prévoyons que cette méthodologie efficace de conception de stabilité informatique sera également utilisée pour améliorer les propriétés biophysiques d'autres candidats vaccins récalcitrants à partir d'agents pathogènes émergents.

Les méthodes actuelles de prédiction de structure d'anticorps reposent sur une homologie de séquence avec des structures connues. Bien que cette stratégie donne souvent des prédictions précises, les modèles peuvent être soumis à des contraintes stéréochimiques. Ici, nous présentons un algorithme entièrement automatisé, appelé AbPredict, qui ne tient pas compte de l'homologie de séquence et utilise à la place une recherche Monte Carlo pour les conformations à faible énergie construites à partir de segments de squelette et d'orientations de corps rigides qui apparaissent dans les structures moléculaires des anticorps. Nous trouvons des cas où AbPredict sélectionne des modèles de boucle précis avec une identité de séquence aussi faible que 10%, alors que le modèle d'identité de séquence la plus élevée diverge considérablement de la conformation de la requête. En conséquence, dans plusieurs cas rapportés dans la récente référence d'évaluation de la modélisation des anticorps, les modèles AbPredict étaient plus précis que ceux de n'importe quel participant, et la qualité stéréochimique des modèles était systématiquement élevée. De plus, dans deux cas aveugles qui nous ont été fournis par des cristallographes avant la détermination de la structure, la méthode a atteint une précision globale du squelette de <1,5 Ångstrom. Une modélisation précise des structures d'anticorps non contraints permettra la conception et l'ingénierie de liants améliorés pour la recherche biomédicale directement à partir de la séquence.

L'énergétique des interactions membrane-protéine détermine la topologie et la structure des protéines : l'hydrophobie entraîne l'insertion de segments hélicoïdaux dans la membrane et les charges positives orientent la protéine par rapport au plan membranaire selon la règle du positif à l'intérieur. Jusqu'à récemment, cependant, la quantification de ces contributions a rencontré des difficultés, excluant l'analyse systématique de la base énergétique de la topologie membrane-protéine. Nous avons récemment développé la méthode dsT beta L, qui utilise le séquençage en profondeur et la sélection in vitro de segments insérés dans la membrane plasmique bactérienne pour déduire les profils d'énergie d'insertion pour chaque résidu d'acide aminé à travers la membrane, et quantifié la contribution d'insertion de l'hydrophobie et du positif. -règle à l'intérieur. Ici, nous présentons un algorithme de prédiction de topologie appelé TopGraph, qui est basé sur une recherche de séquence pour l'énergie d'insertion minimale dsT beta L. Alors que l'énergie d'insertion moyenne attribuée par les échelles expérimentales précédentes était positive (défavorable), la moyenne attribuée par TopGraph dans un ensemble non redondant est de -6,9 kcal/mol. En quantifiant les contributions de l'hydrophobie et de la règle positive à l'intérieur, nous constatons en outre que dans environ la moitié des grandes protéines membranaires, des segments polaires sont insérés dans la membrane pour positionner davantage de charges positives dans le cytoplasme, suggérant une interaction entre ces deux contributions énergétiques. Étant donné que les résidus polaires intégrés à la membrane sont cruciaux pour la liaison au substrat et le changement de conformation, les résultats impliquent la règle positive à l'intérieur dans la détermination des architectures des sites fonctionnels des protéines membranaires. Cette connaissance peut aider à la prédiction de la structure, à l'ingénierie et à la conception de protéines membranaires. TopGraph est disponible en ligne (topgraph.weizmann.ac.il).

Nous, ingénieurs protéiniques, sommes ambivalents à propos de l'évolution : d'une part, l'évolution nous inspire une myriade d'exemples de liants biomoléculaires, de capteurs et de catalyseurs, d'autre part, ces exemples sont rarement bien adaptés aux tâches d'ingénierie que nous avons en tête. Les ingénieurs en protéines ont donc modifié les protéines naturelles par des substitutions ponctuelles et des échanges de fragments dans le but de générer de nouvelles fonctions. Un contrepoint à de tels efforts de conception, qui se poursuivent maintenant avec plus de succès, consiste à éviter complètement les matériaux de départ fournis par la nature et à concevoir de nouvelles fonctions protéiques à partir de zéro en utilisant la modélisation et la conception moléculaires de novo. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans les deux sens, certains domaines de la conception de protéines sont encore hors de portée. À cette fin, nous préconisons une synthèse de ces deux stratégies : en utilisant des calculs de conception à la fois pour recombiner et optimiser des fragments de protéines naturelles, nous pouvons construire des structures stables et encore non échantillonnées, donnant ainsi accès à un répertoire élargi de conformations et fonctions souhaitées. Nous proposons que les futures méthodes qui combinent l'analyse phylogénétique, la bioinformatique de la structure et des séquences et la modélisation atomistique pourraient bien réussir là où l'une de ces approches a échoué par elle-même.

Lors d'une surexpression hétérologue, de nombreuses protéines se replient mal ou s'agrègent, entraînant ainsi de faibles rendements fonctionnels. L'acétylcholinestérase humaine ( hAChE), une enzyme médiateur de la transmission synaptique, est un cas typique d'une protéine humaine qui nécessite des systèmes mammifères pour obtenir une expression fonctionnelle. Nous avons développé une stratégie de calcul et conçu une variante AChE portant 51 mutations qui ont amélioré le tassement du noyau, la polarité de surface et la rigidité du squelette. Cette variante exprimée à des niveaux similaires à 2 000 fois plus élevés dans E. coli par rapport à hAChE de type sauvage et présentait une thermostabilité supérieure de 20 degrés C sans changement des propriétés enzymatiques ou de la configuration du site actif tel que déterminé par cristallographie. Pour démontrer une large utilité, nous avons conçu de la même manière quatre autres protéines humaines et bactériennes. En testant au plus trois modèles par protéine, nous avons obtenu une stabilité améliorée et/ou des rendements plus élevés de protéine soluble et active dans E. coli. Notre algorithme ne nécessite qu'une structure 3D et plusieurs dizaines de séquences d'homologues naturels, et est disponible sur http://pross.weizmann.ac.il.

Au cours de la dernière décennie, les scientifiques ont réalisé des progrès passionnants dans la conception de plis de protéines entièrement sur ordinateur, puis dans leur synthèse réussie en laboratoire (1-5). Ces protéines de conception avaient la même structure expérimentale que dans le modèle et étaient très stables, cependant, elles manquaient de caractéristiques structurelles importantes observées dans les interfaces protéiques et les sites actifs enzymatiques. Dans deux rapports aux pages 680 et 687 de ce numéro, Boyken et al. (6) et Jacobs et al. (7) utiliser le logiciel de modélisation biomoléculaire Rosetta pour concevoir des protéines qui incluent certaines de ces caractéristiques. Les expériences montrent que ces nouvelles conceptions conservent une précision et une stabilité structurelles élevées.

L'insertion de segments formant une hélice dans la membrane et leur association déterminent la structure, la fonction et les niveaux d'expression de toutes les protéines membranaires plasmiques. Cependant, la quantification systématique et fiable de l'énergétique des protéines membranaires a été difficile. Nous avons développé une méthode de balayage mutationnel profond pour surveiller les effets de centaines de mutations ponctuelles sur l'insertion de l'hélice et l'auto-association au sein de la membrane interne bactérienne. L'analyse quantifie l'énergie d'insertion pour tous les acides aminés naturels à 27 positions à travers la membrane, révélant que l'hydrophobie des membranes biologiques est significativement plus élevée que ce qui est apprécié. Nous quantifions en outre les contributions à l'insertion de protéines membranaires à partir de résidus chargés positivement à l'interface cytoplasme-membrane et révélons des différences importantes et imprévues entre ces résidus. Enfin, nous dérivons des paysages mutationnels complets dans les domaines membranaires de la glycophorine A et de l'oncogène ErbB2, et trouvons que l'insertion et l'auto-association sont fortement couplées dans les homodimères de récepteurs.

Le catalyseur disulfure sécrété Quiescin sulfhydryl oxydase-1 (QSOX1) affecte l'organisation de la matrice extracellulaire et est surexprimé dans divers adénocarcinomes et stroma associé. L'inhibition de QSOX1 humain extracellulaire par un anticorps monoclonal a diminué la migration des cellules tumorales dans un modèle de co-culture cellulaire et peut donc avoir un potentiel thérapeutique. Cependant, la spécificité d'espèce de l'anticorps monoclonal QSOX1 a été un revers dans l'évaluation de son utilité en tant qu'agent anti-métastatique in vivo, un problème courant dans l'industrie de la thérapie par anticorps. Nous avons donc utilisé l'ingénierie structurellement guidée pour étendre la spécificité des espèces d'anticorps, améliorant son affinité envers QSOX1 de souris d'au moins quatre ordres de grandeur. Une structure cristalline de la variante repensée, complexée avec son antigène de souris, a révélé que l'anticorps accomplit un ciblage à double espèce grâce à des contacts modifiés entre ses chaînes lourdes et légères, ainsi qu'un remplacement des aromatiques volumineux par des chaînes latérales flexibles et des polaires polyvalentes à pont d'eau. interactions. En parallèle, nous avons produit un anticorps de substitution ciblant QSOX1 de souris qui présente un nouveau mode d'inhibition de QSOX1. Cet ensemble de trois anticorps inhibiteurs de QSOX1 est compatible avec divers modèles de souris pour les essais précliniques et les applications biotechnologiques. Dans cette étude, nous fournissons des informations sur les blocs structurels de la réactivité croisée et mettons en place des jalons pour la conception et la réingénierie réussies des anticorps.

La conception informatique de la fonction des protéines a fait des progrès substantiels, générant de nouvelles enzymes, liants, inhibiteurs et nanomatériaux jamais vus auparavant dans la nature. Cependant, la capacité de concevoir de nouveaux squelettes protéiques dont la fonction est essentielle pour exercer un contrôle sur tous les degrés de liberté des polypeptides reste un défi critique. La plupart des tentatives précédentes pour concevoir de nouveaux backbones ont calculé la chaîne principale à partir de zéro. Ici, au lieu de cela, nous décrivons un algorithme combinatoire d'optimisation du squelette et de la séquence appelé AbDesign, qui exploite le grand nombre de séquences et les structures moléculaires déterminées expérimentalement des anticorps pour construire de nouveaux modèles d'anticorps, les ancrer contre les surfaces cibles et optimiser leur séquence et la conformation du squelette pour une haute stabilité et affinité de liaison. Nous avons utilisé l'algorithme pour produire des conceptions d'anticorps qui ciblent les mêmes surfaces moléculaires que neuf anticorps naturels de haute affinité dans cinq cas, l'identité de la séquence d'interface est supérieure à 30 %, et dans quatre d'entre eux, la conformation du squelette au cœur de la surface de liaison de l'anticorps est à moins de 1 angström d'écart quadratique moyen par rapport aux anticorps naturels. Les conceptions récapitulent les réseaux d'interaction polaire observés dans les complexes naturels, et la rigidité de la chaîne latérale d'acides aminés à la surface de liaison conçue, qui est probablement importante pour l'affinité et la spécificité, est élevée par rapport aux études de conception précédentes. Dans les anticorps anti-lysozyme conçus, les régions déterminant la complémentarité (CDR) à la périphérie de l'interface, telles que L1 et H2, présentent une plus grande diversité de conformation du squelette que les CDR au cœur de l'interface et augmentent la surface de liaison par rapport à l'anticorps naturel, améliorant potentiellement l'affinité et la spécificité.

Contexte : Les types cellulosomiques cohésine-dockerine sont inversés chez Bacteroides cellulosolvens. Résultats : Des approches cristallographiques et computationnelles combinées d'une cohésine isolée ont donné un modèle structurel du complexe cohésine-dockerine qui a été vérifié expérimentalement. Conclusion : Le mode de double liaison de la dockerine n'est pas exclusif à l'intégration enzymatique dans les cellulosomes, il caractérise également l'attachement à la surface cellulaire. Importance : Cette approche combinée fournit une plate-forme pour générer des hypothèses testables de l'interaction cohésine-dockerine de haute affinité. Les interactions cohésine-dockerine orchestrent l'assemblage de l'un des complexes multienzymatiques les plus élaborés de la nature, le cellulosome. Les cellulosomes sont produits exclusivement par des microbes anaérobies et interviennent dans l'hydrolyse très efficace des polysaccharides structuraux végétaux, tels que la cellulose et l'hémicellulose. Dans le modèle canonique d'assemblage de cellulosome, les modules de dockerine de type I des enzymes se lient aux modules de cohésine de type I réitérés d'un scaffoldin primaire. Chaque dockérine de type I contient deux sites de liaison à la cohésine hautement conservés, qui confèrent une flexibilité quaternaire au complexe multienzymatique. Le scaffoldin porte également une dockérine de type II qui ancre l'ensemble du complexe à la surface cellulaire en liant les cohésines de type II des scaffoldins d'ancrage. Chez Bacteroides cellulosolvens, cependant, l'organisation des types cohésine-dockerine est inversée, les paires cohésine-dockerine de type II intègrent les enzymes dans l'échafaudine primaire, et les modules de type I médient la fixation du cellulosome à un échafaudine d'ancrage. Ici, nous rapportons la structure cristalline d'une cohésine de type I de B. cellulosolvens ancrant l'échafaudage ScaB à une résolution de 1,84 angström. La structure ressemble à d'autres cohésines de type I, et le site putatif de liaison à la dockérine, centré sur les brins 3, 5 et 6, est susceptible d'être conservé dans d'autres cohésines de type I de B. cellulosolvens. Des études combinées de modélisation informatique, de mutagenèse et de liaison basées sur l'affinité ont révélé des réseaux de liaison hydrogène similaires entre les résidus de reconnaissance Ser/Asp putatifs dans la dockérine aux positions 11/12 et 45/46, suggérant qu'un mode de double liaison n'est pas exclusif au l'intégration d'enzymes dans les cellulosomes primaires mais peut également caractériser l'assemblage des polycellulosomes et l'attachement à la surface cellulaire. Cette approche générale peut fournir des informations structurelles précieuses sur l'interface cohésine-dockerine, au lieu d'une structure cristalline définitive.

Le gène régulateur auto-immun (AIRE) est crucial pour établir la tolérance immunologique centrale et prévenir l'auto-immunité. Les mutations de l'AIRE provoquent une maladie autosomique récessive rare, le syndrome polyendocrinien auto-immun de type 1 (APS-1), caractérisé par une auto-immunité multi-organes. Nous avons identifié plusieurs cas et familles présentant des mutations mono-alléliques dans le doigt de zinc du premier homéodomaine végétal (PHD1) d'AIRE qui ont suivi une hérédité dominante, généralement caractérisée par une apparition plus tardive, des phénotypes plus doux et une pénétrance réduite par rapport à l'APS-1 classique. Ces mutations faux-sens de PHD1 ont supprimé l'expression génique induite par l'AIRE de type sauvage d'une manière dominante-négative, contrairement aux mutants CARD ou AIRE tronqués qui n'avaient pas cette capacité dominante. L'analyse du tableau Exome a révélé que les mutants dominants PHD1 ont été trouvés avec une fréquence relativement élevée (> 0,0008) dans les populations mixtes. Nos résultats donnent un aperçu de l'action moléculaire de l'AIRE et démontrent que les mutations causant la maladie dans le locus AIRE sont plus fréquentes qu'on ne l'avait précédemment estimé et provoquent des phénotypes auto-immuns plus variables.

Pour mener à bien leurs activités, les macromolécules biologiques équilibrent différents traits physiques, tels que la stabilité, l'affinité d'interaction et la sélectivité. La façon dont des traits si souvent opposés sont codés dans un système macromoléculaire est essentielle à notre compréhension des processus évolutifs et à notre capacité à concevoir de nouvelles molécules avec les fonctions souhaitées. Nous présentons un cadre pour contraindre les simulations de conception à équilibrer différentes caractéristiques physiques. Chaque trait est représenté par l'occupation fractionnelle d'équilibre de l'état souhaité par rapport à ses alternatives, allant de zéro à pleine occupation, et les différents traits sont combinés à l'aide d'opérateurs booléens pour effectuer un langage logique « floue » pour coder toute combinaison de traits. Dans un autre article, nous avons présenté un nouvel algorithme de conception de squelette combinatoire AbDesign où le cadre de logique floue a été utilisé pour optimiser les squelettes et les séquences de protéines pour la stabilité et l'affinité de liaison dans la simulation de conception d'anticorps. Nous étendons maintenant ce cadre et constatons que les simulations de conception à logique floue reproduisent les principes de conception de séquence et de structure vus dans la nature pour sous-tendre une spécificité exquise d'une part et la multispécificité d'autre part. Le langage de logique floue est largement applicable et pourrait aider à définir l'espace des mutations tolérées et bénéfiques dans les systèmes biomoléculaires naturels et à concevoir des molécules artificielles qui codent des caractéristiques complexes. (C) 2014 MRC Laboratoire de biologie moléculaire. Publié par Elsevier Ltd.


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Les défis de la nanomédecine contre le cancer

Le devenir d'un nanosystème administré à un organisme est influencé par un vaste réseau de facteurs. En particulier, l'efficacité des nanostructures antitumorales est limitée par des difficultés de ciblage, des changements dynamiques in vivo des matériaux et de multiples barrières biologiques. Ces obstacles complexes et interconnectés nécessitent des contre-mesures multicouches qui ne peuvent être atteintes qu'avec la multifonctionnalité.

La progression du cancer est le résultat collectif de nombreux événements pathologiques 14 , qui ne sont souvent pas spécifiques de la tumeur mais impliquent des processus physiologiques normaux déformés par la maladie. De plus, les cellules tumorales sont très hétérogènes et présentent des taux de mutation élevés, ce qui entraîne des différences pathologiques entre les différents types de cancers, les individus et les régions intratumorales. Pour remédier à cette hétérogénéité, des thérapies combinatoires ou multi-cibles basées sur les nanostructures sont explorées. Par exemple, le couplage de méthodes ciblées sur les cellules tumorales avec des stratégies qui modulent le microenvironnement tumoral (TME) (Boxਁ) permet d'adapter la thérapie à des caractéristiques tumorales distinctes. Dans les tumeurs hautement fibrotiques, les fibroblastes associés au cancer (CAF) ou les cellules étoilées peuvent être co-ciblés, en plus des cellules cancéreuses, pour inhiber la sécrétion de facteurs de croissance et de cytokines pro-inflammatoires et pour distribuer des thérapies nanostructurées à travers le stroma dense 15� . De plus, la récurrence des tumeurs après occlusion vasculaire par administration ciblée de thrombine peut être considérablement diminuée par la co-administration de doxorubicine, probablement parce que la chimiothérapie aide à éradiquer les régions tumorales moins peuplées de vaisseaux sanguins 18 .

Bien que le développement d'un médicament spécifique à une tumeur soit extrêmement difficile, l'optimisation de la pharmacocinétique et de la biodistribution d'un médicament moins spécifique peut augmenter considérablement son efficacité. En effet, la capacité d'administration ciblée sur la tumeur, que ce soit par le biais d'un ciblage passif basé sur l'effet de perméabilité et de rétention améliorées (EPR), d'un ciblage actif ou d'une libération de médicament sensible aux stimuli, a été considérée comme un avantage clé des nanomédicaments dans le traitement du cancer 2 . Cependant, par rapport aux formulations médicamenteuses conventionnelles, le comportement et le devenir in vivo des nanostructures multifonctionnelles sont plus complexes, ce qui peut les rendre particulièrement sujettes à des incohérences entre les patients et entre les modèles précliniques et les applications cliniques 19 .

Les propriétés des nanostructures sont instantanément affectées lors de leur entrée dans le corps par des interactions à l'interface nano𠄻io. Ces interactions peuvent entraîner des instabilités, telles que l'agrégation de particules, la décomposition, la perte d'unités fonctionnelles ou la libération d'espèces dangereuses, qui affectent grandement l'efficacité de la livraison et la biosécurité 20 . Le contact avec les fluides physiologiques conduit également au cloaking de la nanostructure avec des protéines sériques (la couronne protéique), protégeant potentiellement les fonctionnalités de surface (telles que les ligands de ciblage) et interférant avec la libération du médicament 21 . Les modifications de l'antifouling, telles que le revêtement avec du poly(éthylène glycol) (PEG), sont souvent appliquées pour réduire les interactions entre les nanoparticules et les protéines.Des alternatives basées sur des biomolécules, en particulier des protéines et des peptides, ont également été rapportées 22,23. De plus, l'interférence de la couronne protéique avec les fonctionnalités de surface dépend de la technique de fonctionnalisation, par exemple, les anticorps pré-adsorbés sur des nanoparticules polymères conservent mieux leur capacité de ciblage que les molécules chimiquement conjuguées, peut-être en raison d'une couverture de surface plus robuste 24 . En adaptant les modifications de nanosurface, la composition de la couronne protéique peut être manipulée et exploitée pour augmenter la circulation, réduire la toxicité ou améliorer le ciblage 21,25. Par exemple, Onpattro, un petit ARN interférent disponible dans le commerce (siARN), recrute la protéine de ciblage du foie, l'apolipoprotéine E, sur la surface des nanoparticules lipidiques contenant du cholestérol in vivo 26. Des peptides courts ont également été utilisés pour manipuler les modes de liaison des apolipoprotéines sériques à la surface des nanoparticules afin d'améliorer l'administration à travers la barrière hémato-encéphalique 27 . Bien que l'interférence de l'adsorption non spécifique doit être soigneusement caractérisée 28, cette approche a suggéré la possibilité de moduler plus précisément les protéines corona et de les utiliser comme fonctionnalité supplémentaire.

Dans la circulation sanguine, les phagocytes adhèrent facilement aux nanostructures recouvertes d'une couronne de protéines par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques, ce qui conduit à l'élimination des nanostructures de la circulation par le système réticulo-endothélial (RES) 29 . Ainsi, les revêtements antifouling, tels que le PEG, sont couramment utilisés pour prolonger le temps de circulation des nanostructures. Néanmoins, la modification du PEG ne réduit que partiellement l'immunogénicité, et la stimulation des anticorps de liaison au PEG a soulevé des problèmes de sécurité 30,31. Des stratégies antisalissures plus actives incluent la décoration de surface avec des fragments basés sur CD47 32,33 , une protéine « auto-marqueur » qui inhibe la phagocytose, ou avec des membranes de cellules sanguines extraites (affichant CD47 sur leur surface) 31,34 , pour aider les nanomatériaux à échapper à la clairance par les phagocytes. Dans les modèles murins, ces méthodes ont démontré des propriétés furtives supérieures par rapport à PEGylation 31,32,34. Cependant, la clairance médiée par corona peut également bénéficier à l'administration ciblée des macrophages ou des organes RES. Par exemple, en alternant précisément la charge des liposomes cationiques, ils peuvent être sélectivement dirigés vers le foie et la rate pour délivrer des gènes 35 .

Pour atteindre le tissu tumoral, les nanosystèmes doivent d'abord extravaser de la circulation 1,36, ce qui a longtemps été pensé pour être activé par les fuites vasculaires du sang tumoral. Cependant, l'effet EPR varie considérablement entre les tumeurs et même entre les différentes régions de la même tumeur, et sa signification clinique reste controversée 37 . Les nanoparticules multifonctionnelles peuvent activement augmenter l'extravasation intratumorale en créant une hypertension locale, provoquant une relaxation vasculaire ou induisant des dommages supplémentaires dans les vaisseaux sanguins tumoraux. De telles stratégies peuvent résoudre en partie le problème de l'hétérogénéité de la RPE 38,40, mais la stratification des patients et la médecine personnalisée guidée par l'imagerie s'avéreront essentielles pour adapter les stratégies thérapeutiques basées sur les nanomatériaux 1,2,41.

De plus, l'efficacité de l'extravasation est affectée par les propriétés des nanomatériaux, par exemple, dans le sang qui coule, les nanoparticules sphériques ont tendance à rester près du milieu du vaisseau, tandis que les structures en forme de tige ou de plaque sont plus susceptibles de dériver vers les parois du vaisseau et de présenter fortes interactions avec les cellules endothéliales, en raison de la plus grande zone de contact 36,42. La douceur de la surface des vésicules extracellulaires a un impact considérable sur l'extravasation et l'absorption cellulaire in vivo 43 . L'adhésion endothéliale, et donc l'extravasation, peut être améliorée en revêtant des nanoparticules de membranes cellulaires dérivées de leucocytes 44 . On pense généralement que l'extravasation se produit par fuite paracellulaire, cependant, d'autres mécanismes, tels que le transport actif par les cellules endothéliales 39,45, jouent également un rôle et retiennent l'attention en termes de conception et de ciblage de nanosystèmes 46,47.

La plupart des nanoformulations anticancéreuses sont conçues pour une utilisation intraveineuse. Il convient de noter que les défis posés par les barrières biologiques lors du transport des nanoparticules sont liés à la voie d'administration, par exemple, les stratégies multifonctionnelles n'ont pas encore abordé le problème de l'accumulation de nanomatériaux injectés par voie intraveineuse dans le foie, ce qui peut aider à réduire la toxicité des médicaments délivrés à d'autres tissus. et améliorer la tolérance globale 12, mais reste un problème pour l'administration efficace du médicament à la tumeur. La voie d'administration détermine le schéma de biodistribution des médicaments, et des voies alternatives à l'injection intraveineuse avec des stratégies de ciblage correspondantes sont explorées pour des cancers spécifiques (encadré). L'injection intradermique et sous-cutanée, par exemple, peut être particulièrement utile pour cibler le système lymphatique pour l'immunisation tumorale 48, tandis que les nanoparticules administrées par voie orale peuvent cibler le cancer du côlon 49 .

La tumeur et le TME constituent également une barrière à l'administration de médicaments à base de nanostructures. La pression élevée du fluide interstitiel et le stroma desmoplastique limitent la pénétration des nanostructures 6,36. De plus, les régions tumorales plus profondes sont moins peuplées de vaisseaux sanguins. De plus, les nanoparticules peuvent être capturées par les macrophages associés aux tumeurs (TAM) au lieu des cellules tumorales après extravasation 41 . Ces complications intratumorales ont motivé le développement de stratégies de ciblage TME (Boxਁ), exploitant des cibles potentielles plus accessibles que les cellules tumorales. En effet, des cibles liées à la TME, telles que la protéine d'activation des fibroblastes sur les CAF 16 , le complexe fibrine et fibronectine dans les vaisseaux sanguins tumoraux 18 ou les TAM 50, 51 , ont déjà été appliquées pour la délivrance de nanoparticules. Pour les thérapies qui nécessitent une administration intracellulaire (par exemple, l'administration de gènes et l'administration d'antigènes), l'absorption cellulaire et l'échappement endosomique sont nécessaires. Cependant, contrairement aux petits médicaments hydrophobes, les nanoparticules ne peuvent pas diffuser passivement à travers la membrane plasmique. Par conséquent, des ligands ciblés sur les protéines membranaires, des peptides pénétrant les cellules ou des matériaux fusogènes sont utilisés pour favoriser l'absorption cellulaire 5,52.

Encadré 1 Cibles du microenvironnement tumoral pour les nanostructures multifonctionnelles

Stroma et fibroblastes

Dans le microenvironnement tumoral (TME), les cellules stromales quiescentes deviennent prolifératives et hautement sécrétoires, ce qui donne une matrice extracellulaire dense (MEC), qui agit comme une barrière intratumorale contre la pénétration du médicament. De plus, les composants de la MEC, les cytokines et les chimiokines sécrétées par les fibroblastes activés associés au cancer et les cellules stromales mésenchymateuses favorisent la prolifération des cellules tumorales, l'invasion et l'acquisition d'une résistance aux médicaments 15 . Les protéines des cellules stromales (telles que la protéine d'activation des fibroblastes α) et les composants de l'ECM (en particulier les enzymes de l'ECM) peuvent être utilisés comme cibles pour l'administration ou la libération sélective de médicaments 16 . Les médicaments ciblant les anomalies stromales peuvent être couplés à des stratégies de ciblage TME pour inverser l'activation des cellules stromales, inhiber la signalisation protumorale ou réduire la synthèse et la sécrétion de composants fibreux de la MEC tels que l'hyaluronane et le collagène 15,17.

Vaisseaux sanguins

Dans de nombreuses (mais pas toutes) 241 tumeurs solides, l'angiogenèse est déplacée vers l'état pro-angiogénique, conduisant à un réseau vasculaire tortueux et interrompu, ce qui limite la perfusion du médicament. Les cellules endothéliales vasculaires conditionnées par le TME participent activement à l'exclusion des lymphocytes T ou à la métastase, et l'état pro-coagulant des tumeurs conduit à l'activation des plaquettes, ce qui peut favoriser l'invasion tumorale 242&# x02013244 . Les récepteurs endothéliaux et les microthrombus associés aux tumeurs peuvent être ciblés pour localiser les nanostructures dans le système vasculaire tumoral 40 . Des médicaments peuvent être libérés dans le TME pour moduler la signalisation angiogénique intratumorale (par exemple, la voie du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF)) ou pour neutraliser les facteurs pro-angiogéniques excessifs, qui sont générés en réponse aux thérapies cytotoxiques 245 .

Cellules immunitaires

La plupart des nanothérapies ciblant les cellules immunitaires visent à améliorer la réponse des cellules T cytotoxiques anticancéreuses. Les traitements qui ciblent directement les cellules T à l'aide d'inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (protéine 4 cytotoxique associée aux lymphocytes T (CTLA-4) ou protéine de mort cellulaire programmée 1 (PD-1)) se sont révélés prometteurs contre les tumeurs chaudes, dans lesquelles les cellules T actives sont capables à s'infiltrer mais sont fonctionnellement bloqués par la signalisation des points de contrôle immunitaires 246 . Dans les tumeurs froides, les cellules T ne sont pas activées, en raison de la présence de cellules immunitaires immunosuppressives, qui peuvent être ciblées pour améliorer le recrutement des cellules T. Les nanovaccins qui délivrent des antigènes tumoraux et des agents immunostimulants aux cellules dendritiques peuvent améliorer leur maturation et leur présentation antigénique 247,248 . La reprogrammation des macrophages protumoraux en phénotypes antitumoraux peut raviver leur activité cytotoxique antitumorale et stimuler les réponses des lymphocytes T 50,51 . Les cellules tueuses naturelles (NK) attaquent spontanément les cellules cancéreuses sans nécessiter de sensibilisation à l'antigène. Le ciblage des cellules NK avec des cytokines (par exemple, IL-15) ou des anticorps qui induisent une stimulation et une expansion offre une alternative à l'immunothérapie à base de cellules T 249 .

Vaisseaux lymphatiques

Les tumeurs solides manquent de drainage lymphatique fonctionnel, cependant, les vaisseaux lymphatiques sont des autoroutes importantes pour la métastase des cellules cancéreuses. En effet, des niveaux élevés de lymphangiogenèse dans les tumeurs sont en corrélation avec des résultats médiocres 250,251. Les cellules endothéliales lymphatiques associées aux tumeurs surexpriment les molécules immunosuppressives, telles que PD-L1, mais favorisent également la migration des cellules dendritiques dans les ganglions lymphatiques, associée à une forte infiltration de cellules T naïves 250 . La lymphangiogenèse tumorale peut être modulée en bloquant le VEGFR3, le récepteur du VEGF-C, un facteur lymphangiogénique sécrété par les cellules tumorales 251 . Cependant, les ligands de ciblage des vaisseaux lymphatiques restent limités (avec l'exemple du peptide LyP-1 252).

Encadré 2 Voies d'administration des nanostructures ciblant le cancer

Administration intraveineuse se caractérise par une réponse thérapeutique rapide, une biodisponibilité élevée du médicament et un contrôle élevé de l'administration. Les nanosystèmes structurellement complexes et biologiquement instables ne sont souvent pas adaptés à l'absorption gastro-intestinale ou à l'injection intramusculaire, et donc l'injection intraveineuse est souvent la méthode de choix. De plus, les thérapies anti-métastases nécessitent une administration systémique de médicaments. Cependant, l'administration intraveineuse souffre d'une clairance rapide du médicament, d'une distribution et d'une accumulation tissulaires indésirables, et d'effets secondaires indésirables ultérieurs.

Livraison orale bénéficie d'une bonne observance du patient et peut fournir un accès facile pour le ciblage du tractus gastro-intestinal. Cependant, l'environnement difficile et complexe du tractus gastro-intestinal (variation élevée du pH, enzymes métaboliques, clairance médiée par le mucus) pose des défis pour les nanostructures. Des éléments adhérant au mucus et pénétrant l'endothélium sont généralement nécessaires pour augmenter l'adsorption intestinale et la pénétration des nanomatériaux.

Inhalation et administration intranasale permettre l'accès aux voies respiratoires (par exemple, pour le traitement du cancer du poumon) et permettre un ciblage soutenu et moins invasif, par rapport à l'injection intraveineuse. Les nanostructures nécessitent également des fonctionnalités d'adhérence du mucus pour améliorer l'adhérence et la pénétration du mucus (comme pour d'autres voies muqueuses, telles que l'accouchement vaginal) 253. Cependant, les médicaments inhalés ou administrés par voie intranasale peuvent également être distribués de manière systémique, en effet, les médicaments administrés par voie intranasale se sont avérés s'accumuler dans le système nerveux central 253.

Injection directe et infusion dans les tissus adjacents au site tumoral est une option si les tumeurs sont facilement accessibles. Les voies d'administration locales contournent de nombreuses barrières biologiques (par exemple, les médicaments administrés dans le cerveau contournent la barrière hémato-encéphalique), mais la pénétration tissulaire est toujours nécessaire. Les approches visant à améliorer la pénétration et la rétention des nanomatériaux dans le derme et le tissu sous-cutané restent limitées 254 . Les petites particules injectées localement sont sujettes à un drainage lymphatique rapide, et ainsi l'administration sous-cutanée peut délivrer des nanoparticules aux ganglions lymphatiques et aux cellules immunitaires qui résident dans le système lymphatique.

Chaque voie d'administration conduit à une distribution distincte du médicament et à des schémas distincts d'effets indésirables. Les problèmes de sécurité liés aux voies non intraveineuses, comme l'inhalation ou le contact cutané, doivent être pris en compte 255 . Des études systématiques des toxicités par voie dans le contexte de la nanomédecine contre le cancer seront essentielles.


Informations sur l'auteur : Gillooly JF 1 , Gomez JP 2,3 , Mavrodiev EV 4 .

Date de publication électronique : février 2017

Résumé: Les différences dans les limites et la gamme des niveaux d'activité aérobie entre les endothermes et les ectothermes restent mal comprises, bien que ces différences aident à expliquer les différences fondamentales dans les modes de vie des espèces (par exemple, les modèles de mouvement, les modes d'alimentation et les taux d'interaction). Nous comparons les limites et l'étendue de l'activité aérobie chez les endothermes (oiseaux et mammifères) et les ectothermes (poissons, reptiles et amphibiens) en évaluant la dépendance à la masse corporelle du VO2 max, de la portée aérobie et de la masse cardiaque dans un contexte phylogénétique basé sur un superarbre vertébré nouvellement construit. Contrairement aux travaux antérieurs, les résultats ne montrent aucune différence significative dans l'échelle de la masse corporelle des taux de consommation d'oxygène minimum et maximum avec la masse corporelle au sein des endothermes ou des ectothermes. Pour une masse corporelle donnée, les taux de repos et les taux maximaux étaient respectivement 24 fois et 30 fois inférieurs chez les ectothermes que chez les endothermes. La portée aérobie factorielle variait de cinq à huit dans les deux groupes, la portée des endothermes montrant une modeste dépendance à la masse corporelle. Enfin, les taux de consommation maximale et la portée aérobie étaient positivement corrélés avec la masse cardiaque résiduelle. Ensemble, ces résultats quantifient les similitudes et les différences dans le potentiel d'activité aérobie entre les ectothermes et les endothermes de divers environnements. Ils fournissent des informations sur les modèles et les mécanismes qui peuvent sous-tendre la dépendance à la masse corporelle de la consommation d'oxygène.


Informations sur l'auteur

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Jing Wang, Yiye Li.

Affiliations

CAS Key Laboratory for Biomedical Effects of Nanomaterials & Nanosafety, CAS Center for Excellence in Nanoscience, National Center for Nanoscience and Technology, Chine, Pékin, Chine

Jing Wang, Yiye Li et Guangjun Nie

Centre de science des matériaux et d'ingénierie optoélectronique, Université de l'Académie chinoise des sciences, Pékin, Chine

Jing Wang, Yiye Li et Guangjun Nie

GBA Research Innovation Institute for Nanotechnology, Guangdong, Chine

Institut de technologie avancée du Henan, Université de Zhengzhou, Zhengzhou, Chine


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